DE69002872T2 - Verfahren zur Erhöhung der Zytotoxizität von Anthracyclinen durch Photoaktivierung. - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur invitro-Photoaktivierung von Daunorubicin- und Doxarubicinderivaten mit Hilfe von Licht einer Wellenlänge von zwischen 500 und 700 nm, wodurch die cytotoxische Aktivität dieser Substanzen um einen Faktor 10 bis 10.000 erhöht wird.
• Ein besonders interessantes Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Strahlung in einem Wellenlängenbereich, der im roten Bereich des Spektrums von sichtbarem Licht liegt.
• Die Kennzeichen und Vorteile des erfindungsgemäßen Anthracyclin-Photoaktivierungsverfahrens werden im folgenden in größerer Ausführlichkeit gezeigt.
• Aliquots einer konzentrierten Anthracyclinlösung in bidestilliertem entionisiertem Wasser werden in geeigneter Weise mit einem normalen Zellkulturmedium verdünnt, um eine zur Inkubation geeignete Konzentration zu erhalten.
• Die Zellkulturen werden durch Routineverfahren hergestellt, insoweit das Kulturmedium und der Behälter (z.B. eine Petrischale, ein Kolben etc.) betroffen sind.
• Um den cytotoxischen Eftekt zu bestimmen und auszuwerten, werden geeignete Routinetechniken angewandt, die je nach Zellart und dem zu bestimmenden Effekt (Effekt auf das Zellwachstum, auf die Syntheseaktivität der verschiedenen Zellkomponenten; morphologische, strukturelle und ultrastrukturelle Effekte, Zellvitalität, ausgedrückt als Prozentsatz lebender Zellen etc.) ausgewählt werden.
• Die Kapseln werden mit einem frischen Medium, das das Anthracyclin enthält, während eines Zeitraums von zwischen einer und 48 Stunden inkubiert.
• Die Anthracyclinkonzentration liegt normalerweise unter dem Wert, welcher den untersuchten Effekt detektierbar ergibt, wenn die Verabreichung in Abwesenheit von Strahlung vorgenommen wird.
• Während der Inkubation wird die Kultur mit Licht einer Wellenlänge, die im 500 - 700 nm Bereich innerhalb der Absorptionsbande des zur Inkubation verwendeten Anthracyclins im sichtbaren Bereich ausgewählt wird, mit einer Intensität von 5 bis 500 mW/cm² und einer Lichtdosis von 10 bis 500 J/cm² bestrahlt.
• Das Licht wird in einer zur biologischen Probe senkrechten Richtung eingestrahlt und wird von einem Laser oder einer geeignet gefilterten Lampe produziert, um eine Strahlung der gewünschten Wellenlänge zu erhalten.
• Die Verwendung eines Lasers ist essentiell, wenn optische Fasern oder Lichtleitertechniken zur Lichtübertragung verwendet werden.
• Die Behandlung wird in einer Kammer durchgeführt, worin für die Zellproben unter Behandlung optimale Atmosphären- und Temperaturbedingungen sichergestellt sind.
• Die Bestrahlung wird in Anwesenheit des Anthracyclins durchgeführt und hat eine Dauer von zwischen 15 Minuten und der Gesamtaufenthaltszeit des Anthracyclins in den Zellen.
• Wir haben bewiesen, daß die Bestrahlung während der ersten 30 min der Inkubation mit Anthracyclin von relativ geringer Effizienz ist und daß es eine optimale Zeit von zwischen 60 und 90 Minuten gibt, um den maximalen unmittelbaren cytotoxischen Effekt durch Photoaktivierung mittels einer gegebenen Dosis Licht zu erhalten.
• Für die Behandlung geeignete Anthracycline sind die Daunorubicin- (Daunomicin)- und Doxorubicin- (Adriamicin)- Derivate mit Substituenten, die eine Verschiebung des Absorptionspeaks im Sichtbaren, der für die ursprünglichen Daunomicin- und Adriamicinmoleküle bei etwa 480 nm liegt, zu Wellenlängen zwischen 500 und 700 nm bewirken. Als Beispiele werden Imino- und Aminoderivate angeführt.
• Wir haben herausgefunden, daß durch die erfindungsgemäße Photoaktivierungsbehandlung die cytotoxische Aktivität, die mit Anthracyclindosen erhalten wird, welche in Abwesenheit von Photoaktivierung nur mäßige Resultate ergeben, um einen Faktor 10 erhöht wird, wenn der Langzeiteffekt, wie etwa das Zellwachstum, in den auf die Behandlung folgenden Tagen, gemessen wird, und um einen Faktor von typischerweise 10.000 erhöht wird, wenn der unmittelbare Effekt, etwa der Zelltod am Ende der Behandlung, gemessen wird.
• Diese Ergebnisse sind äußerst wichtig auf dem onkologischen Gebiet, worin, wie bekannt ist, die Anthracycline eine cytotoxische Aktivität aufweisen, die jedoch von schwerwiegenden Nebenwirkungen begleitet ist. In der Tat ist es durch die erfindungsgemäße Behandlung möglich, hohe cytotoxische Effekte mit einer reduzierten Anthracyclindosierung zu erhalten, wodurch die Nebenwirkungen verringert werden.
• Weiterhin ist sehr wichtig, daß die Photoaktivierung mit Hilfe von Licht einer Wellenlänge stattfindet, für welche sowohl Gewebe wie auch Blut relativ transparent sind.
• Die folgenden Beispiele werden zu Zwecken der Erläuterung, nicht der Beschränkung, angeführt.
Liste der Zeichnungen
• Die Begleitzeichnungen beziehen sich auf Folgendes:
• - Figur 1 ist eine graphische Darstellung der Zählung lebender Zellen pro ml als Funktion der auf die Beimpfung der Schalen folgenden Tage;
• - Figur 2 ist eine graphische Darstellung des Prozentsatzes überlebender Zellen, bezogen auf eine nicht-bestrahlte Kultur, als Funktion der Lichtdosis in J/cm²;
• - Figur 3 ist eine graphische Darstellung des Prozentsatzes überlebender Zellen, bezogen auf nicht-bestrahlte Kulturen, als Funktion der Verzögerung vom Beginn der Bestrahlung an, bezogen auf den Start der Inkubation mit 5-ID.
Beispiel 1
• Eine Kultur von Thyroidzellen von Fisher-Ratten, klassifiziert als FRT L5, wurde routinemäßig in Petrischalen in einem Ham F-12-Medium, das mit Coon (K.C. Biological Co.) unter Zugabe von 5% Kälberserum (Grand Island Biological Co.) modifiziert worden war, durch Inkubation bei 37ºC in einer Atmosphäre mit 5% CO&sub2; angelegt.
• Zur Bestimmung der Wachstumskurve wurde eine geeignete Anzahl der Petrischalen-Kulturen trypsinisiert, und die Zellen wurden in Wachstumsmedium so resuspendiert, daß eine Zellkonzentration von ungefähr 10&sup6;/ml vorlag. Suspensionsvolumina mit einer Zellzahl von der Größenordnung 10&sup5; wurden auf Schalen von 60 mm Durchmesser gegossen und mit 3 ml Kulturmedium überdeckt, wobei die Zellsuspension unter Rühren gehalten wurde, um eine einheitliche Zellverteilung in den verschiedenen Schalen zu haben.
• Die Schalen wurden 24 Stunden in einen Inkubator gestellt und dann 2 Stunden mit frischem Reaktionsmedium, das 5- Iminodaunomicin (5-ID) enthielt, inkubiert.
• 5-Iminodaunomicin wurde als eine 1,78 10&supmin;&sup5; M Lösung in entionisiertem, bidestilliertem Wasser hergestellt und wurde zu den verschiedenen Schalen in solchen Mengen gegeben, daß Konzentrationen von 0, 50, 200, 400 und 1000 ng/ml vorlagen. Die Inkubation dieser Schalen wurde im Dunkeln vorgenommen, während gleichzeitig eine Schale, die auf die gleiche Weise präpariert wurde und eine 5-Iminodaunomicin-Konzentration von 50 ng/ml hatte, unter Rotlicht-Bestrahlung einer Wellenlänge von 595 nm inkubiert wurde.
• Das Licht erreichte die Schale in einem 90º-Winkel, und der Strahlenquerschnitt in Querrichtung war höher als der Querschnitt der Schale. Die Bestrahlungsdichte betrug 40 mW/cm² im Zentrum und 15 mW/cm² am Rand. Die verabreichte Lichtdosis wurde auf der Basis einer durchschnittlichen Dichte von 34 mW/cm² berechnet und als 245 J/cm² gefunden.
• Die Kultur wurde in einer Kammer unter Luftstrom bei 37ºC bestrahlt.
• Die Ergebnisse der Behandlung sind in Fig.1 dargestellt, worin die Anzahl lebender Zellen pro ml als Funktion der Tage, die der Beimpfung der Petrischalen (Tag 0) und der zweistündigen Inkubation (Tag 1) folgten.
• Die Bedeutung der Kurven von Fig. 1 ist: Kurve Konzentration von 5-ID (ng/ml) ohne Bestrahlung mit Bestrahlung
• Im Vergleich der Kurve (f) mit der Kurve (b) sieht man, wie die Bestrahlung während der zweistündigen Inkubation mit 50 ng/ml 5-ID in der Verringerung der Anzahl lebender Zellen um eine Größenordnung resultiert.
Beispiel 2
• Unter Befolgung des Verfahrens von Beispiel 1 wurden FRT L5- Zellen resuspendiert, in Schalen verteilt und 72 Stunden inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurde 5-ID in die Schalen in einer solchen Menge eingebracht, daß eine Konzentration von 1000 ng/ml im Medium vorlag, und die Schalen wurden 2 Stunden inkubiert. Während dieses Zeitraums wurden die verschiedenen Schalen mit rotem Licht von 595 nm unter konstanter Bestrahlungsdichte auf der Schale von durchschnittlich 34 mW/cm² während Zeiten von 15 bis 120 Minuten bestrahlt.
• Jede Bestrahlungszeit wurde so gewählt, daß ihr Ende mit dem Ende der Inkubationszeit zusammenfiel. Die durchschnittliche Lichtdosis, die der Schale in 120 min verabreicht wurde, betrug 245 J/cm².
• Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt, worin der Prozentsatz an überlebenden Zellen, bezogen auf eine nichtbestrahlte Kultur, dargestellt ist als eine Funktion der Lichtdosis in J/cm².
• Diese Ergebnisse beweisen, daß die Behandlung dieses Beispiels einen hohen letalen Effekt in kurzer Zeit (ca. 30 Minuten) hat, während Inkubation ohne Bestrahlung bei derselben 5-ID-Konzentration in einer kurzen Zeit keinen meßbaren Effekt hervorruf t (siehe Kurve (e) von Figur 1)
Beispiel 3
• Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme daß jede Schale nur 15 Minuten während der zweistündigen Inkubation mit 5-ID bestrahlt wurde. Diese 15-minütigen Bestrahlungen wurden mit zunehmender Verzögerung bezogen auf des Starts der Inkubation begonnen, und präzise mit Verzögerungen von 0,15,30,45,60,75,90 und 105 Minuten.
• Die Ergebnisse sind in Fig. 3 wiedergegeben, worin der Prozentsatz an überlebenden Zellen, bezogen auf nichtbestrahlte Kulturen, wiedergegeben ist als Funktion der Verzögerung des Bestrahlungsbeginns ab Start der Inkubation mit 5-ID.
• Aus dieser Figur kann man ersehen, wie die besten Ergebnisse bei einer Verzögerung von zwischen 60 und 90 Minuten erhalten werden.

Claims (8)

1. Verfahren zur Erhöhung der in-vitro-Cytotoxizität, dadurch gekennzeichnet, daß während des Aufenthalts von Derivaten von Daunorubicin (Daunomycin) und von Doxorubicin (Adriamycin) mit Substituenten, die eine Verschiebung des Absorptionspeaks im sichtbaren Bereich zu Wellenlängen zwischen 500 und 700 nm bewirken, in den Zellen ein Photoaktivierungsprozeß durch Bestrahlung mit Licht einer Wellenlänge aus dem Bereich von zwischen 500 und 700 nm durchgeführt wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß diese Bestrahlung mit einer Intensität von 5 bis 500 mW/cm² durchgeführt wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestrahlung mit einer Lichtdosis von zwischen 10 und 500 J/cm² durchgeführt wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestrahlung mit Laserlicht ausgeführt wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestrahlung mittels Licht durchgeführt wird, das von Lampen erzeugt und geeignet gefiltert wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Licht durch Lichtleitertechniken verabreicht wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Daunomycin- und Adriamycinderivate die Iminoderivate und die Aminoderivate sind.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestrahlung zwischen 60 und 90 Minuten nach Beginn der Inkubation mit diesen Derivaten beginnt.