DE68916714T2

DE68916714T2 - Verfahren zur Bestimmung von Endotoxinen.

Info

Publication number: DE68916714T2
Application number: DE68916714T
Authority: DE
Inventors: Shuji Matsuura; Haruki Oishi; Aya Takaoka; Masakazu Tsuchiya
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1988-07-05
Filing date: 1989-07-04
Publication date: 1995-01-12
Anticipated expiration: 2009-07-05
Also published as: ES2057128T3; EP0350273B1; ATE108558T1; JPH02124466A; EP0350273A3; EP0350273A2; JPH07113643B2; DE68916714D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Messen der Konzentration von Endotoxin (nachstehend als "ET" bezeichnet) in einer Testprobe durch Messung einer optischen Veränderung, die auf eine Gelierreaktion zurückzuführen ist, die durch eine Reaktion eines Hämozytenlysats von Königskrabben (nachstehend kurz als "AL-Lösung" bezeichnet) mit ET bewirkt wird. Dieses Verfahren kann selbst dann angewendet werden, wenn die Gefahr besteht, daß die Testprobe die durch die Reaktion der AL-Lösung mit ET bewirkte Gelierreaktion beeinflußt.
Es ist bekannt, daß Endotoxine typische Pyrogene sind. Ferner ist bekannt, daß beim Injizieren von mit ET verunreinigtem Blut oder einer mit ET verunreinigter Infusions- oder Injektionsflüssigkeit in einen Körper das ET zu schwerwiegenden Nebenwirkungen, wie Fieber, Schock usw., führt. Daher wird es bei Ausgangsstoffen, Ausgangswässern usw. für Infusionen, Injektionen und dergleichen oder verschiedenen in einen lebenden Körper zu injizierenden Präparaten als notwendig angesehen, die darin enthaltende ET-Menge zu messen, damit Schwierigkeiten vermieden werden.
Die AL-Lösung hat die Eigenschaft, daß sie durch ET zu einer Gelierreaktion aktiviert wird. Ein unter Ausnutzung dieser Eigenschaft durchgeführtes, kostengünstiges Verfahren zum Nachweis von ET ist der sogenannte Limulus-Test, der in der wissenschaftlichen Medizin, in der Pharmazie und der Mikrobiologie weit verbreitet ist. Seit einigen Jahren sind in dem Limulus-Testverfahren verschiedene Verbesserungen eingeführt worden, und anstelle eines semiquantitativen Verfahrens, in dem die ursprünglich verwendete Gel-Clat-Technik angewendet wird, wendet man jetzt im allgemeinen ein optisches Meßverfahren an. Infolgedessen ist eine genauere Bestimmung möglich. In dem optischen Meßverfahren wird eine Trübung festgestellt, die auf ein Gel zurückzuführen ist, das durch die Gelierreaktion einer AL-Lösung mit ET erzeugt wird, und wird als optische Veränderung die Veränderung der Trübung, beispielsweise die Veränderung der Menge des durchgetretenen Lichts, gemessen und ET in Abhängigkeit von der Veränderung der durchgetretenen Lichtmenge bestimmt. In diesem Verfahren wird die ET-Konzentration in einer Testprobe z.B. mit Hilfe eines Graphen bestimmt, der in einer Eichkurve die Eichbeziehung darstellt, die die Abhängigkeit der Zeit, die verstreichen muß, damit der relative Transmissionsgrad einen vorherbestimmten Wert annimmt (diese Zeit wird nachstehend als "Gelierzeit" bezeichnet), von der ET-Konzentration angibt.
Das vorstehend beschriebene, derzeit verwendete Meßverfahren kann zwar ohne besondere Schwierigkeiten zum Messen der ET-Konzentration in Wasser, wie Ausgangswasser, Waschwasser usw., oder zum Messen der ET-Konzentration in einer Testprobe verwendet werden, die die Gelierreaktion zwischen der AL-Lösung und ET nicht beeinflußt, es kann aber nicht verwendet werden, wenn die Testprobe die Gelierreaktion hemmt oder fördert. Eine die Gelierreaktion hemmende Testprobe verlängert die Gelierzeit, so daß der Meßwert kleiner ist als der Istwert. Wenn die Testprobe die Gelierreaktion fördert, ist die Gelierzeit kürzer, so daß der Meßwert größer ist als der Istwert. In derartigen Fällen wird gewöhnlich eine übliche Maßnahme angewendet, in der identische Teilmengen einer kein ET enthaltenden Standard-Testprobe mit ET versetzt werden, beispielsweise die Beziehung zwischen der ET-Konzentration in den so hergestellten Proben und der Gelierzeit durch eine Eichkurve dargestellt wird und mit Hilfe der Eichkurve die ET-Konzentration einer Testprobe bestimmt wird. In der Praxis ist es jedoch sehr schwierig, eine Standard-Testprobe zu erhalten, die kein ET enthält, und aus diesem Grund kann das vorstehend beschriebene Verfahren nur sehr schwer durchgeführt werden.
Andererseits ist in U.S. Pharmacopeia (USPXXI: (85) BACTERIAL ENDOTOXIN TEST), angegeben, daß im Rahmen des Limulus-Tests ein Vorversuch durchgeführt werden muß, durch den bestätigt wird, daß die Testprobe selbst die Gelierreaktion nicht beeinflußt. Dieser Vorversuch wird dort als Test auf Hemmung oder Föderung beschrieben.
Zum Messen der ET-Konzentration in einer die Gelierreaktion beeinflussenden Testprobe ist bisher im allgemeinen ein Verdünnungsverfahren angewendet worden, in dem die Testprobe so stark verdünnt wird, daß ihr Einfluß verlorengeht. In diesem Verfahren treten jedoch folgende Probleme auf: Die Bestimmung des erforderlichen Verdünnungsgrades ist sehr arbeitsaufwendig. Ferner ist es bei einer Testprobe, bei der eine starke Verdünnung erforderlich ist, häufig nicht möglich, mit genügender Sicherheit festzustellen, ob der Verdünnungsgrad zu hoch ist oder ob die in der Testprobe vorhandene Menge an ET kleiner ist als ein Standardwert.
Ein weiteres Beispiel eines Verfahrens zum Messen der ET-Konzentration in einer die Gelierraktion beeinflussenden Testprobe ist in der JP-OS Kokai 62-110153 angegeben. In diesem Verfahren wird die Menge an ET in einer Testprobe mit Hilfe einer Eichkurve bestimmt, die die Beziehung zwischen der ET-Konzentration und der Gelierzeit darstellt und die mit Hilfe von Proben erhalten wird, die aus destilliertem Wasser bestehen, das mit vorherbestimmten Mengen von ET versetzt worden ist. (Diese Eichkurve wird nachstehend kurz als Wasser-Eichkurve bezeichnet.) Ferner wird eine die Beziehung zwischen der ET-Konzentration und der Gelierzeit darstellende Eichkurve verwendet, die mit Hilfe von drei oder mehr Proben erhalten worden ist, die hergestellt werden, indem identische Teilmengen einer Testprobe mit vorherbestimmten Mengen von ET versetzt werden. (Diese Eichkurve wird nachstehend kurz als "Testproben-Eichkurve" bezeichnet.) In diesem Verfahren wird eine Tatsache ausgenutzt, die von den vorliegenden Erfindern erkannt worden ist und die darin besteht, daß die die Beziehung zwischen der ET-Konzentration und der Gelierzeit darstellende Eichkurve, die mit Hilfe von Proben erhalten worden ist, zu deren Herstellung identische Teilmengen einer zunächst kein ET enthaltenden Testprobe mit vorherbestimmten Mengen von ET versetzt worden sind, mit der Wasser-Eichkurve dann übereinstimmt, wenn die Testprobe die Gelierzeit überhaupt nicht beeinflußt. Die erstgenannte Eichkurve liegt über der an zweiter Stelle genannten, wenn die Testprobe die Gelierreaktion hemmt, und die an erster Stelle genannte Eichkurve liegt unter der an zweiter Stelle genannten, wenn die Testprobe die Gelierreaktion fördert. In den meisten Fällen ist die an erster Stelle genannte Eichkurve zunächst zu der Wasser-Eichkurve parallel. Mit anderen Worten wird diese Tatsache wie folgt ausgenutzt: Der Grund dafür, daß bei der tatsächlichen Messung ein Teil der Testproben-Eichkurve zu der Wasser-Eichkurve nicht parallel ist, besteht darin, daß das zunächst in der Testprobe enthaltene ET auf die Testproben-Eichkurve einen gewissen Einfluß ausübt, so daß der ET-Gehalt der Testprobe durch einen Vergleich der Testproben-Eichkurve mit der Wasser-Eichkurve bestimmt werden kann. Nach diesem Verfahren kann der ET-Gehalt der Testprobe jedoch nur gemessen werden, wenn durch Versetzen von identischen Teilmengen der Testprobe mit ET Proben hergestellt worden sind und dabei mindestens eine Probe erhalten wird, die mit ET in einer Menge versetzt worden ist, die im wesentlichen ebensogroß oder kleiner ist als die Menge des zunächst in der Testprobe erhaltenen ET, und zwei oder mehr Proben erhalten werden, die mit ET in solchen Mengen versetzt worden sind, daß die zunächst in der Testprobe enthaltene Menge an ET vernachlässigt werden kann. Infolgedessen hat das genannte Verfahren z.B. den Nachteil, daß der ET-Gehalt der Testprobe in gewissem Grade geschätzt werden muß und daß bestimmte Arbeiten, wie die Herstellung der Proben, viel Mühe erfordern. Daher ist eine weitere Verbesserung des genannten Verfahrens erwünscht.

DARSTELLUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung ist angesichts dieser Bedingungen gemacht worden und soll ein Verfahren schaffen, das ein einfaches und schnelles Messen der ET-Konzentration in einer Testprobe ermöglicht, die das Gelieren einer AL-Lösung durch ET beeinflußt.
Die Erfindung schafft ein Verfahren zum Messen einer Endotoxinkonzentration in einer Probe durch Messen von optischen Veränderungen, die auf eine Gelierreaktion zurückzuführen sind, die durch eine Reaktion eines Hämozytenlysats von Königskrabben mit Endotoxin verursacht wird, in dem
i) zum Herstellen von drei oder mehr mit Endotoxin versetzten Proben eine Testprobe in verschiedenen bekannten Konzentrationen mit Endotoxin versetzt wird,
optische Veränderungen gemessen werden, die auf eine Gelierreaktion zurückzuführen sind, die durch Zugabe des Hämozytenlysats von Königskrabben zu einzelnen mit Endotoxin versetzten Proben herbeigeführt worden ist, und
die Gelierzeit gemessen wird, die verstreicht, bis die optische Veränderung ein vorherbestimmtes proportionales Ausmaß erreicht,
ii) zum Herstellen von drei oder mehr mit Endotoxin versetzten Lösungen eine Lösung, die kein Endotoxin enthält, und keinen Einfluß auf die Gelierreaktion hat, in verschiedenen bekannten Konzentrationen mit Endotoxin versetzt wird,
die Gelierzeit, wie vorstehend in i) beschrieben, gemessen wird und
eine Eichkurve gezeichnet wird, die die Beziehung zwischen der Gelierzeit und den Konzentrationen des Endotoxins in den damit versetzten Proben darstellt,
iii) mit Hilfe der vorstehend nach ii) erhaltenen Eichkurve auf Grund der Gelierzeiten die scheinbaren Konzentrationen des Endotoxins in den damit versetzten Proben bestimmt werden und
iv) zum Bestimmen der Endotoxinkonzentration in einer Testprobe in einem statistischen Geradlinigkeitstest kontrolliert wird, ob zwischen den nach iii) ermittelten, scheinbaren Endotoxinkonzentrationen und den nach i) verwendeten tatsächlichen Konzentrationen des Endotoxins in den damit versetzten Proben ein linearer Zusammenhang besteht.
Die Erfindung schafft ferner eine Vorrichtung zum Messen derartiger ET-Konzentrationen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 zeigt eine im Beispiel 1 erhaltene Eichkurve.
Figur 2 stellt in einem Graphen die Beziehung zwischen der Konzentration von zugesetztem ET (Es) und der im Beispiel 1 erhaltenen scheinbaren ET-Konzentration (Eapp) dar.
Figur 3 stellt in einem Graphen die Beziehung zwischen Es und Eapp dar, die im Beispiel 2 bei der Verwendung einer aus einer Dextranlösung bestehenden Probe erhalten wurde.
Figur 4 stellt in einem Graphen die Beziehung zwischen Es und Eapp dar, die im Beispiel 3 bei der Verwendung eines 20-fach verdünnten GIT-Mediums erhalten wurde.
Figur 5 zeigt schaubildlich das Aussehen eines Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Figur 6 ist ein Blockschema eines elektrischen Systems eines Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Gemäß der Erfindung geht man wie folgt vor:
(i) Zum Herstellen von drei oder mehr zum Einstellen verschiedener ET-Konzentrationen mit ET versetzten Proben wurden im wesentlichen identische Teilmengen einer Testprobe mit ET versetzt. Es wird die optische Veränderung gemessen, die auf eine Gelierreaktion zurückzuführen ist, die durch die Zugabe einer AL-Lösung zu jeder Probe bewirkt wird. Es wird die (nachstehend als "Gelierzeit" bezeichnete) Zeit gemessen, die verstreicht, bis die optische Veränderung einen vorherbestimmten Betrag erreicht.
(ii) Eine Gelierzeit wird wie in (i) angegeben gemessen, doch werden dazu drei oder mehr mit ET versetzte Lösungen verwendet, zu deren Herstellung im wesentlichen identische Teilmengen einer Lösung, die weder ET enthält noch eine Gelierreaktion beeinflußt, die durch die Reaktion einer AL- Lösung mit ET bewirkt wird, mit ET in zum Einstellen verschiedener ET-Konzentrationen versetzt werden, und es wird eine Eichkurve erstellt, die die Beziehung zwischen der Gelierzeit und der Konzentration des zugesetzten ET darstellt.
(iii) Zum Berechnen der scheinbaren ET-Konzentration in jeder gemäß (i) mit ET versetzten Probe werden die gemäß (i) gemessenen Gelierzeiten zu der gemäß (ii) erhaltenen Eichkurve extrapoliert.
(iv) Durch statistische Verarbeitung der gemäß (i) durch Versetzen der Teilmengen der Testprobe mit ET tatsächlich erhaltenen ET-Konzentrationen und der gemäß (iii) gemessenen entsprechenden scheinbaren ET-Konzentrationen wird festgestellt, ob zwischen den erstgenannten und den zuletztgenannten Konzentrationen eine lineare Beziehung vorhanden ist. Wenn dies der Fall ist, kann die ET-Konzentration in der Testprobe ohne weiteres aus dem Wert des Achsabschnitts (des Schnittpunkts) und der Neigung einer Regressionskurve bestimmt werden, deren Formel bei der statistischen Verarbeitung erhalten worden ist.
Die Erfindung kann z.B. wie folgt angewendet werden:
Zunächst werden mindestens drei mit ET versetzte Lösungen mit verschiedenen ET-Konzentrationen hergestellt, indem im wesentlichen identische Teilmengen einer Lösung, die kein ET enthält und die eine durch Umsetzen einer AL-Lösung mit ET bewirkte Gelierreaktion nicht beeinflußt, mit ET zum Einstellen verschiedener Konzentrationen versetzt werden. Jede dieser Lösungen wird mit einer AL-Lösung zur Reaktion gebracht. Dann wird eine die Beziehung zwischen der ET-Konzentration und der Gelierzeit darstellende und nachstehend als "ET-Eichkurve" bezeichnete Eichkurve erstellt. Dann werden mindestens drei mit ET versetzte Proben mit verschiedenen ET-Konzentrationen hergestellt, indem im wesentlichen identische Teilmengen einer Testprobe mit ET zum Einstellen verschiedener Konzentrationen versetzt werden. Jede dieser Lösungen wird mit einer AL-Lösung zur Reaktion gebracht. Danach wird für jede dieser Lösungen die Gelierzeit bestimmt. Auf Grund dieser Gelierzeit wird mit Hilfe der vorher erstellten ET-Eichkurve für jede der aus den Teilmengen der Testprobe hergestellten, mit ET versetzten Proben die scheinbare ET-Konzentration (Eapp) bestimmt. Nach einem üblichen statistischen Verfahren zur Bestimmung der Geradlinigkeit, beispielsweise nach einem Verfahren, in dem Eapp und die tatsächlichen Konzentrationen (Es) der mit ET versetzten Lösungen statistisch verarbeitet und ein Korrelationskoeffizient (γ) bestimmt wird, erfolgt eine Beurteilung, ob die Annahme, daß der proportionale Einfluß der Testprobe auf die Gelierreaktion im Bereich der gemessenen Konzentrationen konstant ist oder nicht, oder in anderen Worten, ob zwischen Eapp und Es eine Linearität vorhanden ist oder nicht, d.h., ob die Eichkurve, die die Beziehung zwischen der Konzentration der mit ET versetzten Lösung und der Gelierzeit darstellt und die auf Grund der Ergebnisse mit einer vorherbestimmten Menge ET versetzten Testprobe erstellt wurde, die erhalten wurden, indem jede der mit verschiedenen Mengen ET versetzten Teilmengen der Testprobe mit der AL-Lösung zur Reaktion gebracht wurde, zu der ET-Eichkurve parallel ist. Wenn die Linearität bestätigt wird, wird die Linearitätsformel
Eapp = a + b . Es (1)
bestimmt.
Die Koeffizienten "a" und "b" dieser Linearitätsformel können wie folgt interpretiert werden:
Wenn das für die Teilmenge der Testprobe bestimmte ET- Potenzerscheinungsverhältnis (das erhalten wird, wenn Eapp durch die tatsächliche ET-Konzentration der Probe geteilt wird) mit R und die tatsächliche ET-Konzentration der Probe mit E bezeichnet wird, ist Eapp durch die Gleichung
Eapp = R . E (2)
gegeben.
Da E die Summe der ursprünglichen ET-Konzentration (Ec) der Testprobe und Es ist, kann die Gleichung (2)
Eapp = R . (Ec + Es )
geschrieben werden. Daher ist
Eapp = R . Ec + R . Es (3)
Durch einen Vergleich der Gleichung (3) mit der Gleichung (1) erhält man
a = R . Ec (4)
b = R (5)
Daher wird das Potenzerscheinungsverhältnis R durch "b" ausgedrückt und wird der Einfluß auf die in der Testprobe durch die Reaktion der AL-Lösung mit ET bewirkte Gelierreaktion in Abhängigkeit von dem Wert von R wie folgt beurteilt:
R = 1: Kein Einfluß der Testprobe
R < 1: Hemmung durch die Testprobe
R > 1: Förderung durch die Testprobe
An den vorstehenden Gleichungen (4) und (5) ist erkennbar, daß die Konzentration Ec des ursprünglich in der Testprobe enthaltenen ET berechnet werden kann, indem "a" durch "b" geteilt wird.
Im Rahmen der Erfindung werden zum Messen der ET-Konzentration der Testprobe (Ec) die Testprobe und die ein ET enthaltende Lösung mit geeigneten Mengen ET versetzt. Die Mengen und Konzentrationen des zugesetzten ET sind nicht besonders kritisch, werden jedoch vorzugsweise im Bereich vom 0,2- bis zum 20-fachen, insbesondere im Bereich vom 0,5- bis zum 10- fachen, der für die Beurteilung maßgebenden, je nach dem Verwendungszweck vorherbestimmten Endotoxinkonzentration (Edet) gewählt. Durch Versetzen jeder Testprobe und jeder kein ET enthaltenden Probe mit ET werden mindestens drei verschiedene bekannte Endotoxinkonzentrationen eingestellt, so daß mindestens 6 Probenlösungen für die Messung erhalten werden. Wenn dabei Ec und Edet sehr verschieden sind, kann dadurch die Zuverlässigkeit der Messung von Ec beeinträchtigt werden. Aber selbst in einem solchen Fall kann zuverlässig beurteilt werden, ob Ec größer oder kleiner ist als Edet, so daß in der Praxis keine Schwierigkeit auftritt. Zur Gewinnung genauerer Werte ist es zweckmäßig, in jeder Testprobe und jeder kein ET enthaltenden Lösung durch Versetzen mit ET mindestens drei verschiedene ET-Konzentrationen einzustellen, die aus dem Bereich vom 0,2- bis zum 20-fachen, vorzugsweise aus dem Bereich vom 0,5- bis zum 10-fachen, der tatsächlichen ET-Konzentration ausgewählt sind. Auf diese Weise wird die vorstehend angegebene Linearitätsformel (1) erhalten. Zum Herstellen von drei ET-Lösungen, die zum Einstellen verschiedener Konzentrationen mit ET versetzt werden sollen, wird vorzugsweise ein sogenanntes zweistufiges Verdünnungsverfahren angewendet.
Im Rahmen der Erfindung liegt die vorherbestimmte, zu erreichende optische Veränderung (Rth) im Bereich von 75 bis 97% von R(t). Dabei wird R(t) wie folgt definiert: Wenn der ursprüngliche Transmissionsgrad eines Gemisches aus der AL- Lösung und der mit ET versetzten Probe (oder der mit ET versetzten Lösung) mit Io und der nach dem Verstreichen einer Zeit gemessene Transmissionsgrad des Gemisches mit I(t) bezeichnet wird, ist R(t) = I(t)/Io . 100.
Wenn Rth kleiner als 75% ist, z.B. 70%, kann das Gelieren nur sehr schwer erkannt werden und wird keine Eichkurve erhalten oder ist die erhaltene Eichkurve auf den Bereich von 0,1 bis 10 ng/ml beschränkt. Wenn dagegen Rth größer ist als 97%, wird die unmittelbar nach dem Mischen der AL-Lösung mit der mit ET versetzten Probe oder der mit ET versetzten Lösung im Gemisch stattfindende Bewegung (Konvektion) oder die durch die Bewegung von Gasblasen verursachte Veränderung von R(t) möglicherweise als Gelieren fehlinterpretiert. Um eine durch derartige Störeinflüsse verursachte, fehlerhafte Feststellung zu verhindern, muß ein Toleranzbereich von 3% wegen der Störungen eingehalten werden.
Daher soll Rth im Bereich von 75 bis 97% und vorzugsweise im Bereich von 80 bis 95% liegen.
Es versteht sich, daß das erfindungsgemäße Verfahren nicht auf eine Testprobe eingeschränkt ist, von der sicher bekannt ist, daß sie die Gelierreaktion beeinflußt, sondern die Erfindung auch auf eine Testprobe angewendet werden kann, von der ein solcher Einfluß nicht sicher bekannt ist, und auf eine Testprobe, die keinen Einfluß ausübt.
Die Auswahl der für das Erstellen der Eichkurve verwendeten Lösung, die kein ET enthält und keinen Einfluß auf die Gelierreaktion hat, die durch das Umsetzen einer AL- Lösung mit ET bewirkt wird, ist zwar nicht kritisch, sofern sie die angegebenen Eigenschaften hat, doch wird pyrogenfreies destilliertes Wasser und insbesondere destilliertes Wasser für Injektionen gewöhnlich bevorzugt, weil es leicht erhältlich ist.
Die Auswahl der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten AL-Lösung ist nicht kritisch, sofern sie für die gewöhnliche Messung von ET verwendet werden kann. Beispielsweise können AL-Lösungen verwendet werden, die aus gefriergetrockneten Produkten hergestellt worden sind, die aus AL- Lösungen hergestellt werden und die im Handel erhältlich sind, z.B. von Associates of Cape Cod Inc. (ACC), HAEMACHEM, Inc., Whittacker Bioproducts, Inc. und Teikoku Hormon Mfg. Co., Ltd. Ferner kann beispielsweise jede beliebige AL-Lösung ohne eine bestimmte Einschränkung verwendet werden, wenn sie durch Extraktion aus Hämozyten von Königskrabben gewonnen worden ist, die zu der Gattung Limulus, der Gattung Tachypleus oder der Gattung Carcinoscorpius gehören, und mit ET in einer Gelierreaktion umsetzbar ist.
Es versteht sich, daß das erfindungsgemäße Meßverfahren ohne weiteres mit einer Vorrichtung durchgeführt werden kann, die ausschließlich für die kinetische Trübungsmessung bestimmt ist. Zu diesen Vorrichtungen gehören z.B. die als Toxinometer ET-201 und von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. hergestellte Vorrichtung und die als LAL-5000 bezeichnete und von ACC Inc. hergestellte Vorrichtung usw. Die Erfindung kann aber auch mit einer Meßvorrichtung durchgeführt werden, die nach einem optischen Prinzip arbeitet, z.B. mit der unter der Bezeichnung MS-2 von Abbot Laboratories erhältlichen Vorrichtung usw.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es zweckmäßig, z.B. einen Mikrocomputer mit einer Software zu verwenden, die auf Grund der Eingabe der für Eapp und Es erhaltenen Werte deine Prüfung auf Linearität und eine Berechnung der ET-Konzentration einer Testprobe ermöglicht.
Die Erfindung schafft ferner zum Messen von Endotoxin eine Vorrichtung mit
(a) einem Konstanttemperaturbad zur Aufnahme mindestens einer Probenküvette, die geeignet ist, ein Gemisch einer Testprobe und einem Hämozytenlysat von Königskrabben (AL) auf einer konstanten Temperatur zu halten,
(b) einer Einrichtung zum Bestrahlen einzelner auf einer konstanten Temperatur gehaltenen Probenküvetten und zum Erfassen der hindurchgetretenen Lichtmengen,
(c) einer Einrichtung zum Anzeigen des Beginns der Messung der durch die Reaktionslösung hindurchgetretenen Lichtmenge
(d) einer Einrichtung zum Messen der Gelierzeit, die nach dem Beginn der Messung verstreicht, bis die Veränderung der Menge des hindurchgetretenen Lichts einen vorherbestimmten anteiligen Betrag erreicht,
(e) einer Einrichtung zum Ermitteln einer Gleichung, die die Beziehung zwischen der nach (d) ermittelten Gelierzeit und der Endotoxinkonzentration von drei oder mehr Proben besteht, die bekannte, unterschiedliche Endotoxinkonzentrationen haben, und einer Einrichtung zum Speichern dieser Gleichung,
(f) einer Einrichtung zum Ermitteln einer scheinbaren Endotoxinkonzentration durch Einsetzen der in (d) ermittelten Gelierzeit und der Endotoxinkonzentration für drei oder mehr durch Versetzen mit Endotoxin in verschiedenen bekannten Mengen eingestellten Proben in die nach (e) ermittelte Gleichung,
(g) einer Einrichtung zum Feststellen einer linearen Beziehung zwischen den Konzentrationen von Endotoxin in den damit versetzten Proben und den für einzelne nach (f) verwendeten Proben ermittelten, scheinbaren Endotoxinkonzentrationen, und einer Einrichtung zum Ermitteln einer eine lineare Beziehung zwischen beiden Konzentrationen darstellenden Gleichung und
(h) einer Einrichtung zum Ermitteln einer Endotoxinkonzentration in der Testprobe auf Grund der Neigung und eines Schnittpunktes, die in (g) ermittelt wurden.
Ein konkretes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung ist in der Figur 5 dargestellt. Gemäß der Figur 5 ist in der Vorrichtung eine Mehrzahl von Küvettenhaltern 7 zum Halten von Meßküvetten vorgesehen. Für jeden Halter 7 ist ein optisches System zum Messen der durchgetretenen Lichtmengen vorgesehen. Man kann auch jedem Halter mittels einer Lichtleitfaser von einer gemeinsamen Lichtquelle Licht zuführen. Ferner werden alle Halter mit einem (in Figur 5 nicht gezeigten) Konstanttemperaturbad oder einer trocken arbeitenden Temperaturregelvorrichtung auf einer konstanten Temperatur, z.B. von 37ºC, gehalten. Nachdem jede die Reaktionslösung enthaltende Küvette in einem Halter befestigt worden ist, kann die Reaktionslösung bis zum Ende der Messung im bewegungslosen Zustand gehalten werden und kann die Messung durchgeführt werden, ohne daß durch eine Bewegung der Gelzustand aufgehoben wird. Wenn für die Messung eine ein Gemisch einer flüssigen Probe und des LAL-Reagens enthaltende Küvette in einem Küvettenhalter 7 befestigt worden ist, wird zum Anzeigen des Beginns der Messung sofort ein Schalter 8 gedrückt und dadurch die Messung der Probe eingeleitet.
Der Schalter 8 wird dann jedesmal gedrückt, wenn eine Küvette für die Messung auf ähnliche Weise in einem Halter 7 befestigt worden ist, so daß eine Mehrzahl von in den Küvettenhaltern der Vorrichtung enthaltenen Proben parallel und gegebenenfalls unter zeitlicher Steuerung gemessen werden können. Gemäß der Figur 5 können in den Haltern der Vorrichtung 16 Küvetten befestigt werden. Dabei ist aber die Anzahl der Küvetten, die gleichzeitig der Messung unterworfen werden können, nicht auf die Zahl 16 beschränkt und kann diese Zahl größer oder kleiner sein, sofern dies die Steuerungskapazität zuläßt. Ferner kann man mit jedem Küvettenhalter 7 einen eigenen Schalter zum Anzeigen des Beginns der Messung verbinden. Außerdem kann man zum Anzeigen des Beginns der Messung automatisch einen Einschaltvorgang durchführen, wenn eine Küvette in einem Küvettenhalter eingesetzt worden ist.
Zum Anzeigen des Zustandes der optischen Systeme kann man eine Anzahl von den Meßzustand anzeigenden Leuchtdioden 9 vorsehen. An diesen Anzeigen kann man erkennen, welches optische System nach dem Drücken des Schalters 8 zur Messung verwendet werden soll oder welches optische System sich im Meßzustand befindet. Ferner kann man in der Vorrichtung eine Anzahl von Leuchtdioden 10 zur Beurteilung des Gelierzustandes einbauen und zur Anzeige der positiven oder negativen Beurteilung für jede Probe verwenden. Die nach dem bekannten Verfahren durch Beurteilung mit dem bloßen Auge erhaltenen Ergebnisse werden daher jetzt objektiv und mit hoher Präzision innerhalb kurzer Zeit angezeigt. Man kann die auf Grund der mit jedem optischen System vorgenommenen Beurteilung des Gelierzustandes bestimmte Gelierzeit (Tg) auf einer Anzeigetafel 11 in Form von Buchstaben und Zahlen darstellen, und in diesem Fall kann außer der Beurteilung positiv/negativ auf Grund der Beziehung zwischen der Endotoxinkonzentration und Tg gemäß Figur 1 auch die Endotoxinkonzentration schnell und mit guter Reproduzierbarkeit angezeigt werden.
Beim Messen einer Mehrzahl von Proben können mit Hilfe eines Anzeigesteuerschalters 12 die Tg-Werte für die einzelnen Proben nacheinander angezeigt werden. Man kann auch alle Werte gleichzeitig anzeigen, wenn ein anderes Anzeigeverfahren, z.B. mit einer Kathodenstrahlröhre, durchgeführt wird.
Mit dem Hauptteil der Vorrichtung ist eine Tastatur 20 verbunden, die zum Auslösen von Arbeitsfunktionen, zur Eingabe von numerischen Daten und zu ähnlichen Zwecken dient. Bei der Eingabe von Daten dient die Anzeigetafel 11 auch zur Kontrolle der eingegebenen Daten.
Figur 6 zeigt in einem Blockschema ein elektrisches System eines Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung. In der Figur 6 ist das den Küvetten für die Messung zugeordnete System zum Konstanthalten der Temperatur der Einfachheit halber nicht dargestellt und ist nur das System zur Steuerung der optischen Messung gezeigt. Die von einer Mehrzahl von Photodetektoren 6 erfaßten, durchgetretenen Lichtmengen werden unter Steuerung durch einen Multiplexer 13 nacheinander erfaßt und durch eine Verhältnisberechnungsschaltung 14 in R(t)-Werte umgewandelt, die dann in einen A/D-Umsetzer 15 eingegeben werden. Das in dem A/D-Umsetzer in einen digitalen Wert umgesetzte Signal wird von einem Computer 16 verarbeitet, der den Gelierzustand beurteilt und Tg bestimmt. Der Computer steuert auch die Anzeige 10 der Beurteilung des Gelierzustandes und die Anzeigetafel 11.
Mit der Tastatur werden Daten eingegeben, die Meßergebnisse darstellen, die für Proben erhalten wurden, die ET in bekannten Konzentrationen enthalten. Auf Grund dieser Meßergebnisse erstellt und speichert der Computer 16 Eichkurven, die die Beziehung zwischen der Gelierzeit und der ET- Konzentration darstellen. Mit Hilfe von geeigneten Programmen kann man mit dem Computer 16 unter Verwendung der genannten Eichkurven auf Grund der Gelierzeiten der mit ET versetzten Proben deren scheinbare ET-Konzentrationen bestimmen und feststellen, ob zwischen den ET-Konzentrationen der mit ET versetzten Proben und deren scheinbaren ET-Konzentrationen eine Linearität besteht, und kann man auf diese Weise eine Gleichung für die lineare Beziehung zwischen beiden Konzentrationen erhalten und die ET-Konzentration in einer Probe auf Grund der Neigung und des Abschnittes auf der Achse (eines Schnittpunktes) einer durch die Linearitätsgleichung gegebenen Kurve bestimmen. Ferner kann man die Meßergebnisse und die Ergebnisse der Datenverarbeitung mit einem Drucker 17 ausdrucken. Außerdem kann man je nach dem Verwendungszweck den Computer 16 erforderlichenfalls mit einem oder mehreren externen Computern verbinden.
Im Rahmen der Erfindung brauchen für die Messung keine speziell geformten Küvetten verwendet zu werden und kann man gewöhnliche Küvetten verwenden, wie sie in dem bekannten, manuell durchgeführten Verfahren verwendet werden.
Vorstehend wurde schon gesagt, daß die Erfindung eine Vorrichtung zum wirksamen parallelen Messen von Endotoxin in einer Mehrzahl von Proben mit hoher Zuverlässigkeit schafft. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann die Messung auch dann genau durchgeführt werden, wenn eine Testprobe Stoffe enthält, die die durch die Reaktion der AL-Lösung mit ET bewirkte Gelierreaktion beeinflussen.
Die Erfindung wird nachstehend konkreter anhand von Beispielen und von Kontrollbeispielen beschrieben. Diese Beispiele dienen nur der Erläuterung der Erfindung und sollen diese nicht einschränken.

Beispiel 1

[Reagenzien]

ET-Lösungen

Es wurden Lösungen verwendet, zu deren Herstellung ein Standard-Endotoxin für die Kontrolle von Escherichia coli (ein vom Stamm UKT-B der Escherichia coli abgeleitetes Lipopolysaccharid, das von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. erhältlich ist) verdünnt wurde. Jede Ampulle enthielt das Lipopolysaccharid in einer Menge, die 500 ng des Bezugsstandard-Endotoxins EC-2 der FDA entsprach und die für die Verdünnung mit 5 ml destilliertem Wasser bestimmt war.

AL-Lösung

Es wurde ein aus einer AL-Lösung, die von Königskrabben der Gattung Limulus gewonnen worden war, hergestelltes gefriergetrocknetes Produkt verwendet, das von Associates of Cape Cod, Inc., erhältlich ist, nachstehend kurz mit "LAL" bezeichnet wird und nach den Etikettangaben eine Empfindlichkeit von 0,03 EE (Endotoxineinheiten) hat und das zum Auflösen in 5 ml bestimmt ist. Dieses Produkt wurde in 5 ml destilliertem Wasser für Injektionen gelöst, und die so erhaltene LAL-Lösung wurde als AL-Lösung verwendet.

[Proben]

i) Gruppe I

Lösungen mit einer Sorbitkonzentration von 2% und einer Konzentration von zugesetztem ET von 0,01, 0,025, 0,05 bzw. 0,1 EE/ml wurden als Proben hergestellt, indem Sorbit (erzeugt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; gewährleistetes Reagens) in destilliertem Wasser für Injektionen zum Einstellen einer Konzentration von 2,2% gelöst wurde und dann jeweils eine ET-Lösung in einer vorherbestimmten Konzentration zugesetzt wurde.

ii) Gruppe II

Lösungen mit einer Sorbitkonzentration von 2% und einer Konzentration von zugesetztem ET von 0,01, 0,025, 0,05 bzw. 0,1 EE/ml wurden als Proben hergestellt, indem der gleiche Sorbit wie in i) in einer ET-Lösung (0,011 EE/ml) zum Einstellen einer Konzentration von 2,2% gelöst und dann jeweils eine ET-Lösung in einer vorherbestimmten Konzentration zugesetzt wurde.

[Meßvorgang]

Die Messung wurde wie nachstehend beschrieben mit einem von Wako Pure Chemical Tndustries, Ltd. hergestellten Gerät mit der Bezeichnung Toxinometer ET-201 nach einem üblichen Verfahren durchgeführt.
0,1 ml jeder Probe wurde zu 0,1 ml der LAL-Lösung zugesetzt, und nach dem Rühren wurde die (nachstehend als Tg bezeichnete) Zeit gemessen, die verstrich, bis bei einer Temperatur von 37ºC der Transmissionsgrad um 5% herabgesetzt war.
Getrennt davon wurde der vorstehend beschriebene Meßvorgang mit Proben durchgeführt, die aus ET-Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen bestanden und die aus destilliertem Wasser für Injektionen und der vorherbestimmten ET-Lösung hergestellt worden waren. Es wurde eine (nachstehend als "Wasser-Eichkurve" bezeichnete) Eichkurve erstellt, die die Beziehung zwischen der ET-Konzentration und Tg darstellt.

[Ergebnisse]

Die wie vorstehend beschrieben erhaltene Wasser-Eichkurve ist in Figur 1 dargestellt.
In der Tabelle 1 sind die Ergebnisse angegeben, die erhalten wurden, wenn die scheinbare ET-Konzentration (Eapp) jeder Lösung der Gruppe 1 mit Hilfe der Wasser-Eichkurve bestimmt wurde. In der Tabelle 1 ist mit Es die Konzentration des zugesetzten ET bezeichnet und ist jeder Wert von Eapp der Durchschnitt von drei Meßwerten. Tabelle 1 Es (EE/ml) Eapp (EE/ml)
In der Figur 2 wird durch - - die für jede Probe der Gruppe I bestimmte Beziehung zwischen dem Wert von Eapp und dem entsprechenden Wert von Es dargestellt. Die gerade Linie - - in Figur 2 ist eine Regressionskurve, die auf Grund der einzelnen Daten nach der Methode der kleinsten Quadrate bestimmt wurde.
Aus den vorstehenden Ergebnissen geht eine befriedigende Korrelation (Linearität) (Korrelationskoeffizient γ = 0,999) zwischen den für die Proben der Gruppe I bestimmten Werten von Eapp und den entsprechenden Es-Werten hervor. Es wurde festgestellt, daß die Wasser-Eichkurve in hohem Maße parallel zu einer Eichkurve ist, die für die Proben der Gruppe I die Beziehung zwischen der ET-Konzentration und Tg darstellt.
Durch statistische Verarbeitung der vorgenannten Werte für Es und Eapp wurde folgende Regressionsformel erhalten:
Eapp = 1,307 . Es + 0,006
Daher war das Potentialerscheinungsverhältnis R gleich 1,307 und wurde die ET-Konzentration in der in diesem Fall verwendeten 2%-igen Sorbitlösung der Gruppe I wie folgt berechnet:
0,006 : 1,307 = 0,005 EE/ml
In der Figur 2 ist die für jede Probe der Gruppe II bestimmte Beziehung zwischen Eapp und dem entsprechenden Wert von Es durch die Linie -o- dargestellt. Die gerade Linie -oin Figur 1 ist eine Regressionskurve, die auf Grund der einzelnen Daten nach der Methode der kleinsten Quadrate erhalten wurde
Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, daß eine befriedigende Korrelation (Linearität) (Korrelationskoeffizient γ = 1,000) auch zwischen den für die Proben der Gruppe II bestimmten Espp-Werten und den entsprechenden Es- Werten vorhanden ist. Es wurde erkannt, daß die Wasser-Eichkurve auch zu einer Eichkurve in hohem Maße parallel ist, die die für die Proben der Gruppe II bestimmte Beziehung zwischen der ET-Konzentration und den Tg-Werten darstellt.
Durch statistische Verarbeitung der für die Proben der Gruppe II erhaltenen Werte für Eapp wurde folgende Regressionsformel erhalten:
Eapp = 1,270 . Es + 0,021
Somit war das Potenzerscheinungsverhältnis R gleich 1,270 und wurde die ET-Konzentration in der in diesem Fall verwendeten 2%-igen Sorbitlösung der Gruppe II wie folgt berechnet:
0,021 : 1,270 = 0,017 EE/ml
Die Differenz zwischen der für die 2%-ige Sorbitlösung der Gruppe I bestimmten ET-Konzentration und der für die 2%-ige Sorbitlösung der Gruppe I bestimmten ET-Konzentration beträgt 0,012 EE/ml. Dies stimmt im wesentlichen mit der Differenz zwischen den ET-Konzentrationen der beiden 2,2%- igen Sorbitlösungen überein, die zum Herstellen der 2%-igen Sorbitlösung verwendet wurden. Aus dieser Tatsache geht hervor, daß die der Erfindung zugrundeliegende Annahme zutrifft.

Beispiel 2

[Reagenzien]

ET-Lösungen

Es wurden die gleichen ET-Lösungen verwendet wie im Beispiel 1.

[AL-Lösung]

Es wurde eine LAL-Lösung verwendet, zu deren Herstellung LAL (von Associates of Cape Cod. Inc.; auf dem Etikett angegebene Empfindlichkeit 0,25 EE/ml, zum Auflösen in 5 ml bestimmt) in 5 ml destilliertem Wasser für Injektionen gelöst wurde.

[Proben]

Lösungen mit einer Dextrankonzentration von 5% und einer Konzentration von zugesetztem ET von 0,05, 0,2 bzw. 2,0 EE/ml wurden als Proben hergestellt, indem Dextran (von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., erhältlich, Molekulargewicht 100 000 bis 200 000) in destilliertem Wasser zum Einstellen einer Konzentration von 5,5% gelöst wurde und dann ET- Lösungen in vorherbestimmten Konzentrationen zugesetzt wurden.

[Meßvorgang]

Die Messung wurde wie im Beispiel 1 durchgeführt.

[Ergebnisse]

In der Tabelle 2 sind die Ergebnisse angegeben, die erhalten wurden, wenn die scheinbare ET-Konzentration (Eapp) jeder Probe mit Hilfe der im Beispiel 1 erhaltenen Wasser- Eichkurve bestimmt wurde. In der Tabelle 2 ist mit Es die Konzentration des zugesetzten ET bezeichnet und ist jeder Wert von Eapp der Durchschnitt von drei Messungen. Tabelle 2 Es (EE/ml) Eapp (EE/ml)
Die Beziehung zwischen den erhaltenen Werten von Eapp und den entsprechenden Werten von Es ist in der Figur 3 dargestellt. Die gerade Linie in Figur 3 ist eine auf Grund der einzelnen Daten nach der Methode der kleinsten Quadrate erhaltene Regressionskurve.
Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, daß eine befriedigende Korrelation (Linearität) (Korrelationskoeffizient γ = 1,000) zwischen Es und Eapp auch dann vorhanden ist, wenn die Dextranlösungen als Proben verwendet wurden, und es wurde festgestellt, daß die Wasser-Eichkurve in hohem Maße parallel zu einer Eichkurve war, die die Beziehung zwischen der ET-Konzentration und Tg darstellt und die auf Grund der Messung mit den Dextranlösungen als Proben erhalten wurde.
Durch statistische Verarbeitung der vorstehenden Werte für Es und Eapp wurde folgende Regressionsformel erhalten:
Eapp = 3,124 . Es + 0,351
Somit war das Potenzerscheinungsverhältnis R gleich 3,124 und wurde die ET-Konzentration in der in diesem Fall verwendeten Dextranlösung wie folgt berechnet:
0,351 : 3,124 = 0,112 EE/ml

Beispiel 3

[Reagenzien]

ET-Lösungen

Es wurden die gleichen ET-Lösungen verwendet wie im Beispiel 1.

[AL-Lösung]

Es wurde eine LAL-Lösung verwendet, zu deren Herstellung LAL (von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., erhältlich; auf dem Etikett angegebene Empfindlichkeit 0,03 EE; zum Auflösen in 5 ml bestimmt) in 5 ml destilliertem Wasser für Injektionen gelöst wurde.

[Proben]

Lösungen mit Konzentrationen von zugesetztem ET von 0,0l25, 0,025, 0,050, 0,10, 0,20 bzw. 0,40 EE/ml wurden als Proben hergestellt, indem GIT-Medium (ein synthetisches Medium für Zellenkulturen, erzeugt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) mit der 20-fachen Menge destillierten Wassers für Injektionen verdünnt wurde und jeweils 0,1 ml einer ET-Lösung mit einer vorherbestimmten Konzentration zu 0,9 ml des verdünnten Mediums zugesetzt wurde.

[Meßvorgang]

Die Messung wurde wie im Beispiel 1 durchgeführt.

[Ergebnisse]

In der Tabelle 3 sind die Ergebnisse angegeben, die erhalten wurden, wenn die scheinbare ET-Konzentration (Eapp) jeder Probe mit Hilfe der im Beispiel 1 erhaltenen Wasser- Eichkurve bestimmt wurde. In der Tabelle 3 ist mit Es die Konzentration des zugesetzten ET bezeichnet und ist jeder Wert von Eapp der Durchschnitt von drei Meßwerten. Tabelle 3 Es (EE/ml) Eapp (EE/ml)
Die Beziehung zwischen den für Eapp erhaltenen Werten und den entsprechenden Werten von Es ist in der Figur 4 dargestellt. Die gerade Linie in Figur 4 ist eine nach der Methode der kleinsten Quadrate erhaltene Regressionskurve.
Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, daß eine befriedigende Korrelation (Linearität) (Korrelationskoeffizient γ = 0,999) auch dann vorhanden ist, wenn die Lösungen des GIT-Mediums als Proben verwendet wurden. Es wurde festgestellt, daß die Wasser-Eichkurve in hohem Maße zu einer Eichkurve parallel war, die die Beziehung zwischen der ET-Konzentration und Tg darstellt und durch die Messung unter Verwendung der Lösungen des GIT-Mediums als Proben erhalten wurde
Durch statistische Verarbeitung der vorstehenden Werte für Es und Eapp wurde folgende Regressionsformel erhalten:
Eapp = 1,399 . Es + 0,099
Somit war das Aktivitätserscheinungsverhältnis R gleich 1,399 und wurde die ET-Konzentration in dem in diesem Fall verwendeten, 20-fach verdünnten GIT-Medium wie folgt berechnet:
0,099 : 1,399 = 0,071 EE/ml
Wie vorstehend beschrieben wurde, schafft die Erfindung ein Verfahren, in dem die ET-Konzentration in einer Testprobe, die die Gelierreaktion zwischen einer AL-Lösung und ET beeinflußt, ohne den für die üblichen Verfahren erforderlichen Arbeitsaufwand leicht und schnell gemessen werden kann

Claims

1. Verfahren zum Messen einer Endotoxinkonzentration in einer Probe durch Messen von optischen Veränderungen, die auf eine Gelierreaktion zurückzuführen sind, die durch eine Reaktion eines Hämozytenlysats von Königskrabben mit Endotoxin verursacht wird, in dem

i) zum Herstellen von drei oder mehr mit Endotoxin versetzten Proben eine Testprobe in verschiedenen bekannten Konzentrationen mit Endotoxin versetzt wird,

optische Veränderungen gemessen werden, die auf eine Gelierreaktion zurückzuführen sind, die durch Zugabe des Hämozytenlysats von Königskrabben zu einzelnen mit Endotoxin versetzten Proben herbeigeführt worden ist, und

die Gelierzeit gemessen wird, die verstreicht, bis die optische Veränderung ein vorherbestimmtes proportionales Ausmaß erreicht,

ii) zum Herstellen von drei oder mehr mit Endotoxin versetzten Lösungen eine Lösung, die kein Endotoxin enthält, und keinen Einfluß auf die Gelierreaktion hat, in verschiedenen bekannten Konzentrationen mit Endotoxin versetzt wird,

die Gelierzeit, wie vorstehend in i) beschrieben, gemessen wird und

eine Eichkurve gezeichnet wird, die die Reziehung zwischen der Gelierzeit und den Konzentrationen des Endotoxins in den damit versetzten Proben darstellt,

iii) mit Hilfe der vorstehend nach ii) erhaltenen Eichkurve auf Grund der Gelierzeiten die scheinbaren Konzentrationen des Endotoxins in den damit versetzten Proben bestimmt werden und

iv) zum Bestimmen der Endotoxinkonzentration in einer Testprobe in einem statistischen Geradlinigkeitstest kontrolliert wird, ob zwischen den nach iii) ermittelten, scheinbaren Endotoxinkonzentrationen und den nach i) verwendeten tatsächlichen Konzentrationen des Endotoxins in den damit versetzten Proben ein linearer Zusammenhang besteht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem das mit dem Endotoxin zu versetzende Lösung destilliertes Wasser für Injektionen ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, in dem für eine Beurteilung je nach dem beabsichtigten Zweck die Konzentration, in der die Testproben oder die Lösungen mit Endotoxin versetzt werden sollen, im Bereich des 0,2- bis 20-fachen der vorherbestimmten Endotoxinkonzentration liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, in dem in dem statistischen Geradlinigkeitstest eine Formel

Epp = a + b x Es

für eine lineare Beziehung aufgestellt wird, in der Eapp eine scheinbare Endotoxinkonzentration, Es eine tatsächliche Konzentration von Endotoxin in einer damit versetzten Probe ist, "a" und "b" Koeffizienten sind, und der Wert a/b berechnet wird.

5. Vorrichtung zum Messen von Endotoxin mit

(a) einem Konstanttemperaturbad zur Aufnahme mindestens einer Probenküvette, die geeignet ist, ein Gemisch einer Testprobe und einem Hamozytenlysat von Königskrabben auf einer konstanten Temperatur zu halten,

(b) einer Einrichtung zum Bestrahlen einzelner auf einer konstanten Temperatur gehaltenen Probenküvetten und zum Erfassen der hindurchgetretenen Lichtmengen,

(c) einer Einrichtung zum anzeigen des Beginns der Messung der durch die Reaktionslösung hindurchgetretenen Lichtmenge

(d) einer Einrichtung zum Messen der Gelierzeit, die nach dem Beginn der Messung verstreicht, bis die Veränderung der Menge des hindurchgetretenen Lichts einen vorherbestimmten anteiligen Betrag erreicht,

(e) einer Einrichtung zum Ermitteln einer Gleichung, die die Beziehung zwischen der nach (d) ermittelten Gelierzeit und der Endotoxinkonzentration von drei oder mehr Proben besteht, die bekannte, unterschiedliche Endotoxinkonzentrationen haben, und einer Einrichtung zum Speichern dieser Gleichung,

(f) einer Einrichtung zum Ermitteln einer scheinbaren Endotoxinkonzentration durch Einsetzen der in (d) ermittelten Gelierzeit und der Endotoxinkonzentration für drei oder mehr durch Versetzen mit Endotoxin in verschiedenen bekannten Mengen eingestellten Proben in die nach (e) ermittelte Gleichung,

(g) einer Einrichtung zum Feststellen einer linearen Beziehung zwischen den Konzentrationen von Endotoxin in den damit versetzten Proben und den fuhr einzelne nach (f) verwendete Proben ermittelten, scheinbaren Endotoxinkonzentrationen, und einer Einrichtung zum Ermitteln einer eine lineare Beziehung zwischen beiden Konzentrationen darstellenden Gleichung und

(h) einer Einrichtung zum Ermitteln einer Endotoxinkonzentration in der Testprobe auf Grund der Neigung und eines Schnittpunktes, die in (g) ermittelt wurden.