DE68913899T2

DE68913899T2 - 9-Anthrylalkyl-Verbindungen, ihre Herstellung und ihre Verwendung.

Info

Publication number: DE68913899T2
Application number: DE68913899T
Authority: DE
Inventors: Hans-Dieter Becker; Stefan Einarsson; Andrzej Grzegorczyk; Bjoern Josefsson; Stig Soeren Lagerkvist; Per Leopold Moeller; Domingo Sanchez; Johan Henrik Soerensen
Original assignee: Eka Nobel AB
Current assignee: Nouryon Pulp and Performance Chemicals AB
Priority date: 1988-08-18
Filing date: 1989-08-04
Publication date: 1994-07-14
Anticipated expiration: 2009-08-05
Also published as: ATE102917T1; US5128120A; SE8802932D0; DE68913899D1; AU602455B2; US5015755A; EP0365495B1; AU3993789A; SE8802932L; EP0365495A2; JPH02111745A; JP2547348B2; SE467738B; CA1328463C; EP0365495A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen, die bestimmte 9-Anthrylalkylverbindungen sind. Die Erfindung betrifft auch die Herstellung der Verbindungen, die Verwendung der Verbindungen als Derivatisierungsreagentien zu Trennungszwecken und bestimmte Zwischenprodukte zur Herstellung der 9-Anthrylalkylverbindungen.

Hintergrund

Die Herstellung von Derivaten bestimmter Stoffe ermöglicht die Bestimmung kleiner Mengen von diesen in komplexen Proben wie Blutplasma und Urin. Chirale Verbindungen können außerdem durch Bildung von Diastereomeren mit chiralen Reagentien, gefolgt von einer Trennung unter Verwendung herkömmlicher HPLC-Säulen (Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie) oder GC-Säulen (Gaschromatographie) getrennt werden.
Die Trennung und Bestimmung von Verbindungen wie Aminen, Alkoholen und Aminosäuren und optischen Isomeren von diesen ist wegen ihrer biochemischen und pharmazeutischen Bedeutung immer wichtiger geworden. Eine große Zahl von Reagentien zur Derivatisierung von Aminen und Aminosäuren für die anschließende Trennung, zum Beispiel mittels Flüssigkeitschromatographie, ist vorgeschlagen worden, aber nur ein Paar haben eine umfangreiche Verwendung gefunden. Unter den achiralen Reagentien ist Chlorameisensäure-9-fluorenylmethylester (FMOC) während der letzten paar Jahre entwickelt worden und fand Verwendung zur Derivatisierung von Aminosäuren. Die Aminosäurederivate werden durch HPLC getrennt und dann durch Fluoreszenznachweis bestimmt, vgl. J. Chromatogr. 1983, Seiten 609 - 618 (S. Einarsson, B. Josefsson, S. Lagerkvist). Der Fluoreszenznachweis mit diesen Reagentien ergibt einen Nachweis bei sehr niedrigen Konzentrationen, während der UV-Nachweis auf höhere Konzentrationen beschränkt ist (wenige fmol bzw. wenige pmol).
Unter den chiralen Derivatisierungsreagentien, d.h. Reagentien, die auch zur Trennung von optischen Isomeren verwendet werden können, ist das Reagens (+)-Chlorameisensäure-1-(9- fluorenyl)ethylester (FLEC) kürzlich entwickelt worden und wird in der WO 87/06929 offenbart. Auch für dieses Reagens ist der Fluoreszenznachweis sehr gut, während der UV-Nachweis auf höhere Konzentrationen beschränkt ist.
Die Ansprüche an ein und die Wünsche nach einem Reagens zu Trennungszwecken gemäß dem vorstehend diskutierten sind in großem Umfang sowohl für achirale als auch chirale Reagentien gleich. Zusätzlich zu der Tatsache, daß es natürlich möglich sein sollte, sie in einer befriedigenden Weise herzustellen, sollten die Reagentien stabile Derivate der zu bestimmenden und/oder zu trennenden Verbindungen bilden, in erster Linie mit Verbindungen, die Aminogruppen enthalten, und hierbei vorzugsweise sowohl mit primären als auch sekundären Aminogruppen, aber natürlich auch mit so vielen anderen Verbindungsarten wie möglich für eine vergrößerte Vielseitigkeit bei der Verwendung. Die Nachweisempfindlichkeit sollte so hoch wie möglich sein und es ist sehr wünschenswert, daß mehr als ein Nachweisverfahren verwendet werden kann. Es soll möglich sein, die hergestellten Derivate durch herkömmliche Säulentrennung zu trennen. Für chirale Derivatisierungsreagentien ist es auch äußerst wichtig, daß es möglich ist, daß sie optisch rein hergestellt werden können und daß die Derivatisierung unter milden Bedingungen ausgeführt werden kann, um das Risiko einer Racemisierung zu vermeiden.

Die Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue 9-Anthrylalkylverbindungen, die als Derivatisierungsreagentien verwendbar sind und die die Ansprüche an solche Mittel erfüllen. Die Verbindungen sind dadurch besonders vorteilhaft, daß sie einen Nachweis mittels UV bei sehr niedrigen Konzentrationen (wenige fmol) erlauben. Der Anthracenchromophor, der Teil der Verbindungen ist, liefert hierbei den Vorteil, daß es möglich ist, seine Absorptionsmaxima (z.B. 256, 366 und 386 nm) für Identifizierungszwecke zu nutzen. Die neuen Verbindungen gemäß der Erfindung sind 9-Anthrylalkylverbindungen und werden durch die allgemeine Formel
gekennzeichnet, in der R ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest bedeutet, wobei jedoch nicht mehr als einer der Reste R einen Alkylrest darstellt, R&sub1; ein Wasserstoffatom, einen niederen Alkylrest, ein Halogenatom oder eine Nitrogruppe bedeutet und willkürlich im Anthracenring positioniert ist, n eine ganze Zahl von 1 bis 7 ist, wobei jedoch die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome in dem Rest -CHR-(CHR)n- 8 nicht übersteigt, und X ein Halogenatom, eine Azidgruppe oder eine Succinimidylgruppe bedeutet.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind somit sowohl achirale als auch chirale Verbindungen, wobei die letzteren folglich ein asymmetrisches Kohlenstoffatom enthalten, d.h. R in der vorstehend angegebenen Formel ist ein Alkylrest. Die chiralen Verbindungen können in Form eines Racemats oder als optisch aktive Isomere vorliegen, wobei die letzteren aus dem intermediären Alkoholracemat durch an sich bekannte Trennungsverfahren, zum Beispiel wie in den Beispielen offenbart, hergestellt werden. Die Verbindungen, in denen die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome in dem Rest -CHR-(CHR)n- 4 nicht übersteigt, sind bevorzugt, da diese die stabilsten Stoffe sind und das beste Trennvermögen aufweisen. Es ist besonders bevorzugt, daß der Rest nicht mehr als 3 Kohlenstoffatome enthält. Für die chiralen Verbindungen ist ferner bevorzugt, daß es sich um Verbindungen handelt, in denen das β-Kohlenstoffatom, vom Anthrylkern aus gezählt, asymmetrisch ist. Mögliche R&sub1;-Substituenten sind die vorstehend definierten Reste, die elektronenziehende Reste sind. Wenn R&sub1; ein niederer Alkylrest ist, sollte er geeigneterweise 1 bis 5 Kohlenstoffatome aufweisen und bevorzugt eine Methyl- oder Ethylgruppe sein. Der Rest X soll ein Rest sein, der bei der Umsetzung mit den in Frage stehenden Verbindungen leicht abgespalten wird, und X kann hierbei ein Halogenatom, wie ein Chlor- oder Bromatom, und die erwähnten Azid- und Succinimidylgruppen bedeuten, von denen gefunden wurde, daß sie solche befriedigenden Reste sind. Es ist besonders bevorzugt, daß X ein Halogenatom ist, geeigneterweise ein Chlor- oder Bromatom, und besonders ein Chloratom, d.h. daß die Verbindungen Chlorameisensäure-9-anthrylalkylester sind. Besonders bevorzugte Verbindungen sind die achirale Verbindung Chlorameisensäure-2-(9-anthryl)ethylester (AEOC) und die chiralen Verbindungen (+ )-Chlorameisensäure-1-(9-anthryl)-2-propylester und (-)-Chlorameisensäure-1- (9-anthryl)-2-propylester.
Die Erfindung betrifft ferner die Herstellung der neuen Verbindungen gemäß den in den Patentansprüchen angegebenen Parametern. Die Verbindungen können ausgehend von dem entsprechenden 9-Anthrylalkohol, der den gewünschten Rest -CHR-(CHR)n- liefert, hergestellt werden, wobei der Alkohol mit einer Verbindung, die den Rest -C(O)-X bereitstellt, umgesetzt wird. Der 9-Anthrylalkohol als solcher kann zum Beispiel aus 9-Bromanthracen über 9-Anthryllithium durch Umsetzung mit einem Alkylenoxid hergestellt werden, vgl. J. Org. Chem., 1986, 51, 2956-2961. Zur Herstellung des Chlorameisensäureesters wird die Umsetzung geeigneterweise durch Umsetzen des in Frage stehenden 9-Anthrylalkohols mit Phosgen ausgeführt. Um Verbindungen zu erhalten, in denen X ein Bromatom ist, wird der 9-Anthrylalkohol geeigneterweise mit Br-Phosgen umgesetzt. Um Verbindungen zu erhalten, in denen X eine Azidgruppe oder eine Succinimidylgruppe ist, wird der jeweilige Halogenameisensäureester geeigneterweise mit Natriumazid bzw. dem N-Hydroxysuccinimid-Dicyclohexylammoniumsalz umgesetzt. Die Umsetzung zwischen dem Anthrylalkohol und dem Reagens, das den Rest -C(O)-X bereitstellt, wird normalerweise in einem inerten Lösungsmittel, wie zum Beispiel Toluol, und geeigneterweise in Gegenwart einer Base, z.B. Pyridin, ausgeführt. Die Umsetzung kann bei Temperaturen von 0ºC bis 110ºC ausgeführt werden. Stöchiometrische Mengen von Anthrylalkohol und Reagens können verwendet werden. Normalerweise betragen die Umsetzungszeiten 0,5 bis 3 Stunden.
Bei der Herstellung von Chlorameisensäureestern wird der Anthrylalkohol geeigneterweise mit Phosgen in einem Lösungsmittel wie Methylenchlorid oder Toluol umgesetzt, wobei die Umsetzung bei Temperaturen von 0ºC bis Raumtemperatur ausgeführt wird.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Verbindungen gemäß der Erfindung. Die Verbindungen sind besonders als Derivatisierungsreagentien zu Trennungs- und Nachweiszwecken geeignet. Sie setzen sich mit primären, sekundären und/oder tertiären Aminogruppen in wäßrigen und nichtwäßrigen Lösungen bei Raumtemperatur um. Die Umsetzung ist sehr schnell und stabile Carbamate werden erhalten. In entsprechender Weise wie sich die Verbindungen der Erfindung mit Aminogruppen und folglich mit Verbindungen wie Aminen und Aminosäuren umsetzen, setzen sie sich auch mit Verbindungen, die Hydroxylgruppen enthalten, um und bilden stabile Carbonate. Alkohole und Kohlenhydrate können folglich auch derivatisiert werden und mit den vorliegenden Reagentien nachgewiesen werden. Zur vollständigen Derivatisierung ist es geeignet, einen verhältnismäßig großen Überschuß an Reagens, mindestens einen bis zu zehnfachen Überschuß, zu verwenden. Die Umsetzung ist selektiv und überschüssiges Reagens kann zum Beispiel mit Pentan leicht extrahiert werden. Die Derivatisierung ist schnell und bei Raumtemperatur werden hohe Ausbeuten erhalten. Für Amine wird die Umsetzung geeigneterweise in gepufferten wäßrigen alkalischen Lösungen ausgeführt.
Die derivatisierten Produkte können, in der Regel nach vorhergehender Trennung, sowohl durch UV-Nachweis als auch durch Fluoreszenznachweis in sehr geringen Mengen nachgewiesen werden. Ein Vergleich mit den entsprechenden Derivaten von FMOC hat eine wesentliche Verbesserung, d.h. eine Abnahme, der Nachweisgrenzen sowohl für den UV-Nachweis als auch für den Fluoreszenz-Nachweis durch Derivatisierung mit den vorliegenden Verbindungen gezeigt. Die eigentliche Trennung kann mittels herkömmlicher Trennungsverfahren, wie verschiedenen Arten von Flüssigkeitschromatographie, ausgeführt werden und wird vorteilhafterweise durch HPLC ausgeführt, die das leistungsfähigste System zur Analyse kleiner Stoffmengen und zur präparativen Trennung ist.
Die chiralen Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung geben zusätzlich zu den vorstehend offenbarten Trennungs- und Bestimmungsverfahren auch die Möglichkeit einer Trennung der optischen Isomeren von zum Beispiel Aminen, Aminosäuren und Alkoholen. Die chiralen Verbindungen ergeben dieselben guten Nachweiseigenschaften wie die achiralen Verbindungen. Die optisch aktiven Formen der Reagentien erlauben die Trennung und quantitative Bestimmung von Diastereomeren der derivatisierten Produkte. Die (-)-Isomere, z.B. (-)-Chlorameisensäureanthrylpropylester, bilden zusammen mit Aminosäuren ein Diastereomerenpaar, wobei die D-Form vor der L-Form abgetrennt wird, was vorteilhaft ist, da die L-Form in den meisten Proben die dominierende Form ist.
Die Erfindung betrifft auch intermediäre Anthrylalkohole zur Herstellung der vorstehend definierten neuen chiralen Verbindungen und diese Zwischenprodukte besitzen die allgemeine Formel
in der ein R einen Alkylrest darstellt und die anderen Wasserstoffatome darstellen, R&sub1; ein Wasserstoffatom, einen niederen Alkylrest, ein Halogenatom oder eine Nitrogruppe bedeutet und willkürlich im Anthracenring positioniert ist und n eine ganze Zahl von 1 bis 7 ist, wobei jedoch die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome in dem Rest -CHR-(CHR)n- 8 nicht übersteigt.
Die geeigneten und bevorzugten Definitionen für die intermediären Anthrylalkohole sind wie vorstehend für die Reagensverbindungen angegeben. Die Zwischenprodukte können zum Beispiel hergestellt werden, indem ein 9-Anthrylalkylaldehyd einer Grignard-Reaktion mit CH&sub3;MgI unterworfen wird. Ein anderes Herstellungsverfahren ist die Umsetzung zwischen 9-Anthryllithium und einem Epoxyalkan.
Die neuen Derivatisierungsreagentien und insbesondere Chlorameisensäure-2-(9-anthryl)ethylester (AEOC) und (+)- und (-)-Chlorameisensäure-1-(9-anthryl)-2-propylester sind besonders zur quantitativen Bestimmung von Aminosäuren, Aminen und Verbindungen, die Hydroxylgruppen enthalten, und ihren optischen Isomeren durch Umkehrphasen-LC (Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie) verwendbar. Die Reagentien setzen sich mit Aminogruppen und Hydroxylgruppen in wäßrigen Lösungen während einiger Minuten bei Raumtemperatur um und stabile Carbamate bzw. Carbonate werden gebildet. Die Umsetzung ist selektiv und überschüssiges Reagens kann mit Pentan extrahiert werden. Der Nachweis der derivatisierten Produkte wird durch die elektronenspektroskopischen Eigenschaften des Anthracenchromophors, Lichtabsorptionswert &epsi; = 190000 M&supmin;¹ cm&supmin;¹ bei etwa 256 nm, begünstigt. Ein Vergleich mit dem Chlorameisensäure- 9-fluorenylmethylesterderivat (FMOC), Lichtabsorptionswert &epsi; = 20000 M&supmin;¹ cm&supmin;¹, hinsichtlich Aminosäuren zeigt, daß die Verbindungen gemäß der Erfindung eine etwa zehnmal so große UV- Empfindlichkeit aufweisen. Die verschiedenen Absorptionsbanden für Anthracen (256, 366 und 386 nm) können verwendet werden, um die Empfindlichkeit beim Nachweis zu erhöhen. Der große Unterschied zwischen Anregungswellenlänge und Emissionswellenlänge der Verbindungen der Erfindung verbessert ebenfalls den Nachweis. Die Derivate von Aminosäuren und den anderen erwähnten Verbindungen mit den neuen Reagentien können in 30 Minuten unter Verwendung herkömmlicher Umkehrphasen- Flüssigkeitschromatographie mit Gradientenelution getrennt werden.

Beispiel 1

Herstellung von 1-(9-Anthryl)-2-propanol

a) Aus 9-Anthryllithium und 1,2-Epoxypropan
Eine Lösung aus 1,2-Epoxypropan (0,65 ml) in Ether (20 ml) wurde einer eiskalten 9-Anthryllithium-Lösung zugefügt, die aus 9-Bromanthracen (1,54 g; 6 mmol) und n-Butyllithium (3,75 g einer 1,6 M Lösung) in Ether (50 ml) hergestellt worden war. Die Aufarbeitung nach 35 Minuten umfaßte die Zugabe wäßrigen Ammoniumchlorids, Extraktion der wäßrigen Phase mit Dichlormethan und Flash-Chromatographie an Kieselgel/Dichlormethan. Das so erhaltene kristalline Produkt wurde aus einer Dichlormethanlösung unter Zugabe von Hexan umkristallisiert. Drei identische Versuche lieferten 2,4 g (56%) blaßgelber nadelförmiger Kristalle, Schmp. 105-107ºC.
b) Aus 9-Anthrylacetaldehyd durch Grignard-Reaktion
9-Anthrylacetaldehyd (1,1 g; 5 mmol) wurde mit einem Soxhlet-Extraktor über einen Zeitraum von 6 Stunden in eine Etherlösung (100 ml) von Methylmagnesiumjodid (30 mmol; hergestellt aus 0,72 g Magnesium) extrahiert. Die Aufarbeitung, wie vorstehend beschrieben, lieferte 1,05 g (89%) 1-(9-Anthryl)-2-propanol als blaßgelbe nadelförmige Kristalle, Schmp. 105-107ºC.
Analyse: Berechnet für C&sub1;&sub7;H&sub1;&sub6;O: C: 86,40; H: 6,82
Gefunden: C: 86,16; H: 6,74

Beispiel 2

Trennung von 1-(9-Anthryl)-2-propanol

1-(9-Anthryl)-2-propanol (500 mg; 2,07 mmol) wurde trockenem Pyridin (25 ml) zugefügt und dann wurde (-)-Camphersulfonsäurechlorid zugefügt (2,28 mmol; 493 mg; 10% Überschuß). Die Lösung wurde unter Rühren bei Raumtemperatur eine Stunde stehengelassen. Die Pyridinlösung wurde mit CH&sub2;C&sub1;&sub2; + HCl (10%; dreimal) und Na&sub2;CO&sub3; (5%; zweimal) extrahiert. Die CH&sub2;Cl&sub2;-Phase wurde zur Trockne eingedampft, was eine Kristallbildung ergab. Die Kristalle wurden in MeOH (90 ml) ausgefällt und dieses ergab weiße Kristalle (700 mg); Schmp. 169- 170ºC. Theoretische Ausbeute: 874 mg.
Die Diastereomeren wurden auf eine HPLC-Säule (5x30 cm), 300 mg jedes Mal, aufgebracht und mit Hexanol:Essigester = 93:7; Fluß: 80 ml/min eluiert. Das erste Isomer wurde mit 90% optischer Reinheit erhalten. Das andere Isomer wurde mit 97% optischer Reinheit erhalten. Die Isomere wurden getrennt in der kleinstmöglichen Menge MeOH umkristallisiert. 320 mg des ersten Isomers (0,76 mmol) wurden in THF (10 ml) gelöst und dann wurde LiAlH&sub4; (2x0,76 mmol; 58 mg) zugefügt. Die Aufarbeitung in herkömmlicher Weise unter Eindampfen der Ether-Phase lieferte 170 mg. Umkristallisieren in Petrolether lieferte 125 mg; Schmp. 122-123ºC.
320 mg des anderen Isomers wurden in der gleichen Weise wie vorstehend behandelt und die gleichen Analysenergebnisse wurden erhalten. Eindampfen der Ether-Phase zur Trockne lieferte 170 mg. Umkristallisieren in Petrolether lieferte 116 mg; Schmp. 122-123ºC. Das racemische Gemisch besitzt einen Schmelzpunkt von 103ºC.

Beispiel 3

Herstellung von Chlorameisensäure-1-(9-anthryl)-2-propylester

Jedes Isomer wurde einzeln (95% optische Reinheit; 125 bzw. 116 mg) in trockenem Toluol (50 ml) gelöst. Die Lösungen wurden eisgekühlt und dann wurden Et&sub3;N (46 mg; 0,45 mmol) und Phosgen (122 mg; 1,23 mmol) zugefügt. Die Lösungen wurden unter Rühren eine Stunde stehengelassen und wurden anschließend filtriert. Die Toluol-Phase wurde zur Trockne eingedampft und Petrolether wurde dem gelblichen Öl zugefügt. Der Petrolether wurde filtriert und eingedampft und die NMR-Spektren zeigten dann optisch völlig reine Verbindungen mit den nachstehend angegebenen Drehwerten.
Isomer I: [a]25D = +44,0º
Isomer II: [a]25D = -44,5º

Beispiel 4

Herstellung von Chlorameisensäure-9-anthrylethylester

Eine Lösung aus 2-(9-Anthryl)ethanol (3,5 g; 15,7 mmol), das durch Umsetzung zwischen Bromanthracen und n-Butyllithium und anschließende Umsetzung mit Ethylenoxid erhalten worden war, in Methylenchlorid (20 ml) wurde langsam einer eiskalten Phosgenlösung (20 ml; 38,4 mmol; 20% in Toluol) zugefügt. Das Umsetzungsgemisch wurde 3 Stunden in einem Eisbad gehalten und wurde dann während der Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Aufarbeitung durch Verdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck lieferte einen kristallinen Rückstand, der aus einer Methylenchloridlösung durch Ausfällen mit Hexan umkristallisiert wurde, wobei 3,36 g (75%) AEOC als praktisch farblose Kristalle, Schmp. 85-87ºC erhalten wurden. 270 MHz ¹H-NMR in CDCl&sub3;: 4,l0 (t, J = 8 Hz, 2H); 4,66 (t, J = 8 Hz, 2H); 7,46-7,61 (m, 4H); 8,03 (d, J = 8 Hz, 2H); 8,27 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 8,43 (s, 1H, H-10).

Beispiel 5

Herstellung von Chlorameisensäure-9-anthrylpropylester

Die Herstellung von 9-Anthrylpropanol umfaßte die reduktive Umwandlung von 9-Anthrylpropionsäure. Diese wird entweder aus 9-Anthrylaldehyd mittels einer Wittig-Reaktion und eines anschließenden katalytischen Hydrierungsschritts gemäß bekannter Technik oder aus Anthron und Acrylnitril mit anschließender Reduktion zur Säure erhalten. Die Reduktion der erhaltenen 9-Anthrylpropionsäure mit LiAlH&sub4; lieferte 9-Anthrylpropanol in einer Ausbeute von 89%. Der Chlorameisensäureester des 9-Anthrylpropanols ("APOC") wurde in der gleichen Weise, wie vorstehend für "AEOC" offenbart, erhalten. Er bildet farblose Kristalle, Schmp. 103-106ºC.

Beispiel 6

Derivatisierung von Aminosäuren unter Verwendung von Chlorameisensäure-2-(9-anthryl)ethylester (AEOC)

Ein Borat-Puffer wurde aus 1 M Borsäure-Lösung hergestellt, die mit Natriumhydroxid auf einen PH-Wert von 7,84 eingestellt worden war. Eine 10 mM AEOC-Lösung in Aceton und 1-Propanol (Volumenverhältnis 1:2) wurde täglich unter Verwendung einer 30 mM Vorratslösung von AEOC in getrocknetem, destilliertem Aceton hergestellt. Eine Probe (400 µl) für die Derivatisierung, die aus Aminosäure-Standardlösungen von Sigma (St. Louis, MO, USA) ausgewählt ist, wurde mit Borat-Puffer (100 µl; pH 7,84) gemischt, was einen gewünschten PH-Wert von 8,55 lieferte. Ein Gemisch aus 500 µl der 10 mM Reagenslösung und 500 µl der gepufferten Probe ließ man 4 Minuten umsetzen, dann gefolgt von zwei Extraktionen des Hydrolyseprodukts mit 2 ml Pentan, um überschüssiges Reagens zu entfernen. Die Derivatisierung wurde in silanbehandelten Umsetzungsgefäßen von 3 ml ausgeführt.
Die Trennung wurde unter Verwendung einer Chromatographie-Säule (Spherisorb ODS2) und eines Flüssigkeitschromatographen (Varian, Modell 5000) ausgeführt und die Aminosäurederivate wurden dann mittels eines UV-Extinktionsdetektors und eines Fluoreszenzdetektors nachgewiesen. Die Phasentrennung der Aminosäureprobe wurde unter Verwendung eines Drei-Komponenten-Lösungsmittels (A, B, C) durch Gradientenelution ausgeführt. Die mobile Phase bestand aus Tetrahydrofuran (A), 50 mM wäßriger Essigsäure-Lösung (B) und 50 mM Natriumacetat-Lösung in einem Wasser-Methanol-Gemisch von 9:1 (C). Die Chromatographiebedingungen waren: Fluß 1,2 ml/min; Raumtemperatur.

Beispiel 7

Trennung von Aminosäuren unter Verwendung von (-)-Chlorameisensäure-1-(9-anthryl)-2-propylester

Zwei Aminosäuren, Phenylalanin und Prolin, die Aminosäuren, die eine primäre bzw. eine sekundäre Aminogruppe enthalten, repräsentieren, wurden für den Versuch ausgewählt. Ein Standard, der den Alkohol 1-(9-Anthryl)-2-propanol enthält, wurde zur Bestätigung des gebildeten Nebenprodukts durch Chromatographie verwendet.
Die Trennungen wurden unter Verwendung einer Varian-Gradientenzuführeinrichtung 5500 ausgeführt. Die Proben wurden mittels eines Rheodyne-Einspritzventils, das mit einer 20 µl- Schleife ausgestattet ist, eingespritzt. Die Derivate wurden mit einem Schoeffel-Fluoreszenzdetektor Modell 970 nachgewiesen. Die Anregungswellenlänge war 250 nm. Ein Sperrfilter wurde auf der Emissionsseite (370 nm) verwendet.
Die Standards der Aminosäuren (Sigma) wurden in 0,1 M Borat-Puffer (PH 8,5) verdünnt. Die Konzentration der Aminosäuren in dem Borat-Puffer war folgendermaßen:
a) L-Phenylalanin 50 µM
b) D-Phenylalanin 50 µM
c) L- und D-Phenylalanin 50 µM (insgesamt)
d) L- und D-Prolin 50 µM (insgesamt)
e) L-Prolin 50 µM
Die gepufferten Aminosäure-Standards (500 µl) wurden 10 Minuten bei Raumtemperatur mit dem gleichen Volumen an Reagens (5 mM, gelöst in Aceton) umgesetzt. Die Proben wurden anschließend zweimal mit ungefähr 1,5 ml Pentan extrahiert und die Pentanphasen wurden verworfen. Nach den Extraktionsverfahren wurde ein Teil der wäßrigen Phase auf die Säule eingespritzt.
Trennungsbedingungen: Mobile Phasen: Tetrahydrofuran und ein Essigsäure-Puffer wurden für die Trennungen verwendet. Der Puffer war aus 3 ml Eisessig in 1 l destilliertem Wasser hergestellt. Der PH-Wert war mit konzentriertem Natriumhydroxid auf 5,0 eingestellt. Die Trennungen wurden in einer isokratischen Weise ausgeführt: 45% THF/55% Puffer zur Trennung von D,L-Phenylalanin und 33% THF/67% Puffer zur Trennung von D,L-Prolin. Flußrate: 1ml/min. Die für die Trennungen verwendete Säule war eine 25 x 0,46 cm-Säule, die mit Umkehrphasenmaterial mit einer Teilchengröße von 5 µm im Durchmesser (TSK-GEL, Toyo Soda LTD) gepackt war. Die α-Werte für die D- und L-Phenylalanin- und die D- und L-Prolin-Trennungen waren 1,11 bzw. 1,19.

Claims

1. Neue 9-Anthrylalkylverbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie die allgemeine Formel

besitzen, in der R ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest bedeutet, wobei jedoch nicht mehr als einer der Reste R einen Alkylrest darstellt, R&sub1; ein Wasserstoffatom, einen niederen Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, ein Halogenatom oder eine Nitrogruppe bedeutet, n eine ganze Zahl von 1 bis 7 ist, wobei jedoch die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome in dem Rest -CHR-(CHR)n- 8 nicht übersteigt, und X ein Halogenatom, eine Azidgruppe oder eine Succinimidylgruppe bedeutet.

2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome in dem Rest -CHR-(CHR)n- 4 nicht übersteigt.

3. Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Rest R, wenn er ein Alkylrest ist, am β-Kohlenstoffatom, vom Anthrylkern aus gezählt, positioniert ist.

4. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome in dem Rest -CHR-(CHR)n- 3 nicht übersteigt.

5. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß X ein Chloratom ist.

6. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Chlorameisensäure-2-(9-anthryl)ethylester oder Chlorameisensäure-1-(9-anthryl)-2-propylester ist.

7. Verbindung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie (-)-Chlorameisensäure-1-(9-anthryl)-2-propylester oder (+)-Chlorameisensäure-1-(9-anthryl)-2-propylester ist.

8. Verfahren zur Herstellung von 9-Anthrylalkylverbindungen der allgemeinen Formel

in der R ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest bedeutet, wobei jedoch nicht mehr als einer der Reste R einen Alkylrest darstellt, R&sub1; ein Wasserstoffatom, einen niederen Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, ein Halogenatom oder eine Nitrogruppe bedeutet, n eine ganze Zahl von 1 bis 7 ist, wobei jedoch die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome in dem Rest -CHR-(CHR)n- 8 nicht übersteigt, und X ein Halogenatom, eine Azidgruppe oder eine Succinimidylgruppe bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß ein 9-Anthrylalkohol, der den Rest -CHR-(CHR)n-OH enthält, mit einer Verbindung X-CO-X, in der X ein Halogenatom darstellt, umgesetzt wird, wonach gegebenenfalls eine zusätzliche Umsetzung mit einem Na-Azid oder N-Hydroxysuccinimid ausgeführt wird.

9. Verwendung von 9-Anthrylalkylverbindungen der allgemeinen Formel

in der R ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest bedeutet, wobei jedoch nicht mehr als einer der Reste R einen Alkylrest darstellt, R&sub1; ein Wasserstoffatom, einen niederen Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, ein Halogenatom oder eine Nitrogruppe bedeutet, n eine ganze Zahl von 1 bis 7 ist, wobei jedoch die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome in dem Rest -CHR-(CHR)n- 8 nicht übersteigt, und X ein Halogenatom, eine Azidgruppe oder eine Succinimidylgruppe darstellt, als Derivatisierungsreagentien zu Trennungs- und Nachweiszwecken, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen mit Verbindungen, die primäre und/oder sekundäre und/oder tertiäre Aminogruppen enthalten, zur Bildung von Carbamaten, die nachgewiesen werden können, oder mit Verbindungen, die Hydroxylgruppen enthalten, zur Bildung von Carbonaten, die nachgewiesen werden können, umgesetzt werden.

10. Intermediäre Anthrylalkohole, dadurch gekennzeichnet, daß sie die allgemeine Formel

besitzen, in der ein Rest R einen Alkylrest bedeutet und die anderen Wasserstoffatome darstellen, R&sub1; ein Wasserstoffatom, einen niederen Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, ein Halogenatom oder eine Nitrogruppe bedeutet, und n eine ganze Zahl von 1 bis 7 ist, wobei jedoch die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome in dem Rest -CHR-(CHR)n- 8 nicht übersteigt.