DE60316792T2

DE60316792T2 - Pharmazeutische verwendung von cox-2-hemmern in angiogenese-vermittelten augenerkrankungen

Info

Publication number: DE60316792T2
Application number: DE60316792T
Authority: DE
Inventors: Romulus Kimbro Alpharetta BRAZZELL; George N. Lambrou; Elisabeth Latour; Anna Ottlecz; Jeanette Marjorie Wood
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2002-01-23
Filing date: 2003-01-22
Publication date: 2008-07-24
Anticipated expiration: 2023-01-23
Also published as: DE60316792D1; CN1283240C; EP1503746B1; TW200302081A; GB0201520D0; BR0307013A; ES2291641T3; ATE375154T1; TWI280878B; CA2468811A1; EP1503746A1; PT1503746E; US20090247638A1; MY145266A; CA2468811C; CN1620288A; AR038198A1; JP2005515241A; US20120322874A1; US20050043410A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf selektive Cyclooxygenase-2 Inhibitoren (COX-2 Inhibitoren), und insbesondere auf die Verwendung von COX-2 Inhibitoren für die Behandlung von Augenkrankheiten, die von einer Angiogenese abhängen, wobei diese von Angiogenese mediierte Krankheit ausgewählt ist aus einer altersbedingten Makuladegneration, einer diabetischen Retinopathie und einem diabetischen Makulaödem.
COX-2 Inhibitoren und deren Verwendung als nicht steroidale antiinflammatorische Mittel (NSAIDs) zur Behandlung von antiinflammatorischen Zuständen und Schmerz sind technisch wohl bekannt. Weiter ist auch schon die Verwendung von COX-2 Inhibitoren vorgeschlagen worden, siehe beispielsweise US 6 025 353 A , zur Behandlung von Störungen, die von Angiogenese abhängen, unter Einschluss von ophthalmischen Zuständen, wie von Cornea-Graft-Rejektion, Augenneovaskularisation, Retinaneovaskularisation unter Einschluss einer Neovaskularisation nach einer Verletzung oder Infektion, diabetischer Retinopathie, Retrolentalfibrose und Neovaskularglaukom.
Es hat sich nun gezeigt, dass bestimmte COX-2 Inhibitoren, insbesondere 5-Alkyl-2-arylamino-phenylessigsäurederivate als COX-2 Inhibitoren wünschenswerte Eigenschaften zur Verwendung bei der Behandlung einer Augenneovaskularkrankheit haben.
Die Erfindung bezieht sich daher auf ein Verfahren zur Behandlung einer durch eine Angiogenese mediierten Augenstörung bei einem Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf, durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines COX-2 Inhibitors der Formel I
an den Patienten,
worin R für Methyl oder Ethyl steht,
R₁ für Chlor oder Fluor steht,
R₂ für Wasserstoff oder Fluor steht,
R₃ für Wasserstoff, Fluor, Chlor, Methyl, Ethyl, Methoxy, Ethoxy oder Hydroxy steht,
R₄ für Wasserstoff oder Fluor steht, und
R₅ für Chlor, Fluor, Trifluormethyl oder Methyl steht,
oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes oder Prodrugesters hiervon.
Weiter bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes oder Prodrugesters hiervon gemäß obiger Definition zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung einer durch eine Angiogenese mediierten Augenstörung, wobei diese von Angiogenese mediierte Krankheit ausgewählt ist aus einer altersbedingten Makuladegeneration, einer diabetischen Retinopathie und einem diabetischen Makulaödem.
Zu Augenstörungen, die durch eine Angiogenese mediiert werden und die erfindungsgemäß behandelt werden können, gehören Augenkrankheiten und Augenstörungen, bei denen direkt oder indirekt eine Angiogenese oder eine Neovaskularisation involviert ist, wie eine altersbedingte Makuladegeneration oder eine diabetische Retinopathie.
In der vorliegenden Beschreibung beziehen sich die Ausdrücke Behandlung oder behandeln sowohl auf eine prophylaktische oder präventive Behandlung als auch auf eine kurative oder die Krankheit modifizierende Behandlung unter Einschluss einer Behandlung von Patienten mit einem Risiko einer Kontraktion der Krankheit oder mit einem Verdacht auf eine Kontraktion der Krankheit und auch auf Patienten, die krank sind oder dahingehend diagnostiziert worden sind, dass sie an einer Krankheit oder einem medizinischen Zustand leiden.
Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel I sind solche, worin R für Methyl oder Ethyl steht, R₁ für Chlor oder Fluor steht, R₂ für Wasserstoff steht, R₃ für Wasserstoff, Fluor, Chlor, Methyl oder Hydroxy steht, R₄ für Wasserstoff steht und R₅ für Chlor, Fluor oder Methyl steht, und pharmazeutisch akzeptable Salze und Prodrugester hiervon.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft die Verbindungen der Formel I, worin R für Methyl oder Ethyl steht, R₁ für Fluor steht, R₂ für Wasserstoff steht, R₃ für Wasserstoff, Fluor oder Hydroxy steht, R₄ für Wasserstoff steht und R₅ für Chlor steht, und pharmazeutisch akzeptable Salze und Prodrugester hiervon.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung bezieht sich auf die Verbindungen der Formel I, worin R für Ethyl oder Methyl steht, R₁ für Fluor steht, R₂ für Wasserstoff oder Fluor steht, R₃ für Wasserstoff, Fluor, Ethoxy oder Hydroxy steht, R₄ für Wasserstoff oder Fluor steht und R₅ für Chlor, Fluor oder Methyl steht, und pharmazeutisch akzeptable Salze und Prodrugester hiervon.
Weiter sind die Verbindungen bevorzugt, worin R für Methyl oder Ethyl steht, R₁ für Fluor steht, R₂, R₃ und R₄ Wasserstoff oder Fluor sind, und R₅ für Chlor oder Fluor steht, und pharmazeutisch akzeptable Salze und Prodrugester hiervon.
Nach einer wiederum weiteren Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf die Verbindungen der Formel I, worin R für Methyl oder Ethyl steht, R₁ für Fluor steht, R₂ für Fluor steht, R₃ für Wasserstoff, Ethoxy oder Hydroxy steht, R₄ für Fluor steht und R₅ für Fluor steht, und pharmazeutisch akzeptable Salze und Prodrugester hiervon.
Nach einer wiederum anderen Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf die Verbindungen der Formel I, worin R für Methyl steht, R₁ für Fluor steht, R₂ für Wasserstoff steht, R₃ für Wasserstoff oder Fluor steht, R₄ für Wasserstoff steht, und R₅ für Chlor steht, und pharmazeutisch akzeptable Salze und Prodrugester hiervon.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung betreffen Verbindungen der Formel I, worin

(a) R für Methyl steht, R₁ für Fluor steht, R₂ für Wasserstoff steht, R₃ für Wasserstoff steht, R₄ für Wasserstoff steht, und R₅ für Chlor steht, und pharmazeutisch akzeptable Salze und Prodrugester hiervon,
(b) R für Methyl steht, R₁ für Fluor steht, R₂ für Wasserstoff steht, R₃ für Fluor steht, R₄ für Wasserstoff steht, und R₅ für Chlor steht, und pharmazeutisch akzeptable Salze und Prodrugester hiervon,
(c) R für Ethyl steht, R₁ für Fluor steht, R₂ für Fluor steht, R₃ für Wasserstoff steht, R₄ für Fluor steht, und R₅ für Fluor steht, und pharmazeutisch akzeptable Salze und Prodrugester hiervon, und
(d) R für Ethyl steht, R₁ für Chlor steht, R₂ für Wasserstoff steht, R₃ für Chlor steht, R₄ für Wasserstoff steht, und R₅ für Methyl steht, und pharmazeutisch akzeptable Salze und Prodrugester hiervon.

Als erfindungsgemäßer COX-2 Inhibitor wird am bevorzugtesten 5-Methyl-2-(2'-chlor-6'-fluoranilino)-phenylessigsäure oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder Prodrugester hiervon verwendet.
Pharmakologisch akzeptable Salze der Verbindung der Formel I sind vorzugsweise Salze mit Basen, bei denen es sich zweckmäßig um Metallsalze handelt, die aus den Gruppe Ia, Ib, IIa und IIb des Periodensystems der Elemente stammen, unter Einschluss von Alkalimetallsalzen, wie Kaliumsalzen und insbesondere Natriumsalzen, oder von Erdalkalimetallsalzen, vorzugsweise Salzen von Calcium oder Magnesium, und auch Ammoniumsalzen mit Ammoniak oder organischen Aminen.
Pharmazeutisch akzeptable Prodrugester der Verbindung der Formel I sind Esterderivate, die durch Solvolyse oder unter physiologischen Bedingungen in die freien Carbonsäuren der Formel I umgewandelt werden können. Solche Ester sind beispielsweise Niederalkylester, wie die Methylester oder Ethylester, Carboxyniederalkylester, wie der Carboxymethylester, Nitroxyniederalkylester, wie der 4-Nitroxybutylester, und dergleichen. Bevorzugte Prodrugs sind die Verbindungen der Formel Ia
worin R und R₁ bis R₅ wie oben für die Verbindung der Formel I definiert sind, und pharmazeutisch akzeptable Salze hiervon.
Verbindungen der Formel I und Ia und deren Synthesen werden beispielsweise beschrieben in WO 99 011 605 A und WO 01 023 346 A .
Die COX-2 Inhibitorverbindungen der Formel I und pharmazeutisch akzeptable Salze und Ester hiervon werden vorzugsweise in Form pharmazeutischer Zusammensetzungen verwendet, die eine wirksame Menge hiervon in Verbindung oder im Gemisch mit Exzipientien oder Trägern umfassen, und sich für eine enterale, parenterale oder topische Anwendung eignen. Zusätzlich können diese Zusammensetzungen auch andere therapeutisch wertvolle Substanzen enthalten. Die Zusammensetzungen können unter Anwendung herkömmlicher Verfahren zur Mischung, Granulation oder Beschichtung hergestellt werden und etwa 0,1 bis 90%, vorzugsweise etwa 1 bis 60%, Wirkstoff enthalten.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die Verbindungen der Formel I umfassen, können beispielsweise Zusammensetzungen sein, die sich enteral, wie oral, rektal, durch Inhalation oder nasal verabreichen lassen, Zusammensetzungen, die parenteral, wie intravenös oder subkutan, verabreicht werden können, Zusammensetzungen für eine transdermale Verabreichung, beispielsweise passiv oder iontophoretisch, oder Zusammensetzungen für eine topische Verabreichung.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche die Verbindungen der Formel I enthalten, sind vorzugsweise für eine orale oder topische Verabreichung ausgelegt.
Die jeweilige Verabreichungsart und die Dosierung können vom Durchschnittsfachmann ohne weiteres unter Beachtung der Besonderheiten des Patienten, insbesondere des Alters, Gewichts, Lebensstils, Aktivitätsgrads und dergleichen, ausgewählt werden.
Bevorzugte orale Formen sind Tabletten und Gelatinekapseln auf Basis des Wirkstoffs zusammen mit a) Verdünnungsmitteln, wie Lactose, Dextrose, Saccharose, Mannit, Sorbit, Cellulose und/oder Glycin, b) Gleitmittel, wie Siliciumdioxid, Talcum, Stearinsäure, Magnesium- und Calciumsalze hiervon und/oder Polyethylenglykol, für Tabletten auch c) Bindemittel, wie Magnesiumaluminiumsilicat, Stärkepaste, Gelatine, Tragacanth, Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon, gewünschtenfalls d) Desintegrantien, wie Stärken, Agar, Alginsäure oder deren Natriumsalz, oder Brausegemische, und/oder e) Absorbentien, Farbstoffe, Aromastoffe und Süßungsmittel. Die Tabletten können unter Anwendung bekannter Verfahren entweder mit Filmüberzügen oder mit enterischen Überzügen versehen sein.
Geeignete injizierbare Zusammensetzungen sind wässrige isotonische Lösungen oder Suspensionen und auch Suppositorien, die zweckmäßig aus Fettemulsionen oder Fettsuspensionen hergestellt werden. Solche Zusammensetzungen können sterilisiert sein und/oder Adjuvantien enthalten, wie Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Netzmittel oder Emulgiermittel, Lösungspromotoren, Salze zur Regulierung des osmotischen Drucks und/oder Puffer.
Geeignete Formulierungen für eine transdermale Anwendung enthalten eine wirksame Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung zusammen mit einem Träger. Zu geeigneten Trägern gehören unter anderem absorbierbare pharmakologisch akzeptable Lösemittel, die eine Passage durch die Haut des Wirts unterstützen. Transdermale Vorrichtungen haben beispielsweise die Form einer Bandage aus einer Unterlage, eines die Verbindung enthaltenden Reservoirs, optional zusammen mit Trägern, und optional einer Sperre zur Mengenkontrolle zwecks Versorgung der Haut des Wirts mit der Verbindung in einer kontrollierten und vorbestimmten Menge während einer längeren Zeitdauer, und Mittel zur Sicherung der Vorrichtung auf der Haut.
Zu bevorzugten Formulierungen für eine topische Anwendung, beispielsweise auf die Haut oder die Augen, gehören wässrige Lösungen, Suspensionen, Salben, Cremes, Gele und Sprühformulierungen, beispielsweise zur Freigabe über ein Aerosol oder dergleichen. Solche topischen Formulierungen enthalten typisch etwa 0,1 bis etwa 50 Gew.-%, vorzugsweise etwa 1 bis 20 Gew.-%, einer COX-2 Inhibitorverbindung.
Die Dosierung des zu verabreichenden COX-2 Inhibitors ist abhängig vom Patienten, dem Körpergewicht, dem Alter und dem jeweiligen Zustand, und von der Form der Verabreichung. Eine Einheitsdosis für eine orale Verabreichung an einen Säuger mit einem Gewicht von etwa 50 bis 70 kg kann etwa 5 bis 2000 mg, beispielsweise 100 bis 800 mg, vorzugsweise 200 bis 400 mg, Wirkstoff enthalten. Ist der COX-2 Inhibitor 5-Methyl-2-(2'-chlor-6'-fluoranilino)-phenylessigsäure oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz hiervon, dann bewegt sich eine geeignete Dosis im Bereich von 100 bis 1500 mg an 5-Methyl-2-(2'-chlor-6'- fluoranilino)-phenylessigsäure, beispielsweise von 200 bis 1000 mg/Tag, wie 200, 400, 500, 600, 800, 900 oder 1000 mg/Tag, und zwar bei Verabreichung von ein oder zwei Dosen täglich.
Parenterale Formulierungen sind speziell injizierbare Flüssigkeiten, die in verschiedener Weise wirksam sind, wie intravenös, intramusklär, intraperitoneal, intranasal, intradermal oder subcutan.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die Verbindungen der Formel I enthalten, für eine erfindungsgemäße Anwendung werden normalerweise in Form einer Verpackung geliefert, welche die Zusammensetzung enthält, beispielsweise als eine Einzeldosis oder als multiple Dosen hiervon, oder als ein Reservoir der Zusammensetzung für eine wiederholte Anwendung, beispielsweise eine topische Anwendung, zusammen mit schriftlichen Instruktionen oder sonstigen Indikationen, beispielsweise einer Packungsbeilage, zwecks Verwendung bei der Behandlung einer durch eine Angiogenese mediierten Augenstörung.
Die Verbindungen der Formel I können auch zusammen mit anderen antiangiogenetischen Mitteln verabreicht werden, wozu unter anderem Bisphosphonate, wie Ibandronat, Alendronat oder Zoledronat und Salze und Ester hiervon, als EGFR Antagonisten gehören.
Zu bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gehören die oben beschriebenen Anwendungen, worin die Verbindung der Formel (I), insbesondere 5-Methyl-2-(2'-chlor-6'-fluoranilino)-phenylessigsäure, pharmazeutisch akzeptable Salze hiervon oder pharmazeutisch akzeptable Prodrugester hiervon, in Form einer oralen Zusammensetzung vorliegt, wobei die durch eine Angiogenese mediierte Augenstörung ausgewählt ist aus einer altersbedingten Makuladegeneration, einer diabetischen Retinopathie und einem diabetischen Makulaödem, und bevorzugter aus einer altersbedingten Makuladegeneration und einer diabetischen Retinopathie.
Die antiangiogenetischen Eigenschaften der Verbindung der Formel I am Auge können unter Anwendung geeigneter Verfahren und Tiermodelle gezeigt werden, wie sie beispielsweise im Folgenden beschrieben werden.
Wirkstoffbehandlungen von Mäusen mit ischämischer Retinopathie
Eine ischämische Retinopathie bei C57/BL6J Mäusen wird durch das folgende Verfahren eingeleitet.
Mäuse mit einem Alter von sieben Tagen werden zusammen mit ihren Müttern in einen luftdichten Inkubator gegeben und darin während 5 Tagen einer Atmosphäre von 75 ± 3% Sauerstoff ausgesetzt. Die Inkubatortemperatur beträgt 23 ± 2°C, und der Gehalt an Sauerstoff wird alle 8 h mit einem Sauerstoffanalysator gemessen. Nach 5 Tagen werden die Mäuse aus dem Inkubator entfernt und in Raumluft gebracht, wobei mit der Behandlung mit einem COX-2 Inhibitor begonnen wird. Die Wirkstoffe werden in mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder in 1% Dimethylsulfoxid verdünnt, und zwar in Abhängigkeit von ihren Löslichkeitscharakteristiken, und werden dann mit PBS auf ihre Endkonzentration gebracht.
Ein Vehikel (Kontrolle) oder ein Vehikel, das verschiedene Konzentrationen an Wirkstoff enthält (Volumen = 50 μl in Neonaten und 100 μl bei erwachsenen Mäusen), werden mittels eines Magenschlauchs in den Magen gebracht. Nach einer 5-tägigen Behandlung mit P17 werden die Mäuse getötet, worauf rasch ihre Augen entfernt und bei einer optimalen Schneidtemperatur in eine Einbettverbindung eingefroren werden (OCT, Miles Diagnostics, Elkhart, IN) oder werden in 10%igem und mit Phosphat gepuffertem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Erwachsene C57BL6J Mäuse werden ebenfalls mittels einer Magensonde mit Wirkstoff oder Vehikel behandelt und nach 5 Tagen wiederum getötet, wobei auch hier eine rasche Entfernung ihrer Augen unter anschließender Einfrierung oder Herstellung von Paraffinsektionen erfolgt.
Quantifizierung einer Retinaneovaskularisation
Eingefrorene Sektionen (10 μm) der Augen von mit Wirkstoff behandelten Mäusen und Kontrollmäusen werden histochemisch mit biotinyliertem Griffonia simplicifolia Lectin B4 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) angefärbt, welches selektiv an Endothelzellen bindet. Die Objektträger werden in Ethanol/H₂O₂ während 30 min bei 4°C inkubiert, worauf sie mit 0,05 M TBS gewaschen und während 30 min in 10%igem normalem Schweineserum inkubiert werden. Die Objektträger werden mit 0,05 M Tris-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,6 (TBS) gespült und während 2 h bei Raumtemperatur mit biotinyliertem Lectin inkubiert. Nach Spülung mit 0,05 M TBS werden die Objektträger mit Avidin, das an Peroxidase gekoppelt ist (Vector Laboratories) während 45 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem Waschen während 10 min mit 0,05 M TBS werden die Objektträger mit Diaminobenzidin inkubiert, wodurch ein braunes Reaktionsprodukt entsteht. Einige Objektträger werden mit Hematoxyl gegenangefärbt, und es werden alle Objektträger mit Cytoseal festgelegt.
Zwecks Durchführung quantitativer Zuordnungen werden 10 μm Seriensektionen durch die gesamte Erstreckung eines jeden Auges geschnitten. Das Gesamtauge wird durch Anfärbung von Sektionen, die etwa 50 bis 60 μm voneinander entfernt sind, gesammelt, wodurch sich 13 Sektionen pro Auge für eine Analyse ergeben. Die mit Lectin angefärbten Sektionen werden mit einem Axioskop Mikroskop (Zeiss, Thornwood, NY) geprüft, wobei Abbildungen unter Verwendung einer 3 CCD Farbvideokamera (IK-TU40A, Toshiba, Tokyo, Japan) und einer Bildfangschaltung digitalisiert werden. Zur Darstellung der mit Lectin angefärbten Zellen auf der Oberfläche der Retina wird eine Image-Pro Plus Software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) verwendet, wobei deren Fläche gemessen wird. Als ein einzelner Versuchswert wird das Mittel aus den 13 Messungen bei jedem Auge verwendet.
Wirkstoffbehandlung von Mäusen während einer Retinavaskularentwicklung
Würfe von neugeborenen C57/BL6J Mäusen werden in Behandlungsgruppen und Kontrollgruppen aufgeteilt, die täglich subkutane Injektionen von 10 mg/kg Wirkstoff oder Vehikel erhalten. Bei P7 oder P10 werden die Mäuse mit Ether anästhesiert und mit 1 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung perfusiert, die 50 mg/ml mit Fluorescein markiertes Dextran (mit einem mittleren Molekulargewicht von 2 × 10⁶ von Sigma, St. Louis, MO) enthalten. Die Augen werden entfernt und während 1 h in 10%igem Phosphat gepufferten Formalin fixiert. Die Cornea und die Linsen werden entfernt, und die gesamte Retina wird vorsichtig von der Augenkappe dissektiert, vom Rand der Retina zum Äquator in alle vier Quadranten radial geschnitten und flach in Aquamount mit nach oben weisenden Photorezeptoren montiert. Die Flachmontagen werden durch Fluoreszenzmikroskopie geprüft, wobei Abbildungen unter Verwendung einer 3 CCD Farbvideokamera (IK-TU40A, Toshiba, Tokyo, Japan) und einer Bildfangschaltung digitalisiert werden. Die Messung des Abstands vom Zentrum des optischen Nervs zur Führungsfront entwickelnder Retinagefäße in jedem Quadranten wird unter Verwendung einer Image-Pro Plus Software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) vorgenommen, wobei der Mittelwert als ein einzelner Versuchswert verwendet wird.
Wirkstoffbehandlung von Mäusen mit einer Choroideaneovaskularisation
Die Bildung einer Choroideaneovaskularisation erfolgt durch Modifikation einer vorher beschriebenen Technik. Kurz gesagt werden hierzu 4 bis 5 Wochen alte männliche C57BL/6J Mäuse mit Ketaminhydrochlorid (100 mg/kg Körpergewicht) anästhesiert, und die Pupillen mit 1% Tropicamid dilatiert. Auf jede Retina werden drei Brennpunkte einer Kryptonlaserphotocoagulation abgegeben (100 μm Größe, 0,1 s Dauer, 150 mW) und zwar unter Verwendung des Schlitzlampenabgabesystems eines kohärenten Photocoagulators Modell 920 und eines von Hand gehaltenen Abdeckobjektträgers als eine Kontaktlinse. Brennpunkte werden in den Uhrzeigerstellungen 9, 12 und 3 des posterioren Pols der Retina angeordnet. Die Bildung einer Blase zum Zeitpunkt der Laserbehandlung, welche eine Ruptur der Bruch-Membran anzeigt, ist ein zum Erhalt einer CNV wichtiger Faktor, so dass nur Mäuse, bei denen bei allen drei Brennungen Blasen gebildet werden, in diese Studie einbezogen werden. 10 Mäuse werden willkürlich einer Behandlung mit Vehikel allein zugeordnet, während weitere 10 Mäuse oral über eine Magensonde ein Vehikel erhalten, das 120 μmol/kg/Tag eines der zu testenden Wirkstoffe enthält. Nach 14 Tagen werden die Mäuse mit einer Überdosis an Pentobarbitalnatrium getötet, worauf ihre Augen rasch entfernt und bei einer optimalen Schneidtemperatur in eine Einbettverbindung eingefroren werden.
Quantifizierung einer Choroideaneovaskularisation
Eingefrorene Seriensektionen (10 μm) werden durch ihre gesamte Erstreckung eines jeden Brennpunkts aufgeschnitten und histochemisch mit einem biotinylierten Griffonia simplicifolia Lectin B4 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) angefärbt, welches selektiv an Endothelzellen endet. Objektträger werden während 30 min bei 4°C in Methanol/H₂O₂ inkubiert, mit 0,05 M TBS gewaschen und dann während 30 min mit 10%igem normalem Schweinserum inkubiert. Die Objektträger werden mit 0,05 M TBS gespült und 2 h bei 37°C mit biotinyliertem Lectin inkubiert. Nach einer Spülung mit 0,05 M TBS werden die Objektträger 30 min bei Raumtemperatur mit Streptavidinphosphatase (Kirkegaard and Perry Laboratories, Cabin John, MD) inkubiert. Nach einem Waschen während 10 min in 0,05 M Tris Puffer vom pH 7,6 werden die Objektträger in Histomark Red (Kirkegaard and Perry) unter Bildung eines roten Reaktionsprodukts entwickelt und mit Cytoseal (Stephens Scientific, Riverdale, NJ) montiert. Einige Objektträger werden mit Contrast Blue (Kirkegaard and Perry) gegenangefärbt.
Zur Durchführung quantitativer Bewertungen werden mit Lectin angefärbte Sektionen mit einem Axioskop Mikroskop (Zeiss, Thornwood, NY) geprüft und Abbilder unter Verwendung einer 3 CCD Farbvideokamera (IK-TU40A, Toshiba, Tokyo, Japan) und einer Bildfangschaltung digitalisiert. Zur Dislineation und Messung der Fläche der mit Lectin angefärbten Blutgefäße im subretinalen Raum wird eine Software Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) verwendet. Für jede Läsion werden Messungen für alle Sektionen gemacht, auf denen eine gewisse Läsion erscheint, und miteinander addiert, wodurch man zu einer integrierten Flächenmessung gelangt. Die dabei erhaltenen Werte werden gemittelt, so dass sich ein experimenteller Wert pro Maus ergibt. Es wird auch ein aus zwei Proben bestehender t-Test für ungleiche Abweichungen erstellt, um hierdurch einen Vergleich des logarithmischen Mittels der integrierten Fläche zwischen einer behandelten Maus und einer Vergleichsmaus zu bekommen.
Die Verbindungen der Formel I inhibieren eine Augenangiogenese, wenn sie nach den oben beschriebenen Modellen getestet werden.
Die Erfindung soll nun anhand der folgenden Beispiele illustriert werden.
Beispiele
A. Formulierungsbeispiele
Beispiel 1

Tabelle 1

Bestandteil	Mengen auf 200 mg Tablettenansatz (kg)
Kern
Granulation
5-Methyl-2-(2'-chlor-6'-fluoranilino)phenylessigsäure als Wirkstoff	50**
Mikrokristalline Cellulose, NF (PH 101)	12,85
Lactosemonohydrat, NF	11,65
Croscarmellosenatrium, NF	1
Povidon, USP	4
Titandioxid, USP	2
Gereinigtes Wasser***, USP	20,375
Extragranulare Phase
Mikrokristalline Cellulose, NF (PH 102)	13
Croscarmellosenatrium, NF	3
Titandioxid, USP	2
Magnesiumstearat, NF	0,5
Beschichtung
Opadry weiß	2,801****
Opadry gelb	2,0****
Opadry rot	0,4****
Opadry schwarz	0,0504****
Gereinigtes Wasser***, USP	29,758****

** Das Gewicht des Wirkstoffs bezieht sich auf die Trockensubstanz (100%) auf Basis des Assaywerts (Faktorisierung). Der Gewichtsunterschied wird eingestellt durch die Menge an verwendeter mikrokristalliner Cellulose.
*** Entfernung während der Verarbeitung.
**** Einschließlich eines 50%igen Überschusses für einen Verlust während des Beschichtungsverfahrens.

Die obige Tabelle 1 zeigt die Formulierung für einen Ansatz von etwa 250000 unmittelbar freisetzenden filmbeschichteten Tabletten mit 5-Methyl-2-(2'-chlor-6'-fluoranilino)-phenylessigsäure. Zur Herstellung dieser Tabletten wird Titandioxid in Wasser dispergiert, worauf Povidon zugegeben und 20 min vermischt wird, um so eine Suspension von Povidon und Titandioxid zu bilden. Der Wirkstoff, die Lactose, die mikrokristalline Cellulose und die Croscarmellose werden während 5 min unter Bildung eines Wirkstoffgemisches in einem Hochleistungsmischer, beispielsweise einem Collette Gral, vermischt. Das Wirkstoffgemisch wird in einem Hochleistungsmischer mit der Suspension von Povidon und Titandioxid granuliert. Die Suspension wird mit einer Geschwindigkeit von 3 kg/min in das Wirkstoffgemisch gepumpt. Nach Zugabe der gesamten Suspension wird das erhaltene Gemisch weitere 90 s gemischt. Die nasse Granulation wird in einem Fließbetttrockner unter einer Lufteinlasstemperatur von 50°C getrocknet. Die angestrebte Restwassermenge beträgt 3,5% (mit einem Zulässlichkeitsbereich von 2,5 bis 4,5%). Die getrocknete Granulation wird unter Verwendung einer Mühle (Oszillator) und eines Siebs mit 30 Maschen gesiebt. Die vorherigen Stufen werden zur Herstellung einer zweiten Granulation wiederholt.
Die extragranulare Phase Titandioxid wird durch ein Handsieb mit 60 Maschen geführt. Die trockenen Granulationen werden mit der extragranularen Phase mikrokristalline Cellulose, Croscarmellosenatrium und Titandioxid in einem Doppelschalenmischer während 300 Umdrehungen unter Bildung eines vorletzten Gemisches vermischt. Das Magnesiumstearat wird durch ein Handsieb mit 60 Maschen geführt und dann mit dem vorletzten Gemisch in einem Doppelschalenmischer für 50 Umdrehungen unter Bildung einer Tablettenmischung vermischt. Die Tablettenmischung wird unter Verwendung einer Tablettenpresse und ovaler Stempel zu Tabletten verpresst.
Die Beschichtungspulver (Opadry) werden zur Herstellung einer Beschichtungssuspension mit einer 15%igen (Gew./Gew.) mit gereinigtem Wasser vermischt. Sodann werden die Tabletten in einer Beschichtungspfanne unter Anwendung einer Lufteinlasstemperatur von 60°C bis 75°C einer Filmbeschichtung unterzogen.

In der folgenden Tabelle 2 werden die Inhaltsstoffe einer 200 mg 5-Methyl-2-(2'-chlor-6'-fluoranilino)phenylessigsäure enthaltenden filmbeschichteten Tablette beschrieben. Tabelle 2

Bestandteil	Theoretische Mengen (mg)	Funktion
Kern
5-Methyl-2-(2'-chlor-6'-fluoranilino)-phenylessigsäure als Wirkstoff	200	Wirkstoff
Mikrokristalline Cellulose (PH 101)	51,4	Füllstoff
Lactose	46,6	Füllstoff
Povidon	16	Bindemittel
Titandioxid	8	Farbstoff
Croscarmellosenatrium	4	Desintegrator
Gereinigtes Wasser*	q. s.	Granulationsflüssigkeit
Extragranulare Phase
Mikrokristalline Cellulose (PH 102)	52	Füllstoff
Croscarmellosenatrium	12	Desintegrator
Titandioxid	8	Farbstoff
Magnesiumstearat	2	Gleitmittel
Kerngewicht	400
Beschichtung
Opadry weiß (00F18296)	7,4676	Farbstoff
Opadry gelb (00F12951)	5,3312	Farbstoff
Opadry rot (00F15613)	1,0668	Farbstoff
Opadry schwarz (00F17713)	0,1344	Farbstoff
Gereinigtes Wasser*	q. s.	Beschichtungslösemittel
Gesamtgewicht	414

* Entfernung während der Verarbeitung.

Zusätzlich können die Tablettenformulierungen auch 5-Methyl-2-(2'-chlor-6'-fluoranilino)-benzylalkohol und/oder 5-Methyl-2-(2'-chlor-6'-fluoranilino)-benzoesäure in einer Menge zwischen etwa 0,01 und 2 Gew.-%, spezieller zwischen etwa 0,1 und 1 Gew.-%, enthalten.
Beispiel 2

Die folgende Tabelle 3 zeigt eine andere Formulierung mit einer Information über die Prozentmengen in Gew./Gew., die Menge in mg/Dosis und die Menge an kg/50000 Tabletten Ansatz. Tabelle 3 Andere Formulierungszusammensetzung

% Gew./Gew.	Bestandteil	mg/Dosis	kg/Ansatz
	Granulation
65,04	5-Methyl-2-(2'-chlor-6'-fluoranilino)-phenylessigsäure als Wirkstoff	400,00	20,00
2,15	Croscarmellosenatrium, NF (Ac-Di-Sol)	13,22	0,661
6,60	Povidon K30, USP	40,59	2,029
18,12	Gereinigtes Wasser, USP*	q. s.	q. s.
	Vermischung
23,56	Mikrokristalline Cellulose, NF (Avicel PH 102)	144,90	6,066
2,15	Croscarmellosenatrium, NF (Ac-Di-Sol)	13,22	0,553
0,50	Magnesiumstearat, NF (pflanzliche Herkunft)	3,07	0,128
	Filmbeschichtung
84,46	Opadry, Global Weiß 00F18296	15,2028	0,296637
14,03	Opadry, Global Rot 00F15613	2,5254	0,049275
1,51	Opadry, Global Schwarz 00F17713	0,2718	0,005303
	Gereinigtes Wasser, UVP*	q. s.	1,990218
	Gewicht der filmbeschichteten Tablette	633,00

* Erscheint nicht im Endprodukt. Prozent an zur Granulation zugesetztem Wasser, bezogen auf das Trockengewicht von Wirkstoff und Croscarmellosenatrium.

Der Ansatz wird wie im Beispiel 1 beschrieben granuliert. Die Granulation wird auf eine Restfeuchtigkeit (% LCD) von 1,79% getrocknet. Das Formulierungsverfahren ist gleich wie das für die Entwicklung der oben beschriebenen Ansätze mit Ausnahme der weiteren Stufe einer Beschichtung mit Opadry in einer Beschichtungspfanne. Die Beschichtungspulver (Opadry) werden derart mit gereinigtem Wasser versetzt, dass sich eine Beschichtungssuspension von 15% Gew./Gew. ergibt. Hierauf werden die Tabletten einer Filmbeschichtung mit der Beschichtungssuspension in einer Beschichtungspfanne unter einer Lufteinlasstemperatur von 60°C bis 75°C unterzogen. Auf Basis von Brüchigkeitsdaten wird eine Zielkraft von 18 kN – Bereich 16 bis 20 kN – angewandt, um den Rest des Ansatzes so zu komprimieren, dass sich eine akzeptable Brüchigkeit – weniger als 0,5% – und Desintegrationszeiten von weniger als 5 min ergeben. Die Ejektionskraft beträgt etwa 800 N während des gesamten Kompressionsvorgangs. Dies zeigt, dass das Gemisch ausreichend geschmiert ist. Es lässt sich weder ein Haften noch Kleben auf den Oberflächen des Stempels nach 225 min feststellen. Somit ergeben sich kleinere Tabletten mit einer hohen Wirkstoffbeladung (65%) unter Anwendung eines Hochleistungsgranulationsverfahrens und Verwendung eines ovalen Werkzeugs mit den Abmessungen 17 × 6,7 mm, wobei die dabei erhaltenen Tabletten über akzeptable Härte- und Brüchigkeitscharakteristiken verfügen.
Zusätzlich können die Tablettenformulierungen auch einen 5-Methyl-2-(2'-chlor-6'-fluoranilino)-benzylalkohol und/oder eine 5-Methyl-2-(2'-chlor-6'-fluoranilino)-benzoesäure in einer Menge zwischen etwa 0,01 und 2 Gew.-%, spezieller zwischen etwa 0,1 und 1 Gew.-%, enthalten.
Beispiel 3

Nass granulierte Tablettenzusammensetzung

Menge pro Tablette in mg	Bestandteil
25	COX-2 Inhibitor
79,7	Mikrokristalline Cellulose
79,7	Lactosemonohydrat
6	Hydroxypropylcellulose
8	Croscarmellosenatrium
0,6	Eisenoxid
1	Magnesiumstearat

Durch Veränderung des Gesamtgewichts und des Verhältnisses der ersten drei Bestandteile können Tabletten mit Dosierungsstärken zwischen 5 und 125 mg erhalten werden. Das Verhältnis von mikrokristalliner Cellulose zu Lactosemonohydrat wird im Allgemeinen vorzugsweise auf 1:1 gehalten.
Beispiel 4
Direkt verpresste Tablettenzusammensetzung

Menge pro Tablette in mg Bestandteil

25 COX-2 Inhibitor

106,9 Mikrokristalline Cellulose

106,9 Lactoseanhydrat

7,5 Croscarmellosenatrium

3,7 Magnesiumstearat
Durch Veränderung des Gesamtgewichts der Tablette und des Verhältnisses der ersten drei Bestandteile können Tabletten mit Dosierungsstärken zwischen 5 und 125 mg erhalten werden. Das Verhältnis von mikrokristalliner Cellulose zu Lactosemonohydrat wird im Allgemeinen vorzugsweise auf 1:1 gehalten.
Beispiel 5
Hartgelatinekapselzusammensetzung

Menge pro Kapsel in mg Bestandteil

25 COX-2 Inhibitor

37 Mikrokristalline Cellulose

37 Lactoseanhydrat

1 Magensiumstearat

1 Kapsel Hartgelatinekapsel
Durch Veränderung des gesamten Füllgewichts und des Verhältnisses der ersten drei Bestandteile können Kapseln mit Dosierungsstärken zwischen 1 und 50 mg erhalten werden. Das Verhältnis von mikrokristalliner Cellulose zu Lactosemonohydrat wird im Allgemeinen vorzugsweise auf 1:1 gehalten. Beispiel 6 Orale Lösung

Menge in mg pro 5 ml Dosis Bestandteil

50 COX-2 Inhibitor

Auffüllung auf 5 ml mit Polyethylenoxid 400
Beispiel 7

Orale Suspension

Menge in mg pro 5 ml Dosis	Bestandteil
101	COX-2 Inhibitor
150	Polyvinylpyrrolidon
Orale Suspension
Menge in mg pro 5 ml Dosis	Bestandteil
2,5	Polyoxyethylensorbitanmonolaurat
10	Benzoesäure
Auffüllung auf 5 ml mit	Sorbitlösung (70%)

Durch Veränderung des Verhältnisses der ersten beiden Bestandteile können Suspensionen mit Dosierungsstärken zwischen 1 und 50 mg pro 5 ml erhalten werden. Beispiel 8 Intravenöse Infusion

Bestandteil in mg pro 200 ml Dosis Bestandteil

1 COX-2 Inhibitor

0,2 Polyethylenoxid 400

1,8 Natriumchlorid

Auffüllung auf 200 ml mit gereinigtem Wasser

Claims

Verwendung einer Verbindung der Formel I
worin R für Methyl oder Ethyl steht, R₁ für Chlor oder Fluor steht, R₂ für Wasserstoff oder Fluor steht, R₃ für Wasserstoff, Fluor, Chlor, Methyl, Ethyl, Methoxy, Ethoxy oder Hydroxy steht, R₄ für Wasserstoff oder Fluor steht, und R₅ für Chlor, Fluor, Trifluormethyl oder Methyl steht, oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes oder Prodrugesters hiervon, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung einer durch eine Angiogenese mediierten Augenstörung, worin die durch eine Angiogenese mediierte Augenstörung ausgewählt ist aus einer altersbedingten Makuladegeneration, einer diabetischen Retinopathie und einem diabetischen Makulaödem.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Verbindung der Formel 15-Methyl-2-(2-chlor-6-fluoranilino)-phenylessigsäure oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz hiervon oder ein pharmazeutisch akzeptabler Prodrugester hiervon ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Verbindung der Formel I in der Form einer oralen Zusammensetzung vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Verbindung der Formel I in der Form einer topischen Zusammensetzung vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die durch eine Angiogenese mediierte Augenstörung ausgewählt ist aus einer altersbedingten Makuladegeneration und einer diabetischen Retinopathie.