DE60313972T2

DE60313972T2 - Blutuntersuchungsmethode zur Früherkennung von Krankeiten wie z.B: Diabetes

Info

Publication number: DE60313972T2
Application number: DE2003613972
Authority: DE
Inventors: Noboru Horiguchi; Hiroshi Horiguchi
Original assignee: Horiguchi Noboru Sakaide
Current assignee: Horiguchi Noboru Sakaide
Priority date: 2003-10-07
Filing date: 2003-10-07
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2023-10-08
Also published as: DE60313972D1

Description

Diese Erfindung betrifft ein Bluttestverfahren zur frühen Erkennung von Erkrankungen.
Biochemische Analyse einer Körperflüssigkeit, wie zum Beispiel Blut, wird für die Diagnose von verschiedenen Erkrankungen in vielen Krankenhäusern derzeit zunehmend durchgeführt. Im Falle der Diagnose von Diabetes werden beispielsweise Blutproben vor und nach einer Mahlzeit allgemein auf die Konzentration von Glukose darin analysiert.
Glukose ist eine Quelle für Energie für menschliche Körperzellen und wird aus der Leber in das Blut freigesetzt. In einem gesunden Individuum sind die Freisetzung von Glukose aus der Leber und der Verbrauch von Glukose in den Zellen ausgeglichen, so dass der Blutglukosegehalt bei etwa 110 mg/dl oder weniger gehalten wird. Insulin ist ein Hormon, das aus der Bauchspeicheldrüse ausgeschieden wird und für den menschlichen Körper notwendig ist, um Zucker, Stärke und andere Lebensmittel korrekt zu einer zellulären Energiequelle umzusetzen. Wenn Stärke im Dünndarm verdaut wird, steigt der im Blut vorhandene Glukosegehalt. Ein solcher Anstieg im Blutglukosegehalt stimuliert erhöhte Sekretion von Insulin, so dass die Leber das Freisetzen der Glukose stoppt. Bei intrazellulärer Verwendung der Glukose verringert sich die Blutglukose auf den normalen Wert. Ein solcher Anstieg und Abfall des Blutglukosewertes wird jedes Mal wiederholt, wenn ein gesundes Individuum Speisen aufnimmt.
Einige Individuen sind unfähig, schnell oder ausreichend Insulin auszuscheiden, auch wenn ihr Blutglukosegehalt nach einer Mahlzeit ansteigt. Wenn unzureichende Bewegung und übermäßige Nahrungsaufnahme zu diesem Zustand hinzukommen, verbleibt Glukose übermäßig im Blut, so dass der Blutglukosegehalt sogar nach einigen Stunden nach Einnahme einer Mahlzeit nicht absinkt.
In der herkömmlichen biochemischen Analyse wird der Blutglukosegehalt durch Isolation von Plasma aus Blutproben gemessen, die vor und nach Mahlzeiten genommen werden. Wenn die Glukosekonzentration in einer Plasmaprobe, die bei einem Zustand mit leerem Magen genommen wurde, größer als 140 mg/dl ist, oder wenn die Glukosekonzentration in einer Plasmaprobe, die direkt nach einer Mahlzeit genommen wurde, größer als 200 mg/dl ist, dann wird bei ihm oder ihr eine Diabetes (Typ-2-Diabetes) diagnostiziert. Ein hoher Glukosegehalt, wenn er für einen längeren Zeitraum fortdauert, wird Probleme mit Herz, Kreislauf, Auge und Niere verursachen.
Es gibt verschiedene Berichte betreffend Symptome von Herzinfarkt bei Individuen, deren Blutglukosegehalte für nicht ausreichend hoch genug gefunden wurden, wenn sie mit dem herkömmlichen Plasmatestverfahren gemessen wurden. Es wurde nämlich gefunden, dass Arteriosklerose sogar bei Vordiabetes fortschreitet. Insbesondere Individuen, deren Insulinausschüttung langsam ist, erleiden wahrscheinlich Arteriosklerose, wenn sie mit einer oder mehreren Bedingungen von der milden Typ-2-Diabets, leichtem Übergewicht, milder Hyperlipidemie und leichter Hyperinsulinemie zusammentreffen. Die herkömmlichen Bluttestverfahren, bei denen Plasma einer Blutprobe auf die Konzentration von Glukose gemessen wird, sind nicht wirksam für die frühe Erkennung von Diabetes. Demzufolge besteht eine dringende Nachfrage für ein diagnostisches Verfahren, das dazu fähig ist, Diabetes und andere Erkrankungen sogar in ihren frühen Stufen präzise zu erkennen.
Mit den herkömmlichen Bluttestverfahren, bei denen Plasma einer Blutprobe auf Bestandteile, wie zum Beispiel Glukose und Milchsäure getestet wird, repräsentieren die gemessenen Werte lediglich solche der Komponenten, die aus den Blutzellen in das Plasma abgesondert und freigesetzt werden. Es wurde gefunden, dass es wichtig ist, um Diabetes oder andere Erkrankungen in ihren frühen Stufen zu erkennen, dass Komponenten, die in roten Blutzellen enthalten sind, gemessen werden sollten. Da rote Blutzellen metabolische Funktionen haben, um Glukose zu zersetzen und vorhergehend die Glukosekonzentration in dem Plasma kontrollieren, ist es nämlich effektiv, den Glukosegehalt in den roten Blutzellen für die frühe Erkennung von Diabetes zu kennen. Weiterhin wurde gefunden, dass das Oxidations-Reduktions-Potential in den Blutzellen und die Konzentrationen von Brenztrauben- und Milchsäure, welche Metabolite von Glukose sind, wichtige Parameter für das frühe Erkennen von verschiedenen Erkrankungen sind.
Dokument US-A-4 142 857 beschreibt ein Bluttestverfahren, aufweisend die Schritte des Abtrennens von roten Blutzellen aus Vollblut (Buffy-Coat-Abtrennung), lysieren der roten Blutzellen, Zentrifugieren und letztendlich Bestimmen der Menge an (glykosylierten) Hämoglobinspezies in dem Überstand.
Die vorliegende Erfindung wurde im Hinblick auf die Probleme der herkömmlichen Bluttestverfahren durchgeführt.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird ein Bluttestverfahren zur Verfügung gestellt, aufweisend die Schritte:

(a) Zentrifugieren einer Säugetierblutprobe zu Plasma und Blutzellen,
(b) Entfernen der Buffy-Coats von den genannten Blutzellen, um rote Blutzellen zu erhalten, die gelöste Stoffe, die darin eingeschlossen sind, enthalten,
(c) Waschen der genannten roten Blutzellen mit einer gepufferten physiologischen Kochsalzlösung und Isolieren der genannten gewaschenen Blutzellen,
(d) Mischen der genannten gewaschenen roten Blutzellen mit einer gepufferten physiologischen Kochsalzlösung, um eine suspendierte Flüssigkeit zu erhalten,
(e) Zentrifugieren der genannten suspendierten Flüssigkeit, um einen Überstand zu entfernen und eine Schicht aus roten Blutzellen zu erhalten,
(f) Mischen der genannten Schicht an roten Blutzellen mit einer hypertonischen Lösung und halten der resultierenden Suspension bei einer Temperatur von 25 bis 40°C für einen Zeitraum der ausreicht, dass die in den roten Blutzellen eingeschlossenen gelösten Stoffe in die hypertonische Lösung penetrieren,
(g) Zentrifugieren der Suspension, um einen Überstand zu erhalten, der die gelösten Stoffe enthält und
(h) Messen des Überstandes auf zumindest einen Faktor, ausgewählt aus einer Glukosekonzentration, einer Brenztraubensäurekonzentration, einer Milchsäurekonzentration und einem Oxidations-Reduktions-Potential.

Die vorliegende Erfindung wird in größerem Detail unten mit Bezugnahme auf die begleitende Zeichnung beschrieben, wobei:
1 ein Beispiel für eine Arbeitskurve für die Bestimmung eines Oxidations-Reduktions-Potentials ist.
Ein Bluttestverfahren gemäß vorliegender Erfindung weist die folgenden Schritte (a)–(h) auf.
Schritt (a):
Eine Probe Säugetierblut wird genommen und zu Plasma und Blutzellen zentrifugiert. Eine herkömmliche intravenöse Blutentnahmeröhre, enthaltend eine geeignete Menge an Antikoagulationsmittel, wie z.B. Hepalin oder EDTA, kann zur Probenentnahme verwendet werden. Die Blutprobe (in einer Menge von zum Beispiel 2 ml) wird vorzugsweise bei einer Kraft von 130 x.g bis 200 × g 5 bis 10 Minuten zu Plasma und Blutzellen zentrifugiert, einschließlich roten Blutzellen, weißen Blutzellen und Plättchen.
Schritt (b):
Die Blutzellen aus Schritt (a) werden in Buffy-Coats, einschließlich weiße Blutzellen und Plättchen, sowie rote Blutzellen, enthaltend darin eingeschlossene gelöste Stoffe, getrennt. Vorzugsweise werden die Blutzellen aus Schritt (a) mit einem Sedimentationsmittel, wie z.B. Metrizamid, vermischt und die Mischung wird bei einer Kraft von 800 × g bis 1.200 × g 7 bis 12 Minuten zentrifugiert, um die roten Blutzellen von den Buffy-Coats zu trennen.
Schritt (c):
Die in Schritt (b) erhaltenen roten Blutzellen werden mit einer gepufferten physiologischen Kochsalzlösung gewaschen und die gewaschenen Blutzellen werden isoliert. Vorzugsweise werden die roten Blutzellen mit einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung vermischt und die resultierende Mischung wird bei einer Kraft von 130 × g bis 200 × g 5 bis 10 Minuten zentrifugiert. Als ein Ergebnis des Waschens werden Verunreinigungen, wie z.B. weiße Blutzellen, Plättchen und Plasma, welche sich auf den roten Blutzellen ablagern, entfernt.
Schritt (d):
Die gewaschenen roten Blutzellen werden mit einer gepufferten physiologischen Kochsalzlösung vermischt, um eine suspendierte Flüssigkeit zu erhalten. Vorzugsweise werden die gewaschenen roten Blutzellen mit einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung in einer Menge vermischt, so dass die suspendierte Flüssigkeit einen Hämatokritwert von 40 bis 50% hat. Stärker bevorzugt wird die phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung so zugegeben, dass 2 ml der suspendierten Flüssigkeit einen Hämatokritwert von 50% haben. Alternativ können die gewaschenen roten Blutzellen mit einer phsophatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung vermischt werden, so dass die suspendierte Flüssigkeit eine Anzahl an roten Blutzellen in dem Bereich von 4.000.000/μl (4×10⁶/Mikroliter) bis 5.000.000/μl (5×10⁶/Mikroliter) hat. Ein maßgeschneidert eingesetzter automatischer Blutzellenzähler wird geeigneterweise verwendet, um die Anzahl der roten Blutzellen zu zählen.
Schritt (e):
Die in Schritt (d) erhaltene suspendierte Flüssigkeit wird zentrifugiert, um einen Überstand zu entfernen und eine rote Blutschicht zu erhalten. Vorzugsweise wird die suspendierte Flüssigkeit mit einer Kraft von 130 × g bis 200 × g 10 bis 15 Minuten zentrifugiert.
Schritt (f):
Die rote Blutschicht wird dann mit einer hypertonischen Lösung vermischt und die resultierende Suspension wird bei einer Temperatur von 25 bis 40°C für einen Zeitraum gehalten der ausreicht, dass die in den roten Blutzellen eingeschlossenen gelösten Stoffe in die hypertonische Lösung penetrieren. Vorzugsweise wird die rote Blutschicht mit einer 5 bis 10 gew.-%igen Kochsalzlösung in einer vorherbestimmten Menge vermischt und die resultierende Mischung wird bei einer Temperatur von 35 bis 38°C 7 bis 15 Minuten gehalten. Aufgrund des osmotischen Druckes passiert die Lösung in den Blutzellen, enthaltend Glukose, Milchsäure, Brenztraubensäure und andere gelöste Stoffe, durch die Zellwand hindurch und diffundiert in die hypertonische Lösung. Um die intrazellulären Komponenten wirksam und vollständig zu gewinnen, während ihrer Denaturierung vorgebeugt wird, ist es notwendig, dass die Suspension bei 25 bis 40°C gehalten wird.
Schritt (g):
Die in Schritt (f) erhaltene Suspension wird zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten, enthaltend die intrazellularen Komponenten, die aus den roten Blutzellen übertragen wurden. Vorzugsweise wird die Suspension mit einer Kraft von 1.500 × g bis 2.000 × g 7 bis 12 Minuten zentrifugiert.
Schritt (h):
Der in Schritt (g) erhaltene Überstand wird auf zumindest einen Faktor, ausgewählt aus einer Glukosekonzentration, einer Brenztraubensäurekonzentration, einer Milchsäurekonzentration und einem Oxidations-Reduktions-Potential gemessen.
Die Glukosekonzentration, Brenztraubensäurekonzentration und Milchsäurekonzentration kann unter Verwendung jedes maßgeschneidert geeignet eingesetzten automatischen biochemischen Analysators ausgeführt werden. Wenn 2 ml einer suspendierten Flüssigkeit mit einem Hämatokrit von 50% in Schritt (d) hergestellt werden, sind die Glukosekonzentration (mg/dl), Milchsäurekonzentration (mg/dl) und Brenztraubensäurekonzentration (mg/dl) die Werte, die durch Multiplikation von 2 mal den gemessen Werten erhalten werden. Wenn eine suspendierte Flüssigkeit mit einer spezifischen Anzahl an roten Blutzellen in Schritt (d) hergestellt wird, kann die Glukosekonzentration (mg/dl), Milchsäurekonzentration (mg/dl) und Brenztraubensäurekonzentration (mg/dl) leicht aus dem gemessenen Wert, mittleren roten Blutzellvolumen, roten Blutzellenanzahl und dem Volumen der suspendierten Flüssigkeit berechnet werden.
Ein Oxidations-Reduktions-Potentiometer wird geeigneterweise für die Messung des Oxidations-Reduktions-Potentials der roten Blutzellen verwendet (ORP-RBC). In diesem Fall wird das ORP-RBC bestimmt unter Verwendung einer Arbeitskurve, die hergestellt wird durch Messen des Oxidations-Reduktions-Potentials des Serums (ORP-srm), erhalten aus der gleichen Blutprobe. Wenn 2 ml einer suspendierten Flüssigkeit mit einem Hämatokrit von 50% unter Verwendung einer 5 gew.-%igen Kochsalzlösung in Schritt (d) hergestellt wurden, wird die Arbeitskurve typischerweise durch das unten beschriebene Verfahren hergestellt.
Aus 4 ml der venösen Blutprobe wird durch Zentrifugieren der Probe bei 3.000 Upm für 10 Minuten ein Serum abgetrennt. Das Oxidations-Reduktions-Potential des Serums (Ax) wird mit einem Potentiometer gemessen. Das Serum wird mit dem gleichen Volumen einer 5 gew.-%igen Kochsalzlösung verdünnt und das Oxidations-Reduktions-Potential des verdünnten Serums (Ay) wird gemessen. Davon getrennt wird das Serum mit dem gleichen Volumen einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) verdünnt und das Oxidations-Reduktions-Potential des verdünnten Serums (Bx) wird gemessen. Das PBS-verdünnte Serum wird weiter mit der gleichen Menge einer 5 gew.-%igen Kochsalzlösung verdünnt und das Oxidations-Reduktions-Potential des verdünnten Serums (By) wird gemessen.

Zusätzlich wird das Originalserum mit dem dreifachen Volumen PBS verdünnt und das Oxidations-Reduktions-Potential des verdünnten Serums (Cx) wird gemessen. Das verdünnte PBS-Serum wird weiter mit der gleichen Menge einer 5 gew.-%igen Kochsalzlösung verdünnt und das Oxidations-Reduktions-Potential des verdünnten Serums (Cy) wird gemessen. Wie in 1 gezeigt werden die Werte Ax, Bx bzw. Cx auf der X-Achse gegen die Werte Ay, By bzw. Cy auf der Y-Achse aufgetragen. Eine Kurve 1, welche den Punkt A (Ax, Ay), Punkt B (Bx, By) und den Punkt C (Cx, Cy) passiert, stellt die Arbeitskurve dar. Die Koordinaten der Punkte A (Ax, Ay), B (Bx, By) und C (Cx, Cy) sind in Tabelle 1 unten zusammengefasst. Tabelle 1

Achse/Punkt	A	B	C
X	Ax: ORP des Originalserums (nicht verdünnt)	Bx: ORP der 2-fachen Verdünnung von Originalserum mit PBS	Cx: ORP der 4-fachen Verdünnung von Originalserum mit PBS
Y	Ay: ORP der 2-fachen Verdünnung des o. a. Serums mit 5%iger Kochsalzlösung	By: ORP der 2-fachen Verdünnung des o. a. Serums mit 5%iger Kochsalzlösung	Cy: ORP der 2-fachen Verdünnung des o. a. Serums mit 5%iger Kochsalzlösung

Ein Punkt P in der Arbeitskurve, der den Y-Achsenwert Y1 hat, was dem Oxidations-Reduktions-Potential der roten Blutzellen wie in Schritt (h) gemessen entspricht, wird dann bestimmt. Der Wert auf der X-Achse (X1) des Punktes P repräsentiert das Oxidations-Reduktions-Potential der roten Blutzellen (ORP-RBC).
Im Übrigen muss zu dem Oxidations-Reduktions-Potential unter Verwendung eines Potentiometers ein Potential der Referenzelektrode zu dem gemessenen Wert addiert werden. Das Referenzelektrodenpotential variiert mit der Temperatur des Überstandes. Die Temperaturabhängigkeit des Potentials der Referenzelektrode PTS-2019C ist wie in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2

Temperatur (°C) Potential (mV)

0 224

5 221

10 217

15 214

20 210

25 206

30 203

35 199

40 196

45 192

50 188

55 185

60 181
Die folgenden Beispiele werden die vorliegende Erfindung weiter veranschaulichen.
Beispiel 1
37 Patienten mit einer nicht insulinabhängigen Typ-2-Diabetes-Mellitus (NIDDM) und 52 gesunde Personen werden jeweils auf D-Glukosekonzentration in roten Blutzellen gemäß dem folgenden Verfahren untersucht.
Venöses Blut (2 ml) wird entnommen (Hepalin wird als ein Antikoagulationsmittel verwendet) und bei einer Kraft von 150 × g 5 Minuten zu Plasma und Blutzellen zentrifugiert. Die Blutzellen werden mit 0,2 ml Metrizamid vermischt und die Mischung wird bei einer Kraft von 1.000 × g 10 Minuten zentrifugiert, um rote Blutzellen von den Buffy-Coats zu trennen. Die roten Blutzellen werden mit einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung gewaschen und die resultierende Mischung wird bei einer Kraft von 150 × g 5 Minuten zentrifugiert. Die gewaschenen roten Blutzellen werden mit einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung in einer Menge vermischt, so dass 2 ml einer suspendierten Flüssigkeit mit einem Hämatokritwert von 50% erhalten werden. Ein automatischer Blutzellenzähler wird verwendet, um den Hämatokrit zu kontrollieren. Die erhaltene suspendierte Flüssigkeit wird bei einer Kraft von 150 × g 5 Minuten zentrifugiert, um eine rote Blutschicht zu erhalten. Die rote Blutschicht wird dann mit einer 5 gew.-%igen Kochsalzlösung vermischt und die resultierende Mischung (2 ml) wird bei einer Temperatur von 37°C 10 Minuten gehalten, um eine Suspension zu erhalten. Die Suspension wird bei einer Kraft von 1.750 × g 10 Minuten zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten, enthaltend die intrazellulären Bestandteile, die aus den roten Blutzellen übertragen wurden. Der Überstand wird unter Verwendung eines biochemischen Analysators auf seine Glukosekonzentration gemessen.
Ein Blutglukosegehalt im Plasma wird auch mit dem herkömmlichen Verfahren gemessen.
In dem Fall der NIDDM-Patienten wird gefunden, dass je höher der Blutglukosegehalt in dem Plasma, umso höher die Glukosekonzentration in den roten Blutzellen ist. Der Patient mit 350 mg/dl Blutglukosegehalt im Plasma hat 50 mg/dl Glukosekonzentration in den roten Blutzellen. In dem Fall der gesunden Individuen wird ebenfalls gefunden, dass je höher der Blutglukosegehalt im Plasma, umso höher die Glukosekonzentration in den roten Blutzellen ist. Das Individuum mit 150 mg/dl Blutglukosegehalt im Plasma hat 10 mg/dl einer Glukosekonzentration in den roten Blutzellen. Aus dem oben Angegebenen resultiert, dass es offensichtlich ist, dass eine Korrelation zwischen dem Blutglukosegehalt im Plasma und der Glukosekonzentration in den roten Blutzellen besteht.
Beispiel 2

Ein Blutzellentest gemäß vorliegender Erfindung wird für einen Diabetes-Mellitus-Patienten (männlich, 70 Jahre alt) ausgeführt, um das Oxidations-Reduktions-Potential (ORP), Milchsäurekonzentration, Brenztraubensäurekonzentration und pH in den roten Blutzellen, in der gleichen Art wie in Beispiel 2 beschrieben, zu bestimmen. Oxidations-Reduktions-Potential (ORP), Milchsäurekonzentration, Brenztraubensäurekonzentration und pH in dem Plasma werden auch in herkömmlicher Art und Weise gemessen. CPK, Myoglobin, LDH und Aldolasewerte werden ebenfalls in herkömmlicher Art und Weise gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 3

	Messung 1	Messung 2
In roten Blutzellen ORP Milchsäure Brenztraubensäure pH	248 mV 10,6 mg/dl 0,68 mg/dl 7,13	221 mV 18,4 mg/dl 1,2 mg/dl 7,24
Im Plasma ORP Milchsäure Brenztraubensäure pH	136 mV 16,8 mg/dl 0,8 mg/dl 7,39	121 mV 18,2 mg/dl 0,9 mg/dl 7,44
CPK Myoglobin LDH Aldolase	29475 U/l 1700 ng/ml 1550 IU/l 169,2 IU/l	15854 U/l 840 ng/ml 1177 IU/l 96,2 IU/l

Messung 1 und Messung 2 werden vor bzw. nach Minusionenbestrahlungsbehandlung des Patienten ausgeführt.
Vor der Minusionenbestrahlungsbehandlung (Messung 1) ist das intrazelluläre ORP sehr hoch (248 mV), was eine signifikante Oxidation in den Zellen anzeigt. Aus diesem Grund ist die Antriebskraft des Na⁺/H⁺-Kanals reduziert, was eine Reduktion des pH (7,13) verursacht. Allgemein ist die Milchsäurekonzentration in der Zelle leicht höher als die im Blut. Im vorliegenden Fall ist die Milchsäurekonzentration (10,6 mg/dl) in der Zelle jedoch sehr viel niedriger als die im Blut (16,8 mg/dl). In den roten Blutzellen gibt es keinen TCA-Kreislauf, das heißt es existiert lediglich ein Glykolysesystem. Daher wird in den roten Blutzellen Glukose zersetzt, um Brenztraubensäure herzustellen, die wiederum zu Milchsäure umgewandelt wird. Demzufolge zeigt die Tatsache, dass die Milchsäurekonzentration in der Zelle sehr viel niedriger ist als im Blut, dass der Metabolismus in der Zelle niedrig ist. Der niedrige pH und das hohe ORP in den Zellen zeigen nämlich einen Anstieg der Azidität und Oxidation an, was Reduktion des Metabolismus verursacht. Die CPK-, Myoglobin-, LDH- und Aldolase-Werte sind demzufolge hoch, was einen schlechten Zustand des Patienten anzeigt.
Als ein Ergebnis der Minusionenbehandlung (Messung 2) ist die Azidität und Oxidation in den Zellen in normalen Werten. Die Milchsäurekonzentration in den Zellen ist leicht höher als die im Blut, obwohl der Wert per se größer ist als der normale Wert. Obwohl die CPK-, Myoglobin-, LDH- und Aldolase-Werte immer noch höher sind als die normalen Werte, verringern sie sich als ein Ergebnis der Minusionenbestrahlungsbehandlung, was anzeigt, dass der Zustand des Patienten verbessert wurde.
Beispiel 3

Ein Blutzellentest gemäß vorliegender Erfindung wird für einen Patienten (männlich, 4 Jahre alt) ausgeführt um Oxidations-Reduktions-Potential (ORP), Milchsäurekonzentration, Brenztraubensäurekonzentration und pH in den roten Blutzellen in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 2 beschrieben, zu bestimmen. Ebenfalls gemessen werden das Oxidations-Reduktions-Potential (ORP), Milchsäurekonzentration, Brenztraubensäurekonzentration und pH im Plasma in herkömmlicher Art und Weise. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Tabelle 4

	Messung 1	Messung 2
In roten Blutzellen ORP Milchsäure Brenztraubensäure pH	229 mV 17,5 mg/dl 0,61 mg/dl 7,11	250 mV 23,8 mg/dl 0,4 mg/dl 7,28
Im Plasma ORP Milchsäure Brenztraubensäure pH	132 mV 15,9 mg/dl 0,5 mg/dl 7,33	121 mV 18,2 mg/dl 0,6 mg/dl 7,37
Blutglukosegehalt	380 mg/dl	309 mg/dl

Messung 1 und Messung 2 werden vor bzw. nach Minusionenbestrahlungsbehandlung des Patienten ausgeführt. Vor der Minusionenbestrahlungsbehandlung (Messung 1) ist die Milchsäurekonzentration in der Zelle 17,5 mg/dl, was leicht höher ist als im Blut (15,9) und im normalen Bereich (8 bis 16 mg/dl). Weiterhin ist das intrazelluläre ORP nicht hoch (229 mV), was anzeigt, dass Oxidation in den Zellen nicht auf einem hohen Wert ist. Der pH ist jedoch sehr niedrig (7,11), was anzeigt, dass die Glykolyse in den Zellen nicht voranschreitet. Nach der Minusionenbestrahlungsbehandlung ist die Milchsäurekonzentration hoch (23,8 mg/dl) und das ORP ist hoch (250 mV), was nahelegt, dass die Oxidation in den Zellen auftritt und der Metabolismus sich verringert. Der pH-Wert ist jedoch in einem guten Bereich, was anzeigt, dass die Glykolyse in den Zellen zufriedenstellend voranschreitet. Tatsächlich wird der Blutglukosegehalt verbessert.
Aus den Daten der Konzentrationen von organischen Säuren (Brenztraubensäure und Milchsäure), ORP und pH in den roten Blutzellen und in dem Plasma, kann die Wahrscheinlichkeit für den Beginn von Zuständen von Erkrankungen diagnostiziert werden. Wenn sich eine Erkrankung verschlechtert, verändern sich die Blutdaten in der folgenden Reihenfolge:

(1) Erste Stufe: Werte der Konzentrationen von organischen Säuren in den roten Blutzellen und im Plasma fallen nicht in einen Standardbereich oder die Balance zwischen den Konzentrationen der organischen Säuren in den roten Blutzellen und in dem Plasma ist nicht normal.
(2) Zweite Stufe: Werte von ORP in den roten Blutzellen und im Plasma fallen nicht in einen Standardbereich oder die Balance zwischen dem ORP in den roten Blutzellen und demjenigen im Plasma ist nicht normal.
(3) Dritte Stufe: pH-Werte in den roten Blutzellen und im Plasma fallen nicht in einen Standardbereich oder die Balance zwischen dem pH-Wert in den roten Blutzellen und jenem in dem Plasma ist nicht normal.

Tabelle 5 zeigt Standardwerte. Tabelle 5

	Referenzwert
In roten Blutzellen ORP Milchsäure Brenztraubensäure pH	235 mV oder mehr 8-16 mg/dl 0,5-1,2 mg/dl 7,24-7,30
Im Plasma ORP Milchsäure Brenztraubensäure pH	130 mV oder mehr 6-14 mg/dl 0,3-0,9 mg/dl 7,36-7,42
CPK Myoglobin LDH Aldolase	35-200 U/L 60 ng/ml 106-211 IU/L 0-6 IU/L

Ein erfindungsgemäßes Bluttestverfahren kann Veränderungen in Glukose-, Brenztraubensäure- und Milchsäurekonzentrationen und im Oxidations-Reduktions- Potential erkennen, deren Veränderungen noch nicht signifikant im Plasma aufgetreten sind. Weiterhin kann das Bluttestverfahren präzise verschiedene Erkrankungen, wie z.B. Diabetes, Herzinsuffizienz, Niereninsuffizienz und chronische Atmungserkrankungen in ihren frühen Stufen diagnostizieren.

Claims

Bluttestverfahren, bei dem man a) eine Blutprobe eines Säugers in ein Plasma und Blutzellen zentrifugiert; b) die Buffy-Coats von diesen Blutzellen entfernt, um rote Blutkörperchen zu erhalten, die darin eingeschlossene, lösliche Stoffe enthalten; c) diese roten Blutkörperchen mit einer gepufferten physiologischen Salzlösung wascht und diese gewaschenen Blutkörperchen isoliert; d) diese gewaschenen roten Blutkörperchen mit einer gepufferten physiologischen Salzlösung mischt, um eine suspendierte Flüssigkeit zu erhalten; e) diese suspendierte Flüssigkeit zentrifugiert, um einen Überstand zu entfernen und eine Schicht aus roten Blutkörperchen zu erhalten; f) diese Schicht aus roten Blutkörperchen mit einer hypertonischen Lösung mischt und die resultierende Suspension bei einer Temperatur von 25 bis 40°C für einen Zeitraum aufbewahrt, der für die in den roten Blutkörperchen eingeschlossenen, gelösten Stoffe ausreicht, um in die hypertonische Lösung zu penetrieren; g) die Suspension zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten, der die gelösten Stoffe enthält; und h) den Überstand nach wenigstens einem Faktor ausmisst, der ausgewählt wird aus einer Glucose-Konzentration, einer Brenztraubensäure-Konzentration, einer Milchsäure-Konzentration und einen Oxidations-Reduktions-Potential.
Bluttestverfahren nach Anspruch 1, bei dem man in Schritt (a) die venöse Blutprobe bei einer Kraft von 130 × g bis 200 × g für 5 bis 10 Minuten zentrifugiert.
Bluttestverfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem man in Schritt (b) die Blutzellen mit einem Sedimentationsmittel mischt und die resultierende Mischung bei einer Kraft von 800 × g bis 1.200 × g für 7 bis 12 Minuten zentrifugiert.
Bluttestverfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem man in Schritt (c) diese roten Blutkörperchen mit einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung mischt und die resultierende Mischung bei einer Kraft von 130 × g bis 200 × g für 5 bis 10 Minuten zentrifugiert.
Bluttestverfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem man in Schritt (d) diese gewaschenen roten Blutkörperchen mit einer Mengen an phosphatgepufferter physiologischer Salzlösung mischt, so dass die suspendierte Flüssigkeit einen Hämatokritwert von 40 bis 50% hat.
Bluttestverfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem man in Schritt (e) die suspendierte Flüssigkeit bei einer Kraft von 130 × g bis 200 × g für 5 bis 10 Minuten zentrifugiert und den Überstand entfernt.
Bluttestverfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem man in Schritt (f) die Schicht aus roten Blutkörperchen mit einer 5 bis 10 gewichtsprozentigen Salzlösung mischt und die resultierende Mischung bei einer Temperatur von 35 bis 38°C für 7 bis 15 Minuten aufbewahrt.
Bluttestverfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem man in Schritt (g) die Suspension bei einer Kraft von 1.500 × g bis 2.000 × g für 7 bis 12 Minuten zentrifugiert.
Bluttestverfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem man in Schritt (h) den Überstand mittels eines automatischen biochemischen Analysegerätes nach wenigstens einem Faktor ausmisst, der aus einer Glucose-Konzentration, einer Brenztraubensäure-Konzentration und einer Milchsäure-Konzentration ausgewählt wird.
Bluttestverfahren nach einem der Ansprüche 1-8, bei dem man in Schritt (h) den Überstand nach einem Oxidations-Reduktions-Potential mittels eines Potentiometers ausmisst.