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STAND DER
TECHNIK
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Die
autoimmunen Krankheiten verursachen eine bedeutende Erscheinung
von Krankheiten und Sterblichkeit der Menschen. Diese Krankheiten
umfassen etwa 80 Krankheiten wie chronische Polyarthritis, systemischer
Lupus und multiple Sklerose und betreffen etwa 5% der Bevölkerung
der Vereinigten Staaten. Eine autoimmune Krankheit, der Typ I-Diabetes,
ist die häufigste
chronische Krankheit bei Kindern, und sie hat eine gleichmäßig anwachsende
Inzidenz auf weltlicher Ebene.
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Im
Allgemeinen beginnt die Erscheinung des Typ I-Diabetes mit der Anzeige
durch die Zellen, die Antigene (APC) von synthetisierten Autoantigenen
aus den Pankreas-Betazellen enthalten. Diese Anzeige hat als Resultat
die Zerstörung
der Pankreas-Betazellen durch das Immunsystem und wird hauptsächlich durch die
Hilfssubstanz T1 (Th1) und die Zellschädigenden Lymphozyten T unterstützt, was
zum Verlust der Insulinproduktion führt.
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Bei
vielen prophylaktischen und therapeutischen Ansätzen für den Typ I-Diabetes wird versucht, die Zerstörung der
Betazellen zu verhindern und das Immunsystem zu veranlassen, die
selbst reagierenden pathogenen Lymphozyten zu beseitigen, zu deaktivieren
oder zu hemmen wie zum Beispiel durch die Verabreichung von Impfungen,
die nur einen Autoantigen liefern, oder durch die Verabreichung
von Substanzen, die direkte Aktuatoren des Immunsystems sind, wie
die Zytokine. Dennoch sind die aktuell verfügbaren Impfungen auf DNA-Basis
für die
Verhinderung der Krankheit nicht vollkom men wirksam, und die Verwendung
von einigen dieser Impfungen ist eher mit der Induktion oder Erhöhung der
Autoimmunität
als mit der Verhinderung der Krankheit verbunden. Außerdem ist
die Verwendung der Zytokine mit einem bedeutenden Vorhandensein
von Krankheiten verbunden.
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FILIPPOVA
M. ET AL: "Effects
of plasmid DNA injection on cyclophosphamide-accelerated diabetes in
NOD mice" DNA AND
CELL BIOLOGY, New York, NY, US, vol. 20. no. 3, 1.März 2001
(01-03-2001), Seiten 175-181, XP002295859 ISSN: 1044-5498, beschreibt
eine Zusammensetzung, die Plasmid-DNA und eine Ausscheidungsform
der GAD enthält,
die den Diabetes verhindern oder verzögern kann, sie beschreibt aber keine
Substanz, die eine Sequenz von Polynukleotiden enthält, die
EP-GP19k codiert.
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Daher
besteht die Notwendigkeit einer neuen Methode für die Verhinderung, Verzögerung des
Erscheinens oder Behandlung von autoimmunen Krankheiten mit Verwendung
von Impfungen, die nicht mit diesen Nachteilen verbunden sind. Außerdem besteht
die Notwendigkeit einer neuen Methode für die Verhinderung, Verzögerung des
Erscheinens oder Behandlung des Typ I-Diabetes mit Verwendung von Impfungen,
die nicht mit diesen Nachteilen verbunden sind.
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ZUSAMMENFASSUNG
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Gemäß einer
Realisierungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung
eines Aufbaus von Polynukleotid mit einer Sequenz von Polynukleotiden
vorgesehen, die das adenovirale Protein E3-GP19k, E3-GP19k codiert,
das ein Glykoprotein 19 KD des Anfangsbereichs 3 für die Herstellung
eines Arzneimittels zur Verhinderung und Verzögerung des Erscheinens des
Typ I-Diabetes ist.
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In
einer Realisierungsform wird das Arzneimittel in Dosierungseinheiten
zwi schen etwa 0,5 mg und etwa 5 mg hergestellt. In einer anderen
Realisierungsform wird das Arzneimittel in Dosierungseinheiten zwischen
etwa 1 mg und etwa 4 mg hergestellt. In einer anderen Realisierungsform
wird das Arzneimittel in Dosierungseinheiten zwischen etwa 2,5 mg
und etwa 3 mg hergestellt. In einer anderen Realisierungsform wird das
Arzneimittel in einer für
die intramuskuläre
Verabreichung passenden Form hergestellt. In einer anderen Realisierungsform
wird das Arzneimittel in einer für
die intravenöse
Verabreichung passenden Form hergestellt.
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Gemäß einer
anderen Realisierungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Methode
für die
Verhinderung, Verzögerung
des Erscheinens oder Behandlung des Typ I-Diabetes in einem Patienten
vorgesehen. Die Methode schließt
die Wahl eines Patienten ein, der für die Entwicklung des Typ I-Diabetes empfindlich
ist, Typ I-Diabetes entwickelt oder Typ I-Diabetes hat;
und
die Verabreichung von einer oder mehreren Dosierungen eines Aufbaus
von Polynukleotid mit einer Sequenz von Polynukleotiden, die das
adenovirale Protein E3-GP19k und einen oder mehrere Antigene für die autoimmune
Krankheit codiert.
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In
einer Realisierungsform ist die autoimmune Krankheit der Typ I-Diabetes.
In einer anderen Realisierungsform schließt die Wahl des Patienten die
Identifizierung der Anwesenheit von Antiinsulin- oder Anti-GAD-Antikörpern, (GAD
= Glutaminsäure-Decarboxylase)
oder sowohl Antiinsulin- als auch Anti-GAD-Antikörpern im Patienten ein. In
einer anderen Realisierungsform schließt die Wahl des Patienten die
Identifizierung der Anwesenheit von ansteigender Hyperglykämie im Patienten
ein. In einer anderen Realisierungsform schließt die Wahl des Patienten die
Identifizierung der Anwesenheit von Glykosurie im Patienten ein.
In einer anderen Realisierungsform schließt die Wahl des Patienten die
Identifizierung der Anwesenheit von einer allgemeinen Prädisposition
für die
autoimmune Krankheit im Patienten ein.
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In
einer anderen Realisierungsform sind eine oder mehrere Dosierungen
mehrfache Dosierungen. In einer anderen Realisierungsform schließt die Verabreichung
von einer oder mehreren Dosierungen eine intramuskuläre Spritze
für den
Patienten mit einer oder mehreren Dosierungen ein. In einer anderen
Realisierungsform schließt
die Methode außerdem
nach der Verabreichung die Monitorierung des Patienten ein, um die
Entwicklung des Typ I-Diabetes
festzustellen.
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ABBILDUNGEN
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Diese
und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung
werden besser durch die folgende Beschreibung, die beiliegenden
Patentansprüche
und die Begleitabbildungen verständlich,
in denen:
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die 1 schematische
Darstellungen der drei Substanzen gemäß der vorliegenden Erfindung
sind; und
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die 2 schematische
Darstellungen der fünfzehn
Plasmiden sind, die getestet wurden, um ihre Wirksamkeit für die Verhinderung,
die Verzögerung
des Erscheinens oder die Behandlung einer autoimmunen Krankheit
gemäß einer
Methode dieser Erfindung festzustellen.
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BESCHREIBUNG
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Gemäß einer
Realisierungsform dieser Erfindung sind Substanzen für die Verhinderung,
Verzögerung des
Erscheinens oder Behandlung des Typ I-Diabetes vorgesehen. Gemäß einer
anderen Realisierungsform dieser Erfindung ist eine Methode für die Verhinderung,
Verzögerung
des Erscheinens oder Behandlung des Typ I-Diabetes vorgesehen. In
einer bevorzugten Realisierungsform ist die Methode, die die Verwendung
einer Substanz gemäß dieser
Erfindung vorsieht, eine Impfung. In den Substanzen und der Methode
dieser Erfindung wird nicht nur die Verabreichung eines Autoantigens
verwendet, und es werden keine Moleküle verwendet, die direkte Aktuatoren
des Immunsystems sind, wie in den vorhergehenden Methoden. In der
vorliegenden Erfindung wird dagegen eine Impfung für die Verhinderung
der Apoptose von einem oder mehreren Zelltypen verwendet, die die
autoimmune Krankheit hemmen kann. Da einer oder mehrere dieser Zelltypen,
die die autoimmune Krankheit hemmen können, noch physiologischen
und immunen Regeln unterliegen, wird die Gefahr, die Autoimmunität herbeizuführen oder
zu erhöhen,
deutlich durch die vorliegende Methode gegenüber einigen Methoden der vorhergehenden
Technik reduziert. Da diese Erfindung außerdem nicht die Verabreichung
von Substanzen einschließt,
die wie die Zytokine direkte Aktuatoren des Immunsystems sind, schließt diese
Erfindung nicht die gefährlichen
Nebenwirkungen ein, die mit diesen direkten Aktuatoren des Autoimmunsystems
verbunden sind. Ein weiterer Vorteil einer genetischen Impfung,
die hauptsächlich
Plasmid-DNA enthält,
besteht darin, dass sie in großen
Mengen zu relativ niedrigen Kosten produziert werden kann und keine „Kühlkette" für die Lagerung
erfordert. Daher ist die Verwendung der Substanzen und Methoden
gemäß dieser
Erfindung sowohl wirtschaftlich als auch praktisch für die Verhinderung,
Verzögerung
des Erscheinens oder Behandlung einer autoimmunen Krankheit. Außerdem verändert eine
genetische Impfung gemäß dieser
Erfindung das genetische Material eines Organismus direkt, was bedeutet,
dass die nativen Epitopen im Gegensatz zu den Impfungen auf Proteinbasis
vom Immunsystem des Organismus behandelt werden. Die Substanzen und
die Methode dieser Erfindung werden jetzt detailliert beschrieben.
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Wie
in dieser Beschreibung verwendet, schließt der Begriff „autoimmune
Krankheit" sowohl
Krankheiten, die teilweise oder ganz auf die Zerstörung der
normalen Zellen oder Gewebe durch das eigene Immunsystem des Organismus
zurückzuführen sind,
als auch die Zerstörung
von Zellen oder Ge weben durch das eigene Immunsystem des Organismus
ein, die in den Organismus transplantiert wurden, um den Platz von
defekten oder fehlenden Zellen oder Geweben einzunehmen, wie zum
Beispiel Transplantationen von Inselzellen oder Transplantationen
von teilweisen oder ganzen Organen.
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Wie
in dieser Beschreibung verwendet, ist nicht gemeint, dass der Begriff „einschließen" und die Variationen
des Begriffs wie „einschließlich" und „schließt ein" andere ganze Additive,
Komponenten oder Phasen ausschließt.
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In
einer Realisierungsform schließt
diese Erfindung eine Substanz ein, die für die Verhinderung, Verzögerung des
Erscheinens oder Behandlung des Typ I-Diabetes verwendet werden
kann. Die Substanz ist ein DNA-Aufbau mit einer Sequenz von Polynukleotiden,
ID von SEQ. NR.: 2, die das adenovirale Protein E3-GP19k codiert,
das die Präsentation
eines Antigens auf den Molekühlen
MHC-I im endoplasmatischen Retikulum verhindert.
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Wie
die Experten des Zweiges in Bezug auf diese Beschreibung verstehen
werden, schließt
die vorliegende Erfindung, auch wenn spezifische Sequenzen für die Sequenzen
der Polinukleotiden geliefert werden, so wie sie in dieser Beschreibung
beschrieben werden, wie zum Beispiel die Sequenzen der Polinukleotiden,
die das adenovirale Protein E3-GP19k codieren, jede beliebige andere
Sequenz ein, die nicht zu einer Änderung
der Translationssequenz der Aminosäuren führt, so wie jede beliebige
Sequenz, die nicht zu einer Änderung
in der Translationssequenz der Aminosäuren führt, wo aber die Änderung
nicht grundlegend die Funktion der Translationssequenz der Aminosäuren beeinflusst,
so dass sie für
die Verwendungen, die in dieser Beschreibung vorgesehen sind, unpassend
wird.
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In
Bezug auf die 1 werden jetzt die schematischen
Darstellungen der drei Substanzen angegeben, eine gemäß dieser
Erfindung. Wie man sehen kann, schließt jede Substanz den Aufbau
einer Plasmid-DNA ein. Die Substanz A schließt einen Plasmid-Aufbau mit
einem Polynukleotid ein, der einen Autoantigen für die autoimmune Krankheit
codiert, wie Glutaminsäure-Decarboxylase-Ausscheidung,
die ein Autoantigen für
den Typ I-Diabetes ist, gefolgt von einem Polynukleotid, ID von
SEQ. NR.: 1, der BAX codiert. Die Substanz B schließt einen
Plasmid-Aufbau mit einem Polynukleotid ein, ID von SEQ. NR.: 2,
der E3-GP19k codiert, ohne einen Polynukleotid, der einen Autoantigen
für die
autoimmune Krankheit codiert. Die Substanz C schließt einen
Plasmid-Aufbau mit einem Polynukleotid ein, ID von SEQ. NR.: 3,
der eine abgeschnittene Form des anti-apoptotischen Proteins BCL-2
ohne einen Polynukleotid codiert, der einen Autoantigen für die autoimmune
Krankheit codiert. Wie in den Abbildungen verwendet, stellt „CMV" das anregende Element
des Zytomegalie-Virus dar, „pA" stellt eine Polyadenylierungsstelle
dar, und „IRES" stellt eine Ribosombindungsstelle
innerhalb des Virus EMCV dar, ID von SEQ. NR.: 4.
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Um
die Vorteile dieser Erfindung zu zeigen, wurden fünfzehn Plasmiden
aufgebaut und als Impfungen verwendet. Jeder Aufbau wurde im Vektor
pND2 kloniert. In Bezug auf die 2 werden
die schematischen Darstellungen der fünfzehn Plasmiden angegeben,
die getestet wurden, um ihre Wirksamkeit für die Verhinderung, Verzögerung des
Erscheinens oder Behandlung einer autoimmunen Krankheit festzustellen.
Wie man sehen kann, befand sich jeder Plasmid unter der Plasmid-Transkriptionskontrolle
desselben Promotors (CMVp), um den Ausdruck beider Leserahmen zu
garantieren, die in jeder transfizierten Zelle offen sind. Während des
Aufbaus dieser Plasmiden, die die cDNA enthalten, die BCL-2 codiert,
wurde festgestellt, dass Plasmiden aufgrund der großen Dimension
der cDNA beseitigt wurden. Daher wurde für den Aufbau der Plasmiden eine
abgeschnittene Version von bcl-2 verwendet, die als Δblc-2 bezeichnet
wurde. Wie in 2 dargestellt, schlossen die
Plasmiden cDNA ein, die zytoplasmatische GAD codiert, ID von SEQ.
NR.: 5 (Plasmid 1); GAD Ausscheidung (SGAD), ID von SEQ. NR.: 6
(Plasmid 2); eine Luciferase Kontrollausscheidung, ID von SEQ. NR.:
7 (Plasmid 3); das geschnittene menschliche anti-apoptotische Protein
BCL-2 (ΔBCL-2), ID
von SEQ. NR.: 3 (Plasmid 4); das anti-apoptotische Protein BAX,
ID von SEQ. NR.: 1 (Plasmid 5); E3-GP19k, ID von SEQ. NR.: 2 (Plasmid
6); ΔBCL-2,
ID von SEQ. NR.: 3, in Kombination mit der zytoplasmatischen GAD,
ID von SEQ. NR.: 5, GAD Ausscheidung, ID von SEQ. NR.: 6, und Luciferase
Ausscheidung, ID von SEQ. NR.: 7 (Plasmiden 7–9, entsprechend), BAX, ID
von SEQ. NR.: 1, in Kombination mit der zytoplasmatischen GAD, ID von
SEQ. NR.: 5, GAD Ausscheidung, ID von SEQ. NR.: 6, und Luciferase
Ausscheidung, ID von SEQ. NR.: 7 (Plasmiden 10–12, entsprechend), und E3-GP19k,
ID von SEQ. NR.: 2, in Kombination mit der zytoplasmatischen GAD,
ID von SEQ. NR.: 5, GAD Ausscheidung, ID von SEQ. NR.: 6, und Luciferase
Ausscheidung, ID von SEQ. NR.: 7 (Plasmiden 13–15, entsprechend).
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Alle
Plasmiden wurden erzeugt, der offene Leserahmen wurde durch die
Verwendung von PCR verstärkt,
die Verstärkerprodukte
wurden nach der Sequentierung der DNA kontrolliert, und sie wurden
ohne Änderungen
vorgefunden. Es wurde daher jeder Aufbau verwendet, um die COS-7-Simianzellen vorübergehend für die Analyse
des Immunoblots der Zelllysate zu transfizieren, die bestätigt hat,
dass ein Genprodukt mit korrekter Dimension codiert wurde (nicht
dargestellte Daten).
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Daher
wurden wie folgt die Effekte der 15 Plasmiden auf diabetischen nicht
fettleibigen Mäusen
(NOD) festgelegt. Zunächst
wurde die Plasmid-DNA durch Verwendung des Kits Qiagen Endofree
(Qiagen Inc., Chatsworth, CA, USA) isoliert, und es wurden intramuskulär 300 ug
von jeder der 15 Plasmid-DNA
in Gruppen von fünfzehn
weiblichen, 4–5
Wochen alten Mäusen
NOD eingespritzt. Die Dosierung von 300 ug wurde als bedeutende
Dosierung für
die menschliche klinische Einstellung auf der Grundlage des Gewichts
des Organismus gewählt.
Das Erscheinen des Diabetes wurde bis zum Alter von 35 Wochen monitoriert,
wobei Urin- und Glukoseblutanalysen verwendet wurden. Die Mäuse wurden
nach positiven Tests aufgrund hoher Glykosurieniveaus mit Glukoseniveaus
im Blut über
300 mg/dl für
zwei aufeinander folgende Tage als diabetisch betrachtet.
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Die
Ergebnisse dieser Experimente haben folgendes bewiesen. Die Prozentzahl
der diabetischen Tiere im Alter von 35 Wochen änderte sich von 73 auf 93%
bei Mäusen,
die mit Plasmiden 1–3
geimpft wurden; von 60 bis 67% bei Mäusen, die mit Plasmiden 4 oder
7–9 geimpft
wurden; von 47 bis 85% bei Mäusen,
die mit Plasmiden 5 und 10–12
geimpft wurden; und von 53 bis 73% bei Mäusen, die mit Plasmiden 6 und
13–15 geimpft
wurden. Die (nicht geimpften) Kontrolltiere hatten eine Inzidenz
des Diabetes von etwa 93%. Daher hat die Verabreichung von 300 ug
des alleinigen Vektors des Plasmids oder von 300 ug des alleinigen
Vektors des Plasmids, der Antigene codiert, Plasmiden 1–3, als
Ergebnis keine bedeutende Hemmung des Diabetes ergeben. Die mit
den Plasmiden 6–9
und 11 geimpften Mäuse
haben eine statistisch bedeutende Hemmung des Diabetes gegenüber den
nicht behandelten Mäusen
gezeigt (P < 0,05
für den
Plasmid 7, und P < 0,02
für den
Plasmid 9). Dazu haben die Mäuse,
die pND2-E3-GP19k, den Plasmid 6, oder pND2-SGAD55-BAX, den Plasmid
11, erhalten haben, eine Inzidenz des Diabetes gezeigt, der sich
bei 35 Wochen bedeutend gegenüber den
Mäusen
verringert, die den Plasmid pND2-GAD65, Plasmid 1, oder pND2-GAD65-BAX, Plasmid
10 (P < 0,04),
erhalten haben, und gegenüber
den Mäusen,
die pND2-GAD65-ΔBCL2,
Plasmid 7, oder pND2-SGAD55-ΔBCL2,
Plasmid 8, erhalten haben, die eine bedeutende Verringerung des
Diabetes gegenüber
den Mäusen
gezeigt haben, die pND2-GAD65, Plasmid 1 (P < 0,05), erhalten haben. Die Hemmung
des Diabetes wurde mit einer geringeren Entzündung der Inseln verbunden
(nicht dargestellte Daten). Diese Resultate werden jetzt detaillierter
beschrieben.
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Die
Mäuse,
die mit Plasmiden mit Δbcl-2,
Plasmiden 4 und 7–9,
geimpft wur den, haben eine Verzögerung
von 4–5
Wochen für
das Erscheinen des Diabetes unabhängig vom damit ausgedrückten Antigen
und eine Verringerung der Inzidenz des Diabetes im Alter von 35
Wochen (60–67%
gegenüber
dem etwa 93% der nicht geimpften Kontrollmäuse) unabhängig vom damit ausgedrückten Antigen
gezeigt. Daher hat der damit ausgedrückte Autoantigen GAD nicht
den Effekt gehemmt.
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Die
Mäuse,
die mit Plasmiden mit bax, den Plasmiden 5 und 10–12, geimpft
wurden, haben keine Hemmung des Diabetes gezeigt, mit Ausnahme des
sgad55-bax, Plasmid 11. Während
die mit Plasmid 11 geimpften Mäuse
angefangen hatten, den Diabetes in einer ähnlichen Zeit wie die anderen
Mäuse zu
entwickeln, die mit einem Plasmid nur mit bax, Plasmid 5, geimpft
wurden, betrug die Inzidenz des Diabetes bei mit Plasmid 11 geimpften
Mäusen
im Alter von 35 Wochen nur 47% gegenüber einer Inzidenz von 93%
bei den nicht geimpften Kontrollmäusen (p < 0,05).
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Die
Mäuse,
die mit Plasmiden mit E3-gp19k, Plasmiden 6 und 13–15, geimpft
wurden, zeigten einen großen
Unterschied beim Erscheinen des Diabetes je nach dem damit ausgedrückten Antigen.
Die Mäuse,
die mit dem Plasmid mit E3-gp19k ohne Autoantigen, Plasmid 6, geimpft
wurden, haben mit einer Verzögerung von
4–5 Wochen
begonnen, den Diabetes zu entwickeln, und sie haben eine Verringerung
des Diabetes im Alter von 35 Wochen gezeigt (53% gegenüber dem
93% der nicht geimpften Kontrollmäuse für die Kontrolle) (p < 0,05). Die Mäuse, die
mit den Plasmiden mit E3-gp19k mit Autoantigen, Plasmiden 13–15, geimpft
wurden, haben den Effekt sowohl in Bezug auf die Verzögerung des
Erscheinens des Diabetes als auch in Bezug auf die Inzidenz der
diabetischen Tiere bei 35 Wochen gehemmt.
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Daher
wurden die Immunantworten mit Verwendung einer ELISpot-Analyse gekennzeichnet,
die spezifisch für
GAD ist, und ELISA der Isotopen IgG Anti-GAD des Serums, um festzulegen, ob die
Hemmung des Diabetes durch die Verabreichung der Substanzen der
vorliegenden Erfindung mit der Hemmung der Aktivität ähnlich wie
die entzündliche
Th1 und mit der Einstellung der Antwort nach oben wie die entzündungshemmende
Th2 verbunden ist.
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Die
Analyse ELISpot wurde wie folgt geführt. Es wurden Splenozyten
der Mäuse
beim Erscheinen des Diabetes oder am Ende der Beobachtungsdauer
der nicht diabetischen Tiere isoliert. Dann wurden die Zellen mit
dem rekombinierenden Protein GAD stimuliert, und es wurde die Anzahl
der Zellen gezählt,
die IFN-Gamma (ähnliche
Aktivität
wie Th1) und IL-4 (ähnliche
Aktivität
wie Th2) ausscheiden, wobei ein Standardprotokoll des Erbauers befolgt
wurde. Danach wurde die Anzahl der Zellen abgezogen, die die Zytokine
bei Fehlen der GAD-Stimulation ausscheiden, und dann wurden die
Resultate analysiert. Für
IFN-Gamma haben die Daten deutlich angezeigt, dass die Hemmung des
Diabetes durch den Plasmid 6, der nur E3-GP19k codiert, oder durch
die Plasmiden 4 und 7–9,
die ΔBCL-2
allein oder zusammen mit einem Antigen codieren, mit der Hemmung
der spezifischen Aktivität
der GAD verbunden ist. Daher konnten E3-19k und ΔBCL-2 eine Immunantwort herbeiführen, die
die Autoreaktivität
gegen die Betazellen unterdrücken
konnte. Überraschenderweise schien
es nicht so, dass die Kombination SGAD55-BAX die Th1 ähnelnde
Aktivität
bedeutend hemmte. Außerdem
hat nur SGAD55, die nicht den Diabetes gehemmt hat, die Th1 ähnliche
spezifische Antwort der GAD gehemmt.
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Gegenüber IL-4
haben die Daten einen Anstieg der spezifischen Aktivität der GAD
bei Mäusen
angezeigt, die den Plasmid 6, der nur E3-GP19k codiert (Hemmung
des Diabetes), den Plasmid 13, der SGAD55 und E3-19k hemmt (keine
Hemmung des Diabetes), und den Plasmid 8 SGAD55 und ΔBCL-2 (Hemmung
des Diabetes) erhalten haben. Auf diese Weise war eine höhere Th2 ähnliche
Aktivität
nicht immer mit einer Th1 ähnlichen
Aktivität
bei der Verringerung oder Hemmung der Krankheit verbunden.
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ELISA
wurde wie folgt geführt.
Für ELISA
wurde Tierserum von Isotopen IgG2a, b und IgG1 Anti-GAD verwendet,
die entsprechend eine Th1 und eine Th2 ähnliche Aktivität anzeigen.
ELISA von IgG2a, b Anti-GAD hat angezeigt, dass drei der Plasmid-DNA,
die für ΔBCL-2, Plasmiden
4, 8 und 9 codieren, eine bedeutende Reduzierung der Th1 ähnlichen
Aktivität
gegenüber
dem Plasmid 5, der für
BAX codiert, aber nicht bei den nicht geimpften Kontrollmäusen, gezeigt
haben. ELISA von IgG1 Anti-GAD hat angezeigt, dass alle Plasmid-DNA,
die BAX, Plasmiden 5 und 10–12
codieren, als Resultat eine Th2 ähnliche
Aktivität
bei der Verringerung haben.
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Diese
Daten zeigen zusammen genommen an, dass zunächst bax, eine Plasmid-cDNA,
die für
ein pro-apoptotisches Protein codiert, als Molekularhilfsstoff für genetische
Impfungen zur Verhinderung von autoimmunen Krankheiten verwendet
werden kann, wie eine Impfung mit einem Polynukleotid, der eine
Ausscheidungsform eines Autoantigens codiert. An zweiter Stelle
konnte eine Plasmid-cDNA, die E3-GP19k codiert oder die nur den
geschnittenen BCL-2 codiert, die autoimmune Krankheit hemmen, auch
wenn eine Plasmid-cDNA, die E3-GP19k codiert oder die nur einen
geschnittenen BCL-2 codiert, weniger wirksam war, wenn sie mit einem
Autoantigen kombiniert wurde.
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In
einer Realisierungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Methode
für die
Verhinderung, Verzögerung
des Erscheinens oder Behandlung einer autoimmunen Krankheit vorgesehen.
Die Methode schließt zunächst die
Wahl eines Patienten ein, der empfindlich für die Entwicklung der autoimmunen
Krankheit ist, der die autoimmune Krankheit entwickelt oder der
die autoimmune Krankheit hat. Die Wahl kann mit Verwendung von Standardmethoden
ausgeführt
werden, wie die Experten des Zweiges in Bezug auf diese Beschreibung verstehen
werden. Wenn zum Beispiel die autoimmune Krankheit der Diabetes
ist, kann die Wahl ausgeführt werden,
indem beim Patienten das Vorhandensein von Antiinsulin- oder Anti-GAD-Autoantikörpern oder sowohl
Antiinsulin- als auch/oder Anti-GAD-Autoantikörpern, das Vorhandensein einer
ansteigenden Hyperglykämie,
das Vorhandensein von Glykosurie, das Vorhandensein von einer genetischen
Prädisposition
für Diabetes
oder mehr als einem der genannten Merkmale festgestellt wird.
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Daher
werden dem Patienten eine oder mehrere Dosierungen eines Plasmid-Aufbaus
gemäß der vorliegenden
Erfindung verabreicht. D. h., ein Plasmid-Aufbau mit einem Polynukleotid,
der E3-GP19k codiert, aber ohne einen Polynukleotid, der ein Autoantigen
für die
autoimmune Krankheit codiert. In einer bevorzugten Realisierungsform
werden dem Organismus zwei Plasmid-Aufbauten gemäß der vorliegenden Erfindung
verabreicht. In einer besonders bevorzugten Realisierungsform werden
dem Organismus alle drei Plasmid-Aufbauten gemäß der vorliegenden Erfindung
verabreicht.
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In
einer bevorzugten Realisierungsform wird der Plasmid-Aufbau in mehrfachen
Dosierungen verabreicht. In einer anderen bevorzugten Realisierungsform
variiert die Dosierung zwischen etwa 0,001 mg/Kg und etwa 10 mg/Kg.
In einer anderen bevorzugten Realisierungsform variiert die Dosierung
zwischen etwa 0,01 mg/Kg und etwa 1 mg/Kg. In einer anderen bevorzugten
Realisierungsform beträgt
die Dosierung etwa 0,05 mg/Kg. In einer bevorzugten Realisierungsform
variiert eine passende Dosierung für einen erwachsenen Menschen
zwischen etwa 0,5 mg und etwa 5 mg. In einer bevorzugten Realisierungsform
variiert eine passende Dosierung für einen erwachsenen Menschen
zwischen etwa 1 mg und etwa 4 mg. In einer bevorzugten Realisierungsform
variiert eine passende Dosierung für einen erwachsenen Menschen
zwischen etwa 2,5 mg und etwa 3 mg. In einer anderen bevorzugten
Realisierungsform wird die Dosierung wöchentlich von etwa 2 bis etwa
10 Mal verabreicht. In einer besonders bevorzugten Realisierungsform
wird die wöchentliche
Dosierung 4 Mal verabreicht. In einer besonders bevorzugten Realisierungsform
wird die wöchentliche
Dosierung nur ein Mal verabreicht.
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Die
Verabreichung kann über
einen passenden Weg verabreicht werden. In einer bevorzugten Realisierungsform
ist der Weg intramuskulär
oder intravenös.
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Dazu
kann die Methode nach der Verabreichung die Monitorierung des Patienten
einschließen,
um die Entwicklung der autoimmunen Krankheit festzustellen.
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BEISPIEL I
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VERHINDERUNG
DES DIABETES
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird das Erscheinen des Diabetes bei einem Patienten zum
Beispiel wie folgt verzögert
oder verhindert. Zunächst
wählt man
den Patienten, indem man sich auf das Vorhandensein der sich im
Umlauf befindenden Antiinsulin- und Anti-GAD-Autoantikörper basiert.
Dann werden dem Patienten intramuskulär 0,05 mg/Kg eines Plasmid-Aufbaus mit einer
Sequenz von Polynukleotiden eingespritzt, ID von SEQ. NR.: 1, die
das pro-apoptotische Protein BAX codiert und die SGAD codiert, ID
von SEQ. NR.: 6, oder mit einer Sequenz von Polynukleotiden, ID
von SEQ. NR.: 2, die das adenovirale Protein E3-GP19k codiert, oder
mit einer Sequenz von Polynukleotiden, ID und SEQ. NR.: 3, die ΔBCL-2 codiert.
Die Einspritzung wird wöchentlich
für 3 Wochen
wiederholt, während
das Niveau der Antiinsulin- und Anti-GAD-Autoantikörper kontrolliert
wird. Die Behandlung wird beendet, wenn das Niveau der sich im Umlauf
befindenden Antiinsulin- und Anti-GAD-Autoantikörper wieder normal ist.
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