DE60301232T2

DE60301232T2 - Mikroarraysystem mit Mikrotiterplatten

Info

Publication number: DE60301232T2
Application number: DE60301232T
Authority: DE
Inventors: Thomas E. Kocher; Timothy J. Wojcik
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Carestream Health Inc
Priority date: 2002-06-13
Filing date: 2003-06-02
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2023-06-03
Also published as: EP1371412A1; DE60301232D1; EP1371412B1; US20030232384A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein biologisches Analysesystem und insbesondere ein biologisches Analysesystem, das Mikroarray-Empfangselemente mit Mikrotiterplatten integriert.
In den vergangenen Jahren haben hochdichte Arrays aus räumlich adressierbaren biologisch aktiven Proben auf einem Empfangselement den Prozess der biologischen Forschung und Entwicklung erheblich verbessert und vereinfacht. Insbesondere in der Molekularbiologie wurde eine bedeutende Infrastruktur auf Basis der Mikrotiter-Plattentechnologie entwickelt. Mikrotiterplatten sind Wells enthaltende Vorrichtungen, die molekularbiologische Versuche durch Kombination mehrerer, in Wells befindlicher Chemikalien ermöglichen. Mikrotiterplatten werden von vielen Herstellern angeboten, beispielsweise auch von Whatman Philtronics und von Corning, Inc., um nur zwei zu nennen. Mikrotiterplatten sind in zahlreichen Konfigurationen lieferbar, u.a. mit 96, 192, 384 Wells usw. Die Platten gibt es mit runden Wells, quadratischen Wells und beispielsweise auch mit im Bogen eingelassenen Filtern. Seit Mikrotiterplatten in der Molekularbiologie sowie in der Arzneimittelforschung und -entwicklung weite Verbreitung gefunden haben, wurde die Robotertechnik zur Automatisierung der Prozesse zur Handhabung der Mikrotiterplatten energisch weiterentwickelt. Im Allgemeinen wird die Robotertechnik eingesetzt, um Platten zwischen verschiedenen Stellen zu bewegen und Flüssigkeiten in den Wells zu dispergieren. Die Automatisierung kommt der Geschwindigkeit und Konstanz zugute. „Array-based ELISAs für High-Throughput Analysis of Human Cytokines, BioTechniques", Band. 31, Nr. 1 (2201), 186–194, (Pierce Endogen) beschreibt eine Technik, bei der Antikörperlösungen mit 20 nl/Spot in 3 × 3 Mustern in Mikrotiterplatten aufgetragen (gespottet) werden. „High-Throughput micorarray-based enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), BioTechniques", Band. 27, Nr. 4, (1999), 778–788, (Genometrix) beschreibt das Potenzial zur Durchführung von Assays mehrerer Analyte mithilfe von 96 Wellplatten im Mikroarray-ELISA-Format.
Auf der Website von Corning/Life Sciences gibt es ausführliche Informationen über Produkte, die in Mikrotiterplatten-Assaysystemen Verwendung finden. Nachteilig sind bei dieser Technologie die Kosten und die Komplexität der Geräte zur Herstellung der Biosite-Arrays in den Wells der Mikrotiterplatten.
Die folgenden Patente beschreiben alternative Mikroarray-Techniken, die allerdings diese Probleme nicht lösen. US-A-6,083,763 von Balch, veröffentlicht am 4. Juli 2000, beschreibt in 7 ein Dünnfilmsubstrat mit leitenden Mustern und darauf angeordneten Biosites, die an einem Reaktionsgefäß mit einer Matrix offener Reaktionskammern befestigt sind, die durch das Dünnfilmsubstrat abgeschlossen werden. Die Biosites werden derart beschrieben, dass sie von Tintenstrahl-, Kapillar- oder fotolithografischen Techniken aufgebracht werden. Laut Beschreibung werden Dünnfilme aus Kunststoff oder Glas auch an konventionellen, bodenlosen Mikrotiterplatten befestigt. Biosites werden entweder vor oder nach Befestigen der Böden an der Platte aufgebracht.
Felder et al. beschreiben in US-A-6,232,066, veröffentlicht am 15. Mai 2001, eine Anordnung aus mehreren Wells, die aus einem Well-Separator, einem Unterteiler und einer Basis zusammengefügt wird. An dieser Basis werden Biosite-Arrays befestigt.
US-A-6,309,828 von Schleifer et al., veröffentlicht am 30. Oktober 2001, beschreibt eine Technik zur Aufbringung eines Arrays aus Nukleinsäuremolekülen auf einem Substrat mithilfe einer Vorrichtung, die eine Syntheseeinheit in Kommunikation mit einer Reinigungseinheit in Kommunikation mit einer Druckeinheit umfasst. Die Synthese-, Reinigungs- und Druckeinheiten sind ausgerichtete Mikrotiterplatten ohne Boden.
WO 00 16101 A (Tufts College) beschreibt Targetanalytsensoren, die Mikrokugeln verwenden.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Lösung der vorstehend besprochenen Probleme nach dem Stand der Technik bereit.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein biologisches Analysesystem bereitzustellen, das folgendes umfasst: ein Mikroarray-Empfangselement, das ein Substrat umfasst, auf dem eine Zusammensetzung aus einer Population biologisch probenmodifizierter Mikrokugeln aufgetragen ist, immobilisiert in einer Beschichtung, die ein Geliermittel oder einen Vorläufer eines Geliermittels enthält, mindestens eine Unterpopulation dieser Population aus Mikrokugeln, die einen optischen Strichcode enthalten, hergestellt aus mindestens einem, den Mikrokugeln zugeordneten Farbmittel, und mit einer biologischen Probe; und eine Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von Wells, die an ersten und zweiten Enden offen sind und in Flüssigkeitsverschlusskontakt mit einem Mikroarray-Empfangselement an den ersten offenen Enden stehen, wobei jedes Well zur Aufnahme einer fluoreszent/chemilumineszent gekennzeichneten biologischen Targetprobe ausgelegt ist, die fluoreszent/chemilumineszent mit der biologischen Probe zusammen wirkt.
Die Erfindung weist folgende Vorteile auf:

1. Es wird ein System bereitgestellt, das Mikrotiterplatten und Mikroarray-Empfangselemente bereitstellt, die einfach und kostengünstig sind.
2. Die Mikroarray-Empfangselemente können entweder bemusterte oder willkürliche Arrays aus biologischen Proben sein.
3. Das Empfangselemente kann lichtdicht oder transparent sein, um die Erfassung durch Auflicht- oder Durchlichtmessgeräte zu ermöglichen.

Die Erfindung wird im folgenden anhand in der Zeichnung dargestellter Ausführungsbeispiele näher erläutert.
Es zeigen:
1 einen schematischen, teilweisen Aufriss zur Darstellung eines Ausführungsbeispiels der Erfindung.
2 eine perspektivische, schematische Ansicht zur Darstellung des Ausführungsbeispiels aus 1.
3A und 3B schematische Ansichten von Mikroarray-Empfangselementen zur Darstellung entsprechend bemusterter und willkürlich verteilter biologisch aktiver Stellen.
4A–4C schematische Ansichten eines optischen Messsystems zur Verwendung in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung.
5 eine schematische Ansicht eines Mikroarray-Empfangselements, das zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist.
Erfindungsgemäß wird ein biologisches Analysesystem bereitgestellt, das eine Kombination aus einer Mikrotiterplatte mit einem Array aus offenen Wells und einem Mikroarray-Empfangselement mit einem willkürlichen oder vorbestimmten Array aus biologisch funktionalen Sites darstellt, die ein sich wiederholendes Muster auf dem Empfangselement bilden und in Kontakt mit den offenen Wells stehen. Dieses Mikroarray-Empfangselement wird in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 09/942,241 beschrieben. Es folgt eine allgemeine Beschreibung des Mikroarray-Empfangselements, wobei für eine umfassendere Beschreibung auf die vorstehend genannte Anmeldung verwiesen wird.
Das erfindungsgemäße Mikroarray-Empfangselement umfasst ein Substrat, das mit einer Zusammensetzung aus Mikrokugeln in einer Flüssigkeit dispergiert ist, die ein Geliermittel oder einen Vorläufer eines Geliermittels enthält, worin die Mikrokugeln in einer willkürlichen oder geordneten Lage auf dem Substrat immobilisiert sind. Das Substrat ist frei von Rezeptoren, die darauf ausgelegt sind, mit den Mikrokugeln physisch oder chemisch zu interagieren. Eine oder mehrere Unterpopulationen der Population aus Mikrokugeln enthält einen eindeutigen optischen Strichcode, der aus mindestens einem den Mikrokugeln zugeordneten Farbmittel hergestellt ist und eine eindeutige biologische Funktionalität oder Probe beinhaltet, die mit den Analyten reagiert, mit denen sie in Kontakt kommt.
Die Verteilung oder Ordnung der Mikrokugeln auf dem Substrat kann vollkommen willkürlich sein (eine räumliche Verteilung ohne Bezug oder Schwerpunkt), oder sie kann an Stellen ausgerichtet sein, die auf dem Substrat vormarkiert oder vorbestimmt sind. Jede Mikrokugel in dem Array weist eine eindeutige Signatur anhand der Farbe auf, die aus Mischung von drei Farbstoffen hergeleitet werden kann, die die Grundfarben Rot (R), Grün (G) und Blau (B) darstellen, um Tausende unterscheidbarer Mikrokugeln mit eindeutigen Farbadresswerten herzustellen (eindeutigen RGB-Werten, z.B. R = 0, G = 204, B = 153). Die Mikrokugeln weisen auf ihrer Oberfläche aktive Stellen auf, an denen eine bestimmte bioaktive Probe befestigt ist. Jede Farbadresse kann daher einer bestimmten bioaktiven Probe entsprechen.
Ein Mikroarray oder eine Population aus Mikrokugeln kann einige oder Hunderte oder mehr Unterpopulationen von Mikrokugeln enthalten, wobei jede Unterpopulation den gleichen Farbcode und die gleiche bioaktive Probe umfasst. Jedes Mikroarray aus Mikrokugeln belegt einen Unterbereich des Substrats und wird in einem Muster über der Fläche des Substrats wiederholt. Die Flächenausdehnung des Mikroarray-Unterbereichs ist vergleichbar mit der Flächenausdehnung eines Mikrotiter-Wells, wobei sich in einem Mikroarray-Unterbereich auch mehrere Wells überlagern können.
Die Mikrokugeln werden vorzugsweise wie in der US-Anmeldung mit der Seriennummer 09/942,241 beschrieben auf dem Substrat aufgetragen.
Um ein Mikroarray, das bioaktive Proben enthält, zur Analyse einer unbekannten biologischen Targetprobe zu verwenden, muss die zu analysierende Probe anhand von fluoreszierenden Farbstoffen oder chemilumineszierenden aktiven Molekülen nicht selektiv markiert werden.
Eine in einem Mikrotiter-Well angeordnete biologische Targetprobe kommt in Kontakt mit den bioaktiven Proben des Mikroarrays. Die fluoreszierenden/chemilumineszierenden Signale, die aus der Hybridisierung der unbekannten biologischen Targetprobe mit bioaktiven Proben auf der Oberfläche der beschichteten Mikrokugeln resultieren, werden mit einer elektronischen Kamera und einem Bildverarbeitungssystem gemessen und analysiert.
Mikrotiterplatten sind in zahlreichen Konfigurationen lieferbar, u.a. mit 96, 192, 384 Wells usw. Die Platten gibt es mit runden und quadratischen Wells sowie mit im Boden eingelassenen Filtern.
1 zeigt ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Wie gezeigt, umfasst das biologische Analysesystem 10 eine Mikrotiterplatte 12 mit einem Mikroarray-Empfangselement 14, das in den Boden der Mikrotiterplatte 12 integriert ist. Die Mikrotiterplatte 12 und das Mikroarray-Empfangselement 14 sind im Teilschnitt dargestellt. Die Mikrotiterplatte 12 umfasst offene Wells 16 mit Öffnungen an den ersten und zweiten Enden 19, 21. Das Bereiche mit biologischer Funktionalität 17 aufweisende Mikroarray-Empfangselement 14 steht in Abdichtungskontakt mit den ersten Enden 19 der Wells 16. Vor Kombination mit der Mikrotiterplatte 12 wird die biologische Funktion des Mikroarray-Empfangselements 14 vorzugsweise entweder durch geordnete Anordnung oder durch beliebige Beschichtungstechniken eingerichtet. In einem alternativen Ausführungsbeispiel wird das Empfangselement am Boden der Mikrotiterplatte 12 vor Einrichten der biologischen Funktionalität durch Wells 16 oder durch die Mikrotiterplatte 12 anhand bekannter Techniken in Verschlusskontakt gebracht.
2 zeigt das Analysesystem 10 von unten. Das Mikroarray-Empfangselement 14 ist teilweise entfernt, um die Wells 16 in der Mikrotiterplatte 12 zu zeugen. Das Mikroarray-Empfangselement 14 erstreckt sich normalerweise über den gesamten Boden der Mikrotiterplatte 12 und bedeckt alle Wells 16. Im Gebrauch werden die Wells 16 mit einem biologischen Targetanalyt gefüllt.
3A zeigt einen Bereich 18 eines Mikroarray-Empfangselements 14 mit Stellen 20 von biologischer Funktionalität. Die Stellen 20 sind in einem vorbestimmt geordneten Array 22 angeordnet. Die Seitenwand 24 eines Wells umgrenzt den Array 22.
3B zeigt einen Bereich 18 eines Mikroarray-Empfangselements 14 mit Stellen 26 von biologischer Funktionalität. Die Stellen 26 sind in einem willkürlichen Array 28 angeordnet. Die Seitenwand 24 eines Wells umgrenzt den Array 28.
4A, 4B, 4C zeigen optische Messsysteme für Lumineszenz, Auflichtfluoreszenz bzw. Durchlichtfluoreszenz. Wie in 4A gezeigt, erzeugt die Hybridisierung eines Targetanalyts 34 in einem Well 16 der Platte 12 mit einer biologischen Probe 17 auf dem Mikroarray-Empfangselement 14 eine Lumineszenz, die von der CCD-Kamera 30 mit der Linse 32 erfasst wird.
Wie in 4B gezeigt, beleuchtet die Leuchtquelle 40 die Rückseite des Mikroarray-Empfangselements 14. Die Hybridisierung des Targetanalyts 34 mit einer biologischen Probe 17 fluoresziert, und die Strahlung wird vom Reflektor 42 zur Kamera 30 mit Linse 32 reflektiert. Das Filter 44 filtert das Beleuchtungslicht heraus und lässt das Fluoreszenzlicht durch.
Wie in 4C gezeigt, beleuchtet die Leuchtquelle 50 die Analyte 34 von der Vorderseite einer Mikrotiterplatte 12 und eines Mikroarray-Empfangselements 14. Da das Mikroarray-Empfangselement 14 in diesem Fall lichtdurchlässig ist, treten die fluoreszierenden Lichtstrahlungen aus der Hybridisierung des Analyts 34 mit einer biologischen Probe 17 durch das Mikroarray-Empfangselement 14 zur CCD-Kamera 30 mit Linse 32 und Filter 44, welches das Beleuchtungslicht herausfiltert, aber das Fluoreszenzlicht durchlässt.
Es sei darauf hingewiesen, dass die in den optischen Messsystemen aus 4A–4C verwendeten Komponenten andere als die gezeigten sein können. Beispielsweise können elektronische oder digitale Kameras mit Sensoren verwendet werden, die keine CCD sind. Außerdem kann die Positionierung der Kamera komplexere optische Systeme als die hier gezeigten bedingen.
5 zeigt ein Mikroarray-Empfangselement, das zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Wie gezeigt, umfasst das Mikroarray-Empfangselement 14 ein Muster aus 24 Bereichen 60 in einer Matrix aus 4 Reihen und 6 Spalten. Jeder Bereich umfasst ein identisches Mikroarray aus willkürlich verteilten biologischen Probenstellen, von denen ein Teil in der auseinandergezogenen Darstellung zu sehen ist. In dieser Ansicht sind 16 verschiedene biologische Proben, die an Mikrokugeln angelagert sind, willkürlich über den Teil 62 des Bereichs 60 verteilt. Erfindungsgemäß ist jede Probe an einer Mikrokugel einer für diese Probe eindeutigen Farbe angelagert, so dass Mikrokugeln aus 16 verschiedenen Farben in Teil 16 vorhanden sind. Wenn beispielsweise ein Analyt, das jedes der 16 komplementären Targets der 16 Proben enthält, in Kontakt mit Teil 62 gebracht wird, erzeugt die Hybridisierung zwischen den 16 Targets der 16 Proben Lumineszenz oder Fluoreszenz von 16 verschiedenen Farben, die mithilfe eines geeigneten optischen Systems erfasst werden (4A–4C).

Claims

Biologisches Analysesystem mit: einem Mikroarray-Empfangselement, das ein Substrat umfasst, auf dem eine Zusammensetzung aus einer Population biologisch probenmodifizierter Mikrokugeln aufgetragen ist, immobilisiert in einer Beschichtung, die ein Geliermittel oder einen Vorläufer eines Geliermittels enthält, mindestens eine Unterpopulation dieser Population aus Mikrokugeln, die einen optischen Strichcode enthalten, hergestellt aus mindestens einem, den Mikrokugeln zugeordneten Farbmittel, und mit einer biologischen Probe; und einer Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von Wells, die an ersten und zweiten Enden offen sind und in Flüssigkeitsverschlusskontakt mit einem Mikroarray-Empfangselement an den ersten offenen Enden stehen, wobei jedes Well zur Aufnahme einer fluoreszent/chemilumineszent gekennzeichneten biologischen Targetprobe ausgelegt ist, die fluoreszent/chemilumineszent mit der biologischen Probe zusammen wirkt.
Biologisches Analysesystem nach Anspruch 1, worin das Mikroarray-Empfangssubstrat mit einer Zusammensetzung beschichtet ist, die eine Population biologisch probenmodifizierter Mikrokugeln enthält, immobilisiert in einer Beschichtung aus einem Geliermittel oder einem Vorläufer eines Geliermittels, wobei die Population eine Vielzahl von Unterpopulationen aus Mikrokugeln enthält, die jeweils einen eindeutigen Strichcode umfassen, hergestellt aus mindestens einem Farbmittel, das den Mikrokugeln zugeordnet ist, und mit einer eindeutigen biologischen Probe.
Biologisches Analysesystem nach Anspruch 1, worin das Mikroarray-Empfangselement ein Muster aus Bereichen umfasst, von denen jeder eine identische Population der Mikrokugeln enthält.
Biologisches Analysesystem nach Anspruch 3, worin die Mikrokugeln in jedem Bereich eine Vielzahl aus Unterpopulationen von Mikrokugeln enthalten, von denen jede einen eindeutigen Strichcode beinhaltet, der aus mindestens einem den Mikrokugeln zugeordneten Farbmittel hergestellt ist, und mit einer eindeutigen biologischen Probe.
Biologisches Analysesystem nach Anspruch 3, worin mindestens ein Mikrotiter-Well in Kontakt mit jedem Bereich der Musters aus Bereichen steht.
Biologisches Analysesystem nach Anspruch 3, worin zwei oder mehr Mikrotiter-Wells in Kontakt mit jedem Bereich der Musters aus Bereichen stehen.
Biologisches Analysesystem nach Anspruch 1, worin der optische Strichcode durch zwei oder mehr Farbmittel erzeugt wird.
Biologisches Analysesystem nach Anspruch 1, worin der optische Strichcode durch eine Mischung aus roten (R), grünen (G) und blauen (B) Farbstoffen erzeugt wird.