DE60220149T2 - Stabile wässrige lösungen des granulozyten-makrophagen-kolonie-stimulierenden faktors - Google Patents

Stabile wässrige lösungen des granulozyten-makrophagen-kolonie-stimulierenden faktors Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung stellt stabilisierte Formulierungen von GM-CSF zur Verfügung.
  • HINTERGRUND
  • Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) ist ein hämatopoetischer Wachstumsfaktor (Zytokin), der die Proliferation und Differenzierung von verschiedenen hämatopoetischen Vorläuferzellen im Knochenmarkstamm stimuliert und außerdem viele der funktionellen Wirkungen von reifen Neutrophilen, Monozyten, dendritischen Zellen und Makrophagen aktiviert oder fördert. GM-CSF ist ein natürliches Glykoprotein, produziert z. B. durch T-Zellen, Makrophagen, Fibroblasten und Endothelzellen.
  • Da es sowohl den Bestand als auch die Funktion von Neutrophilen, Monozyten und dendritischen Zellen beeinflusst, spielt dieses Zytokin eine entscheidende Rolle beim Vermögen des Körpers, eine Immunantwort aufzubauen. GM-CSF wirkt außerdem mit anderen Zytokinen bei der Förderung der Proliferation und Differenzierung von megakaryozytären und erythroiden Vorläuferzellen. GM-CSF aktiviert oder fördert viele funktionelle Wirkungen, einschließlich Chemotaxis, Phagozytose und antikörperabhängiger Zytotoxizität von reifen Neutrophilen, Monozyten, dendritischen Zellen und Makrophagen.
  • Die humanen GM-CSF codierende cDNA wurde kloniert und das rekombinante Protein wurde in verschiedenen Expressionssystemen, einschließlich Hefe, Bakterien (Molgramostim) und Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (Regramostim), hergestellt. Leukine® (Immunex Corporation, Seattle, Washington, USA) ist eine variante Form von in Saccharomyces cerevisiae produziertem GM-CSF. Diese variante Form von GM-CSF wird allgemein „Sargramostim" genannt.
  • Es wurde bewiesen, dass Leukine® dieselben hämatopoetischen Wirkungen wie jene durch endogenen GM-CSF induzierten besitzt, nämlich die entlang des Granulozyten-Makrophagen-Weges ausgeübte Stimulation von Vorläuferzellen zur Bildung von Neutrophilen, Monozyten, Makrophagen und Eosinophilen (Technische Produktbeschreibung: Leukine®, flüssig, Immunex Corp., Seattle, Washington, 1997, welche hier durch Bezugnahme aufgenommen ist). Leukine®, wie endogener GM-CSF, fördert ebenso die Differenzierung von Vorläuferzellen, was zu Erythrozyten und Megakaryozyten führt (ebd.) Neben der Stimulation der Hämatopoese fördert Leukine® viele der funktionellen Wirkungen von reifen Neutrophilen, Monozyten und Makrophagen, wie Chemotaxis, Sekretion von Wachstumsfaktoren, Antitumorwirkung, antibakterielle und antifungale Wirkung usw. (ebd.).
  • Übliche Verwendungen von Leukine® schließen die Behandlung von Empfängern von autologem Knochenmarktransplantat (Non-Hodgkin-Lymphom; Behandlung akuter lymphoblastischer Leukämie; Hodgkin-Lymphom); Verwendung bei Patienten mit verzögertem Anwachsen oder Transplantatversagen nach allogener oder autologer Knochenmarktransplantation; Behandlung von Empfängern von allogenem Knochenmarktransplantat von einem HLA-kompatiblen Spender und Mobilisierung peripherer Blutvorläuferzellen bei Non-Hodgkin-Lymphom, Hodgkin-Lymphom und Brustkrebspatienten ein.
  • GM-CSF wurde als wirksame Behandlung bei entzündlichen Darmerkrankungen, einschließlich Morbus Crohn, vorgeschlagen (WO 00/47195).
  • Stabile Lösungen von LEUKINE® oder andere Formen von biologisch aktivem GM-CSF sind für eine Vielzahl von Verwendungen sehr erwünscht.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Zur Verfügung gestellt werden hierin Verfahren zur Langzeitsiabilisierung von in wässriger Lösung gelagertem GM-CSF. Die Stabilisierung wird durch Zusetzen eines Chelatbildners, der zur Bildung von Komplexen mit zweiwertigen Kationen imstande ist, erreicht.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Wenn Untersuchungen zur Langzeitstabilität an GM-CSF, das in Fertiginjektionsspritzen gelagert wurde, durchgeführt wurden, wurde überraschenderweise beobachtet, dass sich nach langen Zeitspannen das Protein an seinem Aminoterminus zum Teil abgebaut hatte (siehe Beispiel 1). In-vitro-Versuche unter Verwendung einer GM-CSF-sensitiven Zelllinie zeigten, dass die teilweise abgebauten Zubereitungen einen hohen Grad an Bioaktivität behielten (siehe Beispiel 1). Trotzdem können N-terminal abgebaute Formen von GM-CSF unerwünschte Veränderungen ihrer pharmakologischen Eigenschaften in vivo aufweisen. Beispielsweise ist es möglich, dass jedes Abbauprodukt ein bisschen anders im Körper des Patienten metabolisiert wird. Beispielsweise könnte die Halbwertszeit in vivo von N-terminal abgebauten Formen von der des Proteins in voller Länge abweichen. In einem Therapieregime werden die Dosis und Häufigkeit der Verabreichung üblicherweise eingestellt, um zu gewährleisten, dass während des gesamten Behandlungsablaufs ein therapeutisch wirksamer Arzneimittelspiegel im Körper des Patienten aufrechterhalten wird. Wenn abgebaute Formen vorliegen, ist es jedoch möglich, dass der benötigte Arzneimittelspiegel nicht erreicht wird und die Wirksamkeit der Therapie dadurch verringert werden könnte. Außerdem ist es theoretisch denkbar, dass abgebaute Formen des Proteins Antikörper gegen GM-CSF induzieren könnten. Folglich ist es günstig, Formulierungen von GM-CSF zu haben, bei welchen der N-terminale Abbau nicht stattfindet. Um dieses Ziel anzusteuern, wurden Untersuchungen durchgeführt, um einen Weg zur Stabilisierung von Arzneimittelzubereitungen von GM-CSF zu entwickeln.
  • Diese Erfindung stellt stabile Formulierungen von GM-CSF, die nach Lagerung bei 2-8°C hochbeständig gegen N-terminalen Abbau sind, zur Verfügung. Es wird hierin nachgewiesen, dass der Zusatz eines Chelatbildners zu einer Lösung von GM-CSF den N-terminalen Abbau des GM-CSF über Zeiträume bis zu 2 Jahren verhindert. Die erfindungsgemäßen Formulierungen sind für alle medizinischen Zwecke und Forschungszwecke, die GM-CSF einschließen, verwendbar.
  • Wenn die stabilisierten Formulierungen für die therapeutische Verabreichung an Menschen oder andere Säuger sind, muss der zur Stabilisierung von GM-CSF verwendete Chelatbildner physiologisch verträglich sein, das heißt, er muss zur Verwendung bei Menschen in den zum Erreichen der Stabilisierung benötigten Konzentrationen unschädlich sein. Der Chelatbildner muss zur Bildung von Komplexen mit zweiwertigen oder dreiwertigen Kationen, einschließend Ionenformen von Calcium, Mangan, Magnesium, Eisen, Zink, Blei, Quecksilber, Aluminium, Cadmium, Kupfer usw., imstande sein. Chelatbildner, die zur Chelatisierung von zweiwertigen Kationen imstande sind, werden in einer Ausführungsform der Erfindung verwendet. Ein geeignetes Mittel, das zweiwertige Kationen chelatisiert, ist Ethylendiamintetraessigsäure, auch „EDTA" genannt. EDTA wird medizinisch verwendet, z. B. als Therapeutikum zur Behandlung von Patienten mit Bleivergiftung. Ein anderer geeigneter Chelatbildner ist Dexrazoxan, welches ein Derivat von EDTA ist, das leicht Zellmembranen durchdringt und als herzschützendes Mittel gegen Nebenwirkungen der anthracyclininduzierten Kardiomyopathie verwendet wird. Weitere zur Verwendung in den betreffenden Formulierungen geeignete Chelatbildner schließen Dimercaprol (BAL) oder BAL-Glykosidderivate, Deferoxaminmesylat, Deferipron und Penicillamin (Dimethylcystein) ein. In einer anderen Ausführungsform können EGTA oder Citrat als Chelatbildner für zweiwertige Kationen gemäß der Erfindung verwendet werden.
  • Geeignete Konzentrationen des Chelatbildners für die vorliegenden Formulierungen reichen von 0,05 bis 50 mM. Geeignete Bereiche schließen 0,5 bis 10 mM; 0,05 bis 1 mM und 0,1 bis 5 mM ein. In einer Ausführungsform der Erfindung ist der Chelatbildner in einer Konzentration von 5 mM zugesetzte EDTA. In einer anderen Ausführungsform kann eine Konzentration von 0,1 mM EDTA verwendet werden. Jede Form von EDTA kann verwendet werden, z. B. die Dihydratform des Dinatriumsalzes von EDTA. CaNa2-EDTA kann verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäßen wässrigen Formulierungen können in Ampullen oder in Fertiginjektionsspritzen abgepackt werden. In einer Ausführungsform ist der GM-CSF in wässriger Lösung in einer Standardampulle zur Injektion enthalten. In einer geeigneten Formulierung enthalten die Ampullen 1 ml Flüssigkeit, umfassend 500 μg/ml GM-CSF (wie LEUKINE®, flüssig, Immunex Corporation), 1,2 mg/ml TRIS-HCl (auch „Tromethamin" genannt), 40 mg/ml Mannitol und 10 mg/ml Saccharose bei pH-Wert 7,4. Die vorhergehende Formulierung kann außerdem 1,1% Benzylalkohol als Konservierungsstoff enthalten, jedoch kann ein anderer physiologisch verträglicher Konservierungsstoff den Benzylalkohol ersetzen, falls gewünscht. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird der GM-CSF zur Lagerung in eine Fertiginjektionsspritze abgepackt, welche eine Formulierung mit GM-CSF (wie LEUKINE®) zu 500 μg/ml, 10 mM TRIS-HCl, 40 mg/ml Mannitol und 10 mg/ml Saccharose bei pH-Wert 7,4 enthält. In Spritzen abgepackter GM-CSF kann außerdem 1,1% Benzylalkohol oder einen anderen pharmakologisch verträglichen Konservierungsstoff enthalten. Falls gewünscht, kann die Konzentration an GM-CSF in derartigen Formulierungen bis zu einer Konzentration zwischen 500 und 1000 μg/ml oder höher erhöht werden.
  • Der Chelatbildner wird den Lösungen von GM-CSF auf jeder gewünschten Stufe der Herstellung der Formulierungen zugesetzt. Beispielsweise kann eine konzentrierte Lösung von GM-CSF gemischt werden, um die gewünschte Endkonzentration durch Zugeben entsprechender Mengen an Wasser, TRIS-HCl, Mannitol, Saccharose und Chelatbildner genau vor der Abpackung in einzelne Ampullen oder Spritzen oder genau vor der Lyophilisierung zu erhalten. Standardverfahren der Lyophilisation können für diesen Zweck verwendet werden.
  • Im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeter GM-CSF schließt jeden pharmazeutisch sicheren und wirksamen humanen GM-CSF oder jedes Derivat davon mit der biologischen Aktivität von humanem GM-CSF ein. Die biologische Aktivität kann beispielsweise durch Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen TF-1-Zellassays oder eines anderen geeigneten Bioassays, der auf dem Fachgebiet bekannt ist, bestimmt werden. Vorzugsweise wird rekombinanter GM-CSF verwendet. Ein geeigneter GM-CSF zur Verwendung in den betreffenden Formulierungen ist der humane GM-CSF, dessen Aminosäuresequenz in SED ID NO: 1 zur Verfügung gestellt wird. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „rekombinanter GM-CSF" entweder auf GM-CSF, der in einer Zelle, in welche eine Nukleinsäure eingeführt wurde, die das exogene GM-CSF-Gen codiert, oder in einer Zelle, in welcher das endogene GM-CSF-Gen durch die Einführung regulatorischer Elemente, die eine hohe Transkriptionsrate des endogenen GM-CSF-Gens induzieren, zur vermehrten Bildung von GM-CSF stimuliert wurde, synthetisiert wurde.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist der in den betreffenden Formulierungen verwendete GM-CSF rekombinanter humaner GM-CSF (rhu GM-CSF), wie LEUKINE® (Immunex Corporation, Seattle, Washington). LEUKINE® (allgemein „Sagramostim" genannt) ist ein biosynthetischer, aus Hefe stammender, rekombinanter humaner GM-CSF, der aus einem einzigen Glykoprotein aus 127 Aminosäuren besteht, der sich von dem in SEQ ID NO: 1 dargestellten endogenen humanen GM-CSF dadurch unterscheidet, dass er anstatt eines Arginins an Position 23 ein Leucin aufweist. LEUKINE® wird in der Hefe Saccharomyces cerevisiae produziert. Anderer natürlicher und synthetischer GM-CSF und Derivate davon mit der biologischen Aktivität von natürlichem humanen GM-CSF können ebenso in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar sein.
  • LEUKINE®, flüssig, ist eine sterile injizierbare wässrige Lösung, im Allgemeinen in Ampullen von 1 ml vertrieben, mit 500 μg/ml (2,8 × 106 IE) Sagramostim; 40 mg/ml Mannitol; 10 mg/ml Saccharose; 1,2 mg/ml Tromethamin; sterilem Wasser und 1,1% Benzylalkohol. LEUKINE®, lyophilisiert, wird ebenfalls vertrieben (Immunex Corporation) und ist üblicherweise in Ampullen abgepackt, die ein steriles lyophilisiertes Pulver zur Rekonstitution mit 1 ml sterilem Wasser enthalten. LEUKINE®, lyophilisiert, kann 250 μg oder 500 μg Sargramostim (1,4 × 106 IE oder 2,8 × 106 IE); 40 mg Mannitol; 10 mg Saccharose und 1,2 mg Tromethamin enthalten. LEUKINE®, flüssig, und rekonstituierte Lösungen von LEUKINE®, lyophilisiert, werden gekühlt bei 2-8°C gelagert. Zur Stabilisierung dieser Formulierungen wird ein Chelatbildner zugesetzt, wie vorstehend beschrieben. Beispielsweise wird EDTA (oder ein anderer geeigneter Chelatbildner) zu der gewünschten Konzentration zu der flüssigen Formulierung hinzugefügt, bevor sie in Ampullen abgepackt wird. Feste EDTA oder ein anderer Chelatbildner können der lyophilisierten Formulierung in Mengen, die die gewünschte Endkonzentration liefern, wenn das Pulver zur Injektion hydratisiert wird, zugesetzt werden.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer stabilisierten wässrigen Lösung des Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors zur Verfügung gestellt. Dieses Verfahren schließt das Zusammenmischen von EDTA in einer Konzentration von 0,1 bis 50 mM, 500 μg/ml Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor, 10 mM TRIS-HCl, 40 mg/ml Mannitol und 10 mg/ml Saccharose ein. Die verschiedenen Bestandteile des Gemisches können gleichzeitig oder der Reihe nach in wässriger Lösung zugegeben werden. Das Gemisch kann andere physiologisch verträgliche Bestandteile enthalten, falls so gewünscht.
  • GM-CSF, wie LEUKINE® oder Molgramostim, kann außerdem zu Hydrogelen zur topischen Anwendung, wie den in US-Patent Nr. 6.120.807 beschriebenen Hydrogelen, formuliert werden. Zur Formulierung geeigneter Hydrogele verwendete Polymere schließen Polysaccharide, Polyacrylsäuren, Polyphosphazene, Polyethylenglykol-PLGA-Copolymere und andere synthetische, biologisch abbaubare Polymere ein. Zur Stabilisierung von in einem derartigen Hydrogel dispergiertem GM-CSF wird ein Chelatbildner wie EDTA in einer Konzentration von 0,05 bis 50 mM oder in einer Konzentration von 0,1 bis 5 mM zugesetzt. In bestimmten Ausführungsformen wird eine Konzentration von 0,1 oder 5 mM verwendet.
  • In einer Ausführungsform der betreffenden Erfindung wird Sargramostim formuliert, wie vorstehend für LEUKINE®, flüssig, beschrieben, außer dass EDTA zu einer Konzentration von 5 mM zugegeben wird. In einer anderen Ausführungsform wird Sargramostim formuliert, wie vorstehend für LEUKINE®, lyophilisiert, beschrieben, außer dass 5 mM EDTA zu der Lösung vor der Lyophilisation hinzugefügt wird. In noch einer anderen Ausführungsform wird trockenes EDTA-Pulver in geeigneten Mengen mit lyophilisiertem LEUKINE® gemischt, bevor es abgepackt wird.
  • Die stabilen Formulierungen von GM-CSF der betreffenden Erfindung schließen wässrige Lösungen ein, die auf allen gewünschten Wegen verabreicht werden können. Beispielsweise werden die stabilisierten Formulierungen von GM-CSF durch Injektion verabreicht. Die Injektion kann subkutan, intramuskulär oder durch intravenöse Infusion sein.
  • Formulierungen von GM-CSF mit EDTA können auch durch Inhalation eines Aerosolsprays verabreicht werden. Die Formulierung kann zunächst in eine Vorrichtung zur Aerosolabgabe abgepackt werden oder kann in einen mit dieser Abgabeform kompatiblen Behälter überführt werden. Die Aerosolabgabe kann zum Dispensieren von Formulierungen, die original in flüssiger Form abgepackt sind, oder die original als lyophilisiertes Pulver abgepackt sind, was Rekonstitution vor der Verabreichung erfordert, verwendet werden. Die Aerosolabgabe ist besonders wirksam zum Befördern von Sargramostim in die Nasengänge oder Lungen, kann aber auch zur systemischen Verabreichung des stabilisierten GM-CSF verwendet werden. In einer Ausführungsform der Erfindung ist der mit Aerosolspray verabreichte GM-CSF Sargramostim.
  • Da der Glykosylierungsgrad von biosynthetischem GM-CSF Halbwertszeit, Verteilung und Ausscheidung zu beeinflussen scheint, kann die wirksamste Dosis von GM-CSF bei den betreffenden Verfahren in Abhängigkeit von der verwendeten Quelle variieren (Lieschke und Burgess, N. Engl. J. Med. 1992, 327: 28-35; R. T. Dorr, Clin. Ther. 1993, 15: 19-29; Horgaard et al., Eur. J. Hematol. 1993, 50: 32-36). Die wirksamste Dosis und Häufigkeit der Verabreichung kann wie benötigt durch den Arzt des Patienten gemäß der medizinischen Praxis abgestimmt werden und wird vom Alter des Patienten, Gewicht und zu behandelndem Zustand abhängen. Wirksame Dosen von GM-CSF können von etwa 50 bis 250 μg pro Dosis reichen. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Dosis genau oder etwa 100 μg. In anderen Ausführungsformen liegt die verwendete Dosis zwischen 100 und 125 μg. In einer anderen Ausführungsform wird eine von 125 bis 250 μg reichende feste Dosis verabreicht. Geeignete feste Dosen schließen 100 μg, 150 μg, 200 μg und 250 μg GM-CSF ein. Falls gewünscht, kann die Dosis als Funktion der Körperoberfläche berechnet werden, wie z. B. 125 bis 250 μg/m2.
  • Die hierin beschriebenen verbesserten GM-CSF-Formulierungen sind zur Behandlung jedes medizinischen Zustandes verwendbar, bei welchem die Verabreichung von GM-CSF dabei wirksam ist, eine messbare Verbesserung mindestens eines Indikators, der allgemein zur Einschätzung der Schwere dieses Zustandes verwendet wird, herbeizuführen. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen stabilisierten Formulierungen in jedem therapeutischen Regime, das LEUKINE® (Sargramostim), LEUCOMAX® (Molgramostim), Regramostim, pegylierten GM-CSF oder eine physiologisch verträgliche Wildtyp-Formulierung oder biologisch aktiven GM-CSF verwendet, ausgetauscht werden. Erkrankungen, die mit den hierin beschriebenen stabilisierten GM-CSF-Formulierungen behandelt werden können, schließen HIV-Infektion oder andere Virusinfektionen, bakterielle Infektionen, Krebs, langsam heilende Wunden oder Geschwüre (wie Dekubiti oder diabetische Geschwüre), entzündliche Darmerkrankung, einschließlich Morbus Crohn, und alveoläre Proteinose ein. Krebs kann ebenfalls mit den betreffenden Formulierungen behandelt werden, einschließend, aber nicht beschränkt auf Melanom, Brustkrebs, Gehirntumore, Leukämien, Lymphome, Karzinom und Adenokarzinom. Außerdem können die erfindungsgemäßen Formulierungen als Impfhilfsstoff verwendet werden, der beispielsweise zusammen mit einem Impfstoff gegen eine Infektionskrankheit oder mit einem Tumorimpfstoff, einschließlich Peptidimpfstoffen gegen Melanom, Brustkrebs, Gehirntumore und andere Krebsarten, verabreicht werden kann.
  • Die betreffenden stabilisierten GM-CSF-Formulierungen können außerdem verwendet werden zur Herabsetzung des Auftretens einer Infektion bei Krebspatienten, die eine myelosuppressive Chemotherapie erhalten; zur Förderung der Erholung von Knochenmarkzellen bei Patienten, die eine myeloablative Chemotherapie, gefolgt von einer autologen oder allogenen Knochenmarktransplantation, erhalten haben, als Behandlung gegen Krebsarten, wie Non-Hodgkin-Lymphom, akute lymphoblastische Leukämie, Hodgkin-Lymphom, oder andere Krebsarten; zur Förderung der Mobilisierung peripherer Blutvorläuferzellen für die Ansammlung durch Leukapherese vor der Transplantation; zur Verkürzung der Dauer von Neutropenie und mit Neutropenie in Zusammenhang stehenden klinischen Folgeerscheinungen bei Krebspatienten, die allogenes oder autologes Knochenmarktransplantat erhalten haben; und zur Verringerung der benötigten Zeit zur Erholung der Neutrophilen bei Krebspatienten, wie Patienten mit akuter myelogener Leukämie, nach Chemotherapie. Die hierin beschriebenen stabilisierten Formulierungen können auch zur Stimulation der extrakorporalen Expansion von gezüchteten hämatopoetischen Stammzellen verwendet werden.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen verwendbare Ausführungsformen der Erfindung.
  • BEISPIEL 1
  • N-terminaler Abbau von gelagertem GM-CSF
  • Veränderungen im Umkehrphasen-HPLC-Profil wurden nach etwa 6 Monaten Lagerung von LEUKINE® in CARPUJECT®-Fertiginjektionsspritzen (AMTEST Laboratories, Redmond, Washington), die mit 1 ml LEUKINE®, flüssig, gefüllt worden waren, beobachtet. Die Umkehrphasen-HPLC für diese Untersuchungen wurde unter Verwendung einer Protein- und Peptidsäule C18 von Vydac (218TP54), 5 μm, 4,6 × 250 mm, durchgeführt. Puffer A für die Umkehrphasenchromatographie war Wasser/TFA 0,1%; Puffer B war Acetonitril/TFA 0,1% und Puffer C war 1 M NaCl/Wasser/TFA 0,1%. Der zum Entwickeln der Säule verwendete Gradient war: 1% B/min für 25-65%, B bei konstanten 20% und C über 40 Minuten bei 1 ml/min. Das Injektionsvolumen betrug 50 μl. Das Elutionsprofil für das gelagerte LEUKINE® zeigte eine absteigende Schulter am Hauptpeak dieses Profils.
  • Die Massenspektrometrie identifizierte diese Schulter als GM-CSF, das in unterschiedlichem Maße am N-Terminus gekürzt wurde. Die Massenspektrometrie (Sciex API 350) wurde unter Entwicklung der Proben auf C18-Umkehrphasensäulen wie vorstehend beschrieben durchgeführt, außer dass Natriumchlorid aus den Puffern weggelassen wurde. Das Eluat aus der C18-Säule wurde in das Massenspektrometer elektroversprüht. Zur Auswertung der Massenspektren wurden Masse/Ladung-Spektren (m/z) von dem gesamten GM-CSF-Elutionspeak aufgenommen und unter Verwendung der Software BioMultiView auf Massen ausgewertet.
  • LEUKINE® ist in seiner unmodifizierten Formulierung an seinem Aminoterminus heterogen, üblicherweise 65% Protein in voller Länge und 35% einer etwas kürzeren Form, beginnend bei Ala3, umfassend. Die Ergebnisse der Massenspektren der in Spritzen gelagerten Produkte zeigten das Vorhandensein sowohl der vollentwickelten Ala1-Spezies als auch weiterer, zu Ala3, Arg4, Ser5, Ser7, Ser9 und Thr10 gekürzter Spezies. In bei 2-8°C gelagerten Produkten blieb der Anteil des Proteins in voller Länge (Ala1) unverändert, was darauf hinwies, dass die einzige Spezies, die für den durch Lagerung hervorgerufenen Abbau bei dieser Temperatur anfällig ist, die Ala3-Spezies ist. Bei 30°C jedoch wurde selbst die Ala1-Spezies abgebaut. Es sollte erwähnt werden, dass diese Untersuchungen mit Massenspektren nur auf die unglykosylierten Spezies gerichtet waren, die spätere Arbeit aber zeigte, dass auch die glykosylierten Formen gekürzt werden. Es wird abgeschätzt, dass die Bestimmungsgrenze (LOQ) bei der Ermittlung des prozentualen Anteils der Spezies in voller Länge und der gekürzten Spezies mit diesem Verfahren etwa 5% ist.
  • Weitere Charakterisierungen legten nahe, dass diese Kürzung auf einen metallionenkatalysierten Vorgang zurückzuführen war. Diese Aussage stützten die folgenden Beobachtungen. Erstens war der Abbau auf den N-Terminus eingegrenzt. Zweitens konnte die Umkehrphasenschulter durch den Zusatz einer exogenen α-Aminopeptidase simuliert werden. Für diese Simulation wurden 5 Einheiten α-Aminopeptidase (Sigma A8299) zu LEUKINE®, flüssig, hinzugefügt und dieses wurde 3 Tage bei 37°C inkubiert. Es wurde nach Massenspektrometrie festgestellt, dass Formulierungen mit zugesetzter α-Aminopeptidase die folgenden N-Termini enthielten: Ser5, Gln11 und pGln11 (das stabile Cyclisierungsprodukt von Gln11). Wenn die Inkubation bis zu 7 Tagen ausgedehnt wurde, fand der Abbau nicht über Gln11 hinaus statt. Der weitere Abbau kann durch die Cyclisierung von Gln11 gestoppt worden sein. Drittens konnten wir den beobachteten N-terminalen Abbau von GM-CSF durch Zusetzen von mM EDTA zu den Formulierungen stoppen.
  • Das Kation, das diesen aminoterminalen Abbau katalysiert, wurde nicht endgültig ermittelt. In einem Versuch, dieses Kation zu bestimmen, wurden Metallionen aus von CARPUJECT®-Spritzen entnommenen Gummistöpseln mittels Soxhlet-Extraktion erschöpfend extrahiert. Das am reichlichsten vorhandene zweiwertige Kation, das extrahiert wurde, war Zink, wodurch nahegelegt wurde, dass dieses das katalysierende Kation sein könnte. Versuche wurden durchgeführt, wobei Zn2+ zu den Formulierungen von LEUKINE® in dem Bestreben hinzugefügt wurde, den N-terminalen Abbau zu beschleunigen, das zugesetzte Zink hatte aber keine wesentliche Wirkung im Vergleich zu einer Kontrollprobe. Die Proben wurden jedoch nur etwa einen Monat vor der Untersuchung gelagert, daher wurden die Ergebnisse nicht als beweiskräftig angesehen. Gemäß der durch den Hersteller der CARPUJECT®-Spritzen gelieferten Angaben, sind viele unterschiedliche Metallionen in kleinen Mengen in den Gummistöpseln vorhanden, einschließlich Calcium, Kupfer, Eisen, Blei, Chrom, Magnesium, Mangan, Molybdän und anderen.
  • Bioassays wurden unter Verwendung der Zelllinie TF-1 durchgeführt, welche sensitiv auf humanen GM-CSF ist und sich schneller vermehrt, wenn dieses Zytokin dem Kulturmedium zugesetzt wird (siehe z. B. Kitamura et al., J. Cell. Physiol. 1989, 140: 323-334). Die Bioaktivität wird durch Hinzugeben bekannter Mengen an GM-CSF (1 ng/ml) zu den Zellen in Gegenwart von 3H-Thymidin untersucht. Die Zellproliferation als Reaktion auf den GM-CSF wird durch Messung der über die Zellen in die DNA eingebrachten Menge des mit Tritium markierten Thymidins quantifiziert. Die Ergebnisse der Bioassays an den gekürzten Formen von Sargramostim zeigten, wenn es an den Zwischenpositionen gekürzt wurde (Kombinationen von Arg4, Ser5, Ser7, Ser9 und Thr10) und auch wenn es vollkommen zu Gln11 gekürzt wurde, dass keine wesentliche Änderung der biologischen Aktivität beobachtet wurde.
  • BEISPIEL 2
  • Untersuchung der Langzeitstabilität
  • Zur Untersuchung der Langzeitwirkungen der Lagerung in Gegenwart von EDTA wurde eine Gesamtmenge von 7 Chargen LEUKINE® in CARPUJECT®-Spritzen mit und ohne den Zusatz von 5 mM EDTA vorbereitet. Die Spritzen wurden bei entweder 2-8°C (übliche Lagertemperatur) oder 30°C (zur Herbeiführung eines beschleunigten Abbaus) gelagert. Jede Spritze enthielt 1 ml Flüssigkeit mit 500 μg LEUKINE®) und 10 mM TRIS-HCl (1,2 mg/ml), 40 mg/ml Mannitol und 10 mg/ml Saccharose bei pH-Wert 7,4. Nach Inkubation über unterschiedliche Zeitdauer wurden die gelagerten Proben auf N-terminalen Abbau untersucht.
  • Bei 6 Monaten wurden die Proben mit SDS-PAGE, Umkehrphasen-HPLC, TF-1-Bioassay, Peptidmapping reduzierter und nicht reduzierter tryptischer Peptide und Massenspektrometrie (Sciex API 350) analysiert. Für die SDS-PAGE waren die Probefüllungen 1 μg/Bahn in 2× nicht reduzierendem Phosphatprobenpuffer in 16%igen TRIS-Glycin-Gelen von Novex. Die Gele wurden bei 30 mA in TRIS-Glycin-SDS-Laufpuffer laufen gelassen und mittels Anfärbungskit Novex Silver Xpress angefärbt. Für die Umkehrphasen-HPLC verwendeten wir eine Protein- und Peptidsäule C18 von Vydac (218TP54), 5 μm, 4,6 × 250 mm. Puffer A war Wasser/TFA 0,1% und Puffer B war Acetonitril/TFA 0,1%; Puffer C: 1 M NaCl/Wasser/TFA 0,1%. Der Gradient betrug: 1% B/min für 25-65%, B bei konstanten 20% und C über 40 Minuten bei 1 ml/min. Das Injektionsvolumen betrug 50 μl. Die TF-1-Assays wurden durchgeführt, wie für Beispiel 1 beschrieben. Für die Massenspektrometrie wurden Proben auf C18-Umkehrphasensäulen wie vorstehend, aber ohne Natriumchlorid entwickelt, dann in das Massenspektrometer elektroversprüht. Die Ergebnisse der Massenspektren wurden zur Erstellung von halbquantitativen Werten über den Grad des N-terminalen Abbaus verwendet, obwohl dieses Verfahren nicht validiert war. Es wird abgeschätzt, dass die Bestimmungsgrenze bei der Ermittlung des prozentualen Anteils der Spezies in voller Länge und der gekürzten Spezies mit diesem Verfahren etwa 5% ist. Das Peptidmapping reduzierter tryptischer Peptide weist C-terminale Peptide, die über Disulfid verknüpft sind, nach. Das Peptidmapping wurde mit Umkehrphasenanalyse von trypsiniertem Protein auf C18 vorgenommen.
  • Die Ergebnisse der Sechsmonatsuntersuchungen demonstrierten einen deutlichen N-terminalen Abbau, wenn LEUKINE® in Spritzen bei entweder 2-8°C oder 30°C über 6 Monate in Abwesenheit von EDTA gelagert wurde. Der Abbaugrad schwankte von Charge zu Charge beträchtlich. Bei den bei 2-8°C in Gegenwart von entweder 0,1 oder 0,5 mM EDTA inkubierten Proben wurde der N-terminale Abbau unterbunden. Bei den bei 30°C in Gegenwart von entweder 0,1 oder 0,5 mM EDTA inkubierten Proben wurde der N-terminale Abbau erheblich verringert. Es wurde außerdem beobachtet, dass bei einer einzigen Charge von LEUKINE® die bei 30°C in Gegenwart einer hohen Konzentration an EDTA (5 mM) inkubierten Proben einen ungeklärten Masseverlust von ca. 17 Da zeigten, der aber in keiner der anderen 6 Chargen, die untersucht wurden, auftrat.
  • Bei 12 Monaten wurden Proben von 7 Chargen, gelagert mit oder ohne EDTA bei 2-8°C oder mit oder ohne 5 mM EDTA bei 30°C, untersucht. Dieser Satz von Proben schloss auch eine Charge ein, die mit 0,1 mM EDTA formuliert worden war. Diese Proben wurden mit SDS-PAGE (4-20%ige Gels mit nicht reduzierendem Probenpuffer und Lauf bei 34 mA), Umkehrphasen-HPLC-Lauf wie bei den Sechsmonatsproben, TF-1-Bioassay (siehe nachstehend) und Massenspektrometrie analysiert. Die Ergebnisse zeigten im Vergleich zu den Sechsmonatsergebnissen, dass sich der N-terminale Abbau bei beiden Temperaturen in den 12 Monate ohne EDTA gelagerten Proben fortgesetzt hatte. Formulierungen mit EDTA bei einer der Konzentrationen (0,1 oder 5 mM) wurden bei Lagerung bei 2-8°C vor dem Abbau geschützt. Der N-terminale Abbau erfolgte in den bei 30°C mit oder ohne zugesetzte EDTA gelagerten Zwölfmonatsproben.
  • Eine der Testchargen wurde bei 1, 3, 6 und 12 Monaten analysiert. In dieser speziellen Charge zeigten die bei 2-8°C ohne EDTA gelagerten Proben einen zeitabhängigen Verlauf des Abbaus und die Ala3-Spezies war nach 12 Monaten völlig weg. In einer der 7 untersuchten Chargen wurde kein Rückgang der Ala3-Spezies in Abwesenheit von EDTA beobachtet, der Grund dafür ist jedoch nicht bekannt. Kurz dargestellt, zeigten 6 der 7 untersuchten Chargen N-terminalen Abbau bei Lagerung in Spritzen bei 2-8°C in Abwesenheit von EDTA.
  • Für den Zeitpunkt von 24 Monaten wurden 4 Chargen, gelagert mit oder ohne EDTA bei 2-8°C, und 4 Chargen, gelagert mit EDTA bei 30°C, untersucht. Diese Proben wurden mit SDS-PAGE, RP-HPLC, SEC, TF-1-Bioassay und Massenspektrometrie analysiert, wie in Beispiel 1 oder für die Sechsmonatsproben beschrieben. Bei den 24 Monate bei 2-8°C gelagerten Proben wurde in Abwesenheit von EDTA ein vollständiger N-terminaler Abbau der Ala3-Spezies beobachtet. Die bei 2-8°C in Gegenwart von 5 mM EDTA gelagerten Proben zeigten diesen Abbau nicht. Der Abbau der Spezies in voller Länge (Ala1-Spezies) war zu erkennen, wenn die Proben bei 30°C mit EDTA gelagert wurden. Es wird geschlussfolgert, dass LEUKINE®-Formulierungen mit 5 mM EDTA bei Lagerung bei 2-8°C 2 Jahre stabil bleiben können.
  • BEISPIEL 3
  • Einfluss der EDTA-Konzentration bei der Stabilisierung von GM-CSF
  • Leukine wurde bei 2-8°C oder 30°C über 14 Monate in CARPUJECT®-Spritzen mit 0; 0,1; 1,5; 5; 10 oder 50 mM EDTA gelagert.
  • Nach 6 Wochen wurden einige der Proben mit nicht reduzierender SDS-PAGE, Umkehrphasen-HPLC, Massenspektrometrie und Peptidmapping reduzierter und nicht reduzierter Peptide analysiert, wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben. Nach 14 Monaten wurden die restlichen Proben mit SDS-PAGE, Größenausschlusschromatographie (SEC) auf BIORAD®-Biosil-Säulen, Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Protein- und Peptidsäule C18 von Vydac, TF-1-Bioassay und Massenspektrometrie analysiert, wie vorstehend beschrieben, außer dass für die Größenausschlusschromatographie (SEC) 20 μl jeder Probe in eine Biorad-Biosil-Säule 125 injiziert und unter Verwendung von 100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH-Wert 6,8, bei 1 ml/min als mobile Phase isokratisch eluiert wurden. Die Analysen nach 14 Monaten schlossen Proben, gelagert bei 2-8°C mit oder ohne EDTA und gelagert bei 30°C mit EDTA, ein.
  • Die Ergebnisse bestätigten, dass EDTA beim Schützen von LEUKINE® vor N-terminaler Kürzung in bei 2-8°C über 14 Monate gelagerten Proben wirkt. Zu diesem Zeitpunkt standen die bei 30°C mit 10 mM EDTA gelagerten Proben nicht mehr zur Untersuchung zur Verfügung, alle anderen Proben wurden jedoch mit allen vorstehend beschriebenen Verfahren, außer Peptidmappinguntersuchung, analysiert. Die bei 30°C gelagerten Proben zeigten eine Abnahme des Anteils der Spezies in voller Länge (Ala1-Spezies) im Vergleich zu den bei 2-8°C gelagerten Proben, und der N-terminale Abbau war in den ohne EDTA bei 30°C gelagerten Probe am schlimmsten. Die bei 30°C gelagerten Proben zeigten auch eine erhebliche Oxidation, nachgewiesen durch einen großen Anteil von früh eluierendem Material, der mit Umkehrphasen-HPLC ersichtlich war. Für die bei 2-8°C gelagerten Proben waren Konzentrationen an EDTA bis 0,1 mM herab bei der Hemmung des N-terminalen Abbaus von GM-CSF wirksam.
  • Nachstehende Tabelle 1 stellt die auf Massenspektrometrie nach 14 Monaten Lagerung basierenden Schätzwerte dar. Die Zahlen in Tabelle 1 geben den analysierten prozentualen Anteil am Gesamtprotein an, der durch jede der in der Tabelle aufgeführten Spezies gebildet wurde. Ohne EDTA wurden 24% des bei 2-8°C gelagerten GM-CSF zu Arg4 oder Ser5 verkürzt. In allen mit EDTA bei 2-8°C gelagerten Proben wurden, ungeachtet der EDTA-Konzentration, keine Spezies kleiner als Arg4 beobachtet und nur 5% oder weniger des Leukine endete bei Arg4. Die in Gegenwart von EDTA bei 2-8°C gelagerten Proben bestanden aus 57-71% GM-CSF in voller Länge (Ala1). Da 0,1 mM EDTA so schützend wie die untersuchten höheren Konzentrationen war, ist es möglich, dass Konzentrationen an EDTA geringer als 0,1 mM ebenso wirksam bei der Verhinderung des N-terminalen Abbaus sind.
  • In allen bei 30°C gelagerten Proben gab es einen großen Anteil N-terminalen Kürzens, ob EDTA vorhanden war oder nicht (siehe Tabelle 1). Beispielsweise wurden in der ohne EDTA bei 30°C gelagerten Probe 61% des Proteins zu Arg4 oder weiter gekürzt. Bis zu Trp13 gekürzte Spezies wurden gefunden. Dagegen wiesen die bei dieser Temperatur mit EDTA gelagerten Proben nur 20-30% bis Arg4 oder darüber hinaus gekürzte Spezies, ohne Kürzungen über Thr10 hinaus, auf. Der Abbau beinhaltete eine erhebliche Verringerung der Spezies in voller Länge (Ala1-Spezies), wobei nur 28-39% der Spezies in voller Länge nach 14 Monaten bei 30°C zurückblieben.
  • Die Proben wurden in dem TF-1-Bioassay untersucht, um die Bioaktivität im Vergleich zu einer Referenzprobe von GM-CSF zu bewerten. Die ohne EDTA bei 30°C gelagerte Probe zeigte eine ungewöhnlich hohe Aktivität. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass es in den bei 30°C in Gegenwart von EDTA gelagerten Proben eine leichte Abnahme der Bioaktivität gegeben haben kann, aber es gab in keinem Fall einen eindeutigen Trend, der zeigte, dass sich die Bioaktivität in dieser Gruppe der Proben mit steigenden Mengen an EDTA erhöhte. Alle bei 2-8°C mit oder ohne EDTA gelagerten Proben wiesen eine mit der Referenzprobe von LEUKINE® vergleichbare Bioaktivität auf.
  • Die vorstehenden Untersuchungen bestätigten, dass EDTA bei von 0,1 bis 50 mM reichenden Konzentrationen beim Schützen von GM-CSF vor N-terminaler Kürzung in bei 2-8°C bis zu 14 Monaten gelagerten Proben wirkt. Die bei 30°C gelagerten Proben zeigten eine Abnahme des Anteils der Spezies in voller Länge (Ala1-Spezies) im Vergleich zu den bei 2-8°C gelagerten Proben, und der N-terminale Abbau war in der ohne EDTA bei 30°C gelagerten Probe am extremsten. Die bei 30°C gelagerten Proben zeigten auch eine erhebliche Oxidation, wie nachgewiesen durch einen großen Anteil von früh eluierendem Material, der mit Umkehrphasen-HPLC ersichtlich war. Tabelle 1. Massenspektrometrieanalysen von LEUKINE®, gelagert 14 Monate bei 2-8°C oder 30°C
    Figure 00170001
    • -: keine Probe
  • Während die beispielhaften Ausführungsformen der Erfindung vorstehend erläutert und beschrieben wurden, wird es selbstverständlich sein, dass verschiedene Veränderungen darin vorgenommen werden können, ohne vom Wesen und Umfang der Erfindung abzuweichen.
  • SEQUENCE LISTING
    Figure 00180001

Claims (14)

  1. Physiologisch verträgliche wässrige Lösung, die rekombinanten Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor und von 0,1 mM bis 50 mM EDTA umfasst.
  2. Wässrige Lösung nach Anspruch 1, wobei die Konzentration an EDTA von 0,1 bis 5 mM beträgt.
  3. Wässrige Lösung nach Anspruch 1, wobei der rekombinante Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor Sargramostim ist.
  4. Wässrige Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die EDTA-Konzentration 5 mM ist, und weiter, wobei die Lösung einen pH-Wert von 7,4 hat und 10 mM TRIS-HCl, 40 mg/ml Mannitol und 10 mg/ml Saccharose umfasst.
  5. Wässrige Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend GM-CSF zu 500 μg/ml, 10 mM TRIS-HCl, 40 mg/ml Mannitol, 10 mg/ml Saccharose bei pH-Wert 7,4 und 1,1% Benzylalkohol.
  6. Verfahren zur Herstellung einer stabilisierten, physiologisch verträglichen, wässrigen Lösung des Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors, umfassend Mischen von EDTA mit einer wässrigen 500 μg/ml Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor umfassenden Lösung, 10 mM TRIS-HCl, 40 mg/ml Mannitol und 10 mg/ml Saccharose, auf eine Konzentration von 0,1 bis 50 mM.
  7. Verfahren zur Herstellung einer lyophilisierten Formulierung von rekombinantem Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor, welches umfasst: a) Herstellen der wässrigen Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und b) Lyophilisieren der wässrigen Lösung.
  8. Verfahren zur Herstellung einer lyophilisierten Formulierung von rekombinantem GM-CSF, umfassend: a) Lyophilisieren einer wässrigen Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, jedoch ohne EDTA, und b) Zusetzen einer geeigneten Menge an EDTA zur Bildung einer lyophilisierten Formulierung, die bei Hydratisierung die wässrige Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 ergibt.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei der rekombinante Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor Sargramostim ist.
  10. Wässrige Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung bei der Therapie.
  11. Verwendung der wässrigen Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer entzündlichen Darmerkrankung.
  12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die entzündliche Darmerkrankung Morbus Crohn ist.
  13. Verwendung der wässrigen Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Geschwüren.
  14. Lyophilisierte Formulierung von rekombinantem Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor, erhältlich gemäß dem Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8.
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