DE60219621T2

DE60219621T2 - Organometallischer Komplex

Info

Publication number: DE60219621T2
Application number: DE60219621T
Authority: DE
Inventors: Jih-Ru Hwu; Shwu-Chen Tsay; Kuang-Lieh Lu; Jiann-Jyh Lo-Tung Town Huang; Jui-Te Neihu Hung; Sheng-Fa Pa-De Yu
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-08-29
Filing date: 2002-08-29
Publication date: 2007-12-20
Anticipated expiration: 2022-08-30
Also published as: DE60219621D1; ATE360024T1; EP1394169A1; EP1394169B1

Description

HINTERGRUND
Übergangsmetallkomplexe, die DNA schneiden, sind weithin als „chemische Nukleasen" bekannt. Siehe z. B. Pyle & Barton (1990) Prog. Inorg. Chem. 38:413; Sigman et al. (1987) Acc. chem. Res. 26:98; and Stubbe & Kozarich (1987) Chem. Rev. 87:1107. Diese Komplexe binden fest an DNA und spalten diese dann unter verschiedenen Bedingungen. Zum Beispiel kann ein Übergangsmetallkomplex DNA spalten, sobald er an ein DNA-spaltendes Motiv bindet, z. B. Acridinorange (Lippard et al. (1984) J. Am. Chem. Soc. 106:6102); sobald er mit Röntgenstrahlen bestrahlt wird (Grokhovsky & Zubarev (1991) Nucl. Acids Res. 19:257); oder unter photolytischen Bedingungen (Rudnicki et al. (1991) Bioorg. Med. Chem. Lett. 1:451; oder Thorp et al. (1995) J. Am. Chem. Soc. 117:11673).
Darüber hinaus können die gerade beschriebenen Übergangsmetallkomplexe Antikrebsaktivität besitzen. Siehe z. B. Bruhn et al. (1987) Prog. Inorg. Chem. 38:477; und Sherman & Lippard (1987) Chem. Rev. 87:1153. Zum Beispiel wurden Cisplatin und Carboplatin (in anderen Worten Platinkomplexe) routinemäßig zur Behandlung von Hoden- oder Gebärmutterkrebs eingesetzt (Christian (1992) Semin. Oncol. 19:720; und Barnard (1989) J. Plat. Met. Rev. 33:162). Darüber hinaus wurden viele Cisplatinderivate als neue Antikrebsmittel mit weniger toxischen Nebenwirkungen und einer reduzierten Resistenz entwickelt. Siehe Reedijk (1996) J. Chem. Soc., Chem. Commun. 801; und Hambley (1997) Coord. Chem. Rev. 166:181. Wo 89/09598 beschreibt DACH-PEKomplexe mit Antikrebsaktivität.
ZUSAMMENFASSUNG
Diese Erfindung betrifft einen Übergangsmetallkomplex, der sich als Nukleinsäure bindendes und spaltendes Agens eignet. Diese Erfindung betrifft einen Metallkomplex der Formel:
wobei M Pt ist;
X ein Pyridinyl ist;
Y ein Halogen, Tosylat, Mesylat, Triflat, Pyrophosphat oder Carboxylat ist;
A₁ C ist, A₂ N ist, A₃ ist S und A₄ ist O;
und R1 und R2 unabhängig voneinander Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Alkoxyl, Aryloxyl, Heteroaryloxyl, Alkoxycarbonyl, Aryloxylcarbonyl oder Heteroaryloxylcarbonyl sind.
Ein beispielhafter Komplex dieser Erfindung ist PtCl(DMSO) [η²-C₅H₄SN(O)]:
Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Cyclyl, Heterocyclyl, Alkoxyl, Aryloxyl, Heteroaryloxyl, Alkoxylcarbonyl, Aryloxylcarbonyl oder Heteroaryloxylcarbonyl wie oben erwähnt bezieht sich sowohl auf substituierte als auch unsubstituierte Einheiten. Im Rahmen dieser Anmeldung ist Alkyl eine geradlinige oder verzweigte Hydrocarbonkette, welche 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält. Der Begriff „substituierte" bezieht sich auf einen oder mehrere Substituenten (welche dieselben oder verschiedene sein können) und jeder ein Wasserstoffatom ersetzen. Beispiele für Substituenten schließen die folgenden ein, ohne jedoch limitierend zu sein: Halogen, Hydroxyl, Amino, Cyano, Nitro, C₁-C₆Alkyl, C₁-C₆ Alkenyl, C₁-C₆ Alkoxyl, Aryl, Heteroaryl oder Heterocyclyl, wobei Alkyl, Alkenyl, Alkoxyl, Aryl, Heteroaryl und Heterocyclyl wahlweise mit C₁-C₆ Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Halogen, Hydroxyl, Amino, Alkylamino, Arylamino, Dialkylamino, Diarylamino, Cyano oder Nitro, substituiert sind. Der Begriff „Aryl" betrifft ein Hydrocarbonringsystem mit wenigstens einem aromatischen Ring. Beispiele für Aryleinheiten schließen die folgenden, ohne jedoch limitierend zu sein, ein: Phenyl, Naphthyl und Pyrenyl. Der Begriff „Heteroaryl" betrifft ein Hydrocarbonringsystem mit wenigstens einem aromatischen Ring, der wenigstens ein Heteroatom wie O, N oder S enthält. Beispiele für Heteroaryleinheiten schließen, ohne jedoch limitierend zu sein, die folgenden ein: Pyridinyl, Carbazolyl und Indolyl.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Binden und Spalten einer Nukleinsäure. Das Verfahren schließt das Inkontaktbringen einer Nukleinsäure mit einem oder mehreren der oben beschriebenen Metallkomplexe ein. Das Spalten der Nukleinsäure kann durch UV-Bestrahlung des Metallkomplexes, der an die Nukleinsäure gebunden ist, erreicht werden. Die hierin be schriebene Nukleinsäure betrifft eine Purin enthaltende DNA oder RNA. Sie kann sowohl einzelsträngig, doppelsträngig oder partiell einzel- oder partiell doppelsträngig sein. Gemäß einigen Ausführungsbeispielen wird das Verfahren dieser Erfindung in einem wässrigen Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 8 durchgeführt. Ein Spalten kann unter Verwendung von UV-Licht mit einer Wellenlänge > 300 nm durchgeführt werden.
Weitere Merkmale, Zwecke und Vorteile der Erfindung sind aus der folgenden Beschreibung und den Ansprüchen offensichtlich.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Diese Erfindung betrifft einen Übergangsmetallkomplex und dessen Verwendung als Nukleinsäure bindendes und spaltendes Agens. Der Metallkomplex dieser Erfindung kann durch bekannte Verfahren einschließlich der synthetischen Herstellungsverfahren, die hierin offenbart werden, hergestellt werden.
Zum Beispiel kann ein Metallkomplex durch das Hinzufügen eines Mercapto, oxidsubstituierten Heteroaryls zu einer Lösung, die K₂PtCl₄ enthält, hergestellt werden. Die Addition wird im Dunkeln ausgeführt. Anschließend wird ein R₁, R₂-substituiertes Sulfoxyd zu der Lösung zugegeben, um den erwünschten Metallkomplex herzustellen. Das Verfahrensprodukt kann über chromatographische Säulen aufgereinigt werden. Im Nachfolgenden wird ein Schema zur Synthese eines Metallkomplexes dieser Erfindung aufgezeigt (z. B. Komplex 1: vergleiche die Box im Schema).
Ein Übergangsmetallkomplex dieser Erfindung kann als Nukleinsäure bindendes oder spaltendes Agens eingesetzt werden. Typischerweise bindet er an den Heteroarylring eines Purins der Nukleinsäure. Die Bindung kann koordiniert zwischen dem Übergangsmetall und einem Heteroatom wie etwa Stickstoff ablaufen. Man nehme z. B. Komplex 1. Dieser bindet spezifisch an die C-6 Aminosäure eines Adenins. Ohne Bestrahlung zeigt eine massenspektrometrische Analyse kein Anzeichen einer DNA-Spaltung, resultierend aus dieser Bindung. Nach einer UV-Bestrahlung bildet sich ein intramolekularer Ringschluss, der zu einer Nukleinsäurespaltung führt. Darüber hinaus bindet der Übergangsmetallkomplex auch an ein Guanin in Anwesenheit einer externen Base (z. B. Piperidin). Der Komplex bindet dabei nicht nur spezifisch an die C-2 Aminosäure des Guanins, sondern es kommt auch zur Spaltungsreaktion unter Beteiligung der externen Base unter UV-Bestrahlung. Siehe die nachfolgenden spezifischen Beispiele.
Ein gespaltenes Nukleinsäureprodukt („genickte Nukleinsäure") enthält wenigstens einen Bruch, wobei zwei nebeneinander liegende Basen nicht kovalent verbunden sind. Dies kann unter Verwendung von denaturierenden Polyacrylamidgelen nachgewiesen werden (Molecular Cloning, 2^nd Ed. Sambrook et al. eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Es ist auch möglich, die genickte Nukleinsäure gelelektrophoretisch aufzutrennen und nachzuweisen, wobei die genickte Nukleinsäure mit einem fluoreszierenden oder radioaktiven Markierung versehen ist.
Ein Übergangsmetallkomplex dieser Erfindung kann eine Nukleinsäure (z. B. DNA) in vivo binden und spalten. Es ist wohl bekannt, da eine selektive Interaktion eines Metallkomplexes mit zellulärer DNA zum Tod der Tumorzellen führt. Für geeignete Reviews siehe Reedik (1992) Inorganica Chimica Acta 198-200:873; und Wong & Giandomenico (1999) Chem Rev 99:2451. Diese Erfindung deckt daher eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren ab, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung ein wirksames Gemenge wenigstens eines Übergangsmetallkomplexes, wie er in dem Abschnitt zusammenfassend beschrieben ist und einen pharmazeutisch annehmbaren Trägers, darstellt.
Weiterhin kann der zuvor beschriebene Übergangsmetallkomplex auch als Schere für Nukleinsäure dienen, um kurze Nukleinsäurefragmente zu produzieren. Eine Vielzahl neuer Techniken, wie Massenspektrometrie und Micro-Arrays verwenden kurze Nukleinsäurefragmente in der Analyse oder der Sequenzierung. Siehe z. B. Nordhoff (1996) Trends Anal. Chem. 15:240; Ramsay (1998) Nat. Biotechnol. 16:40; und Marshall & Hodgson (1998) Nat. Biotechnol 16:27. Die Übergangsmetallkomplexe dieser Erfindung sind daher für diese neuen Techniken geeignet. Z. B. kann der Komplex in einem Genchip zum Nachweis von Krebs oder Viruserkrankungen verwendet werden.
Die nachfolgenden speziellen Beispiele sind rein illustrativer Natur und beschränken den Rest der Offenbarung in keiner Art und Weise. Es wird davon ausgegangen, dass der Fachmann basierend auf der vorliegenden Beschreibung und ohne weitere Anstrengungen die Erfindung in ihrem vollen Umfang einsetzen kann.
Synthese eines Organoplatinkomplexes PtCl (DMSO) [η²-C₂H₄SN(O)]
Es wurde zu eine Lösung von Natrium 2-Mercaptopyridin-N-oxid in N,N-Dimethylformamid (10 mL) über einen Zeitraum von einer Stunde und im Dunkeln langsam K₂PtCl₄ (415 mg, 1.000 mmol) in 100 mL wässriger Lösung zugegeben. Anschließend wurde Dimethylsulfoxyd (DMSO, 1,0 mL) zu der Lösung zugegeben und für drei Tage gerührt. Die Lösungsmittel wurden aus der Lösung unter reduziertem Druck entfernt und es wurde ein Produkt erhalten. Das Produkt wurde unter Verwendung einer Chromatographiesäule, die mit Silikagel (100 % CH₂Cl₂ als Eluent) gepackt war, aufgereinigt, um [Pt(Cl)(DMSO)(η²-C₅H₄SN(O))] (Komplex 1) als gelbes Pulver (408 mg, 0,940 mmol, 94 % Ausbeute) zu erhalten.
Elementaranalyse für PtC₇H₁₀NO₂S₂:

Berechnet: C, 19,34; H, 2,32; N, 3,22.
Gefunden: C, 19,56; H, 2,18; N, 3,10.
MS (FAB, ¹⁹⁵Pt, ³⁷Cl) m/z: 436 (M⁺), 399 (M⁺ – Cl), 305 (M⁺ – L).

Kristallographische Daten: Die kleinste Einheit besteht aus zwei Molekülen: C₁₄H₂₀C₁₂N₂O₄S₄Pt₂:
M = 869,64, triklin, Raumgruppe P1, mit den Gitterkonstanten
a = 10,249 (3) Å, b = 10,963 (5) Å, c = 11,083 (3) Å,
α = 82,71(3)°, β = 76,183(21)°, γ = 76,64(3)°,
V = 1171,1(7) Å³, Z = 2, Dc = 2,462 g cm^–3, T = 298 K,
... = 0,71069 Å, μ (Mo/Ka) = 12,6336 nm^–1,
Enraf-nonius CAD4-Diffraktometer, 20_max = 45,0°,
3259 gemessene Refraktionen, 1861 konnten beobachtet werden (R = 0,057, ωR (F²) = 0,059).
Die [Pt(Cl)(DMSO)(η²-C₅H₄SN(O))] Struktur wurde auch über Einzelkristallröntgendiffraktionsanalyse identifiziert. Das 1-Hydroxypyridin-2-Thion gab insgesamt drei Elektronen zur Bindung mit einem Pt-Metallatom ab, d. h. das Thiolatzentrum stellte ein Elektron und das Sauerstoffatom stellte zwei Elektronen zur Verfügung.
Einzelstrang DNA Spaltung
Spaltung bei verschiedenen pH-Werten: Eine Reaktionsmischung (10 μL), welche supercoiled, zirkuläre ϕX174 RFI DNA Stocklösung (50 μM/Basenpaar), Komplex 1 (5,0 μM) und einen Phosphatpuffer (0,10 M, pH 5,0, 6,0, 7,0 und 8,0) in einem Pyrexröhrchen enthielt, wurde bei 37° C vorinkubiert. Die Reaktionsmischung wurde dann mit 350 nm UV-Licht (32-W) für 2 Stunden bei Raumtemperatur bestrahlt. Nach Zugabe eines Gelladepuffers (0,25 % Bromophenolblau, 0,25 % Xylencyanol und 30 % Glycerol) wurde der Reaktionsmix auf ein 1%iges Agarosegel geladen und anschließend mit Ethidiumbromid gefärbt. Die Banden im Geld wurden durch einen 312 nm UV-Transilluminator sichtbar gemacht und mit einer FB-PDC-34-Kamera photographiert. Die supercoiled zirkuläre DNA und die gespaltene DNA konnten klar im Gel gesehen werden. Die Ergebnisse zeigten, dass gespaltene DNA nur beobachtet werden konnte, wenn der Reaktionsmix einen pH von 5,0, 6,0 oder 7,0 hatte und dass die supercoiled zirkuläre DNA und gespaltene DNA beobachtet werden konnten, wenn der Reaktionsmix einen pH von 8,0 hatte.
Spaltung bei verschiedenen Konzentrationen des Komplexes:
Die Reaktionsmischungen (10 μL), die supercoiled zirkuläre ϕX174 RFI DNA Stocklösung (50 μM/Basenpaar), den Komplex 1 (0,050-100 μM) und einen Phosphatpuffer (0,1 M, pH 6,0) enthielten, wurden in einem Pyrexröhrchen bei 37° C vorinkubiert. Die Mischung wurde mit 350 nm UV-Licht (32-W) für 2 Stunden bei Raumtemperatur bestrahlt. Nach dem Zugeben eines Gelbeladungspuffers (0,25 % Bromophenolblau, 0,25 % Xylencyanol und 30 % Glycerol) wurde der Reaktionsmix auf ein 1%iges Agarosegel geladen und anschließend mit Ethidiumbromid gefärbt. Die Banden im Gel wurden mit einem 312-nm UV-Transilluminator sichtbar gemacht und mit einer FB-PDC-34-Kamera photographiert. Die supercoiled zirkuläre DNA (Form I) und die gespaltene DNA (Form II) waren deutlich im Gel erkennbar. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst:
Tabelle 1: Spaltung von Einzelstrang-supercoiled-zirkulärer ϕX174 RFI mit Komplex 1

^αIm Dunkeln.

Die Ergebnisse zeigen, dass Komplex 1 DNA in einer pH-abhängigen Art und Weise (pH 5,0-8,0) spaltet und saure Bedingungen bevorzugt sind (pH 5,0-7,0). Überraschenderweise zeigte dieser Metallkomplex ausgesprochen starke DNA-spaltende Aktivität sogar bei einer Konzentration von nur 1,0 μM. Weiterhin trat keine Spaltung von Einzelstrang-DNA im Dunkeln auf.
Ortsspezifische DNA-Spaltung
Ein 160-Bp Doppelstrang-DNA-Fragment wurde aus einem 501-660 Fragment der pBR322 DNA präpariert. Es wurde mittels Polymerasekettenreaktion amplifiziert (Bailly & Waring (1995) J. Am. Chem. Soc. 117:7311; Bailly et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:3784; und Sayers & Waring (1993) Biochemistry 32:9094), und am 5'-terminalen Ende mit γ-[³²P]-ATP und einer T4-Polynukleotidkinase markiert. Ein Reaktionsmix, der eine am 5'-Terminus markierte ³²P-DNA-Lösung, einen Phosphatpuffer (0,10 M, pH 6,0) und den Komplex 1 (20-100 μM) in einem Pyrexröhrchen enthielt, wurde bei 37° C für 30 Minuten vorinkubiert. Die Reaktionsmischung wurde mit 350 nm UV-Licht unter aeroben Bedingungen für zwei Stunden bei Raumtemperatur bestrahlt. Der an DNA-Fragmente gebundene Metallkomplex wurde unter Verwendung von 0,3 N NaCN (pH = 11) bei 37° C für acht Stunden, entfernt (Schwartz et al. (1990) J. Am. Chem. Soc. 112:3673; und Zou et al. (1994) Biochemistry 33:5404). Die Reaktionsmischung wurde dann entweder mit einem Gelladepuffer oder 95 % Ethanol gequenched. Einige Proben, die einer Piperidinbehandlung unterzogen wurden, wurden durch die Zugabe von Ethanol ausgefällt und in einer wässrigen Piperidinlösung (1,0 M, 60 μL) bei 95° C für 30 Minuten resuspendiert. Nachfolgend wurden alle Proben sequenziell lyophilisiert, mit Wasser behandelt (30 μL), lyophilisiert und in einem Gelladepuffer (80 % Formamid, 0,25 % Bromophenolblau und 0,25 % Xylencyanol) resuspendiert. Die Proben und ein Maxam-Gilbert-Marker wurden durch ein 10%iges Polyacrylamid/8,0 M Harnstoffgel analysiert. Die Elektrophorese wurde bei einer Spannung von 300 Volt für 60 Minuten durchgeführt und anschließend wurde die Spannung auf 600 Volt für weitere acht Stunden angehoben. Das Gel wurde unter Verwendung eines Kodak X-Omat Ar-5-Films und eines intensivierenden Bildschirmes sichtbar gemacht, welcher für 24 Stunden bei –70° C exprimiert wurde. Die Quantifizierung der relativen Intensität der DNA-Fragmente wurde unter Verwendung eines Mictrotek-Scanners und der NIH 1.60-Imagesoftware durchgeführt.
Die nachgewiesenen DNA-Fragmente wurden mit dem Maxam-Gilbert-Marker auf einem Autoradiogramm verglichen und durch ein computerunterstütztes Programm quantifiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass der Komplex 1 die DNA an Purinresten mit einer radioaktiven Piperidinbehandlung (Armitage (1998) Chem. Rev. 98:1171) und an Adeninresten ohne Piperidinbehandlung schneiden.
DNA-bindender und -schneidender Mechanismus
Ein doppelt helikales Oligonukleotid d(ATAT)₂ wurde hergestellt und zu einer Phosphatpufferlösung (pH = 6,0), die den Komplex 1 (1:1) enthielt, zugegeben. Die Lösung wurde für zwei Stunden im Dunkeln aufbewahrt. Es wurde ein Zwischenprodukt nachgewiesen mit einer Ausbeute von 57 %, und einem Signal bei 650,1 für (M + H⁺), was sich aus einer Analyse mittels eines Elektronenspray-Ionisationsdetektors in der LC-Massenchromatographie ergab. Dann wurde die Lösung mit 350 nm UV-Licht für zwei Stunden bei Raumtemperatur bestrahlt. Es wurde ein Produkt mit einem Signal bei 456,1 für (M + H⁺) nachgewiesen. Die Ergebnisse deuten an, dass Komplex 1 zunächst an das C-6-Amino an einem Adenin bindet und ein Zwischenprodukt bildet. Dann bildete sich ein intramolekulärer Ringschluss aus, um das DMSO zu entfernen und um eine kovalente Bindung zwischen dem N-7-Stickstoffatom und dem Platin in Komplex 1 zu bilden, welche zur Spaltung des Oligonukleotids führt. Das Kontrollexperiment hat gezeigt, dass die Spaltreaktion durch die UV-Bestrahlung angeregt wurde.
Das nachfolgende Schema stellt die gerade beschriebene Reaktion dar:
Zum Vergleich wurde eine Reaktion, die 2'-Deoxyguanosin und Komplex 1 mit einschloss, ausgeführt. Komplex 1 band an die C-2 Aminogruppe des Guanins, um eine kovalente Pt-N-Bindung auszubilden. Ein intramolekulärer Ringschluss fand nicht statt aufgrund des Abstandes und der geometrischen Unzulänglichkeiten zwischen dem Pt und dem N-7-Stickstoffatom des Guanins. Im Ergebnis zeigte sich, dass die Spaltung an einem Guanin die Unterstützung einer externen Base (z. B. Piperidin) benötigt. In einem weiteren Experiment wurde ein Überschuss an Komplex 1 zu einer 2'-Deoxyguanosinlösung zugegeben und anschließend mit Piperidin behandelt. Es wurde ein Zwischenprodukt mit einer Ausbeute von 42 % nachgewiesen bei einem Signal von 1063,9 für (M + H⁺), wie es durch einen Elektronenspray-Ionisierungsdetektor im LC-Massenchromatogramm analysiert wurde. Das Zwischenprodukt war in der Lage, ein zyklisches Produkt hervorzubringen mit einer Ausbeute von 80 % bei einem Signal von 792,0 für (M + H+) bei 350-nm UV-Bestrahlung, jedoch nicht im Dunkeln. Das nachfolgende Schema beschreibt die gerade beschriebene Reaktion:
Die dargestellten Ergebnisse deuten an, dass Komplex 1 effizient an DNA bindet und diese unter kontrollierten Bedingungen deutlich spaltet; sowie, dass das UV-Licht als Auslöser fungierte, um die Spaltung an den Purinresten auszulösen.

Claims

Ein Metallkomplex der Formel
wobei M Pt ist; X ein Pyridinyl ist; Y ein Halogen, Tosylat, Mesylat, Triflat, Pyrophosphat oder Carboxylat ist; A₁ ist C, A₂ ist N, A₃ ist S und A₄ ist O; und R₁ und R₂ unabhängig voneinander Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Alkoxyl, Aryloxyl, Heteroaryloxyl, Alkoxylcarbonyl, Aryloxylcarbonyl oder Heteroaryloxalcarbonyl sind.
Der Metallkomplex gemäß Anspruch 1, wobei Y ein Halogen ist.
Der Metallkomplex gemäß Anspruch 1, wobei R₁ und R₂ jeweils ein Alkyl sind.
Der Metallkomplex gemäß Anspruch 1, wobei der Metallkomplex die Formel hat:
Zusammensetzung enthalten den Metallkomplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 und weiterhin enthaltend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Metallkomplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder Zusammensetzung gemäß Anspruch 5 zur Verwendung als Medikament.
Verwendung des Metallkomplexes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder der Zusammensetzung gemäß Anspruch 5 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumoren.