DE602004010578T3

DE602004010578T3 - Vorrichtung und Verfahren zur Aufnahme von Tierzellenkolonien

Info

Publication number: DE602004010578T3
Application number: DE602004010578.3T
Authority: DE
Inventors: Stephen Richmond; Christopher Mann; Andrew Board; Yonggang Jiang
Original assignee: Molecular Devices LLC
Current assignee: Molecular Devices LLC
Priority date: 2003-08-01
Filing date: 2004-07-22
Publication date: 2017-08-31
Anticipated expiration: 2024-07-23
Also published as: DE602004010578T8; DE04254370T1; EP1754537A1; US8293526B2; US20050026221A1; US20090116714A1; EP1502649B2; US8034625B2; US7776584B2; EP1882523B1; DE602004010578D1; DE602004010578T2; US8034612B2; US8293527B2; DE602004027761D1; DE07020151T1; DE202004021397U1; EP1754537B1; US20120028238A1; US20120028237A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufnahme von Tierzellkolonien.
Automatisierte Vorrichtungen für verschiedenartige wiederholte Aufgaben in Bezug auf genetische und proteomische Untersuchungen haben weite Verbreitung gefunden. Beispielsweise sind seit mehreren Jahren automatisierte Vorrichtungen im Handel erhältlich, die zur Mikroanordnung von Proben, zum Aufnehmen von Bakterienkolonien oder zum Gewinnen von Gel-Kernen dienen. Beispielhaft beschreiben WO-A-92/1233A [7] und Johns et al [9] einen frühen Bakterienkolonie-Aufnahmeroboter unter Verwendung von festen Nadeln. Uber et al [8] beschreibt eine Bilddarstellung zum Identifizieren der Koordinaten von Bakterien- oder Hefe-Kolonien, sowie einen separaten Aufnahmeroboter zum Aufnehmen der Kolonien auf der Basis von mit der Bildeinrichtung erzeugten Koordinaten, wobei das Aufnehmen durch Eintauchen einer entsorgbaren Pipettenspitze in die Probenflüssigkeit ausgeführt wird. Eine Vorrichtung zum automatischen Aufnehmen von Säugetier-Zellkolonien stand jedoch bisher nicht zur Verfügung.
Proben von Säugetier-Zellkolonien liegen üblicherweise in einer von zwei Typen vor. Beim ersten Typ ist die Säugetier-Zellkolonie in einem halb-festen Medium in Suspension gehalten. Beim zweiten Typ haftet die Säugetier-Zellkolonie auf einem Substrat und ist in einem flüssigen Medium eingetaucht.
Ein Problem beim automatischen Aufnehmen von Säugetier-Zellkolonien des ersten Typs liegt im Lokalisieren, Entnehmen und Abgeben von individuellen Zellzielkolonien aus dem halb-festen Medium. Bei anhaftenden Kolonien besteht das zusätzliche Problem, dass die Kolonie vom Substrat abgelöst werden muss, bevor sie entnommen werden kann. Die Standard Praktiken (nicht automatisiert) zum Ablösen von anhaftenden Kolonien sind ein Abkratzen mit einem Skalpell oder einer andersartigen mechanischen Klinge, und Aufschluss mit Trypsin. Keine dieser Praktiken ist für eine Automatisierung gut geeignet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der Erfindung ist ein Verfahren gemäß Anspruch 1 vorgesehen.
Der automatisierte Prozess kann zum Sortieren oder Aufnehmen von Tierzellkolonien verwendet werden, die biologische Moleküle enthalten, ausdrücken oder absondern, wie etwa ein Protein (Eiweiß) oder einen Kohlenwasserstoff von Interesse, und die über eine Zellenabbildung erfasst werden können. Die Tierzellkolonien können optisch auf verschiedene Arten erfasst werden, z. B. mit Hilfe von fluoreszierender Färbung, nicht-fluoreszierender Färbung oder ohne jegliche Färbung; über Raman-Streuung, durch Phasenkontrast oder Verwendung von Nomarski-Interferenzabbildung.
Die Kolonien werden hauptsächlich aus Säugetier-Zellkolonien bestehen, aber auch andere Tierzellkolonien, wie Insekten-Zellkolonien können aufgenommen werden. Die Ziel-Tierzellkolonien können anhand einer Vielzahl von Eigenschaften unterschieden werden, wie etwa Form, Größe, Farbe oder molekularer Inhalt der Zelle, der Membran oder deren Ausscheidungen oder durch eine beliebige Kombination mehrerer Eigenschaften.
Der Aufnahmeschritt kann ein Wiederholen der Ausrichtungs- und Ansaugschritte für mehrere der hohlen Nadeln umfassen, um mehrere der Tierzellkolonien aufzunehmen.
Der Abgabebehälter kann eine Anordnung von Titern (Mulden) umfassen, die in einem charakteristischen Abstand zueinander angeordnet sind. In diesem Fall wird es bevorzugt, dass auch die hohlen Nadeln in diesem charakteristischen Abstand zueinander angeordnet sind, damit der Abgabeschritt parallel für alle hohlen Nadeln ausgeführt werden kann. Es ist günstig, wenn die hohlen Nadeln in einem charakteristischen Abstand angeordnet sind, der mit einem Standardabstand für Titerplatten übereinstimmt. Dies vermindert die Bewegung des Aufnahmekopfes und erlaubt es, den Prozess zu Parallelisieren.
Die Tierzellkolonien können mit einem fluoreszierenden Eiweiß/Protein (FP) kontaktiert sein oder dieses ausdrücken, z. B. ein grün fluoreszierendes Protein (GFP), um die Bildverarbeitung zu unterstützen. Das FP kann in den Zellen vorliegen, auf der Oberfläche der Zellen oder in das die Zellen umgebende Medium abgesondert sein. Der Prozess kann auf jedem Molekül beruhen, das mit einem Antikörper, einem Liganden oder einem Rezeptor detektierbar ist.
Der Aufnahmekopf kann in vorteilhafter Weise einen Antriebsmechanismus zur Erzeugung von seitlichen Oszillationen der distalen Enden der hohlen Nadeln umfassen, um das Ablösen von anhaftenden Tierzellkolonien zu erleichtern. Zum Beispiel kann der Antriebsmechanismus so ausgelegt werden, dass er eine Drehbewegung der distalen Enden der hohlen Nadeln bewirkt. Andere Arten der Bewegung, etwa linear, sind auch möglich.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Zum besseren Verständnis der Erfindung und um zu zeigen, wie sie ausgeführt werden kann, wird beispielhaft auf die Zeichnungen verwiesen, die zeigen:
1 ist eine perspektivische Ansicht des unteren Teils einer Vorrichtung geeignet zur Ausführung des Verfahrens der Erfindung
2 ist eine perspektivische Ansicht der Vorrichtung
3 zeigt Einzelheiten eines Lichttisch-Beleuchtungssystems der Vorrichtung
4 ist eine schematisierte Seitenansicht der optischen Anordnung der Vorrichtung
5 ist eine perspektivische Ansicht des Aufnahmekopfes der Vorrichtung
6 ist perspektivische Ansicht einer hohlen Nadel des Aufnahmekopfes mit dem zugehörigen Antriebsmechanismus
7 ist ein schematisierter Schnitt durch die hohle Nadel und den Antriebsmechanismus von 6 im Betrieb
8 stellt eine Folge von schematischen Darstellungen der Schritte bei der Aufnahme von anhaftenden Tierzellkolonien dar
9 ist eine schematisierte Zeichnung der Fluid-Bauteile (fluidics) der Vorrichtung
10 ist ein schematisches Blockdiagramm der Steuerung der Vorrichtung
11 ist ein Flussdiagramm eines mittels der Vorrichtung durchgeführten beispielhaften Prozesses
12 ist ein Flussdiagramm des Zellkolonieaufnahmeteils des Prozesses von 11.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
1 zeigt eine perspektivische Ansicht des unteren Teils einer Vorrichtung, die zur Ausführung des Verfahrens der Erfindung geeignet ist. Der obere Teil ist nicht dargestellt, um das Vorrichtungsbett 10 sichtbar zu machen. Eine Lichttischplatte 12 aus einem durchscheinenden Material, bekannt als Opalacryl, ist bündig mit dem Vorrichtungsbett 10 montiert. Die Lichttischplatte 12 könnte auch aus einem anderen durchscheinenden Akryl- oder Glasmaterial bestehen, z. B. gesandstrahltem Glas oder Perspex (Plexiglas).
Ein Satz von Stiften oder Klammern 14 (vier in dieser Figur) ist um den Umfang der Lichttischplatte 12 vorgesehen, um Behälter für biologische Proben, wie Petrischalen, die Zellkolonien enthalten, auf dem Lichttisch anzuordnen und zu fixieren. Die Kolonien könnten auch in Q-trays, Omni-trays oder beliebigen anderen geeigneten Behältern bereitgestellt werden. Die Lichttischplatte 14 wird von unten her von optischen Einrichtungen beleuchtet, die unter dem Vorrichtungsbett in dem von dem Hauptbett 16 zur Verfügung gestellten Raum angeordnet sind.
Die Tierzellkolonien können menschliche Zellkolonien oder andere Säugetier-Zellkolonien oder Insektenzellkolonien sein. Die Zellen können z. B. unsterblich, embryonisch oder Stammzellen sein. Typischerweise würden die Zellkolonien in Gewebekultur gezogen.
Die Vorrichtung hat einen Aufnahmekopf 18 zum Aufnehmen von Säugetier-Zellkolonien, der über das Hauptbett der Vorrichtung durch x- y- und z-Positionierungsmotoren 20, 22 und 24 bewegbar ist. Der gezeigte Aufnahmekopf 18 umfasst eine Anordnung von hohlen Nadeln 26, von denen jede mit einer Fluidleitung verbunden ist. In einem Beispiel hat der Aufnahmekopf 18 eine 1 × 8 Anordnung von Nadeln, wobei jede hohle Nadel 26 ihre eigene Fluidleitung 28 besitzt, zum Ansaugen und Abgeben einer Zellkolonie, um die Zellkolonie aus einem Behälter zu entnehmen, gefolgt von Ablegen der Zellkolonieprobe in einem Titer 29 oder einen anderen Zielort. Es dürfte klar sein, dass normalerweise mehrere Titerplatten verwendet werden, obwohl nur eine aus Gründen der Einfachheit dargestellt ist. Ein Raster von Titer-Aufnahmemulden kann auf dem Hauptbett der Vorrichtung zur Verfügung gestellt werden. Es kann auch eine Automatisierung der Handhabung der Titerplatten vorgesehen sein, z. B. als ”Hotel”-System, oder einen voll-automatischen Titerplatten-Stapler und -Zuführer, wie aus dem Stand der Technik bekannt ist. Der Aufnahmekopf 18 wird von dem z-Positionierer getragen, der seinerseits vom y-Positionierer getragen wird und dieser wiederum vom x-Positionierer. Der Aufnahmekopf 18 ist auf einer Seite mit einer Kamera 19 für eine maschinelle Bildaufnahme versehen. Die Kamera 19 kann mit einem Zoom-Objektiv oder mit Wechselobjektiven ausgestattet sein, um verschiedene Vergrößerungen und damit Auflösungen zu erzielen. Alternativ kann eine weitere (nicht gezeigte) Kamera auf dem Aufnahmekopf 18 montiert sein, so dass zwei Kameras mit verschiedener Objektiv-Vergrößerung vorhanden sind. Eine für niedrige Auflösung und großes Gesichtfeld und die andere für ein kleines Gesichtsfeld mit hoher Auflösung. Im Gebrauch wird die Kamera mit niedriger Auflösung benutzt, um die gesamte Petrischale oder anderen Behälter zu erfassen (kartieren), um die Orte von Zellkolonien zu identifizieren/ermitteln. Dann wird die Kamera mit der hohen Auflösung eingesetzt, um jede Kolonie abzubilden. Selbstverständlich kann ein ähnliches Vorgehen auch mit einer einzigen am Aufnahmekopf 18 montierten Kamera mit veränderlicher Vergrößerung durchgeführt werden.
Benachbart zum Aufnahmekopf 18 kann am z-Positionierer auch ein (nicht gezeigter) Greifer für Titerplatten befestigt sein, der es erlaubt, Titerplatten auf dem Hauptbett der Vorrichtung herum zu bewegen.
Eine einzelne Titerplatte 29 ist beispielhaft auf dem Hauptbett der Vorrichtung dargestellt. Das Hauptbett kann mit Stationen für Titerplatten und Schalen für Kolonien von verschiedenen Standard-Typen versehen sein.
Nachdem aufgenommene Zellkolonien in ihre Titer abgegeben wurden, müssen die hohlen Nadel gereinigt werden, bevor sie benutzt werden können, um weitere Zellkolonien aufzunehmen, um eine Kreuz-Kontamination zu vermeiden. Zum Reinigen der Nadeln wird eine Wasch- und Trockenstation 2 verwendet. Der Waschteil umfasst ein erstes und ein zweites Bad 4 und 6. Der Trockenteil besteht aus einer Kammer zum Ausblasen der Nadeln mit Luft und bevorzugt auch aus Halogen- oder anderen Lampen. Die Lampen dienen zum Sterilisieren und Trocknen der Nadeln durch Erhitzung. Das Gebläse kann das Trocknen unterstützen, aber wenn Lampen vorhanden sind, dient es hauptsächlich zum Kühlen der Nadeln nach der Erhitzung.
Nach Beendigung eines Durchgangs bewegen die x-, y- und z-Positionierer 20, 22 und 24 den Aufnahmekopf 18 zur Wasch- und Trockenstation 2. Die Nadeln werden in das erste Waschbad 4 abgesenkt und eingetaucht, das Wasser oder eine Wasser/Bleichemischung enthält. Das erste Waschbad 4 kann mit aufrecht stehenden Bürsten, die in der Reinigungsflüssigkeit eingetaucht sind, versehen sein. In diesem Fall werden die x- und y-Positionierer verwendet, um die Nadeln in einer drehenden Bewegung in der xy-Ebene über die Bürsten zu bewegen. Bevorzugt werden die Nadeln auch mit einer sterilisierenden Lösung, wie etwa Bleiche, durchspült. Der Aufnahmekopf 18 wird dann zu dem zweiten Bad 6 bewegt, das beispielsweise Ethanol zur weiteren Reinigung enthält. Ethanol wird im letzten Bad im Hinblick auf seine Flüchtigkeit verwendet, da dies das nachfolgende Trocknen der Nadeln unterstützt. Die bestimmten Reinigungsmittel sind lediglich erwähnt, um konkrete Beispiele zu geben. Andere Reinigungsmittel werden manchmal verwendet.
Der Aufnahmekopf wird dann über die Trocknungsstation 8 bewegt. Wenn vorhanden, werden die Halogenlampen zu diesem Zeitpunkt eingeschaltet, um die Nadeln zu Erwärmen/Erhitzen. Ein Luftgebläse wird dann eingeschaltet, um die Nadeln zu trocknen und/oder um sie auf Umgebungstemperatur zu kühlen, wenn sie durch die Halogenlampe erwärmt wurden.
Das Hauptbett kann auch andere Standardausrüstungen umfassen, wie einen Abfallschacht, eine Vorrichtung zum Entfernen der Deckel von Titerplatten, einen Titerplatten-Schüttler oder ein Titerplatten-Hotel. Keine von diesen ist gezeigt. Die Vorrichtung kann auch mit einem automatischen Titerplatten-Zufuhr- und -Stapelmechanismus versehen sein, desgleichen mit einem automatischen Zufuhr- und Stapelmechanismus für Schalen, die Zellkolonien enthalten. Keine von diesen ist gezeigt.
2 ist eine perspektivische Ansicht einer Vorrichtung. Im Vergleich zu 1 zeigt die Vorrichtung auch den oberen Teil der Maschine. Der obere Teil ist hauptsächlich aus einem licht- und gasdichten Gehäuse/Deckel 30 mit zwei Seiten 32, einer Rückwand 34 und einer Abdeckung 36. Eine sogenannte Hochleistungs-Luftpartikel (HEPA)-Filtereinheit 35 ist auch auf der Abdeckung 36 montiert. Das Arbeitsvolumen der Vorrichtung, das vom Hauptbett 10 und dem Gehäuse 30 umschlossen ist, kann in einer kontrollierten Umgebung im Wesentlichen frei von kontaminierenden Partikeln gehalten werden. Dies geschieht durch die Zufuhr von gefilterter Luftdurch die HEPA-Filtereinheit 35 in das Arbeitsvolumen und durch Halten des Arbeitsvolumens unter einem geringen Überdruck, so dass ungefilterte Luft aus der Umgebung daran gehindert ist, in das Arbeitsvolumen einzudringen.
Auf der Vorderseite der Maschine befindet sich eine mit Scharnieren versehene Tür 38, um den Zugang zu erlauben. Auf der Abdeckung 36 ist eine Detektoreinheit 40 angeordnet, die einen Matrix-Detektor in Form eines CCD-Chips und zugehörige Abbildungsoptik in Form eines Objektivs und geeigneter Filter enthält. Die Abbildungsoptik ist so konstruiert, dass sie die obere Fläche der Lichttischplatte als Abbildungsebene besitzt, oder eine geringfügig höhere Ebene, um die übliche Dicke der Basis einer Schale für Zellkolonien zu berücksichtigen. Der CCD-Chip kann mit einem Peltier-Kühler (nicht gezeigt) gekühlt werden, um Rauschen zu reduzieren. Falls eine niedrigere Arbeitstemperatur erwünscht ist, um das Rauschen noch weiter zu vermindern, könnte ein kryogenes Kühlmittel, wie flüssiger Stickstoff, verwendet werden, beispielsweise mit einem Kryostaten mit geschlossenem Kreislauf. Der Matrix-Detektor muss kein CCD sein und könnte ein beliebiger, geeigneter zweidimensionaler Matrix-Detektor sein, wie eine Vielkanalplatte (multi channel plate MCP). Der Matrix-Detektor kann gekühlt sein, z. B. mit einem Peltier-Modul oder mit einem kryogenen Kühlmittel, wie flüssigem Stickstoff.
Die Detektoreinheit 40 ist in einem zylindrischen Gehäuse enthalten, das aufrecht auf der Abdeckung der Maschine verschraubt ist, so dass die optische Hauptachse ”O” der Detektoreinheit senkrecht zu der Ebene des Hauptbetts der Vorrichtung steht. Optischer Zugang zu dem darunter liegenden Lichttisch wird durch eine Öffnung im Dach ermöglicht.
3 zeigt Einzelheiten eines Lichttisch-Beleuchtungssystems der Vorrichtung. Die Zeichnung ist eine perspektivische Ansicht von einer Seite der Maschine von einer Position, die nach unten und durch die Ebene des Hauptbetts der Maschine blickt, jedoch ohne das Hauptbett zu zeigen. Die Ebene des Hauptbetts (und die Lichttischplatte) ist mit dem Bezugszeichen 10 markiert. Der Hauptteil des Beleuchtungssystems ist eine (Licht)Quelleneinheit 50, mit rechteckigem Grundriss und mit Abmessungen, die in etwa denjenigen der Lichttisch-Beleuchtungsplatte (z. B. 300 × 200 mm) entsprechen und die eine Dicke von ungefähr 20 mm hat. In der Basis der Lichtquelleneinheit ist eine Mehrzahl von blauen Licht emittierenden Dioden (LEDs) angeordnet, die Licht mit einer nominalen mittleren Wellenlänge von 473 nm abstrahlen. (In anderen Ausführungsformen könnten LEDs mit hiervon verschiedener Farbe verwendet werden). Die LEDs sind in vier Gruppen 52 (gestrichelte Linien) angeordnet, wobei jede Gruppe eine verpackte Einheit von 100 oberflächenmontierten LEDs mit integrierter Fresnellinse umfasst. Alternativ könnten einzelne LEDs verwendet werden, die über die Fläche der Lichtquelleneinheit verteilt sind. Über den LEDs und die gesamte Fläche der Lichtquelleneinheit überdeckend befindet sich eine Filterplatte (nicht gezeigt) gefolgt von einem schichtförmigen, holographischen Diffusor 54. Der holographische Diffusor ist eine Platte aus Kunststoffmaterial mit einer mikrostrukturierten Oberflächenreliefstruktur, die durch einen Prägeprozess unter Verwendung eines holographisch erzeugten Prägewerkzeugs hergestellt wird (vgl. hierzu US 5,534,386 : Physical Optics Corporation (6)). Der Diffusor homogenisiert das Licht der LEDs, so dass die Intensitätsverteilung des LED-Lichts auf der Lichttischplatte ausgeglichen ist. Auf beiden Seiten der der Lichtquelleneinheit sind Lichtstreifeneinheiten 56 angeordnet, um eine Weißlichtbeleuchtung der Lichttischplatte für Kontrastabbildung bereitzustellen.
4 stellt eine schematische Seitenansicht dar, welche die optische Auslegung zeigt. Im oberen Teil der Figur kann man die Detektoreinheit 40 sehen, welche auf der Abdeckung 36 befestigt ist. Die Detektoreinheit 40 enthält einen CCD-Chip 42 mit zugeordneter Sammeloptik 44, welche schematisch als eine einzige Objektivlinse dargestellt ist. Es versteht sich, dass jegliche geeignete Linsen(oder Spiegel)-Kombination verwendet werden kann, um die Lichttischplatte auf der aktiven Oberfläche des CCD-Chip darstellen zu können. Die optische Achse ”U” der Detektoreinheit 40 ist ebenfalls gezeigt. Die Detektoreinheit 40 weist auch ein Filter 46 auf. Dies ist ein Bandpassfilter zum Filtern der LED-Emission. Eine mittlere Wellenlänge von 620 nm mit 35 nm Bandpass ist für die zuvor erwähnten blauen LEDs ausgewählt. Es versteht sich, dass im Allgemeinen eine geeignete Auswahl eines Bandpasses oder eines Abtrennfilters bzgl. der Emission der LEDs getroffen werden kann und die Erregungs- und Emissionsbänder der fluoreszenten Farbe zu nutzen. Darüber hinaus kann bei gewissen Anwendungen z. B. mit Kontrastdarstellung ein Filter entbehrlich sein. In der Mitte der Figur sind die Lichttischplatte 12 und Tischklammern 14 dargestellt, wobei die Lichttischplatte 12 im Allgemeinen in der Ebene des Hauptbettes der Vorrichtung liegt. Im unteren Teil der Figur ist die Lichtquelleneinheit 50 mit ihren LEDs 52, dem Filter 53 und dem Diffuser 54 gezeigt. Das Filter 53 ist ein gefärbtes Bandpasshauptfilter einer solchen Art, welche für elektrisches Leuchten verwendet wird, welches beim vorliegenden Beispiel blau ist, in welchem blaue LEDs verwendet werden. Das Filter 53 ist wirksam zum Entfernen unerwünschter Bestandteile der LED-Emission. Insbesondere hat sich (im Fall von) bei blauen LEDs herausgestellt, dass ein kleiner Anteil der LEDs durch das Emittieren von Wellenlängenbestandteilen außerhalb des blauen in den grünen und den roten eine Fehlfunktion besitzt. Ein unterschiedliches Farbfilter kann in Abhängigkeit von den Ausgangswellenlängen der verwendeten LEDs gewählt werden. Die winklig angeordneten Streifenlichteinheiten 56 sind ebenfalls klar ersichtlich.
Eine CCD-Belichtungszeit von etwa 10 Sekunden bis 3 Minuten ist normalerweise ausreichend, um Zellkolonien darzustellen. Die Belichtungszeit wird von einer Anzahl von Faktoren abhängig sein, z. B. vom verwendeten Farbtyp. Eine brauchbare Farbe ist trypan-blau. Die Belichtungszeit ist proportional der Bestrahlungsintensität, so dass die Belichtungszeit reduziert werden kann, indem eine intensivere Bestrahlung von weißen Lichtquellen, Laser oder in LED's verwendet wird.
5 ist eine perspektivische Ansicht, welche einen Teil des Aufnahmekopfes 18 mit größerem Detail zeigt. Die Endabschnitte der hohlen Nadeln 26 sind sichtbar, indem sie durch den Boden ihrer Gehäuseteile hindurch dringen. Das hohle Innere der Nadeln erstreckt sich nach oben und dann durch eine rechtwinklige Biegung, um an Zapfen 27 zum Anschluss flexibler Fluidleitungen (in 5 nicht gezeigt, jedoch angedeutet in 1). Es soll ebenfalls festgestellt werden, dass der Aufnahmekopf 18 mit den Nadeln als ein einziges Stück entfernt und in einem Autoklav zur Sterilisation behandelt werden kann. Ein automatisierter Kopfaustausch kann ebenfalls vorgesehen sein, wie z. B. in US 10/144,763 von Ruddock beschrieben, dessen Inhalt hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Zahlreiche Mehrfachkopfanordnungen werden in Betracht gezogen.
Um z. B. die Geschwindigkeit zu erhöhen, können zwei Köpfe ähnlich dem in 5 gezeigten vorgesehen sein. Während einer dieser Köpfe angewendet wird, kann der andere in einer automatisierten Wasch-/Trocknungsstation gereinigt werden, wodurch Totzeit eliminiert wird, welche ansonsten während der Kopfsterilisation auftreten würde, wie es in US 10/298,948 von Elverd, Haslam und Ruddock beschrieben ist, dessen Inhalt hier durch Bezugnahme eingefügt wird. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, ein Speziallistenbildkopf zum Tragen der Kamera (oder Kameras) vorzusehen. Indem ein separater Bildkopf vorgesehen wird, wird das Gewicht der Köpfe reduziert, wodurch die Geschwindigkeit erhöht wird, mit welcher sie gescannt werden können und wodurch Überlastprobleme verhindert werden. Dies kann besonders nützlich sein, wenn der Bildkopf weitere Teile enthält wie z. B. sein eigenes Spektrometer oder mehrere Kameras.
6 stellt eine perspektivische Ansicht von einer der Nadeln 26 in größerem Detail dar. So wie die Nadel ist auch ein Elektromotor 60 gezeigt, welcher längs der Nadel 26 angebracht ist. Die hohle Nadel 26 weist sowohl äußere als auch innere Nadeln 62 und 64 auf, wobei die innere Nadel 64 koaxial im Innern der äußeren Nadel 62 angeordnet ist. Beide Nadeln sind aus nicht rostendem Stahl hergestellt. Die innere Nadel 62 bildet das Ende des Fluidweges, welcher die flexible Leitung enthält. Der Elektromotor 60 ist mit der inneren Nadel 64 über einen Verbindungsstab 66 verbunden, welcher mittels einer an dem Motor 60 montierten Kurbel angetrieben wird. Der Motor treibt somit die innere Nadel 62 an, sodass sie eine Drehbewegung ausführt, wobei die Bewegung durch Biegen der inneren Nadel 64 aufgenommen wird.
Bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel weist die innere Nadel 64 einen Innendurchmesser von 0,7 mm und einen Außendurchmesser von 1,07 mm auf. Die äußere Nadel 62 ist 35 mm lang und hat einen 5 mm Außendurchmesser, wobei sie sich auf 4,2 mm an ihrem Ende verjüngt, sowie einen Innendurchmesser von 3,2 mm. Diese Abmessungen sind geeignet zum Aufnehmen von Zellkolonien einer mittleren Größe von etwa 0,5 mm.
7 ist ein schematischer Schnitt der Nadel 26 und des Motors 60, wobei die Nadel im Gebrauch zum Aufnehmen benachbarter Zellkolonien gezeigt ist. Die innere und die äußere Nadel 64 und 62 sind zu sehen, sowie der Motor 60 und der Verbindungsstab 66. Wie ersichtlich, ist das Ende der inneren Nadel 64 axial im Inneren des Endes der äußeren Nadel 62 um einen Abstand d1 zurückgesetzt. Bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel sind Werte von d1 = 0,25–0,5 mm verwendet worden. Weitere Werte im Bereich von 0,1 bis 2 mm sind anwendbar, und zwar in Abhängigkeit von den relevanten Parametern wie z. B. mittlerer Koloniegröße und Flüssigkeitsviskosität. Die Figur zeigt die Nadel 26 abgesenkt in Position zur Aufnahme einer benachbarten Zellkolonie 74. Die Nadel 26 ist derart abgesenkt, dass das distale Ende der äußeren Nadel 62 in die Flüssigkeit 72 eingetaucht und um einen kleinen Betrag d2 von der oberen Oberfläche der Probenbehälterbasis (Substrat) 76 versetzt, auf welchen die Zellkolonien wachsen. Bei vorliegendem Ausführungsbeispiel ist d2 zwischen etwa 0 (d. h. Antreffen gegen die Platte 76) und 0,5 mm variiert, obwohl größere Versätze in Betracht gezogen werden können, z. B. bis zu 2 mm. Dabei sind Werte von 0 (d. h. Antreffen), 0,1 mm und 0,2 mm üblich. Die Nadel 26 ist auch mit der Zellkolonie 74 ausgerichtet, wie es durch die xy-Koordinaten der Kolonie bestimmt ist, welche durch das Bild der mit der Kamera 40 aufgenommen und der nachfolgenden Bildverarbeitung bestimmt wurde.
In der dargestellten Position ist der Motor 60 so betätigt, dass das Ende der inneren Nadel 64 oszilliert, wodurch eine Turbulenz in der Flüssigkeit 72 erzeugt wird. Eine Oszillationsfrequenz von etwa 100 Hz ist erfolgreich verwendet worden. Andere Frequenzen dürften wahrscheinlich auch funktionieren. Die durch diese Bewegung erzeugten Kräfte haben sich als ausreichend herausgestellt, um die Zellkolonie zu entnehmen und ein Einsaugen der entnommenen Zellkolonie in die hohle Nadel zu ermöglichen, welche, wie zuvor erwähnt, das Ende der Kapillare 70 bildet. Die innere Nadel 64 ist durch einen Flansch 68 gehalten, welcher in die Oberseite der äußeren Nadel 62 passt und eine mittige Durchgangsbohrung aufweist, durch welche die innere Nadel 64 in einem Schiebegleitsitz hindurchläuft.
Im Fall von nicht benachbarten Kolonien, welche in einem halbfesten Wachstumsmedium sind, versteht es sich, dass die Kolonien nicht an der Platte haften, sodass keine Notwendigkeit zum Vibrieren der Nadel gegeben ist.
8 stellt eine Reihe von schematischen Darstellungen A–E dar, welche die verschiedenen Schritte beim Aufnehmen einer ausgewählten Säugetierzellkolonie veranschaulicht. In der Darstellung A ist die Nadel 70 über einer benachbarten Zielkolonie 74 abgesenkt, welche in einer Flüssigkeit 72 eingetaucht ist, und zwar nach Ausrichtung der xy-Koordinaten. In der Darstellung B ist die Nadelspitze direkt über der Kolonie bereit zum Ausführen des Aufnahmevorganges eingetaucht. Die Darstellung C zeigt die Situation nach der vibrationsinduzierten Aufnahme, bei welcher das Einsaugen stattfindet. Eine Flüssigkeitssäule, in welcher die Kolonie in Suspension ist, wird nach oben in die Nadel gezogen, indem der Druck in der Nadel abgesenkt wird. Die Darstellung D zeigt die Situation, nachdem die Nadel aus dem Probenbehälter angehoben worden ist. Die Kolonie wird unter einem Druck, welcher geringer als der Atmosphärendruck ist, welcher in der Nadel aufrechterhalten wird, gehalten. Zum Ausgeben kann der Aufnahmekopf dann über eine Titerplatte bewegt werden. Die Darstellung E zeigt die Situation, in welcher das Ende der Nadel in einen Titer einer Titerplatte abgesenkt worden ist und die Kolonie aus der Nadel durch Anheben des Druckes in der Nadel ausgestoßen worden ist, wodurch der Zellaufnahmevorgang beendet wird.
Die obige Beschreibung bezieht sich auf ein Beispiel einer benachbarten Kolonie. Es versteht sich, dass, wenn eine Kolonie in Suspension, eine vereinfachte Form desselben Prozesses ausgeführt werden kann, bei welchem die mit der Entnahme einer benachbarten Kolonie verbundenen Schritte ausgelassen sind. Es versteht sich auch, dass einige der Teile der Vorrichtung im Fall der Aufnahme von Zellkolonien aus einer Suspension redundant sind und weggelassen werden können, falls die Maschine nicht die Fähigkeit zum Handling benachbarter Kolonien benötigt. Z. B. kann die äußere Nadel wie auch der Motor und damit verbundene Antriebsteile weggelassen werden.
9 ist eine schematische Zeichnung der für die Flüssigkeit vorgesehenen Elemente der Vorrichtung. Eine der Nadeln 26 ist verbunden mit ihrer Flüssigkeitsleitung 28 gezeigt, welche aus einer flexiblen Leitung hergestellt ist, welche an einer an dem Gehäuse einer für die Flüssigkeiten benötigten Einheit 86 montiert ist. (Die Sammelleitung 81 wird zum Aufnehmen sämtlicher Fluidleitungen 28 verwendet, obwohl nur eine einzige gezeigt ist.) Die Sammelleitung 81 nimmt auch eine weitere Fluidleitung 101 von einem Flüssigkeitszufuhrgefäß 103 über eine Fluidleitung 101 auf, welche die Flüssigkeit in das Zufuhrgefäß 103 über einen abgedichteten oberen Flansch 105 einleitet. Die Flüssigkeit in dem Behälter 103 kann unter Druck gehalten sein. Im Inneren der die Flüssigkeit betreffenden Einheit 86 ist die Flüssigkeitszufuhr von der Sammelleitung 81 über eine Fluidleitung 99 zu einem normalerweise offenen (N.O.) Anschluss 93 eines Ventils 85 verbunden, und die andere Seite des Fluidweges, welcher zu der Nadel 26 führt, ist von der Sammelleitung 81 über eine Fluidleitung 97 zu einem normalerweise geschlossenen (N.C.) Anschluss 89 des Ventils 85 verbunden. Die für die Flüssigkeiten vorgesehene Einheit 86 schließt auch eine Pumpe 83 ein, welche eine hin- und hergehende Kolben/Zylinderpumpe welche eine Verbindung über eine Fluidleitung 95 zu einem gemeinsamen Anschluss (COM) 87 des Ventils 85 herstellt. Das Ventil 85 sowie auch die Pumpe 83 sind mit einer für die Flüssigkeiten vorgesehenen Steuereinheit 84 mittels elektrischer Steuerleitungen verbunden. Die für die Flüssigkeiten vorgesehene Steuereinheit 84 ihrerseits ist mit einem Steuercomputer verbunden und durch diesen angetrieben (nicht in dieser Figur gezeigt).
Im Gebrauch wird das Ventil 85 wie folgt gesteuert. Wenn das Ventil 85 in seiner Ruhezustand ohne Inputs ist, ist der N.O.-Anschluss 93 offen, und der N.C.-Anschluss 89 ist geschlossen. Dies verbindet die hin- und hergehende Pumpe mit dem Fluidgefäß 103, sodass es Flüssigkeit aus dem Reservoir mittels einer geeigneten Abwärtsbewegung des Pumpenkolbens in seinen Zylinder ziehen kann. Andererseits, wenn das Ventil 85 in seinem betätigten Zustand mit einem energetisierenden Input-Signal ist, ist der N.O.-Anschluss 93 geschlossen, und der N.C.-Anschluss 89 ist offen. Dies verbindet die hin- und hergehende Pumpe 83 mit der Nadel 26, was es der Flüssigkeitssäule in dem Fluidweg, welcher durch die Elemente 26, 28, 97 und 95 erlaubt, die jeweilige Richtung durch die Bewegung des Pumpenzylinders bewegt zu werden. Dies gewährleistet die Feinsteuerung zum Einsaugen und Ausstoßen von Tierzellenkolonien, was schematisch in 8, wie zuvor beschrieben, gezeigt ist. Das Anheben des Kolbens ermöglicht auch ein Durchspülen des Fluidweges während des Reinigens. Zum Reinigen können die Fluidgefäße von Hand ausgetauscht werden. Alternativ kann ein automatisiertes Schalten zwischen verschiedenen Fluidbehältern unter Verwendung zusätzlicher computergesteuerter Ventile vorgesehen sein. Gegebenenfalls kann ein unter Druck stehender Gasbehälter als ein Fluidgefäß (z. B. zum Reinigen mit Druckgas) vorgesehen sein, so dass die Fluidgefäße nicht notwendigerweise Flüssigkeit enthalten müssen. Es versteht sich, dass die Gefäße 103 von einer Vielzahl von Nadeln genutzt werden können und dass nicht für jede Nadel ein separates Gefäß vorgesehen sein muss. Individuelle Pumpen können auch von zwei oder mehr Ventilen genutzt werden, um Kosten zu reduzieren.
10 ist ein schematisches Blockdiagramm, welches das Steuersystem der Vorrichtung zum Koordinieren der verschiedenen Komponenten zur Ausführung des zuvor beschriebenen Prozesses zeigt. Ein Computer (PC 90) wird als eine grundlegende Steuerkomponente verwendet und ist mittels elektronischer Verbindungen unter Verwendung standardisierter Interface-Protokolle mit verschiedenen Komponenten verbunden, welche Teil des automatisierten Steuersystems sind. Die Steuerung wird durch eine Steuersoftware 91 bewirkt, welche im PC 90 vorliegt. Eine Bildverarbeitungssoftware 92 liegt ebenfalls im PC 90 vor und ist mit der Steuersoftware 91 verbunden. Die Bildverarbeitung kann als Software, wie zuvor beschrieben, Hardware oder Firmware, je nach Wunsch, ausgeführt werden. Die Detektoreinheit 40 in der Form einer CCD-Kamera ist mit dem PC 90 zum Empfangen von digitalen Bildern verbunden, welche mit der Kamera aufgenommen wurden. Eine Beleuchtungs- und Filtersteuereinrichtung 80 ist mit dem PC 90 verbunden. Diese Steuereinrichtung wird verwendet, um die LEDs 52 und die Weißlichtquelleneinheit 56 zu steuern, welche benutzt wird, um die Lichttischplatte 12 zu beleuchten und auch um einen geeigneten Filter 46 aus einem motorgetriebenen Filterrad auszuwählen. Eine Steuereinrichtung 82 für einen Wäscher/Trockner ist mit dem PC 90 verbunden und wird verwendet, um das Gebläse und die Halogenlampen des Trockners zu steuern. Die Positionierer 20, 22, 24 zum Bewegen des Aufnahmekopfes 18 sind mit dem PC 90 verbunden. Die kopfmontierte Kamera 19 ist mit dem PC 90 zum Empfangen der Digitalbilder verbunden, welche durch die kopfmontierte Kamera 19 aufgenommen werden. Diese werden verwendet zum Ausrichten der Nadeln des Aufnahmekopfes mit den verschiedenen Teilen der Wasch- und Trocknungsstation 4, 6, 8, der Titerplatten 29, Kolonien etc. Die Fluidleitungen 70 sind mit der für Flüssigkeiten vorgesehenen Einheit 86 verbunden, welche durch die für die Flüssigkeiten vorgesehene Steuereinheit 84 gesteuert wird, welche mit dem PC 90 verbunden ist. Die für Flüssigkeiten vorgesehene Steuereinheit 84 wird verwendet, um den Druck in den Fluidleitungen zu steuern, um ein Einsaugen, ein Halten und ein Ausstoßen der Flüssigkeit aus der Probe zu steuern. Die für die Flüssigkeiten vorgesehene Steuereinheit 84 steuert ebenfalls den Waschzyklus der Nadeln und der Fluidleitungen, wobei ein Reinigungsfluid aus den Bädern 4, 6 eingesaugt und von den Enden der Nadeln während des eingesaugt und von den Enden der Nadeln während des Reinigungszykluses ausgestoßen wird.
11 ist ein Flussdiagramm, welches einen beispielhaften Prozess zeigt, welcher durch die Vorrichtung ausgeführt wird. Der Prozess hat die folgenden Schritte:

S1 Platziere die Zellschalen in einen Bildbereich, d. h. auf einer Lichttischplatte 12
S2 Beleuchte den Bildbereich 12 unter Verwendung von entweder einer farbigen Lichtquelle 52 (typischerweise zum Detektieren gefärbter Zellkolonien unter Verwendung von Fluoreszenz) oder der Weißlichtquelle 56 (typischerweise für ungefärbte Kolonien)
S3 Nimm ein Bild/Bilder unter Verwendung einer CCD-Kamera 40 auf
S4 Führe eine Software basierte Analyse zum Detektieren der Zellkolonien aus, um eine ”Aufnahmeliste” zu schaffen
S5 Zuordnen der Robotervorrichtung zum Auswählen von Zellkolonien aus der Aufnahmeliste (detaillierter nachfolgend beschrieben)
S6 Speichern aller Bilder und Daten
S7 Entfernen der Titerplatten, welche die aufgenommenen Kolonien enthalten

Bzgl. der Schritte S2 bis S4 werden die Zellkolonien unter Verwendung von Fluoreszenz sichtbar gemacht. Z. B. kann ein fluoreszenzmarkierter Antikörper benutzt werden, welcher sich an ein gewünschtes Protein bindet, das abgesondert wurde von den Zellkolonien, an der Oberfläche davon ausgedrückt oder in dieser enthalten ist. Während des Darstellens der Fluoreszenz erscheinen die Zellkolonien als hell emittierende Punkte, wenn sie mit einer geeigneten Anregungswellenlänge (z. B. mit blauen LEDs) bestrahlt werden. Eine Abreicherung der fluoreszenten Antikörper in der unmittelbaren Nähe der Zellkolonien tritt ebenfalls auf, was den Effekt des Erzeugens einer ”inversen Halo” hat, d. h. eines dunkleren Bereiches um jede helle Kolonie, was die Bildverarbeitung unterstützt.
Alternativ werden, im Falle des Einfärbens, die Zellkolonien durch Zumischen einer geeigneten Farbe in die Suspension sichtbar gemacht. Es soll jedoch festgestellt werden, dass es möglich ist, viele Kolonien ohne Einfärben oder Fluoreszenz sichtbar zu machen.
12 ist ein Flussdiagramm, das im größeren Detail Schritt S5 zeigt, den Zellkolonie aufnehmenden Teil des Prozesses. Schritt S5 des Prozesses hat die folgenden Unterschritte:

S5.1 Auswählen eines Elementes aus der Aufnahmeliste zum Aufnehmen
S5.2 • Bewegen einer ungenutzten Nadel bis über die zugeordnete xy-Koordinate der aufzunehmenden Zellkolonie • ”Feuern” (d. h. absenken) der Nadel in die Kolonieaufnahmeposition, wobei das Ende der Nadeln in das Medium über der Zielkolonie um einen Versatz d2 eingeführt ist • Lediglich für angesaugte Kolonien – Bewegen des Nadelendes zum Entfernen der Zielzellkolonie • Ansaugen eines definierten Volumens • Zurückziehen der Nadel und Halten der Probe, während andere Nadeln gefeuert werden
S5.3 Sofern nicht alle Nadeln verwendet werden oder alle Kolonien in der Aufnahmeliste aufgenommen worden sind, Wiederholen von Schritt S5.2
S5.4 Bewegen des Aufnahmekopfes über die Titerplatte und Ausrichten der Nadeln bzgl. der Titer – dann Ausgeben aller Proben gleichzeitig in die Titerplatte (Mikrotiterplatte)
S5.5 Reinigen aller Nadeln unter Verwendung der Wasch- und Trocknungsstation 2
S5.6 Sofern nicht alle Kolonien in der Aufnahmeliste aufgenommen worden sind, Bewegen des Aufnahmekopfes zurück in den Probenbereich und zurück zu Schritt S5.1.
Dies vervollständigt Schritt S5.

Dies beendet die Beschreibung des Hauptausführungsbeispiels. Verschiedene mögliche Alternativen werden nachfolgend erwähnt.
Das Einsaugen ist beschrieben worden in Form von Hindurchlassen einer Flüssigkeitssäule durch die Fluidleitungen und in die Nadeln. Eine Alternative wäre, eine Flüssigkeitssäule in der Mehrheit jeder Flüssigkeitsleitung zu halten, jedoch einen Verschluss mit Luft oder mit Inertgas, wie z. B. Helium und Stickstoff, in der Nadelspitze zu haben. Die Probe könnte eingesaugt werden durch ein Nach-oben-ziehen von Flüssigkeitssäule und Luftverschluss zusammen, so dass der Luftverschluss die Probenflüssigkeit oder das halbfeste Medium vom Hauptkörper der Flüssigkeitssäule separiert. Die Verwendung eines Gasverschlusses bietet eine verbesserte Sterilität, da die Probenflüssigkeit von der Hauptflüssigkeitssäule durch den Gasverschluss isoliert ist.
Alternative optische Konfigurationen sind möglich. So kann z. B. eine Laserquelle verwendet werden, wie z. B. ein Ionenlaser anstelle von Licht emittierenden Dioden. Der Laserstrahl kann über die untere Oberfläche der Lichtplatte gescannt werden. In diesem Fall kann ein einzelner Kanaldetektor verwendet werden. Geeignete Ionenlaser schließen Argonionen- und Kryptonionenquellen ein. Es versteht sich, dass das Strahlscanning mit geeigneten Scanspiegel-Optiken ausgeführt werden kann. Emissionswellenlängen über einen weiten Bereich können verwendet werden, z. B. 200 nm bis 1,6 μm, oder außerhalb dieses Bereiches.
Die Vorrichtung kann mit einer Vielzahl von optisch basierten Verfahren verwendet werden. Einfache Kontrastbilddarstellung kann verwendet werden, oder höher entwickelte spektroskopische Verfahren auf der Basis von optischer Dichte, Lumineszenz oder Raman-Scattering. Sofern höher entwickelte Spektralanalyse benötigt wird, wie z. B. für Resonanz-Raman-Scattering, die Sammeloptik kann ein Spektrometer oder einen kontinuierlich einstellbaren Bandpassfilter aufweisen, welche vor dem Detektor angeordnet sind. Um bedeutende optische Dichteänderungen zu erhalten, müssen hohe Farbkonzentrationen verwendet werden, und viele Zellen werden benötigt, um signifikante Änderungen in der optischen Dichte zu erzielen. Vorzugsweise verwenden die optisch basierten Verfahren Fluoreszenz und/oder Lumineszenz, welche empfindlichere Untersuchungsmethoden sind, verglichen mit der optischen Dichte.
Es wird auch herausgestellt, dass, obwohl das Hauptausführungsbeispiel eine Illumination eines Lichttisches von unten zeigt, eine Illumination von oben kann ebenfalls anstelle oder in Kombination mit einer Illumination von unten verwendet werden.
In einigen Fällen kann die kopfmontierte Kamera (oder Kameras) ausschließlich verwendet werden, und die abdeckungsmontierte Kamera wäre dann nicht erforderlich.
Lumineszente Substrate schließen ein, sind aber nicht beschränkt darauf, Luziferase, Luziferin (Anal Biochem (1994) 219, 169–181), Aequorin (Methods Enzymol. (1978) 57, 271–291), und alkaline Phosphatase (Clin. Chem (1996) 42, 1542–1546).
Fluoreszente Substrate können ein sehr helles Signal ergeben, was es ermöglicht, dass sie leicht auf dem einzigen Zellniveau detektiert werden können. Ein bevorzugtes Fluoreszentprotein ist grünes Fluoreszenzprotein wie z. B. ein modifiziertes (z. B. mutiertes) GFP. Lediglich beispielhaft kann ein GFP an ein oder mehrere Antikörper zur Detektierung eines Proteins von Interesse konjugiert sein.
Die GFP der Quallenart Aequorea victoria ist ein Protein mit einem Erregungsmaximum mit 395 nm und einem Emissionsmaximum bei 510 nm und benötigt keinen exogenen Faktor. Die Eigenschaften und Anwendungen von GFP für das Studium von Genausdruck (gene expression) und Proteinlokalisation sind beispielsweise in Nat Cell Biol (2002) 4, E15–20; Biochemistry (1974) 13, 2656–2662; Photochem. Photobiol. (1980) 31, 611–615; Science (1994) 263, 12501–12504; Curr. Biology (1995) 5, 635–642; und US 5,491,084 , diskutiert worden.
Demgemäß kann die Vorrichtung mit verschiedenen fluoreszenten und nicht fluoreszenten Proteinen und Farben verwendet werden.
Da weitere Arten von Licht emittierenden Dioden kommerziell verfügbar werden (wie z. B. Ultraviolett), können weitere Gruppen vorgesehen sein, sodass die Vorrichtung so ausgebildet sein kann, dass ein größerer Bereich möglicher Wellenlängenanregung vorgesehen ist. Die Vorrichtung kann auch als multifunktionelle Vorrichtung vorgesehen sein, in dem Licht emittierende Dioden unterschiedlicher Arten wie z. B. eine erste Gruppe zum Ausgeben in einem ersten Wellenlängenband (z. B. Blau) und eine zweite Gruppe zum Ausgeben in einem zweiten Wellenlängenband (z. B. Grün, Rot) vorgesehen sein.
Eine Vielzahl von fluoreszenten Farben ist verfügbar, welche emittieren über sichtbares Licht von Ultraviolett bis Blau, Grün, Orange und Rot. Es versteht sich, dass der vorgeschlagene Entwurf leicht modifiziert werden kann, um ihn mit jeder Art von gewünschter fluoreszenter Farbe, Protein mit geeigneter Anpassung an die optischen Quellen, Filter und Detektoren verwendet werden kann. Insbesondere kann die Erfindung auf cy3 und cy5 Farben angewendet werden, welche von Amersham Biosciences verfügbar sind. Nicht fluoreszente Farben, auf welche die Erfindung angewendet werden kann, schließen Trypanblau ein.
Es versteht sich auch, dass, obwohl der Begriff Licht emittierende Diode im Stand der Technik gewöhnlich verwendet wird, um lediglich eine Art einer Lichtquelle auf der Basis von Diodenemission zu beschreiben, dass der Begriff Licht emittierende Dioden breiter in den Ansprüchen des vorliegenden Dokumentes anzusehen ist, um jegliche Form von Licht emittierenden Diodenquellen einschließlich Diodenlaser, wie z. B. Halbleiter-Diodenlaser und superlumineszente Dioden abzudecken.
Nachfolgend sind Wege, in welchen eine Kolonie von Interesse identifiziert werden kann, und zwar unter Verwendung der Vorrichtung, detaillierter beschrieben.
Der automatisierte Prozess, welcher hier beschrieben ist, kann verwendet werden, um eine oder mehrere Zellkolonien von Interesse auf der Basis von Kontrastbilddarstellung zu sortieren, aufzunehmen oder zu identifizieren.
Daher kann die vorliegende Erfindung zum Identifizieren und Analysieren biologischer Moleküle verwendet werden, welche in Zellkolonien vorhanden sind, einschließlich z. B. Peptiden, Polypeptiden, Nukleinsäuren und glycosilierte und nicht-glycosilierte Proteine (Oligosaccharide, Lipide und Ähnliches).
Es versteht sich für einen Durchschnittsfachmann, dass ein biologisches Molekül, wie z. B. ein Protein von Interesse, auf eine Vielzahl von Arten detektiert werden kann. Lediglich beispielhaft kann das biologische Molekül wie folgt detektiert werden:

1. Das Expressierungssystem, das verwendet wird, um das Protein von Interesse zu Tage treten zu lassen, kann eines sein, welches bewirkt, dass das Protein von Interesseaus der Zellkolonie in das umgebende Medium sekretiert wird. Wenn das expressierte Protein in das Kulturmedium sekretiert wird, dann wird der Expressionsvektor typischerweise eine geeignete Signalsequenz enthalten, welche die Sekretion des Proteins in das Kulturmedium richtet. Ein Fluoreszenz-Antikörper beispielsweise, welcher spezifisch für das Protein von Interesse ist, kann dann verwendet werden für die nachfolgende Identifikation der Zellkolonien, welche das Protein von Interesse expressieren.
2. Das Expressierungssystem, welches verwendet wird, um das Protein von Interesse in Erscheinung treten zu lassen, kann eines sein, in dem das Expressieren des Proteins von Interesse an der Oberfläche einer Zelle, wie z. B. der Zellmembran, erfolgt. Für den Durchschnittsfachmann ist es verständlich, das Vektoren – wie z. B. Expressionsvektoren – Kodiersequenzen enthalten, welche mit Signalsequenzen ausgestattet sind, welche die Sekretion der kodierenden Sequenzen durch eine spezielle Zellmembran richten. Ein Fluoreszenz-Antikörper beispielsweise kann dann für die nachfolgende Identifikation von Zellkolonien verwendet werden, welche das Protein von Interesse expressieren.
3. Die Zellkolonie könnte permeabel gemacht werden unter Verwendung einer Zellpermeabilisierungssubstanz der Gestalt, dass beispielsweise ein fluoreszenter Antikörper in die Zellenkolonie eintreten kann und sich mit dem Protein von Interesse verbinden kann, während die Lebensfähigkeit der Zellkolonie dennoch erhalten bleibt.
4. Die Zellkolonie kann einen Expressionsvektor aufweisen, in welchem ein Protein von Interesse mit einem Reporter oder einem ”tag” wie z. B. GFP verbunden wird. Auf diese Weise, erfolgt eine Expression des Proteins von Interesse auch bei der Expression des Reporters, der die Identifikation der Zellenkolonie schafft. Die einzigartige Tag-Sequenz wird der Nukleotid-Sequenz zugefügt, welche das Protein durch rekombinante DNA-Techniken kodiert, was ein Protein schafft, das durch einen Antikörper erkannt werden kann, welcher spezifisch für beispielsweise das Tag-Peptid ist. Eine große Vielfalt von Reportern kann in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wobei bevorzugte Reporter zweckmäßigerweise erkennbare Signale bereitstellen (z. B. durch Fluoreszenz). Beispielsweise kann ein Reporter-Gen ein Enzym kodieren, welches eine Reaktion katalysiert, welche die Lichtabsorptionseigenschaften verändert. Beispiele von Reporter-Molekülen schließen ein, sind jedoch nicht auf β-Galactosidase, Invertase, grünes fluoreszentes Protein, Luziferase, Chloramphenicol, Acetyltransferase, β-Glucoronidase, Exo-Glucanase und Glucoamylase. Beispielsweise können fluoreszent gekennzeichnete Biomoleküle, welche spezifisch mit speziellen chemischen Eigenschaften des Bindens oder Andockens synthetisiert wurden, als fluoreszente Reportermoleküle verwendet werden. Fluoreszenz gekennzeichnete Antikörper sind besonders nützliche Reportermoleküle infolge ihres hohen Grades an Spezifizität zum Anhaften an einem einzigen molekularen Ziel in einem Gemisch von Molekülen als Komplex als eine Zelle, Gewebe oder einem Extrakt von beiden.

Es gibt eine große Zahl von Wegen, um Fluoreszenz zu messen. Beispielsweise bewirken einige fluoreszente Reportermoleküle eine Änderung in Anregungs- oder Emissionsspektren, einige weisen eine Resonanzenergieübertragung auf, bei welcher ein fluoreszenter Reporter Fluoreszenz verliert, während ein zweiter an Fluoreszenz gewinnt, einige bewirken eine Unterdrückung oder ein Auftreten von Fluoreszenz, während andere Rotationsbewegungen veranlassen. Eine multi-spektrale Bildgebung kann ebenfalls verwendet werden.
Anwendungsbeispiele
Einige spezifische Beispiele, wie die Vorrichtung verwendet werden kann, werden nachfolgend angegeben.
Auswahl von Zellen für biopharmzeutische Herstellung
Die vorliegende Erfindung kann auch geeignet sein für ein automatisches Sortieren von Zellkolonien, welche erhöhte Niveaus eines Proteins von Interesse expressieren oder sekretieren. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das Protein von Interesse ein biopharmazeutisches Protein wie z. B. ein Protein, das zweckmäßig bei der Behandlung oder Diagnose von Krankheiten ist.
Derartige Zellen können gemäß einem Beispiel entsprechend der Helligkeit der Fluoreszenz der Zellenkolonie detektiert werden, welche mit der Menge von Protein korreliert, welches expressiert wird. Die hellsten Zellkolonien können dann zur weiteren Analyse/Verarbeitung aufgenommen werden.
Wie zuvor beschrieben, könnte die vorliegende Erfindung auch für die Gewinnung von Zellkolonien verwendet werden, welche Membrane und sekretierte Proteine produzieren.
Stammzellen
Differentiation ist ein Prozess, wodurch Strukturen und Funktionen von Zellen progressiv realisiert werden, um spezialisiertere Zellen zu erhalten. Deshalb, wenn die Zellen mehr spezifiziert sind, werden sie mehr spezialisiert. Bei der Mehrzahl der Säugetierzellarten ist die Zelldifferentiation ein Einwegprozess, welcher ultimativ zu schließlich differenzierten Zellen führt. Obwohl einige Zellarten während des gesamten Lebens ohne Teilung und ohne, dass sie ersetzt werden, fortbestehen, setzen jedoch viele Zellarten ein Teilen während der Lebenszeit des Organismus fort und unterliegen einer Erneuerung. Dies kann durch einfache Teilung, wie im Falle von Zellen – wie z. B. blutbildenden Zellen und epidermischen Zellen – durch Teilung von relativ undifferenzierten Stammzellen geschehen, welchem sich ein Programm nachfolgender irreversibler Differenzierung von einer der Tochterzellen anschließt.
Da die vorliegende Erfindung besonders geeignet ist für die Identifikation von Zellen auf der Basis von Unterschieden in der Zellgröße, der Form und/oder der Replikationsrate, kann dies verwendet werden, um eine oder mehrere Stammzellen zu identifizieren und/oder zu isolieren, sobald sie in einen gegebenen Zelltyp differenziert worden sind.
RNAi
Post-transskriptionale Genstilllegung (PTGS) bewirkt durch doppelsträngige RNA (dsRNA) ist ein konservierter Zellenverteidigungsmechanismus zum Steuern der Expression von Fremdgenen. Man nimmt an, dass die zufällige Integration von Elementen, wie z. B. Transposonen oder Viren die Expression der dsRNA bewirkt, was eine sequenz-spezifische Degradation von homologen einsträngigen mRNA oder viralen genomischen RNA bewirkt. Der Stilllegungseffekt ist bekannt als RNA-Interferenz (RNAi). Der Mechanismus des RNAi schließt das Verarbeiten von langen dsRNAs in Dopplungen von 21 bis 25 Nukleotiden (nt) RNAs. Diese Produkte werden als kleininterferierende oder stilllegende RNAs (siRNAs) genannt, welche die sequenzspezifischen Mediatoren der mRNA-Degradation sind.
In differenzierten Säugetierzellen sind dsRNA > 30 bp gefunden worden, um die Interferonantwort zu aktivieren, welche zu einer Beendigung der Proteinsynthese und der nicht-spezifischen mRNA-Degradation führt. Diese Antwort kann jedoch unter Verwendung von 21 ntsiRNA-Dopplungen umgangen werden, indem es erlaubt wird, dass eine Genfunktion in kultivierten Säugetierzellen analysiert wird.
In Säugetieren kann RNAi durch das Liefern von entweder kurzen dsRNA-Molekülen (siRNAs) direkt in die Zelle oder durch Liefern von DNA-Konstrukten ausgelöst werden, welche die dsRNA innerhalb der Zelle produzieren.
Der Prozess kann verwendet werden, um Zellen zu identifizieren und aufzunehmen, bei einem geänderten Phänotyp zur weiteren Analyse, da die RNAi morphologische Veränderung in den Zellen induziert.
Zelltransformationsuntersuchungen
Unterschiede zwischen transformierten und nicht-transformierten Zellen können auch gemäß der vorliegenden Erfindung detektiert werden.
Derartige Untersuchungen können verwendet werden, um beispielsweise die Transformationsfähigkeiten von Viren oder Chemikalien zu untersuchen.
Derartige Untersuchungen stellen ein Verfahren zum Untersuchen von Änderungen dar, welche in Übereinstimmung sind mit Tumorigenese ohne die Kenntnis der genetischen Natur der Beschädigung, welche die Änderung veranlasst hat. Nach einem Ausplatieren bei niedriger Dichte können transformierte Zellen, welche einen geänderten Phänotyp haben, unter Verwendung morphologischer Kriterien identifiziert werden, wobei die Zellen in einem automatisierten Prozess unter Verwendung der Bildgebungsfähigkeit der Vorrichtung identifizierbar sind.
Zelltransformationsuntersuchungen testen deshalb nach genetischer Veränderung, welche an einem veränderten Phänotyp aufgetreten sind, welche leicht durch das morphologische Erscheinungsbild der transformierten Zellen identifiziert werden.
Gewinnung von Viren
Das Vorhandensein eines Virus gibt oft Anlass für morphologische Veränderungen in einer Wirt-Zelle. Jegliche detektierbare Veränderungen in der Wirt-Zelle in Folge einer Infektion sind bekannt als ein zytopatischer Effekt. Zytopatische Effekte können bestehen in Form von Zellabrundung, Fehlorientierung, Anschwellen oder Schrumpfen, Tod, Lösen von der Oberfläche etc.
Die zytopatischen Effekte, welche durch verschiedene Viren erzeugt worden sind, hängen vom Virus und den Zellen ab, an welchen er gewachsen ist. Das kann in den klinischen Virologie-Laboratorien verwendet werden, um eine Identifizierung eines isolierten Virus zu unterstützen.
Derartige zytopatische Effekte können die Morphologie der Zelle ändern, welche unter Verwendung des automatisierten Prozesses, welcher hier beschrieben ist, detektiert werden können.
Transfektion von Genen
Im Allgemeinen benötigt das Einfügen eines Gens in eine Zelle einen dominanten selektiven Marker, wie z. B. Neomyzin-Resistenz. Die hohe Wirksamkeit eines automatisierten Systems, welches hier beschrieben ist, kann einen derartigen Marker überflüssig machen, da Zellen in begrenzten Lösungen ausplatiert und Kolonien zur weiteren Analyse aufgenommen werden könnten.
Immortalisierung von Zellen
Die Transformation mit Chemikalien oder Viren kann einen immortalen Phänotyp induzieren. Das Verfahren, welches hier beschrieben ist, erlaubt es, derartige Zellen zu selektieren.
Selektion von Zellklonen, welche post-translationale modifizierte Proteine erzeugen
Therapeutische Proteine wie z. B. ein Erythro-Protein oder Gewebeplasminogen-Aktivator verdanken ihre Serum-Halbwertzeit Zuckerrückständen am Protein. Klonen von Zellen, welche eine gewünschte Modifikation erzeugen, können mit kennzeichnendem Lektin detektiert und dann aufgenommen werden.
IN BEZUG GENOMMENE DOKUMENTE

[1] US 6,198,107 : Clare Chemical Research, Inc
[2] JP 07-260742 : Sanyo Electric Co Ltd
[3] WO 98/23950 : Oxford Glycoscience (UK) Ltd.
[4] US 5,587,062 : Shimadzu Corporation
[5] WO 99/051977 : Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften
[6] US 5,534,386 : Physical OpticsCorporation
[7] WO 92/12233 : Medical Research Council
[8] Uber et al: Bio Techniques, vol. 11, no 4 (1991), pages 642–647
[9] Jones et al: Nucleic AcidsResearch, vol. 20, no. 17 (1992), Pages 4599–4606

Claims

Ein Verfahren zum automatisierten Aufnehmen von Tierzellkolonien mithilfe einer Vorrichtung, umfassend: a) Bereitstellen eines Aufnahmekopfes (18), der wenigstens eine Hohlnadel (26) umfasst, wobei der Aufnahmekopf mithilfe von Positionierungsmotoren (20, 22, 24) über die Vorrichtung bewegbar ist; b) Anordnen eines Probenbehälters (13) mit einer Vielzahl von Tierzellkolonien (74), die in einem Medium gelagert werden, auf der Vorrichtung, sowie eines Abgabebehälters (29); c) Verwenden von maschinellem Sehen (40) und Bildverarbeitung (90), um Tierzellkoloniepositionen in der Probe zu identifizieren; d) Bewegen des Aufnahmekopfes über den Probenbehälter; e) Aufnehmen einer Tierzellkolonie durch Ausrichten von einer der wenigstens einen Hohlnadel an einer der Tierzellkoloniepositionen, Einführen eines distalen Endes der Hohlnadel in das Medium und Ansaugen der Tierzellkolonie an der Position in die Hohlnadel; und f) Abgeben der aufgenommenen Tierzellkolonie durch Bewegen des Aufnahmekopfes über den Abgabebehälter und Auswerfen der aufgenommenen Tierzellkolonie in den Abgabebehälter.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Aufnahmeschritt das Wiederholen des Ausrichtungs- und des Ansaugschritts für die wenigstens eine Hohlnadel umfasst, um mehrere Tierzellkolonien aufzunehmen.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die wenigstens eine Hohlnadel eine Vielzahl von Hohlnadeln umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Abgabebehälter eine Anordnung von Vertiefungen umfasst, die durch einen charakteristischen Abstand getrennt sind, und die Hohlnadeln ebenfalls in dem charakteristischen Abstand angeordnet sind, so dass der Auswerfschritt für alle Hohlnadeln parallel durchgeführt werden kann.
Das Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, wobei die Tierzellkolonien an dem Probenbehälter anhaften, und wobei nach dem Einführungsschritt das distale Ende der Nadel im Verhältnis zum Probenbehälter gerüttelt wird, um die Tierzellkolonie an dieser Position zu lösen, bevor der Ansaugschritt durchgeführt wird.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Tierzellkolonien mit einem Kontrastverstärkungsmittel gefärbt werden, um die Bildverarbeitung zu unterstützen.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Tierzellkolonien mit einem Fluoreszenzmittel gefärbt werden, um die Bildverarbeitung zu unterstützen.
Das Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Vielzahl von Tierzellkolonien ein interessierendes biologisches Molekül umfasst oder exprimiert.
Das Verfahren nach Anspruch 8, wobei das interessierende biologische Molekül ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: einem Peptid, einem Polypeptid, einer Nukleinsäure oder einem glycosylierten oder unglycosylierten Protein.
Das Verfahren nach Anspruch 9, wobei das interessierende Protein ein biopharmazeutisches Protein ist.
Das Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Einführungsschritt das Bewegen der Hohlnadel zu einer Kolonieaufnahmeposition umfasst, in der das distale Ende der Hohlnadel in das Medium getaucht und um einen Versatzabstand von einer Basis des Probenbehälters versetzt wird und dann der Ansaugschritt an der Kolonieaufnahmeposition ausgeführt wird.
Das Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend: (i) Verwenden des maschinellen Sehens zum Aufnehmen eines Bilds der Probe; (ii) Durchführen einer Analyse des Bilds mit der Bildverarbeitung, um die aufzunehmenden Tierzellkolonien zu erfassen, wodurch eine Aufnahmeliste von Zielkolonien erstellt wird; und (iii) Anweisen der Vorrichtung, die Zielkolonien von der Aufnahmeliste zu gewinnen, wobei die Zielkolonien durch wiederholtes Durchführen des Ausrichtungs-, Aufnahme- und Abgabeschritts aufgenommen werden.