DE60133750T2

DE60133750T2 - Verfahren zur herstellung von closterovirus-resistenten pflanzen

Info

Publication number: DE60133750T2
Application number: DE60133750T
Authority: DE
Inventors: Wouter Pieter De Ruiter; Bernardus Josef Van Der Knaap; Abraham Alexander Klapwijk; Rene Johannes Hofstede
Original assignee: De Ruiter Seeds R&D BV
Current assignee: Monsanto Invest BV
Priority date: 2000-09-14
Filing date: 2001-09-14
Publication date: 2009-05-14
Anticipated expiration: 2021-09-15
Also published as: JP5599541B2; JP5706858B2; EP1317558B1; ES2211361A1; AU2001294407A1; EP2292775A2; EP1992221A1; EP1188833A1; PT1317558E; ES2304131T3; DE60133750D1; EP2292775A3; EP1317558A2; ES2211361B1; US20080189811A1; JP2012213409A; WO2002022836A2; US7348467B2; US8759622B2; US20040006790A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Gurkenpflanzen, die resistent gegen Closteroviren sind, welche in Gurken vorkommen.
Hintergrund der Erfindung
Während der letzten 15 Jahre sind Vergilbung erzeugende Viren in der Gurke eine ernsthafte Sorge von Züchtern geworden, da sie zu Ausfällen bei der Produktion von Gurken (Hassan: A Review of a Yellowing and Stunting disorder of Cucurbits in the United Arab Emirates Emir., J. Agric. Sci (1991), 2: 1–16). Die vergilbenden Viren sind Closteroviren. Insbesondere betrifft dies zwei von der Mottenlaus (whitefly) übertragene Viren. Die Viren sind als Beet Pseudo Yellows Virus (BPYV) bekannt sind, was gleichbedeutend mit dem Chlorotic Spot Virus der Gurke ist, welches durch Trialeurodes vaporariorum übertragen wird, und mit dem Cucurbit Yellow Stunting Disorder Virus (CYSDV), welches durch Bemisia tabaci übertragen wird. Die Gruppe der Closteroviren umfasst ferner unter anderem das Lettuce Infection Yellows Virus (LIYV), das ein Mitglied der Closteroviren-Gattung Crinivirus ist. Die Viren werden normalerweise für etwa 7 Tage in den Überträgern gehalten und durch die Fütterungsaktivität der Mottenläuse auf der Pflanze übertragen. Eine herkömmliche Art der Krankheitskontrolle ist die Eliminierung der Überträger durch Insektizidbehandlung. Bislang gab es keine bekannte Quelle für eine Resistenz der Erreger, und es ist dahingehend geforscht worden, den Überträger durch Insektizidbehandlung zu elimieren oder durch Anzüchten einer Resistenz gegen Mottenläuse. Bislang sind beide Ansätze für die Kontrolle der Erkrankungen erfolglos geblieben. Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Gurkenpflanzen bereitzustellen, die resistent gegen das Closterovirus sind, welches in der Gurke auftritt, insbesondere gegen BPSV und CYSDV.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegenden Erfinder haben herausgefunden, dass die Gurke Landrace Khira, PI 250147, die aus Pakistan stammt, eine Resistenz gegen BPSV und CYSDV verleiht. Sie kreuzten PI 250147 mit Cucumis sativus-Kulturzuchtmaterial. Nach Durchführung der Kreuzung, wurden Samen in dieser Pflanze produziert, und die geernteten Samen wurden in Pflanzen angezüchtet. Diese Pflanzen wurden hinsichtlich ihrer Resistenz gegen BPYV und CYSDV untersucht. Pflanzen, die eine Resistenz zeigten, wurden mit empfindlichen Elite-Linien der Gurke rückgekreuzt. Es wurde eine QTL (Quantitative Trait Loci)-Analyse unter Verwendung der AFLP-Fingerprint-Technologie durchgeführt, die zu dem Ergebnis führt, dass die Resistenz mit zwei QTLs assoziiert ist.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Gurkenpflanzen bereit, die resistent gegen in der Gurke vorkommende Closteroviren sind, wobei das Verfahren Schritte umfasst, bei denen man:

a. eine Cucumis sativus-Pflanze bereitstellt, die Allele enthält, welche Resistenz gegen Gurken-Closteroviren verleihen, wobei die Allele durch zwei Quantitative Trait Loci QTL1 und QTL2 auf verschiedenen Chromosomen charakterisiert sind, wobei QTL1 durch die folgenden flankierenden Marker definiert ist; i) einen Marker von etwa 244 bp, der von 5' nach 3' aus einem EcoRI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, einem genomischen Fragment der Gurke und einem MseI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 besteht, ii) einen Marker von etwa 188 bp, der von 5' nach 3' aus einem EcoRI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, einem genomischen Fragment der Gurke und einem MseI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 besteht, und iii) einen Marker von etwa 251 bp, der von 5' nach 3' aus einem EcoRI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 3, einem genomischen Fragment der Gurke und einem MseI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 4 besteht, oder einen beliebigen Teil der DNA-Sequenz von PI 250147 zwischen den flankierenden Markern, der Resistenz gegen Closterovirus verleiht, und wobei QTL2 durch die folgenden Marker definiert ist: i) einen Marker von etwa 260 bp, der von 5' nach 3' aus einem EcoRI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 5, einem genomischen Fragment der Gurke und einem MseI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 besteht, und ii) einen Marker von etwa 107 bp, der von 5' nach 3' aus einem EcoRI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 5, einem genomischen Fragment der Gurke und einem MseI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 6 besteht, oder einen beliebigen Teil der DNA-Sequenz von PI 250147 zwischen den flankierenden Markern, der Resistenz gegen Closterovirus verleiht,
b) die in Schritt a bereitgestellte Cucumis sativus-Pflanze mit Cucumis sativus-Kulturzuchtmaterial kreuzt,
c) die aus der Kreuzung in Schritt b resultierenden Samen sammelt;
d) die Samen in Pflanzen regeneriert;
e) die Pflanzen aus Schritt d im Hinblick auf eine Resistenz gegen Gurken-Closteroviren beurteilt; und
f) Pflanzen, die resistent gegen Gurken-Closteroviren sind, unter Verwendung der in Schritt a definierten Marker identifiziert und selektiert.

Die Erfindung stellt ferner Samen einer Gurkenpflanze bereit, die resistent gegen in der Gurke vorkommende Closteroviren ist, wobei diese durch das obige Verfahren hergestellt wurde.
Der Begriff "Resistenz gegen Gurken-Closteroviren" wird vorliegend in derselben Bedeutung verwendet, wie er von Züchtern verwendet wird: eine Pflanze ohne sichtbare Symptome an Blatt, Stamm oder Frucht, die durch Closteroviren verursacht werden.
Bei der Gurke ist die genetische Variabilität beschränkt. Darüber hinaus ist es nahezu unmöglich, Cucumis sativus mit verwandten Arten zu kreuzen. Quellen für genetisches Material, das Merkmale für (neue) Krankheiten enthält, sind daher schwierig zu erhalten. Sogenannte Landrace, bei denen es sich um Subspezies der kommerziell verwendeten Lang-Gurken (long cucumber) und Slicer-Gurken handelt, werden z. B. in Osteuropa beibehalten: die Subspezies rigidus var. "Europea" und die Subspezies gracilis var. "Izmir and Cilicium" (S. Neykov, Plant Genetic Resources Newsletter, 99, 1–2 (1994). In diesem Artikel wurde vorgeschlagen, dass Khira PI 196289, die aus Indien stammt, Potential für eine kombinatorische Selektion aufweist, insbesondere bei Geschmackseigenschaften. Es wurde überraschenderweise herausgefunden, dass Khira PI250147 eine neuartige Resistenz gegen BPYV und CYSDV unter den 150 getesteten und bekannten Akzessionen aufweist. Die vorliegende Erfindung betrifft den erfolgreichen Transfer der Allele, die Resistenz gegen BPYV und CYSDV verleihen, auf die Lang-Gurke und die Mini-Typen, die üblicherweise in Europa und dem Nahen Osten verwendet werden.
In der englischen Literatur wird der Name Khira einige Male erwähnt (Neykov, 1994, Dhillon, Plant Genetic Resources Newsletter, 119, 59–61, 1999), jedoch nie im Zusammenhang mit einer Virusresistenz. Dies liegt daran, dass die beiden betroffenen Viren in Pakistan und in der umgebenden Region nicht vorkommen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zur Herstellung von Gurkenpflanzen (Cucumis sativus), die resistent gegen BPYV und CYSDV sind. Diese Pflanzen werden als resistent gegen Erkrankungen bezeichnet, wenn die Pflanzen bei Kontakt mit Mottenläusen, welche BPYV und CYSDV enthalten, keine Krankheitssymptome zeigen im Vergleich zu empfindlichen Pflanzen signifikant verringerte Symptome zeigen. Die Pflanzen, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten werden, sind aufgrund der Resistenz gegen BPYV und CYSDV in Cucumis sativus neu. PI 250147 enthält Allele, die eine Resistenz gegen BPYV und CYSDV verleihen. Die Allele können erfolgreich unter Verwendung von markerunterstützten Züchtungsverfahren auf Elite-Linien übertragen werden. Die erfindungsgemäßen Pflanzen können durch herkömmliche Züchtungsverfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann Samen von PI 250147 verwendet werden. Aufgrund des unterschiedlichen Krankheitsdrucks ist die Markerselektion für den selektiven Transfer auf Elite-Linie, die mit bekannten erfolgreichen Hybriden auf dem Markt konkurrieren können, entscheidend. Die Vererbung erfolgt Oligogen-rezessiv. Dies bedeutet, dass sehr große Populationen aus isolierten Pflanzengenerationen erforderlich sind, um die weniger als 2% resistenten (homozygoten) Pflanzen zu finden.
Beispiel 1

Es wurde ein Test entwickelt, bei dem der Mottenlaus (Trialeurodes und/oder Bemisia) als Überträger verwendet wurde. Mottenläusen wurde es erlaubt, sich von infizierten adulten Gurkenpflanzen, die BPYV enthielten, in einer kontrollierten Gewächshausumgebung zu ernähren. In dieses Treibhaus wurden 150 Einträge aus Genbanken (75 aus Indien, 60 aus China und 15 aus Pakistan) eingebracht, wobei die Empfindlichkeit überprüft wurde. Einzelne junge Pflanzen im Blattstadium 2–4 wurden auf einem Träger (30 Pflanzen/m²) in ein Treibhaus platziert, wobei diese von infizierten Pflanzen und Mottenläusen umgeben waren. Die Begutachtung wurde 2 Wochen später dupliziert. Dieser Aufbau des Tests führte zu einer erfolgreichen, zufälligen Verteilung des Virus auf alle jungen Pflanzen auf den Trägern. Nach 2 Wochen wurden alle Pflanzen in ein Treibhaus gepflanzt, das den Überträger enthielt. Nach weiteren 3 bis 4 Wochen wurde die Infektion auf einer Skala von 1 (Resistenz) bis 8 (empfindlich) bewertet. Symptome für Empfindlichkeit waren 5 bis 6 Wochen nach Beginn des Experiments sichtbar. Überraschenderweise war lediglich eine Akzession, PI 250147 (Khira), resistent, wie durch das offensichtliche Fehlen von Symptomen gezeigt wurde. Tabelle 1

Akzessionskode	1. Experiment	2. Experiment	Durchschnitt
PI 197087	3	5	4
PI 164819	8	8	8
PI 179676A	7	8	7,5
PI 164794	8	8	8
PI 250147 (Khira)	1	2	1,5
PI 211117	6	4	5
PI 202801	4	6	5
PI 182190	8	8	8
PI 212599	8	5	6,5
PI 344439	7	8	7,5
PI 211988	6	8	7
PI 419009	8	8	8
PI 391573	7	8	7,5
PI 321011	6	8	7

Tabelle 1: Resistenz gegen CYSDV, wie sie auf einer Skala von 1 (resistent) bis 8 (empfindlich) bewertet wurde (ein Teil der 150 Akzessionen)

Die resistente Akzession wurde mit Elite-Zuchtlinien gekreuzt. Die erste Rückkreuzung (BC1) erwies sich als vollständig empfindlich gegen das Virus, was auf die Tatsache verweist, dass die Resistenz durch rezessive Gene kontrolliert wird. Daher war die BC1 selbstbestäubend. Selbstbestäubende Samen wurde wie in diesem Beispiel beschrieben auf Träger gesät und im Hinblick auf die Resistenz der Pflanzen getestet. Die resistenten Pflanzen wurden in ein Treibhaus gebracht, wo die visuelle Selektion auf den Phänotyp durchgeführt wurde, der äquivalent zu der in der anfänglichen Kreuzung verwendeten Elite-Linie ist. Die selektierten einzelnen Pflanzen wurden mit dem ursprünglichen Elite-Elter rückgekreuzt, und anschließend wurde dieselbe Zuchtstrategie für den Transfer von rezessiven Merkmalen auf die Elite-Linie durchgeführt.
Beispiel 2
PI 250147 wurde mit einer Elite-Zuchtlinie gekreuzt. Die E1-Samen wurden gesammelt. Die F1-Pflanzen wurden bis zur Reife angezüchtet und die Pflanzen wurden selbstbestäubt. Die F2-Samen wurden anschließend geerntet. Die F2-Population wurde in einem Treibhaus unter Testbedingungen ausgesät, die im Wesentlichen denen von Beispiel 1 entsprachen. Von jeder einzelnen Pflanze wurde das Ausmaß der Resistenz beurteilt, und es wurden DNA-Proben erhalten. Mit diesem Material wurde eine QTL (Quantitative Trait Loci)-Analyse durchgeführt, wie sie im Wesentlichen in Young, Annual Review of Phytopathology 34, 479–501 (1996), beschrieben wurde. Die Analyse wurde bei Keygene unter Verwendung der AFLP-Technologie durchgeführt (Vos et al., Nucleic Acids Research, 1995, Band 23, Nr. 21, 4407–4414) durchgeführt. Im Ergebnis war die Resistenz auf 3 QTLs zurückzuführen:
Ein Haupt-QTL, der 42% der phänotypischen Variation erklärt (QTL1, ursprünglich in einer 24 cM-Region, die 4 Marker enthält). Ein zweiter, mittlerer QTL, der 13% des Phänotyps erklärt, auf einem anderen Chromosom (QTL2, ursprünglich in einer 24 cM-Region, die 7 Marker enthält) und ein dritter QTL in einer Region, die 8 Marker enthält. Die Marker in jeder QTL-Region wurden verwendet, um F2-Individuen aus der großen F2 zu identifizieren, die in Bezug auf eine der drei QTL-Regionen Rekombinante waren. Die Rekombinanten wurden in nahe isogene Rekombinante (Near Isogenic Recombinants; NIR)-Gruppen eingeteilt, sodass die genetische Konstitution der Verbindung innerhalb einer Gruppe lediglich im Hinblick auf den analysierten QTL abwich. Durch Vergleich der F3-Phänotypen innerhalb und zwischen den Gruppen wurde eine Feinkartierung der QTLs durchgeführt. Die F3 dieser NIR-Gruppen wurde im Hinblick auf die Resistenz untersucht.
Wir konnten 2 der 3 QTL-Regionen eingrenzen. QTL1 ist nur noch 16 en, QTL2 lediglich 10 cM groß.
Sequenzprotokoll
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung von Gurkenpflanzen, die resistent gegen Closteroviren sind, die in der Gurke vorkommen, wobei das Verfahren Schritte umfasst, bei denen man: a. eine Cucumis sativus-Pflanze bereitstellt, die Allele enthält, welche Resistenz gegen Gurken-Closteroviren verleihen, wobei die Allele durch zwei Quantitative Trait Loci QTL1 und QTL2 auf verschiedenen Chromosomen charakterisiert sind, wobei QTL1 durch die folgenden flankierenden Marker definiert ist; i) einen Marker von etwa 244 bp, der von 5' nach 3' aus einem EcoRI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, einem genomischen Fragment der Gurke und einem MseI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 besteht, ii) einen Marker von etwa 188 bp, der von 5' nach 3' aus einem EcoRI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, einem genomischen Fragment der Gurke und einem MseI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 besteht, und iii) einen Marker von etwa 251 bp, der von 5' nach 3' aus einem EcoRI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 3, einem genomischen Fragment der Gurke und einem MseI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 4 besteht, oder einen beliebigen Teil der DNA-Sequenz von PI 250147 zwischen den flankierenden Markern, der Resistenz gegen Closterovirus verleihen, und wobei QTL2 durch die folgenden Marker definiert ist: i) einen Marker von etwa 260 bp, der von 5' nach 3' aus einem EcoRI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 5, einem genomischen Fragment der Gurke und einem MseI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 besteht, und ii) einen Marker von etwa 107 bp, der von 5' nach 3' aus einem EcoRI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 5, einem genomischen Fragment der Gurke und einem MseI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 6 besteht, oder einen beliebigen Teil der DNA-Sequenz von PI 250147 zwischen den flankierenden Markern, der Resistenz gegen Closterovirus verleiht, b. die in Schritt a bereitgestellte Cucumis sativus-Pflanze mit Cucumis sativus-Kulturzuchtmaterial kreuzt, c. die aus der Kreuzung in Schritt b resultierenden Samen sammelt, d. die Samen in Pflanzen regeneriert, e. die Pflanzen aus Schritt d im Hinblick auf eine Resistenz gegen Gurken-Closteroviren beurteilt, und f. Pflanzen, die resistent gegen Gurken-Closteroviren sind, unter Verwendung der in Schritt a definierten Marker identifiziert und selektiert.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die in Schritt a bereitgestellte Cucumis sativus-Pflanze PI 250147 (eine Khira Landrace) ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Closterovirus Beet Pseudo Yellows Virus (BPYV) oder Cucurbit Yellow Stunting Disorder Virus (CYSDV) ist.
Verfahren zur Herstellung von Samen, die zu Gurkenpflanzen führen, welche resistent gegen Closteroviren sind, die in der Gurke vorkommen, wobei das Verfahren Schritte umfasst, bei denen man: a. eine Cucumis sativus-Pflanze bereitstellt, die Allele enthält, welche Resistenz gegen Gurken-Closteroviren verleiht, wobei die Allele durch zwei Quantitative Trait Loci QTL1 und QTL2 auf verschiedenen Chromosomen charakterisiert sind, wobei QTL1 durch die folgenden flankierenden Marker definiert ist; i) einen Marker von etwa 244 bp, der von 5' nach 3' aus einem EcoRI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, einem genomischen Fragment der Gurke und einem MseI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 besteht, ii) einen Marker von etwa 188 bp, der von 5' nach 3' aus einem EcoRI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, einem genomischen Fragment der Gurke und einem MseI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 besteht und iii) einen Marker von etwa 251 bp, der von 5' nach 3' aus einem EcoRI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 3, einem genomischen Fragment der Gurke und einem MseI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 4 besteht, oder einen beliebigen Teil der DNA-Sequenz von PI 250147 zwischen den flankierenden Markern, der Resistenz gegen Closterovirus verleiht, und wobei QTL2 durch die folgenden Marker definiert ist: i) einen Marker von etwa 260 bp, der von 5' nach 3' aus einem EcoRI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 5, einem genomischen Fragment der Gurke und einem MseI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 besteht, und ii) einen Marker von etwa 107 bp, der von 5' nach 3' aus einem EcoRI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 5, einem genomischen Fragment der Gurke und einem MseI-Primer mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 6 besteht, oder einen beliebigen Teil der DNA-Sequenz von PI 250147 zwischen den flankierenden Markern, der Resistenz gegen Closterovirus verleiht, b. die in Schritt a bereitgestellte Cucumis sativus-Pflanze mit Cucumis sativus-Kulturzuchtmaterial kreuzt, c. die aus der Kreuzung in Schritt b resultierenden Samen sammelt, d. Samen, die zu Gurkenpflanzen führen, welche resistent gegen Gurken-Closteroviren sind, unter Verwendung der in Schritt a definierten Marker selektiert und identifiziert.