DE60125591T2

DE60125591T2 - Methoden zum screening von verbindungen die den lipid metabolismus modulieren

Info

Publication number: DE60125591T2
Application number: DE60125591T
Authority: DE
Inventors: David Michael Kentville WINTHER; Christine Leah Kentville KNICKLE; Martin Coldbrook HAARDT; John Stephen New Minas ALLEN; Andre Kingston PONTON; Justo Roberto Coldbrook DE ANTUENO; Kenneth D. Coldbrook JENKINS; O. Solomon Coldbrook NWAKA
Original assignee: Xenon Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Xenon Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2000-10-26
Filing date: 2001-10-26
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2021-10-27
Also published as: AU2002214856B2; CA2427024A1; JP2004512049A; WO2002034940A2; US20090060900A1; DE60125591D1; EP1354047B1; AU1485602A; ATE349535T1; EP1354047A2; WO2002034940A3; US7256028B2; US20040096435A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die Identifizierung von Nucleotiden, Proteinen, Verbindungen und/oder pharmakologischen Wirkstoffen, welche den Expressionsspiegel von Desaturase-Genen wirksam regulieren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Diabetes mellitus stellt eine Ansammlung genetisch bedingter Funktionsstörungen dar, von denen eine der veränderte Metabolismus von Lipiden ist, verbunden mit einem Insulinmangel oder einer Insulinresistenz. Diabetiker neigen zu bestimmten Langzeit-Komplikationen. Die Palette medizinischer Probleme umfasst kardiovaskuläre Erkrankungen, Retinopathie, Nephropathie und Neuropathie. Bei dem letzteren Zustand handelt es sich um eine neuropathologische Funktionsstörung des peripheren Nervensystems, welche zu einer Verringerung der Nervenleitungsgeschwindigkeit sowohl in motorischen wie auch in sensorischen Nerven führt. Die Pathophysiologie der diabetischen peripheren Neuropathie könnte mit dem anomalen Metabolismus essentieller Fettsäuren in Verbindung stehen (Julu, P. in Essential Fatty Acids and Eicosanoids, AOCS Press, III., USA, S. 168-175 (1998)). Dieser anomale oder veränderte Lipidmetabolismus äußert sich in einem Mangel im Einbau von n-6-Fettsäuren in Membranphospholipide (Coste et al., J. Nutr. Biochem. 10: 411-420 (1999)). Befunde von experimentellen Diabetes-Studien an Tieren weisen darauf hin, dass die Biosynthese von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFAs) durch die Desaturations- und Elongationssysteme gestört wird. Eine multizentrische klinische Studie, die von Scotia Pharmaceuticals (GB) unterstützt wurde, hat gezeigt, dass die Versorgung von Patienten mit leichter diabetischer Neuropathie mit n-6-Fettsäuren wie z.B. Gamma-Linolensäure (GLA) den Verlauf der Krankheit lindert (Keen et al., Diabetes Care 16: 8-15 (1993)).
PUFAs sind auch dafür bekannt, dass sie Zellzyklus-Arrest, Induktion von Apoptose, Hemmung der Mitose (Seegers et al., Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 56: 271-280 (1997) und Lai et al., Br. J. Cancer 74: 1375-1383 (1996)) sowie Zellproliferation (Calviello et al., Int. J. Cancer 75: 699-705 (1998)), eine Verringerung der Tumor-Endothel-Adhäsion, eine Verbesserung der Informationsübertragung über die Gap-Junctions des Endothels (Jiang et al., Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 56: 307-316 (1997)), eine Hemmung von Urokinasen (du Toit et al., Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 51: 121-124 (1994)), eine Verringerung der Wirkungen von Wachstumsfaktoren auf Krebszellen (Jiang et al., Br. J. Cancer 71: 744-752 (1995b)), die Rückbildung der Mehrfachresistenz gegenüber Arzneistoffen (Weber et al., J. Nat. Cancer Inst. 86: 638-639 (1994)) sowie eine Steigerung der cytotoxischen Wirkungen von Chemotherapeutika verursachen (Plumb et al., Br. J. Cancer 67: 728-733 (1993) und Anderson et al., Anticancer Res. 18: 791-800 (1998)).
N-3- und n-6-Fettsäuren folgen einer ähnlichen metabolischen Route und es ist wahrscheinlich, dass verschiedene Enzyme auf ähnliche Substrate in beiden PUFA-Familien wirken. In dem n-6-Reaktionspfad wird Dihomo-Gamma-Linolensäure (DGLA, 20:3n-6) durch Desaturation mit Hilfe eines Enzyms, das unter dem Namen Delta-5-Desaturase (D5D) bekannt ist, zu Arachidonsäure umgewandelt. Dieses Enzym erzeugt in dem n-3-Reaktionspfad auch Eicosapentaensäure (EPA, 20:5n-3) aus Delta-8,11,14,17-Eicosatetraensäure (20:4n-3).
Delta-5-Desaturase gehört zu einer Unterklasse von Enzymen, die als „Front end"-Desaturasen bekannt sind, welche Doppelbindungen in die Acylkette zwischen der Carboxyl-Gruppe und einer vorhandenen Doppelbindung einführen. Die Delta-5-Desaturase ist ein an die Membran des endoplasmatischen Retikulums gebundenes Enzym, welches Teil eines Systems ist, das aus drei Haupt-Proteinen besteht, die mit einer Elektronentransportkette verbunden sind (Fujiwara et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 110: 36-41 (1983) und Arch. Biochem. Biophys. 233: 402-407 (1984)). Die Clonierung, die Expression und die Fettsäureregulation der menschlichen Delta-5-Desaturase ist früher beschrieben worden (Cho et al., J. Biol. Chem 274: 37335-37339 (1999b); Leonard et al., Biochem. J. 347: 719-724 (2000) und Marquardt et al., Genomics 66: 175-183 (2000)).
Es ist vorgeschlagen worden, dass es sich sowohl bei Arachidonsäure (AA) als auch bei Eicosapentaensäure (EPA), direkten Produkten von Delta-5-Desaturase, um Schlüssel-PUFAs handelt, die mit einer Vielzahl von Krankheiten assoziiert sind. Ein chronisches zelluläres Ungleichgewicht zwischen AA und EPA und deren jeweiligen Eicosanoid-Derivaten kann bedeutende Auswirkungen auf die Gesundheit haben. Dieses Ungleichgewicht ist mit arteriellem Bluthochdruck, Hypercholesterinämie, arteriosklerotischer Herzkrankheit, chronischer Entzündung und Autoimmunkrankheiten, allergischem Ekzem und anderen atopischen Funktionsstörungen in Verbindung gebracht worden (Booyens et al., Med. Hypotheses 18: 53-60 (1985)). In diesem Zusammenhang hat die Fettsäure-Analyse einer Gruppe der Plasmaphospholipid-Fraktion von Patienten mit koronarer Herzkrankheit ans Licht gebracht, dass die Spiegel von AA, EPA, Gamma-Linolensäure (GLA) und Docosahexaensäure (DHA) niedrig sind. Bei Patienten mit primärer Hypertonie sind Linolsäure (LA) und AA ebenfalls niedrig. (Das U., Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 52: 387-391 (1995)). Darüber hinaus könnte die Bioverfügbarkeit von Eicosanoid-Vorläufern und insbesondere von AA verschiedene vaskuläre Funktionen beeinträchtigen und einen Einfluss auf die Pathogenese oder auf die Komplikationen der Hypertonie haben (Russo et al., Hypertension 4: 1058-1063 (1997)). Es ist auch gezeigt worden, dass der Prozentsatz an AA-enthaltenden Arten von Phosphatidylcholin (PC) im Plasma von Patienten mit Hypercholesterinämie erniedrigt war. Die gleichen PC-Arten mit AA waren in den Thrombocyten der Patienten erniedrigt (Dobner, P. und Engelmann B., Am. J. Physiol. 275: E777-E784 (1998)).
Außer dass es als Vorläufer von Eicosanoiden und anderen bioaktiven Molekülen dient, kann AA als ein sekundärer Botenstoff fungieren (Khan et al., Cell. Signal. 7: 171-184 (1995)).
Die proinflammatorischen Eicosanoide Prostaglandin E₂ und Leukotrien B₄ sind von AA abgeleitet, das durch den hohen Gehalt an mehrfach ungesättigten n-6-Fettsäuren und den niedrigen Gehalt an mehrfach ungesättigten n-3-Fettsäuren der modernen westlichen Ernährung auf hohen zellulären Konzentrationen gehalten wird (James et al., Am. J. Clin. Nutr. 71: 343S-348S (2000)). Kürzliche Ergebnisse haben nahegelegt, dass die Produktion von Prostaglandin E₂ durch Hemmen der Delta-5-Desaturation vermindert werden kann, mit einer gleichzeitigen Verringerung von Entzündungsvorgängen wie z.B. rheumatoider Arthritis (Chavali, S.R. und Forse, R.A. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 61: 347-352 (1999); Navarro et al., J. Rheumatol. 27: 298-303 (2000)). In der Tat sind AA-abgeleitete Eicosanoide proinflammatorisch und regulieren die Funktionen von Zellen des Immunsystems. Der Verzehr von Fischölen führt zu einem Austausch von AA in Zellmembranen durch EPA. Dies ändert die Menge und verändert das Gleichgewicht der erzeugten Eicosanoide. Ein Verzehr von Ölen, die reich an EPA sind, vermindert die Proliferation von Lymphocyten, die T-Zell-vermittelte Cytotoxizität, die Aktivität natürlicher Killerzellen, die Makrophagen-vermittelte Cytotoxizität, die Chemotaxis von Monocyten und Neutrophilen, die Expression des und die Antigenpräsentation durch den Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex Klasse II, die Produktion von pro-inflammatorischen Cytokinen (den Interleukinen 1 und 6, Tumornekrosefaktor) und die Expression von Adhäsionsmolekülen. (Calder, P.C., Braz. J. Med. Biol. Res. 4: 467-490 (1998)). Bei experimentell induzierter T-Zell-vermittelter Autoimmunkrankheit scheinen Diäten ohne essenzielle Fettsäuren oder Diäten, welche mit n-3-Fettsäuren supplementiert sind, die Krankheit zu verstärken, wohingegen n-6-Fettsäuren diesen vorbeugen oder den Schweregrad vermindern. Die Regulation der Genexpression, der Signaltransduktionswege, der Produktion von Eicosanoiden und Cytokinen und die Wirkung von antioxidativen Enzymen sind alle Mechanismen, über die mit der Nahrung aufgenommene n-6- und n-3-Fettsäuren Wirkungen auf das Immunsystem und auf Autoimmunkrankheit ausüben können. (Harbige, L.S., Proc. Nutr. Soc. 4: 555-562 (1998)).
Patienten mit atopischer Dermatitis (Ekzem) weisen erniedrigte Spiegel von Delta-5- Desaturase-Produkten wie z.B. AA auf (Hansen, A.E. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 31: 1160-1161 (1933)). Diese Befunde stehen im Einklang mit den anderen Studien, in denen Ekzem-Patienten niedrige Spiegel von Serum-AA aufwiesen (Manku et al., Br. J. Dermatol. 110: 643-680 (1984)). Der therapeutische Nutzen einer Supplementierung mit n-6-PUFAs bei atopischem Ekzem ist berichtet worden (Wright, S. und Burton, J.L., Lancet 2: 1120-1122 (1982)). Diese Behandlungen sind nicht auf n-6-PUFAs beschränkt, da günstige Wirkungen auch unter Verwendung einer Salbe erreicht worden sind, die EPA und DHA enthielt (Watanabe T. und Kuroda Y., J. Med. Invest. 46: 173-177 (1999)).
Psoriasis ist eine weitere, damit assoziierte Krankheit. Dabei handelt es sich um eine multifaktorielle Hautkrankheit, die durch einen umfassenden Anstieg von freier AA und deren pro-inflammatorischen Metaboliten gekennzeichnet ist. Wenn man einen alternativen Vorläufer (d.h. EPA) bereitstellt, der mit AA bei der Eicosanoid-Synthese konkurriert, wird die pro-inflammatorische Wirkung vermindert, indem die Erzeugung von weniger inflammatorischen und chemotaktischen Derivaten mit einer gleichzeitigen Verringerung der chronischen Plaque-artigen Psoriasis induziert wird (Mayser et al., J. Am. Acad. Dermatol. 38: 539-547 (1998)).
Auf ähnliche Weise ist das akute Atemnotsyndrom (ARDS), welches durch eine akute Lungenverletzung gekennzeichnet ist, mit einer übermäßigen Freisetzung von AA-abgeleiteten inflammatorischen Mediatoren und toxischen Sauerstoffradikalen aus aktivierten intrapulmonären Makrophagen und Neutrophilen verbunden. Die Ergänzung von Ernährungsrezepturen mit einer Kombination aus EPA und GLA, die einen anti-inflammatorischen Zustand begünstigt, wird als adjuvante Therapie bei der klinischen Behandlung von Patienten mit ARDS oder von Patienten, die ein Risiko für die Entwicklung von ARDS aufweisen, eingesetzt (Gadek et al., Crit. Care Med. 27: 1409-1420 (1999)).
Es gibt auch eine Verbindung zwischen der Anreicherung von Lipiden im Allgemeinen und AA, insbesondere mit dem histologischen Schweregrad der menschlichen Gelenkpathologie (Lippiello et al., Metabolism 40: 571-576 (1991)). Kürzliche Befunde zeigen, dass die Supplementierung mit n-3-Fettsäuren die molekularen Mechanismen beeinflusst, die die Expression von katabolen Faktoren regulieren, die in den Abbau von Gelenkknorpel (ACD) verwickelt sind. Dies zeigt die nützliche Rolle von n-3-PUFAs bei der Abschwächung der physiologischen Parameter, welche Gelenkentzündungen verursachen und diese fördern (Curtis et al., J. Biol. Chem 275: 721-724 (2000)).
AA und EPA haben unterschiedliche Wirkungen auf Krebs in Säugerzellen. Studien haben gezeigt, dass n-3- und n-6-PUFAs und/oder deren Metaboliten die Fähigkeit haben, die Expression von Tumorsuppressoren zu modulieren (Jiang et al., Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 62: 119-127 (2000)), zu anti-metastatischen Mechanismen zu führen (Jiang et al., Br. J. Cancer 77: 731-738 (1998a) und Biochem. Biophys. Res. Commun. 244: 414-420 (1998b)) und die Expression von Zelladhäsionsmolekülen modulieren, wozu E-Cadherin, Desmoglein und Beta-Catenin gehören (Jiang et al., Cancer Res. 55: 5043-5048 (1995) und Jiang et al., Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 62: 119-127 (2000)).
Insbesondere ist berichtet worden, dass EPA das Wachstum von menschlichem Bauchspeicheldrüsenkrebs-Zelllinien in vitro erheblich hemmt (Falconer et al., Br. J. Cancer 69: 826-832 (1994)) und die Akute-Phase-Reaktion in Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs-Kachexie herunterreguliert (Wigmore et al., Clin. Sci. 92: 215-221 (1997)). Es ist auch gezeigt worden, dass maligne Zellen nach einer Exposition gegenüber EPA viel höhere Spiegel von potenziell cytotoxischen Superoxid-Radikalen und Lipid-Peroxidations-Produkten erzeugen (Takeda et al., Anticancer Res. 13: 193-199 (1993)).
Pilze, Mikroalgen und Rattenleber-Mikrosomen sind in verschiedenen Laboratorien eingesetzt worden, um Inhibitoren der Fettsäure-Delta-5-Desaturase zu testen (Kawashima et al., Biosci. Biotech. Biochem. 60: 1672-1676 (1996) und Obukowicz et al., Biochem. Pharmacol. 55: 1045-1058 (1998)). Diese Modelle, die unterschiedliche Spezies einsetzen, sind jedoch durch die Tatsache eingeschränkt, dass diese für ein Screening von Arzneistoffen nicht nah genug an dem gewünschten Zielmolekül, nämlich der menschlichen Delta-5-Desaturase, sind. Daher ist es wünschenswert, ein verbessertes Modell und eine verbesserte Methodik zu ent wickeln, um Wirkstoffe zu identifizieren, welche die Aktivität von Säuger- und insbesondere von menschlichen Fettsäure-Desaturasen modulieren. Der Einsatz von menschlicher Delta-5-Desaturase in ganzen Zellen, Sphäroplasten und Mikrosomen oder als das aufgereinigte Enzym aus transformierter Hefe, welche die Desaturase überexprimiert, stellt einen brauchbaren Ansatz dar, chemische Banken auf Modulatoren des Enzyms zu testen. Das transformierte Hefe-Modell beseitigt auch mögliche ethische Bedenken, die entstehen könnten, wenn menschliche oder Säugergewebe verwendet werden, um große Mengen dieser Enzyme für das Screening nach Arzneistoffen zu gewinnen.
In diesem Zusammenhang wird ein experimentelles Modell benötigt, welches man manipulieren kann, um die Expression von genetischem Material zu untersuchen, welches von Menschen und anderen Spezies isoliert worden ist, um die Rolle und die Funktion dieser Gene und deren korrespondierenden Proteinen im Metabolismus von PUFAs zu ermitteln. Dies ist insbesondere in Anbetracht der Tatsache der Fall, dass das Verhältnis zwischen der einzigartigen Rolle eines Proteins in einem metabolischen Reaktionspfad und der Expression des Gens, welches dieses Protein codiert, normalerweise ein genau koordinierter Vorgang ist, so dass subtile Abweichungen häufig zu anomalen physiologischen Prozessen führen können. Darüber hinaus würde ein solches System die Entdeckung und die Identifizierung von Zielmolekülkandidaten für Arzneistoffe erleichtern, welche auf der DNA- oder Protein-Ebene agieren, um Anomalitäten oder Ungleichgewichte bei Veränderungen des Lipidstoffwechsels zu korrigieren, welche mit bestimmten pathologischen Zuständen assoziiert sind, wie z.B. mit der diabetischen Neuropathie.
Auf dem Weg zur Entwicklung eines solchen Systems ist es entscheidend, die Kontrollregion für das Delta-5-Desaturase-Gen zu lokalisieren.
Der EMBL-Datenbankeintrag mit der Hinterlegungsnummer AV722419 offenbart eine EST-Sequenz, die zu dem Homo sapiens-cDNA-Clon HTBBZG12 gehört, welcher aus Hypothalamus-Gewebe abgeleitet wurde. Von dieser EST-Sequenz ist gezeigt worden, dass sie einige Ähnlichkeit zu einem Teil der Kontrollregion des Delta-5-Desaturase-Gens ausweist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung lehrt eine isolierte Nucleinsäure, umfassend eine DNA-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) SEQ ID NO: 1; (b) einem Fragment von (a), welches mindestens 15 Nucleotide hat; (c) einer Sequenz, welche zu mindestens 90% homolog zu (a) ist, und (d) eine Sequenz, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an (a), (b) oder (c) hybridisiert, wobei die Sequenzen (a) bis (d) in der Lage sind, die Transkription eines Gens zu regulieren, und wobei diese DNA-Sequenz nicht die DNA-Sequenz ist, die in dem EMBL-Datenbankeintrag mit der Hinterlegungsnummer AV722419 offenbart ist. Die Erfindung enthält eine Kontrollregion eines Gens der menschlichen Delta-5-Desaturase.
Die Erfindung lehrt ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül, umfassend die Nucleinsäure der Erfindung und ein Reportergen, wobei die Nucleinsäure eine Kontrollregion ist, welche transkriptionell mit dem Reportergen verbunden ist, um die Transkription des Reportergens effektiv zu initiieren, zu beenden oder zu regulieren. Das Reportergen kann aus der Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus Luciferase, Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), β-Galactosidase, alkalische Phosphatase, plazentare alkalische Phosphatase, Glucuronid-Synthetase, grün fluoreszierendes Protein (GFP) und menschlichem Wachstumshormon.
Die Erfindung lehrt auch ein Vektorkonstrukt, enthaltend das rekombinante Nucleinsäuremolekül der Erfindung, wobei das Vektorkonstrukt in der Lage ist, das Reportergen zu exprimieren, um ein Reportergenprodukt zu erzeugen, welches nach dem Einführen des Vektorkonstrukts in eine geeignete Wirtszelle oder ein geeignetes Wirtssystem nachgewiesen werden kann. Die Erfindung lehrt ferner eine Wirtszelle oder ein Wirtssystem, welches mit dem Vektorkonstrukt transformiert oder transfiziert ist. Bei der Wirtszelle kann es sich um eine Säugerzelle oder eine menschliche Zelle handeln. Die Säugerzelllinie kann von den menschlichen Zelllinien ZR-75-1 oder HepG2 stammen.
Die Erfindung lehrt auch ein Verfahren zum Screenen eines Modulators, welcher in der Lage ist, die transkriptionelle Expression eines Gens für die Delta-5-Desaturase eines Säugers zu modulieren oder zu regulieren, umfassend die Schritte: Bereitstellen eines Wirtssystems, enthaltend die Nucleinsäure der Erfindung und ein Reportergen, welches funktionell mit der Nucleinsäure verknüpft ist, wobei die Nucleinsäure eine Kontrollregion ist, welche wirksam ist, ein Transkriptionsniveau des Reportergens zu initiieren, zu beenden oder zu regulieren; Inkontaktbringen des Wirtssystems mit einer Testkomponente; Auswerten des Transkriptionsniveaus des Reportergens, wobei eine messbare Differenz im Transkriptionsniveau des Reportergens in Gegenwart der Testkomponente verglichen mit einer Kontrolle unter identischen Bedingungen, aber in Abwesenheit der Testkomponente, ein Indikator für die Fähigkeit der Testkomponente ist, die Expression des Delta-5-Desaturase-Gens transkriptionell zu modulieren oder zu regulieren; und Auswählen der Testkomponente, welche diese Fähigkeit besitzt, als Modulator. Die Kontrollregion kann eine DNA-Sequenz haben, welche durch SEQ ID NO: 1 repräsentiert ist, oder ein Fragment davon (siehe 1).
Die vorliegende Anmeldung lehrt ferner ein Verfahren zum Screenen eines Modulators, welcher in der Lage ist, die enzymatische Aktivität eines funktionellen Delta-5-Desaturase-Enzyms eines Säugers zu modulieren, umfassend die Schritte: Bereitstellen eines Wirtssystems, enthaltend eine Nucleinsäuresequenz, die ein Delta-5-Desaturase-Enzym eines Säugers codiert und welche funktionell mit einer Promotorregion verknüpft ist, wobei die Promotorregion wirksam ist, das Expressionsniveau der Nucleinsäuresequenz zu initiieren, zu beenden oder zu regulieren; Inkontaktbringen des Wirtssystems mit einer Testkomponente; Auswerten der enzymatischen Aktivität der Delta-5-Desaturase, wobei eine messbare Differenz im Spiegel eines Lipidmetaboliten oder assoziierter Cofaktoren in Gegenwart der Testkomponente verglichen mit einer Kontrolle unter identischen Bedingungen, aber in Abwesenheit der Testkomponente, ein Indikator für die Fähigkeit der Testkomponente ist, die Enzymaktivität der Delta-5-Desaturase zu modulieren; und Auswählen der Testkomponente, welche diese Fähigkeit besitzt, als Modulator. Das Delta-5-Desaturase-Enzym kann von der Ratte (SEQ ID NO: 3) oder vom Menschen sein.
Die vorliegende Anmeldung lehrt ferner ein Verfahren zum Screenen eines Modulators, welcher in der Lage ist, die enzymatische Aktivität eines funktionellen Delta-5-Desaturase-Enzyms eines Säugers zu modulieren, umfassend die Schritte: Bereitstellen des aufgereinigten Delta-5-Desaturase-Proteins für das Wirtssystem, Inkontaktbringen des Wirtssystems mit einer Testkomponente; Auswerten der enzymatischen Aktivität der Delta-5-Desaturase, wobei eine messbare Differenz im Spiegel eines Lipidmetaboliten oder assoziierter Cofaktoren in Gegenwart der Testkomponente verglichen mit einer Kontrolle unter identischen Bedingungen, aber in Abwesenheit der Testkomponente, ein Indikator für die Fähigkeit der Testkomponente ist, die Enzymaktivität der Delta-5-Desaturase zu modulieren; und Auswählen der Testkomponente, welche diese Fähigkeit besitzt, als Modulator. Das Delta-5-Desaturase-Enzym kann von einem Säuger (SEQ ID NO: 3 der Ratte) oder vom Menschen sein.
Die vorliegende Anmeldung lehrt ein Verfahren zum Screenen eines Modulators, wie vorstehend beschrieben, wobei es sich bei der Screeningmethode um einen Test zur Identifizierung von Testkomponenten handelt, welche Gene, Genprodukte, Proteine oder Verbindungen verändern, welche daran beteiligt sind, den Fettstoffwechsel zu modulieren und/oder eine Krankheit zu beeinflussen, wozu die diabetische Neuropathie gehört.
Die Lehre der vorliegenden Anmeldung umfasst Modulatoren, die durch die Screeningmethoden der Erfindung identifiziert worden sind. Der Modulator kann in einer aufgereinigten Form vorliegen. Die Lehre schließt Arzneimittel ein, umfassend einen solchen Modulator und einen/ein pharmazeutisch verträglichen/s Träger oder Verdünnungsmittel.
Die vorliegende Anmeldung lehrt auch die Verwendung eines wie vorstehend erwähnten Modulators oder einer wie vorstehend erwähnten Zusammensetzung zur Behandlung von Krankheiten, einschließlich jener, die einen anomalen Fettstoffwechsel betreffen, wie z.B. die diabetische Neuropathie.
Die vorliegende Anmeldung lehrt ferner ein isoliertes Delta-5-Desaturase-Gen der Ratte (SEQ ID NO: 2) ebenso wie ein Delta-5-Desaturase-Protein, welches eine verknüpfte Marker-Sequenz aufweist (siehe 4 für die mit einem Marker versehene menschliche Sequenz), und umfasst ein Delta-5-Desaturase-Protein, wobei es sich bei der Marker-Sequenz um ein V5-Epitop oder um 6 Histidinreste (6×His) handelt.
Die vorliegende Anmeldung lehrt ferner ein Verfahren zum Screenen eines Modulators, welcher in der Lage ist, die enzymatischen Aktivitäten funktioneller Delta-5- und/oder Delta-6-Enzyme von Säugern innerhalb desselben Wirtssystems zu modulieren, umfassend die Schritte: Bereitstellen eines Wirtssystems, enthaltend Nucleinsäuresequenzen, welche ein Säuger-Delta-5- oder Delta-6-Desaturase-Enzym codieren und funktionell mit Promotorregionen verknüpft sind, wobei die Promotorregionen wirksam sind, das Expressionsniveau der Nucleinsäuresequenz zu initiieren, zu beenden oder zu regulieren; Inkontaktbringen des Wirtssystems mit einer Testkomponente; gleichzeitig Auswerten der enzymatischen Aktivität der Delta-5-Desaturase, wobei eine messbare Differenz im Spiegel eines Lipidmetaboliten oder assoziierter Cofaktoren in Gegenwart der Testkomponente verglichen mit einer Kontrolle unter identischen Bedingungen, aber in Abwesenheit der Testkomponente, ein Indikator für die Fähigkeit der Testkomponente ist, die Enzymaktivität der Delta-5-Desaturase zu modulieren; und Auswählen einer Testkomponente, welche diese Fähigkeit besitzt, als Modulator. Das Delta-5-Desaturase-Enzym kann von der Ratte (SEQ ID NO: 3) oder vom Menschen sein.
Die vorliegende Anmeldung lehrt ferner die Verwendung eines Modulators oder einer Zusammensetzung, wie vorstehend erwähnt, für die Behandlung von Krankheiten, die mit dem Fettstoffwechsel zu tun haben, wie z.B. arteriellem Bluthochdruck, Hypercholesterinämie, atherosklerotischer Herzkrankheit, chronisch entzündlichen und Autoimmun-Funktionsstörungen, allergischem Ekzem und anderen atopischen Funktionsstörungen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
In der folgenden Beschreibung wird die Erfindung mit Hilfe der begleitenden Figuren ausführlich beschrieben, welche bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung veranschaulichen und in denen:
1 die Nucleinsäuresequenz der Kontrollregion der menschlichen Delta-5-Desaturase (hD5D) von -1357 bis -1 zeigt, nummeriert relativ zu dem Translationsstartcodon ATG (SEQ ID NO: 1).
2 als ein Referenzbeispiel die Nucleinsäuresequenz der Delta-5-Desaturase der Ratte (rD5D), die einen Teil des Fettsäure-Desaturase-Gens codiert (SEQ ID NO: 2) zeigt.
3 als ein Referenzbeispiel die Aminosäuresequenz des rD5D-Enzyms (SEQ ID NO: 3) zeigt.
4 als ein Referenzbeispiel die Aminosäuresequenz des am C-Terminus mit einem Marker versehenen menschlichen D5D-Enzyms zeigt.
5 eine schematische Darstellung des Plasmids pTh5009.1 (7211 bp) ist, welches die C-terminalen Marker enthält. Die codierende Sequenz der menschlichen Delta-5-Desaturase ist zwischen den Restriktionsstellen für HindIII und XbaI gezeigt (Referenzbeispiel).
6 eine schematische Darstellung des Plasmids pYh5006.3 (7108 bp) ist. Die codierende Sequenz der menschlichen Delta-5-Desaturase ist zwischen den Restriktionsstellen für HindIII und XbaI gezeigt (Referenzbeispiel).
7 eine schematische Darstellung des Plasmids pYr5014.1 (7117 bp) ist. Die codierende Sequenz der Delta-5-Desaturase der Ratte ist zwischen den Restriktionsstellen für HindIII und XbaI gezeigt (Referenzbeispiel).
8 eine schematische Darstellung des Plasmids pBh4013.1 (5410 bp) ist. Die Kontrollregion der menschlichen Delta-5-Desaturase ist zwischen den Restriktions stellen für SacI gezeigt (Referenzbeispiel).
9 eine schematische Darstellung des Plasmids pGh4014.1 (6181 bp) ist. Die Kontrollregion der menschlichen Delta-5-Desaturase ist zwischen den Restriktionsstellen für SacI gezeigt (Referenzbeispiel).
10 eine schematische Darstellung des Plasmids pRh4007.1 (5631 bp) ist. Die Kontrollregion der menschlichen Delta-5-Desaturase ist zwischen den Restriktionsstellen für SacI und XhoI gezeigt (Referenzbeispiel).
11 eine schematische Darstellung des Plasmids pRh4002.1 (5751 bp) ist. Die Kontrollregion der menschlichen Delta-6-Desaturase ist zwischen den Restriktionsstellen für KpnI und XhoI gezeigt (Referenzbeispiel).
12 eine Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)-Analyse radioaktiv markierter Methylester von Fettsäuren aus Hefe zeigt, die mit pYr5014.1 transformiert ist und die mit Dihomo-Gamma-Linolensäure [1-¹⁴C]-20:3n-6 inkubiert wurde (Referenzbeispiel).
13 eine Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)-Analyse radioaktiv markierter Methylester von Fettsäuren aus Hefe zeigt, die mit pYes2 transformiert ist und die mit Dihomo-Gamma-Linolensäure [1-¹⁴C]-20:3n-6 inkubiert wurde (Referenzbeispiel).
14 eine Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)-Analyse radioaktiv markierter Methylester von Fettsäuren aus Hefe zeigt, die mit pYr5014.1 oder pTh5009.1 transformiert ist und die mit Eicosatetraensäure [1-¹⁴C]-20:4n-3 inkubiert wurde (Referenzbeispiel).
15 eine Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)-Analyse radioaktiv markierter Methylester von Fettsäuren aus Hefe zeigt, die mit pYes2 transformiert ist und die mit Eicosatetraensäure [1-¹⁴C]-20:4n-3 inkubiert wurde (Referenzbeispiel).
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung entwickelte sich aus Beobachtungen, dass die orale Supplementierung von natürlich vorkommenden Fettsäuren einen gewissen therapeutischen Nutzen gehabt hat, bestehenden metabolischen Mangelfunktionen entgegenzuwirken, welche bei manchen Krankheitszuständen vorherrschen. Um jedoch neue Strategien für eine therapeutische Intervention anzugehen, war es notwendig, über die Messung von Lipidspiegeln und die Supplementierung von Lipiden hinauszugehen und die tatsächlichen Enzymaktivitäten und die Regulation der Expression der Gene direkt zu messen, von denen diese Enzyme codiert werden. Während die Reaktionspfade für die metabolischen Umwandlungen von PUFAs im Allgemeinen bekannt sind, sind die menschlichen Gene, die auf einzigartige Weise in die Expression der verschiedenen entlang dieser Pfade genutzten Enzyme einbezogen und dafür verantwortlich sind, bislang größtenteils nicht charakterisiert worden. Derzeit zeigen neu isolierte menschliche Desaturase-Gene Sequenzhomologie zu anderen Genen mit bekannter Funktion, aber diese Information allein liefert nur einen Hinweis auf die möglichen Arten von Beziehungen, welche möglicherweise zwischen diesen Genen und den Proteinen, welche sie codieren, bestehen (Cho et al., J. Biol. Chem 274: 471-477 (1999a)). Infolgedessen führen die Isolierung und Identifizierung solcher nützlicher Teile des Genoms (z.B. von Desaturase-Genen) zu der Notwendigkeit, die Fähigkeit zu entwickeln, diese Art von Information umfassender mit der Biologie der Zelle oder des Organismus zu integrieren, aus welcher oder welchem diese Gene isoliert worden sind.
In diesem Zusammenhang haben die gegenwärtigen Erfinder ein experimentelles Modell entwickelt, welches manipuliert werden kann, um die Expression des genetischen Materials zu untersuchen, das von Menschen und anderen Spezies isoliert worden ist, um die Rolle und die Funktion dieser Gene und deren codierter Proteine im Metabolismus der PUFAs zu ermitteln. Die Beziehung zwischen der einzigartigen Rolle eines Proteins in einem metabolischen Reaktionspfad und der Expression des Gens, welches das Protein codiert, ist normalerweise ein gut koordinierter Vorgang, so dass subtile Abweichungen häufig zu anomalen physiologischen Prozessen führen. Das vorliegende System erleichtert somit die Entdeckung und die Identifizierung von Arzneistoffkandidaten, die auf der DNA- oder der Protein-Ebene agieren, um Anomalitäten oder Ungleichgewichte in Veränderungen des Fettstoffwechsels zu korrigieren, die mit bestimmten pathologischen Zuständen wie z.B. diabetischer Neuropathie assoziiert sind.
Die vorliegende Erfindung ist insbesondere auf eine Kontrolle der Expression des Säuger-Delta-5-Desaturase (D5D)-Enzyms und auf die Verwendung von dessen Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen in Expressionsvektoren und Wirtssystemen für Arzneistoff-Screeningverfahren gerichtet. Die Erfinder haben die Kontrollregion (d.h. den Promotor und andere regulatorische Elemente) für das menschliche D5D-Gen isoliert, cloniert und identifiziert. Genetische Elemente, die für die Kontrolle der D5D-Genexpression verantwortlich sind, sind somit unabhängig von der das Desaturase-Gen codierenden Region (nämlich den Aminosäure codierenden Sequenzen) isoliert worden und werden dazu verwendet, um Wirkstoffe zu testen, welche die D5D-Genexpression modulieren. Die hierin bereitgestellten Arzneistoff-Screeningverfahren sind somit darauf ausgelegt, Testkomponenten, welche die D5D-Aktivität oder das Niveau der D5D-Genexpression modulieren, für deren anschließende Verwendung bei der Behandlung und/oder der Vorbeugung von bestimmten pathologischen Funktionsstörungen, einschließlich derjenigen, welche mit einem anomalen Fettstoffwechsel assoziiert sind, zu identifizieren.
Dementsprechend stellt die Clonierung der Kontrollregion des D5D-Gens ein leistungsfähiges Werkzeug bereit, um die Rolle der D5D-Genexpression zu analysieren und um Modifikationen davon zu induzieren, welche die mit den metabolischen Funktionsstörungen einhergehenden Veränderungen beseitigen oder kontrollieren. Die Identifizierung und Charakterisierung der Promotor-, Enhancer- und Silencer-Regionen des D5D-Gens ermöglicht es den gegenwärtigen Erfindern, die Rolle von einzelnen in der D5D-Kontrollregion gelegenen regulatorischen Elementen zu identifizieren und zu verstehen, ebenso wie mögliche pharmakologische Modulatoren der D5D-Genexpression zu entdecken.
Die D5D-Kontrollregion
Experimentelle Arbeiten mittels der reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) zeigten, dass die Intron/Exon-Struktur von hD5D (BC269730_2), wie sie in GenBank für AC004770 vermerkt ist, im Wesentlichen korrekt war. Weitere Forschungsarbeiten zu dieser Desaturase mit Hilfe der 5'-RACE (schnelle Amplifikation von cDNA-Enden) auf menschlicher cDNA aus der Leber zeigten das Vorhandensein alternativer Spleißvorgänge für dieses Gen. Man gelangte zu dieser Schlussfolgerung durch DNA-Sequenzierung der 5'-Enden einer Reihe von einzelnen Clonen. Es ist von anderen (Cho et al., J. Biol. Chem 274: 37335-37339 (1999b) und Leonard et al., Biochem. J. 347: 719-724 (2000)) ebenso wie von den Anmeldern gezeigt worden, dass hD5D ein Gen ist, das eine aktive Delta-5-Desaturase codiert.
In diesem Zusammenhang wurden Hefezellen mit pTh5009.1, das das menschliche D5D-Gen enthält (siehe 5) oder mit pYES2/CT transformiert. Die mit pTh5009.1 transformierte Hefe wandelte 29% von DGLA in AA um, wohingegen in der mit pYES2/CT transformierten Hefe keine solche Umwandlung auftrat. Eine solchermaßen transformierte Hefe desaturierte Alpha-Linolensäure nicht.
Delta-5-Desaturase wurde mittels RT-PCR cloniert. Zuerst wurde cDNA durch reverse Transkription von Gesamt-RNA erzeugt, welche aus Gewebe extrahiert worden war, das Fettsäure-Desaturasen von Säugern exprimierte, wobei Zufalls-Primer verwendet wurden (Perkin-Elmer). Die anschließende Amplifikation der Desaturase-cDNA wurde durch PCR erhalten, wobei Vorwärts- und Rückwärts-Primer eingesetzt wurden, die spezifisch konstruiert waren, um der codierenden Sequenz für das hD5D-Gen zu entsprechen.
Die für die Amplifikation von Desaturase-cDNA von Säugern konstruierten Oligonucleotid-Primer können eine oder mehrere Endonuclease-Erkennungsstellen enthalten, um die Clonierung in einen Expressionsvektor nach der Amplifikation mittels PCR zu erleichtern. In der vorliegenden Erfindung enthalten die für die Clonierung der Desaturase-Gene von Säugern verwendeten Vorwärts- und Rückwärts-Primer eine EcoRI- und eine XhoI-Stelle bzw. eine Hind III- und eine XbaI-Stelle.
Wahlweise kann in einem Oligonucleotid-Primer ein Translationsstart- oder Stoppcodon fehlen, solange solche Codons in dem Clonierungsvektor bereitgestellt werden, der funktionell mit der cDNA-Sequenz verknüpft sein muss, welche die Säuger-Desaturase codiert (d.h. stromaufwärts am 5'-Ende bzw. stromabwärts am 3'-Ende der die Desaturase codierenden Sequenz positioniert).
Die Translationsstart- und Stoppcodons können innerhalb der Sequenzen der Vorwärts- bzw. Rückwärts-Primer bereitgestellt werden, wobei eine Ausnahme darin bestand, dass die Primer, welche dazu verwendet wurden, die mit einem Marker versehenen Konstrukte zu erzeugen, keine Stoppcodons aufwiesen.
Beispiele für Vorwärts- und Rückwärts-Primer, die nützlich sind, um die rD5D- und hD5D-cDNAs für das Einsetzen in Expressionsvektoren zu clonieren, sind nachstehend in Beispiel 1 aufgeführt.
Ein rD5D-cDNA-Fragment, welches die Nucleotide +1 bis +1344 umspannt, wurde mittels RT-PCR cloniert, wobei Gesamt-RNA verwendet wurde, die aus Lebergewebe der Ratte extrahiert worden war. Die Nucleotidsequenz, die eine funktionell aktive rD5D codiert, ist in 2 abgebildet (SEQ ID NO: 2). Das rD5D-Protein wird durch die abgeleitete Aminosäuresequenz repräsentiert, die in 3 abgebildet ist (SEQ ID NO: 3).
Ein hD5D-cDNA-Fragment, welches die Nucleotide +1 bis +1335 umspannt, wurde durch RT-PCR-Amplifikation von Gesamt-RNA aus der menschlichen Zelllinie Chang (ATCC Nr. CCL-13) cloniert. Die Nucleotidsequenz, die eine funktionell aktive hD5D codiert, ist unter der GenBank-Hinterlegungsnummer AF199596 gemeldet. Die codierte hD5D wird durch die Aminosäuresequenz repräsentiert, welche unter der GenBank-Hinterlegungsnummer AAF29378 gemeldet ist.
Die hD5D-Kontrollregion wurde mittels PCR-Amplifikation aus genomischer DNA von menschlichen Leukocyten cloniert. In einer ersten PCR-Reaktion diente menschliche genomische DNA, die im Labor der gegenwärtigen Erfinder hergestellt worden war, als Matrize. Gemäß der GenBank-Hinterlegungsnummer AC004770 wurden synthe tische Rückwärts- und Vorwärts-Primer eingesetzt, welche an der Position +126 der hD5D-CDS bzw. an der Position –1357 der Sequenz stromaufwärts vom ATG begannen, um ein Fragment von 1483 bp Länge zu erzeugen.
Die Rückwärts- und Vorwärts-Primer, die für die Clonierung der hD5D-Kontrollregion von der Nucleotidposition +126 bis –1357 von dem Translationsstartcodon ATG verwendet wurden, sind nachstehend in Beispiel 2 aufgeführt.
Das der erwarteten Fragmentgröße entsprechende PCR-Produkt wurde gewonnen, in einen TA-Clonierungsvektor, bevorzugt pCRII (Invitrogen) eingesetzt und dann sequenziert. Linearisierte Clonierungsvektoren für die TA-Clonierung enthalten einen Überhang mit einem einzelnen 3'-Desoxythymidin (T)-Rest, um eine effiziente Ligierung der PCR-Produkte mit 3'-Desoxyadenin (A)-Überhängen zu gestatten. DNA-Produkte einer PCR-Amplifikation enthalten einen einzelnen 3'-A-Überhang aufgrund der nicht matrizenabhängigen Aktivität von Taq-Polymerasen.
Das pCRII/hD5D-Kontrollregionkonstrukt (pCh4012.1) enthält 126 bp der hD5D-CDS. Die Kontrollregion von hD5D, auf die in der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, beginnt an Position –1 und endet bei –1357 vom ATG. Die Größe des Fragments beträgt 1357 bp. Die Sequenz ist durch SEQ ID NO: 1 (1) repräsentiert.
Die Subclonierung der 1357 bp großen hD5D-Kontrollregion in einen Reportervektor nach deren Einbau in den pCRII-Clonierungsvektor wurde mittels PCR-Amplifikation erhalten, wobei ein neuer Satz von Vorwärts- und Rückwärts-Primern verwendet wurde. Die PCR-Reaktion diente auch dazu, den 126 bp großen Teil der hD5D-CDS zu entfernen, indem das pCh4012.1-Konstrukt als Matrize verwendet wurde. Die bei der Subclonierung der hD5D-Kontrollregion verwendeten Oligonucleotid-Primer können vorteilhafterweise zusätzliche Nucleotidsequenzen umfassen, die eine oder mehrere Endonuclease-Erkennungsstellen enthalten, um die Einsetzung und die Ligierung in einen Expressionsvektor nach der PCR-Amplifikation zu erleichtern. In der vorliegenden Erfindung enthalten die Vorwärts- und Rückwärts-Primer an beiden Enden eine SacI-Restriktionsstelle. Wahlweise kann ein Oligonucleotid-Primer auch ein Translationsstartcodon enthalten (d.h. stromabwärts am 5'-Ende des Rückwärts-Primers positioniert), das funktionell mit einer heterologen Nucleinsäuresequenz verknüpft ist, die ein Genprodukt codiert. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Translationsstartcodon nicht innerhalb des Rückwärts-Primers bereitgestellt, sondern stattdessen vom 5'-Ende der heterologen Nucleinsäuresequenz beigesteuert, welche an das 3'-Ende der Kontrollregion ligiert ist.
Beispiele für Vorwärts- und Rückwärts-Primer, die für die Clonierung der hD5D-Kontrollregion von Position –1357 bis –1 von dem Translationsstartcodon ATG verwendet wurden, sind nachstehend in Beispiel 3 aufgeführt.
Escherichia coli ist ein bevorzugter spezifischer prokaryontischer Wirt, um die DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung zu clonieren und replizieren. Andererseits ist Hefe, insbesondere Saccharomyces cerevisiae, der bevorzugte Wirt für die Expression der die Säuger-Desaturase codierenden Sequenzen.
Vektorkonstruktion
Dementsprechend umfasst ein Vektorkonstrukt der vorliegenden Erfindung notwendige Elemente für dessen Proliferation und Selektion sowohl in eukaryontischen als auch in prokaryontischen Zellen. Zu Expressionsvektoren der Erfindung gehören pYES2 und pYES2/CT (Invitrogen), die im Wesentlichen einen Replikationsursprung, einen induzierbaren Promotor und zwei selektierbare Markergene enthalten. Insbesondere enthält der Vektor pYES2/CT auch eine kurze DNA-Sequenz, die Marker (z.B. V5/6×His-Epitope) codiert, welche es ermöglichen, dass das translatierte Produkt, ein mit Markern versehenes Desaturase-Protein, leicht mit im Handel erhältlichen Antikörpern und/oder Affinitäts-Chromatographie-Säulen identifiziert und/oder aufgereinigt werden kann. Die Vektoren pYES2 und pYES2/CT verleihen Uracil-Prototrophie für eine Selektion in Hefe und einen Galactose-induzierbaren GAL1-Promotor für die Expression, welcher in Gegenwart von Galactose aktiviert wird und stromaufwärts von der Clonierungsstelle liegt. Galactose-induzierbare Promotoren (GAL1, GAL7 und GAL10) sind in großem Umfang für eine auf hohe Spiegel abzielende und regulierte Expression von Proteinen in Hefe verwendet worden (Lue et al., Mol. Cell. Biol. 7: 3446-3451 (1987) und Johnston, M., Microbiol. Rev. 51: 458-476 (1987)). Die Transkription von den GAL-Promotoren wird durch das GAL4-Protein aktiviert, das an die Promotorregion bindet und die Transkription aktiviert, wenn Galactose vorhanden ist. In Abwesenheit von Galactose bindet der Antagonist GAL80 an GAL4 und hindert GAL4 daran, die Transkription zu aktivieren. Die Zugabe von Galactose hindert GAL80 daran, die Aktivierung durch GAL4 zu hemmen.
Ein Expressionsvektor kann eine Translationsstart- oder Terminations-(z.B. Stopp)-Sequenz enthalten, die orientiert vorliegt und funktionell mit der cDNA-Sequenz verknüpft ist, welche die Säuger-Desaturase codiert (d.h. stromaufwärts am 5'-Ende bzw. stromabwärts am 3'-Ende der die Desaturase codierenden Sequenz positioniert). Die Translationsstart- und Terminationscodons können jedoch bereits innerhalb der Sequenzen der Vorwärts- bzw. Rückwärts-Primer bereitgestellt werden, welche dazu verwendet werden, die Clonierung der Desaturase-Gene von Säugern in den Vektor pYES2 zu erleichtern (siehe Beispiel 1). Die Vorwärts- und Rückwärts-Primer für die Clonierung in pYES2/CT sind so konstruiert, dass sie ein mit einem V5/6×His-Marker versehenes Desaturase-Protein exprimieren (siehe Beispiel 1).
Wirtssysteme
Die Lehre der vorliegenden Anmeldung stellt ein rekombinantes Nucleinsäure-Konstrukt bereit, welches einen Teil eines D5D-Gens eines Säugers einschließlich der Aminosäure-codierenden Region enthält und welches einen heterologen Promotor aufweist, der in der Lage ist, die Transkription eines Fettsäure-Desaturase-Gens zu initiieren. Die Aminosäure-codierende Region stammt von einem menschlichen D5D-Gen. Insbesondere stellt die Lehre ein Nucleinsäure-Konstrukt bereit, welches eine heterologe Promotorregion aufweist, die bevorzugt induziert wird, eine Nucleinsäuresequenz, welche eine funktionelle D5D eines Säugers (z.B. Mensch oder Ratte) und eine Terminationsregion codiert, wobei die Promotorregion funktionell mit der Nucleinsäuresequenz verknüpft ist, so dass sie die Expression der Nucleinsäuresequenz effektiv kontrolliert. Alternativ kann das rekombinante Nucleinsäure-Konstrukt eine heterologe Transkriptionsterminationregion enthalten, die in einem Wirtssystem funktionell ist. Das rekombinante Nucleinsäure-Konstrukt wird als Teil eines Expressionsvektors cloniert, welcher dann in ein Wirtssystem eingeführt werden kann.
Ein Polynucleotid, welches ein D5D-Gen eines Säugers (z.B. Mensch oder Ratte) codiert, kann an eine heterologe Sequenz ligiert werden, um ein mit einem Marker versehenes Protein zu codieren. Für das Screening von Wirtssystemen, die D5D exprimieren, kann es nützlich sein, ein mit einem Marker versehenes Desaturase-Protein zu codieren, welches von einem im Handel erhältlichen Antikörper erkannt wird. Ein mit einem Marker versehenes Protein lässt sich auch so bearbeiten, dass es eine Spaltungsstelle enthält, welche zwischen einer D5D codierenden Sequenz und der heterologen Protein-Sequenz gelegen ist, so dass die Fettsäure-Desaturase von dem heterologen Anteil abgespalten und gereinigt wird.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf ein rekombinantes Nucleinsäure-Konstrukt gerichtet, das die Nucleinsäure der Erfindung (z.B. eine Kontrollregion eines D5D-Gens eines Säugers) und ein Reportergen enthält. Die Kontrollregion ist von einem menschlichen D5D-Gen abgeleitet. Die Kontrollregion und die Reportersequenz sind funktionell verknüpft, so dass die Kontrollregion die Transkription oder die Translation der Reportersequenz effektiv intiiert, beendet oder reguliert. Das rekombinante Nucleinsäure-Konstrukt wird als Teil eines Expressionsvektors cloniert, welcher dann in ein Wirtssystem eingeführt wird.
Dementsprechend wird das Wirtssystem mit dem Nucleinsäure-Konstrukt transformiert/transfiziert, das die Nucleinsäuresequenz des D5D-Gens auf eine solche Weise enthält, dass die Promotorregion und die Terminatorregion funktionieren, und kann daher dazu verwendet werden, um eine Expression eines funktionell aktiven Desaturase-Enzyms auf einem hohen Niveau zu erreichen. Eine Testkomponente, welche die Aktivität des Desaturase-Enzyms erhöht oder erniedrigt, ist ein Verstärker bzw. ein Inhibitor. Daher können definierte Testkomponenten als Grundlage für die Formulierung oder die Innovation von therapeutischen Wirkstoffen verwendet werden, um Krankheiten zu behandeln, die mit dem Niveau von aktivem und reguliertem D5D-Enzym in Gewebe verbunden sind.
Die transformierte/transfizierte Wirtszelle wird mittels Selektion auf ein Markergen identifiziert, das auf dem eingeführten Vektorkonstrukt enthalten ist. Das eingeführte Markergen kann daher Antibiotika-Resistenz verleihen oder einen essenziellen Wachstumsfaktor oder ein Enzym codieren und das Wachstum auf selektiven Medien erlauben, wenn es in dem transformierten/transfizierten Wirt exprimiert wird. Üblicherweise werden transformierte/transfizierte Wirte aufgrund ihrer Fähigkeit, auf selektiven Medien zu wachsen, selektiert. Selektive Medien können ein Antibiotikum enthalten oder diesen kann ein essenzieller Wachstumsnährstoff fehlen, welcher für das Wachstum des untransformierten/untransfizierten Wirts notwendig ist. Die Transformation von Escherichia coli- und Hefezellen wurde durch Selektion auf Ampicillin enthaltendem Medium bzw. auf Medium ohne Uracil festgestellt, auf der Grundlage der Selektionsmarkergene (z.B. Beta-Lactamase und URA3), welche in den Vektoren pYES2 und pYES2/CT vorhanden sind.
Ein Zell-freies Expressionssystem wird erhalten, indem man das Nucleinsäure-Konstrukt, welches die codierende Sequenz für eine vorstehend beschriebene funktionelle Säuger-Desaturase enthält, in einen zweckdienlichen Expressionsvektor setzt, welcher für den Gebrauch in vitro konstruiert ist, und eine in vitro-Transkription/Translation in einem Zelllysat wie z.B. einem mRNA-abhängigen Kaninchen-Retikulocytenlysat durchführt. Gegebenenfalls können weitere Komponenten in das System eingebaut werden, wie z.B. essenzielle Cofaktoren und Aminosäuren. Mikrosomale Systeme sind erfolgreich eingesetzt worden, um Enzymaktivität aus einer Anzahl verschiedener Quellen wie z.B. Tierorganen, einschließlich Leber, Gehirn, Herz etc., und Mikroorganismen, einschließlich Hefe (de Antueno et al., Lipids 29: 327-331 (1994); Todd et al., Plant J. 17: 119-130 (1999); Nishi et al., Biochim. Biophys. Acta 1490: 106-108 (2000)) zu testen.
Ein mikrosomales Wirtssystem wird erhalten, indem man das Wirtssystem mit dem Nucleinsäure-Konstrukt transformiert/transfiziert, welches die codierende Sequenz für eine vorstehend beschriebene, funktionelle Säuger-Desaturase enthält, und Mikrosomen isoliert (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994)). In vitro-Transkription/Translation wird durchgeführt, indem man Kaninchen-Retikulocyten-Lysat und essenzielle Cofaktoren hinzugibt; gegebenenfalls können markierte Aminosäuren eingebaut werden. Solche in vitro-Expressionsvektoren können einige oder alle Expressionssignale bereitstellen, die in dem verwendeten System notwendig sind. Diese Methoden sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und die Komponenten des Systems sind im Handel erhältlich. Das Reaktionsgemisch wird direkt auf das Polypeptid getestet, z.B. indem man dessen spezifische Enzymaktivität ermittelt, oder das synthetisierte Polypeptid wird aufgereinigt und dann auf seine spezifische enzymatische Aktivität getestet.
Ein Zellsystem, welches dazu verwendet wird, Kontrollregionen zu untersuchen, die an der Regulation des Niveaus der Genexpression von Säuger-D5D beteiligt sind, ist die Säugerzelllinie ZR-75-1 (ATCC nr. CRL-1500) oder HepG2 (ATCC Nr. HB-8065).
Reportergene, die in solchen Studien im großen Umfang eingesetzt werden, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Enzyme wie z.B. Luciferase, Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), β-Galactosidase, Esterasen, Phosphatasen, Proteasen und andere Proteine wie z.B. das grün fluoreszierende Protein (GFP) und menschliches Wachstumshormon. In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei dem Reportergen entweder um CAT oder um Luciferase, welche über das Niveau der spezifischen enzymatischen Aktivität nachgewiesen werden, die wiederum mit der Menge des Enzyms korreliert, das hergestellt wurde, und somit mit dem Expressionsniveau des Reportergens.
Ein Reportervektor der vorliegenden Erfindung, welcher essenzielle Elemente für seine Funktionsfähigkeit in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen umfasst, ist pCAT-3-Basic (Promega Corp., WI). Die von genomischer DNA abgeleitete Kontrollregion der Säuger-Desaturase wird mit Hilfe von herkömmlichen Methoden in der richtigen Orientierung (5' nach 3') angrenzend (5') an das Startcodon des Reportergens mit oder ohne zusätzliche Kontrollelemente ligiert. Die Region 3' von der das Reportergen codierenden Sequenz enthält eine Transkriptionsterminations- und eine Polyadenylierungsstelle, z.B. die SV40-Poly(A)-Stelle. Die Desaturase-Kontrollregion und das Reportergen, die in dem Reportervektor funktionell verknüpft sind, werden in einen Clonierungswirt, bevorzugt E. coli, transformiert. Der Wirt wird gezüchtet und der replizierte Vektor gewonnen, um ausreichende Mengen des rekombinanten Konstrukts für die anschließende Transfektion in einen zweiten Wirt herzustellen, bevorzugt die Säugerzelllinien ZR-75-1 oder HepG2.
Wirtssysteme und Screening auf Arzneistoffe
Die Erfindung schließt Verfahren für das Screening von Nucleotiden, Proteinen, Verbindungen oder pharmakologischen Wirkstoffen ein, welche die Genexpression von D5D auf der transkriptionellen Ebene verstärken oder hemmen. Zu diesem Zweck werden Zell-basierte, Zelllysat- und/oder aufgereinigte Enzymtests verwendet, um diese verstärkenden oder hemmenden Komponenten nachzuweisen.
Die Expression des D5D-Gens ist mit Diabetes und verwandten Funktionsstörungen, arteriellem Bluthochdruck, Hypercholesterinämie, atherosklerotischer Herzkrankheit, chronisch-entzündlichen Funktionsstörungen, Autoimmunfunktionsstörungen, allergischem Ekzem und anderen atopischen Funktionsstörungen, entzündlichen Prozessen wie z.B. rheumatoider Arthritis, verminderter Proliferation von Lymphocyten, T-Zell-vermittelter Cytotoxizität, natürlicher Killerzell-Aktivität, Makrophagen-vermittelter Cytotoxizität, Chemotaxis von Monocyten und Neutrophilen, der Expression des und der Antigenpräsentation durch den Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex Klasse II, der Bildung von pro-inflammatorischen Cytokinen (Interleukine 1 und 6, Tumornekrosefaktor) und der Expression von Adhäsionsmolekülen, Ekzemen, Psoriasis, dem akuten Atemnotsyndrom (ARDS); Abbau des Gelenkknorpels (ACD) und Krebs in Verbindung gebracht worden.
Eine klinische Studie zur menschlichen Diabetes der gegenwärtigen Erfinder hat Daten geliefert, welche darauf hindeuten, dass AA und EPA im Plasma und in den Phospholipiden der roten Blutzellen von Typ 1-Diabetikern erniedrigt sind. Diese Studie bestätigt und erweitert eine von Scotia Pharmaceuticals unterstützte multizentrische klinische Studie, in welcher die enterale Verabreichung von n-6-PUFAs die neurophysiologischen Parameter von leichter diabetischer Neuropathie verbessert (Keen et al., Diabetes Care 16: 8-15 (1993)). Es ist über erniedrigte Spiegel von langkettigen n-6-Fettsäuren berichtet worden (Arisaka et al., J. Paediatr. Gastroenterol. Nutr. 5: 878-882 (1986); Tilvis, R.S. und Miettinen, T.A., J. Clin. Endocrinol. Metab. 61: 741-745 (1985); und van Doormaal et al., Diabetologia 31: 576-584 (1988)). Der Spiegel von DGLA war in der Typ-I-Diabetes-Gruppe nicht erniedrigt, was darauf hinweist, dass die Abnahme von AA auf eine erniedrigte Aktivität von Delta-5-Desaturase zurückzuführen sein könnte.
In der Studie diabetischer Ratten der gegenwärtigen Erfinder war der Plasmagehalt des Phospholipids AA in den 2 Wochen und 7 Wochen mit Streptozotocin induzierten diabetischen Ratten um 31% bzw. 27% erniedrigt. Wie in der menschlichen Diabetes-Studie blieben die DGLA-Spiegel im Vergleich zu den Kontrollen unverändert, somit standen die erniedrigten Spiegel von AA und EPA im Einklang mit einer nachgewiesenen Verminderung der Delta-5-Desaturase-Aktivität. Eine verminderte Aktivität des Desaturase-Systems bei Diabetes wurde erstmals von Brenner et al., Am. J. Physiol. 215: 63-70 (1968) berichtet. Anschließend ist dieser Befund bestätigt worden (Mimouni, V. und Poisson, J.P., Biochim. Biophys. Acta 1123: 296-302 (1992); Dang et al., Lipids 24: 882-889 (1989); und Faas, F.H. und Carter, W.J., Lipids 15: 953-961 (1980)) und wird als ein Schlüsselfaktor bei der Entwicklung sekundärer Komplikationen von Diabetes angesehen. In der Studie Streptozotocininduzierter diabetischer Ratten hat man festgestellt, dass die Delta-5-Desaturase-Aktivität in hepatischen Mikrosomen von diabetischen Ratten im Vergleich zu den Kontrollratten um 37% erniedrigt ist. Diese Befunde stützen die Hypothese, dass Delta-5-Desaturase ein potenzielles Arzneistoff-Zielmolekül bei Diabetes und auch eine nützliche Fettstoffwechsel-Verbindung für Arzneistoff-Screeningtests darstellt.
Die vorliegende Erfindung bietet ein Arzneistoff-Screeningverfahren zur Identifizierung von Nucleotiden, Proteinen, Verbindungen und/oder pharmakologischen Wirkstoffen, welche die Transkription eines D5D-Gens von Säugern modulieren oder regulieren. Dieses Verfahren umfasst (1) ein neues Nucleinsäure-Konstrukt, welches eine Kontrollregion eines Desaturase-Gens von Säugern aufweist, d.h. die Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung und eine heterologe Nucleinsäuresequenz (z.B. ein Reportergen), wobei die Kontrollregion funktionell mit der Nucleinsäuresequenz verknüpft ist, so dass sie die Transkription der Nucleinsäuresequenz effektiv initiiert, beendet oder reguliert, von denen alle mit Hilfe eines das neue Nucleinsäure-Konstrukt enthaltenden Expressionsvektors in eine Zelle oder ein Zelllysat eingeführt werden, (2) Inkontaktbringen der Zelle oder des Zelllysats mit einer Testkomponente, (3) Ermitteln, ob die Testkomponente in der Lage ist, das Transkriptionsniveau der Nucleinsäuresequenz zu verändern, und (4) Auswählen derjenigen Komponenten, welche eine derartige Aktivität zeigen. In diesem Zusammenhang können die definierten Testkomponenten als Basis für die Formulierung oder die Innovation von therapeutischen Arzneistoffen verwendet werden, um Krankheiten zu behandeln, die mit dem Niveau der Genexpression von D5D in Zusammenhang stehen. Testkomponenten, welche das Transkriptionsniveau der Reportersequenz erhöhen oder erniedrigen, stellen Verstärker bzw. Inhibitoren dar.
Insbesondere beinhaltet die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von nützlichen und funktionellen Teilen der D5D-Kontrollregion und verschiedener funktioneller und regulatorischer Elemente innerhalb der Kontrollregion, welche mit dem Expressionsniveau des Desaturase-Gens verknüpft sind. Funktionelle Teile der Desaturase-Kontrollregion, welche veränderte Spiegel der Genexpression zur Folge haben, werden mittels Manipulation (z.B. Deletion, ortsspezifische Mutagenese etc.) verschiedener Abschnitte der Region ebenso wie durch die direkte oder indirekte Wirkung von Modulatoren ermittelt.
Das Wirtssystem zur Durchführung des Arzneistoff-Screeningverfahrens kann aus eukaryontischen Zellen bestehen, einschließlich Pilz- oder Säugerzellen. Genauer gesagt lehrt die vorliegende Anmeldung einen Arzneistoff-Screening Test unter Verwendung von transformierter Hefe als ganzen Zellen, Sphäroplasten, Zellhomogenaten, Organellen (z.B. Mikrosomen etc.) oder aufgereinigtem Enzym, um Wirkstoffkandidaten zu identifizieren, welche die enzymatische Aktivität einer Säuger-D5D modulieren. Der Hefewirt Saccharomyces cerevisiae, Stamm INVSc1 (Invitrogen, CA) kann mit den Hefe-Expressionsvektoren pYES2 oder pYES2/CT (Invitrogen) transformiert werden, welche die codierende Sequenz der Säuger-D5D enthalten. Hefezellen werden für den Einsatz in dem vorliegenden Verfahren ausgewählt, weil diese (1) keine Fettsäure-Delta-5-Desaturase-Aktivität gezeigt haben (Aki et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 255: 575-579 (1999)), (2) deren Transkriptions- und Translationsprozesse ähnlich, wenn nicht sogar identisch zu den Prozessen sind, die in Säugerzellen ablaufen, und (3) sie häufig einer genetischen Manipulation zugänglicher sind als Säugerzellen und sie viel schneller wachsen (Guthrie, C. und Fink, G., Meth. Enzymol. 194 (1991)). Demnach bieten Hefezellen ein hervorragendes Modell für eukaryontische Genexpression und zur Untersuchung der Modulation der Aktivität von Säuger-D5D.
Wenn eine Wirtszelle wie z.B. eine Hefezelle, wie vorstehend beschrieben, mit einem DNA-Konstrukt transformiert wird, wird sie in Tests verwendet, um Testkomponenten zu identifizieren, welche die Desaturase-Aktivität modulieren. Testkomponenten, welche die D5D-Aktivität modulieren, werden identifiziert durch (1) Inkontaktbringen der transformierten Wirtszelle mit der Testkomponente für eine feste Zeitspanne und (2) Ermitteln des Spiegels des Lipidmetaboliten (d.h. des Spiegels des Produkts, das aus dem Substrat erzeugt wurde) oder assoziierter Cofaktoren innerhalb der behandelten Zellen. Dieser Spiegel des Metaboliten in einer Zelle kann dann mit dem Spiegel des Metaboliten in Abwesenheit der Testkomponente verglichen werden. Der Unterschied zwischen den Spiegeln des Metaboliten, sofern es einen gibt, zeigt an, ob die Testkomponente von Interesse die D5D-Aktivität moduliert. Darüber hinaus liefert die Höhe des Spiegels des Fettmetaboliten, der zwischen den behandelten und unbehandelten Zellen erzeugt wird, einen relativen Hinweis auf die Stärke dieser Verbindungen) als Modulator der Desaturase-Aktivität. Man setzt Mikrosomen aus Rattenleber in Verbindung mit dem bevorzugten Wirtssystem ein, um die Stärke jener Verbindungen) als einem Modulator der Desaturase-Aktivität zu erhärten.
Ein Arzneistoff-Screeningtest wird ebenfalls unter Verwendung von Säugerzellen als Wirtssysteme durchgeführt, um die Regulation der D5D-Genexpression zu beobachten und Testkomponenten zu identifizieren, die die Expression eines Reportergens modulieren, das von den Kontrollregionen oder den regulatorischen Elementen des D5D-Gens gesteuert wird. Die Zelllinien ZR-75-1 und HepG2 werden bevorzugt als Wirtssysteme verwendet, die mit den Reportervektoren pCAT-3-Basic (Promega) oder pGL3-Basic (Promega) transfiziert werden, welche die Kontrollsequenz der Säuger-D5D enthalten.
Wenn eine bevorzugte Wirtszelllinie wie z.B. ZR-75-1 mit einem Reporter-DNA- Konstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung transfiziert wird, wird sie in Tests eingesetzt, um Testkomponenten zu identifizieren, welche das Transkriptionsniveau des Gens über funktionell aktive regulatorische Elemente/Oligonucleotidsequenzen modulieren. Testkomponenten, welche das Transkriptionsniveau des Gens ändern, lasse sich identifizieren durch (1) Inkontaktbringen der transformierten Wirtszelle mit der Testkomponente für eine feste Zeitspanne und (2) Ermitteln des Niveaus der Genexpression (z.B. CAT-Aktivität) innerhalb der behandelten Zellen. Dieses Expressionsniveau wird mit jener des Reportergens in Abwesenheit der Verbindungen) verglichen. Der Unterschied zwischen dem Niveau der Genexpression, sofern es einen gibt, zeigt an, ob die Verbindungen) von Interesse die Funktionalität der regulatorischen DNA-Elemente modifiziert(en). Darüber hinaus liefert die Höhe des Niveaus des Reporterprodukts, das zwischen den behandelten und unbehandelten Zellen erzeugt wird, einen relativen Hinweis auf die Stärke dieser Verbindungen) als einem Modulator der Transkription des D5D-Gens über transkriptionelle regulatorische DNA-Elemente.
In einer Ausführungsform wird ein Hochdurchsatz-Screeningprotokoll eingesetzt, um eine große Zahl von Testkomponenten auf deren Fähigkeit zu überprüfen, die Transkription eines D5D-Gens von Säugern über deren Wirkung auf die Desaturase-Kontrollregion zu modulieren oder zu regulieren. Dementsprechend ermöglicht es das Design des transkriptionellen Systems, eine große Auswahl von Komponenten als potenzielle therapeutische Wirkstoffe zu screenen, welche die Genexpression von D5D verändern und dadurch die Gewebespiegel eines funktionellen D5D-Enzyms erhöhen oder erniedrigen, dessen physiologische Bedeutung eine Normalisierung von Lipidmetaboliten einschließt.
Für die hierin beschriebenen Arzneistoff-Screeningverfahren kann das Wirtssystem eine Zelle, ein Gewebe, ein Organ, ein Organismus oder ein beliebiger Teil davon sein, welches eine Umgebung oder Bedingungen zur Verfügung stellt, die eine Transkription und/oder eine Transkription, gefolgt von einer anschließenden Translation, gestatten oder ermöglichen, um ein funktionelles Protein oder Polypeptid zu ergeben. Organismen würden Tiere wie z.B. Säuger einschließen. In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Arzneistoff-Screeningverfahren in prokaryon tischen und eukaryontischen Zellen durchgeführt. In Ausführungsformen der Erfindung schließen eukaryontische Zellen Hefezellen und Säugerzellen ein.
Potenzielle Antagonisten umfassen kleine organische Moleküle, Peptide, Polypeptide und Antikörper, welche an ein Polynucleotid oder Polypeptid der Erfindung binden und dadurch seine Aktivität hemmen oder ausschalten. Potenzielle Antagonisten können auch kleine organische Moleküle, ein Peptid, ein Polypeptid wie z.B. ein eng verwandtes Protein oder ein Antikörper sein, die dieselben Stellen auf einem Bindungsmolekül binden, wie z.B. einem Bindungsmolekül, ohne die durch Delta-5-Desaturase induzierten Aktivitäten zu induzieren, wodurch die Wirkung der Delta-5-Desaturase blockiert wird, indem die Substratbindung gestört wird.
Potenzielle Antagonisten schließen ein kleines Molekül ein, welches an die Bindungsstelle des Polypeptids bindet und diese besetzt, wodurch die Bindung an zelluläre Bindungsmoleküle verhindert wird, so dass die normale biologische Aktivität blockiert wird. Beispiele für kleine Moleküle umfassen, sind aber nicht beschränkt auf kleine organische Moleküle, Peptide oder Peptid-ähnliche Moleküle. Andere potenzielle Antagonisten umfassen Antisense-Moleküle (siehe Okano et al., EMBO J. 7: 3407-3412 (1988) für eine Beschreibung dieser Moleküle). Selektive Modulatoren können z.B. Antikörper und andere Proteine oder Peptide umfassen, die spezifisch an die Delta-5-Desaturase oder an die Delta-5-Desaturase-Nucleinsäure binden, Oligonucleotide, die spezifisch an Delta-5-Desaturase (siehe die am 18. März 1993 veröffentlichte internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/05182 des Patentzusammenarbeitsvertrags, welche Verfahren zur Auswahl von Oligonucleotiden beschreibt, die selektiv an Zielbiomoleküle binden) oder an Delta-5-Desaturase-Nucleinsäure (z.B. Antisense-Oligonucleotide) binden, und andere, nicht peptidische, natürliche oder synthetische Verbindungen, die spezifisch an die Delta-5-Desaturase oder die Delta-5-Desaturase-Nucleinsäure binden.
Zielmoleküle für die Entwicklung von selektiven Modulatoren umfassen zum Beispiel: (1) die Regionen der Delta-5-Desaturase, welche mit anderen Proteinen in Kontakt treten und/oder die Delta-5-Desaturase innerhalb einer Zelle lokalisieren und (2) die Regionen der Delta-5-Desaturase, welche das Substrat binden.
Antikörper
Mit Hinblick auf die Durchführung Protein-basierter Tests können Antikörper gegen das Delta-5-Desaturase-Genprodukt erzeugt werden, indem immunologische Standardtechniken, Fusionsproteine oder synthetische Peptide, wie hierin beschrieben, eingesetzt werden. Monoclonale Antikörper lassen sich auch erzeugen, indem man heute übliche Techniken einsetzt, wie z.B. diejenigen, die von Waldmann, T.A., Science 252: 1657-1662 (1991) und Harlow E. und Lane D. (Hrsg.), Antibodies, A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York beschrieben worden sind. Es ist auch ersichtlich, dass Antikörperfragmente, d.h. Fab'-Fragmente, auf ähnliche Weise eingesetzt werden können. Immuntests, z.B. ELISAs, in denen eine Testprobe mit dem Antikörper in Kontakt gebracht und die Bindung an das Genprodukt nachgewiesen wird, können eine schnelle und effiziente Methode bereitstellen, das Vorhandensein und die Menge des durch Fettsäuren regulierten Genprodukts zu ermitteln.
So lehrt die vorliegende Anmeldung auch polyclonale und/oder monoclonale Antikörper und Fragmente davon sowie immunologische Bindungsäquivalente davon gegen die Delta-5-Desaturase von Menschen und Säugern (z.B. der Ratte), welche in der Lage sind, spezifisch an die zur Debatte stehenden Polypeptide und Fragmente davon oder an Polynucleotidsequenzen von der zur Debatte stehenden Polynucleotidregion, insbesondere aus dem Lokus des zur Debatte stehenden Polypeptids oder eines Teils davon, zu binden. Der Begriff „Antikörper" wird verwendet, um sich sowohl auf eine homogene molekulare Einheit als auch auf ein Gemisch zu beziehen, wie z.B. ein Serumprodukt, welches aus einer Vielzahl verschiedener molekularer Einheiten zusammengesetzt ist. Polypeptide können synthetisch in einem Peptidsyntheseapparat hergestellt und an Trägermolekül (z.B. KLH („keyhole limpet hemocyanin")) gekoppelt und über mehrere Monate hinweg in Kaninchen injiziert werden. Die Kaninchenseren werden auf Immunreaktivität gegen das zur Debatte stehende Polypeptid oder Fragment getestet. Monoclonale Antikörper können erzeugt werden, indem man Mäusen Polypeptide des Proteins, Fusionsproteine oder Fragmente davon injiziert. Monoclonale Antikörper werden mittels ELISA einem Screeningprozess unterzogen und auf spezifische Immunreaktivität mit dem zur Debatte stehenden Polypeptid oder Fragmenten davon getestet (Harlow E. und Lane D. (Hrsg.) Antibodies, A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York). Die Antikörper werden in Tests ebenso wie als Arzneistoffe nützlich sein.
Sobald man eine ausreichende Menge des gewünschten Polypeptids erhalten hat, kann man es für verschiedene Zwecke einsetzen. Eine typische Anwendung ist die Herstellung von Antikörpern, die spezifisch binden. Diese Antikörper können entweder polyclonal oder monoclonal sein und können mit Hilfe von in vitro- oder in vivo-Techniken hergestellt werden, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind. Zur Erzeugung von polyclonalen Antikörpern wird ein geignetes Zielimmunsystem ausgewählt, üblicherweise eine Maus oder ein Kaninchen. Weitgehend aufgereinigtes Antigen wird dem Immunsystem auf eine Weise präsentiert, welche von den für das Tier geeigneten Methoden und von anderen Immunologen wohlbekannten Parametern bestimmt wird. Typische Injektionsstellen sind in den Fußballen, intramuskulär, intraperitoneal oder intradermal. Natürlich können andere Spezies für Maus oder Kaninchen substituiert werden. Polyclonale Antikörper werden dann mit auf dem Fachgebiet bekannten Methoden aufgereinigt, auf die gewünschte Spezifität eingestellt.
Eine immunologische Reaktion wird gewöhnlich mit einem Immuntest getestet. Normalerweise beinhalten solche Immunotests eine gewisse Reinigung einer Antigenquelle, zum Beispiel jene, die von denselben Zellen und auf dieselbe Weise wie das Antigen erzeugt wird. Eine Vielzahl von Immunotest-Verfahren sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt (Harlow E. und Lane D. (Hrsg.) Antibodies, A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York oder Goding, J.W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 3. Ausgabe, Academic Press, New York).
Monoclonale Antikörper mit Affinitäten von 10^–8 M^–1 oder bevorzugt 10^–9 bis 10^–10 M^–1 oder stärker werden typischerweise durch Standardprozeduren erzeugt, wie sie z.B. in Harlow E. und Lane D. (Hrsg.) Antibodies, A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York oder Goding, J.W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 3. Ausgabe, Academic Press, New York beschrieben sind. In Kürze, geeignete Tiere werden ausgewählt und das gewünschte Immunisierungsprotokoll befolgt. Nach einer geeigneten Zeitspanne wird die Milz solcher Tiere herausgeschnitten und einzelne Milzzellen fusioniert, üblicherweise mit immortalisierten Myelomzellen unter geeigneten Selektionsbedingungen. Danach werden die Zellen clonal aufgetrennt und die Überstände jedes Clons auf deren Produktion eines geeigneten Antikörpers getestet, welcher spezifisch für die gewünschte Region des Antigens ist.
Andere geeignete Techniken beinhalten die in vitro-Exposition von Lymphocyten gegenüber den antigenen Polypeptiden oder alternativ die Selektion von Antikörperbanken in Phagen oder in ähnlichen Vektoren (Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989)). Die hierin gelehrten Polypeptide und Antikörper können mit oder ohne Modifikation eingesetzt werden. Häufig werden Polypeptide und Antikörper markiert, indem man, entweder kovalent oder nicht kovalent, einen Stoff anhängt, welcher ein nachweisbares Signal zur Verfügung stellt. Es ist eine große Vielzahl von Markierungen und Konjugationstechniken bekannt und über diese wird umfangreich sowohl in der wissenschaftlichen als auch in der Patentliteratur berichtet. Zu geeigneten Markierungen gehören Radionucleotide, Enzyme, Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, fluoreszierende Stoffe, chemilumineszente Stoffe, magnetische Partikel und dergleichen. Patente, welche die Verwendung solcher Markierungen lehren, umfassen US-Patent Nr. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 und 4,366,241. Es können auch rekombinante Immunoglobuline erzeugt werden (siehe US-Patent Nr. 4,816,567).
Arzneistoffdesign
Die Modulation der Genfunktion von Delta-5-Desaturase lässt sich durch die Verwendung therapeutischer Wirkstoffe oder Arzneistoffe bewerkstelligen, die so konzipiert werden können, dass sie mit verschiedenen Gesichtspunkten der Struktur oder der Funktion der Delta-5-Desaturase-Kontrollregion interagieren. Zum Beispiel kann ein Arzneistoff oder ein Antikörper an eine Faltungsstruktur der Kontrollregion binden, um eine fehlerhafte Struktur zu korrigieren. Alternativ könnte ein Arzneistoff an einen spezifischen funktionellen Rest binden und dessen Affinität für ein Substrat oder einen Cofaktor erhöhen. Die Wirksamkeit eines Arzneistoffs oder eines Wirkstoffs lässt sich durch ein Screening-Programm identifizieren, in dem die Modulation in vitro in Zellsystemen verfolgt wird, in denen ein Protein des Delta-5-Desaturase-Gens exprimiert wird. Alternativ lassen sich Arzneistoffe konzipieren, um die Aktivität des Delta-5-Desaturase-Gens aus der Kenntnis der Struktur/Funktions-Beziehungen und aus der Kenntnis des spezifischen Defekts in den verschiedenen mutierten NF1-Proteinen zu modulieren (siehe Copsey, D.N. und Delnatte, S.Y.J. Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs, 1988, Stockton Press, New York).
Gentherapie
Es kann eine Vielzahl von Gentherapie-Ansätzen in Übereinstimmung mit der Erfindung eingesetzt werden, um die Expression von Delta-5-Desaturase in vivo zu modulieren. Zum Beispiel können Antisense-DNA-Moleküle konstruiert und dazu verwendet werden, um die Delta-5-Desaturase-DNA in vivo zu blockieren. In einer anderen Ausführungsform können Oligonucleotide, welche darauf ausgelegt sind, an die 5'-Region der Delta-5-Desaturase-Kontrollsequenz zu hybridisieren und Tripelhelixstrukturen auszubilden, dazu eingesetzt werden, die Transkription der Delta-5-Desaturase zu blockieren oder zu vermindern. In noch einer anderen Ausführungsform kann eine Nucleinsäure, welche die Volllängen-Version der Wildtyp-Kontrollregion von Delta-5-Desaturase codiert, in vivo in Zellen eingeführt werden, die sonst nicht in der Lage wären, das Wildtyp-Produkt von Delta-5-Desaturase in ausreichenden Mengen oder überhaupt zu produzieren.
Zum Beispiel wird bei einer herkömmlichen Ersatztherapie das Genprodukt oder sein funktionelles Äquivalent dem Patienten in therapeutisch wirksamen Mengen gegeben. Das Delta-5-Desaturase-Protein kann unter Verwendung von üblichen Techniken aufgereinigt werden, wie z.B. jenen, die in Deutscher, M. (Hrsg.), Guide to Protein Purification, Meth. Enzymol. 182 beschrieben sind. Ausreichende Mengen des Genprodukts oder des Proteins zur Behandlung lassen sich zum Beispiel durch Zellkultursysteme oder durch synthetische Herstellung gewinnen. Arzneistofftherapien, welche das Genprodukt stimulieren oder ersetzen, können ebenfalls angewandt werden. Transportvehikel und Transportschemata können spezifisch auf das jeweilige Protein oder den zu verabreichenden Arzneistoff zugeschnitten werden.
Hierin wird auch Gentherapie gelehrt, wobei rekombinante Technologie eingesetzt wird, um das Gen in die Zellen des Patienten zu transportieren, oder Vektoren verwendet werden, die den Patienten in vivo mit dem Genprodukt versorgen. Retroviren sind als ein bevorzugter Vektor für Experimente in somatischer Gentherapie mit einer hohen Infektionseffizienz und stabiler Integration und Expression angesehen worden (Orkin et al., Prog. Med. Genet. 7: 130-142 (1988)). Zum Beispiel kann die Delta-5-Desaturase-cDNA in einen retroviralen Vektor cloniert und entweder von ihrem endogenen Promotor oder von dem retroviralen LTR (lange endständige Wiederholung) gesteuert werden. Zu anderen Transportsystemen, die man einsetzen kann, gehören Adeno-assoziiertes Virus (AAV) (McLaughlin et al., J. Virol. 62: 1963-1973 (1988)), Vaccinia-Virus (Moss et al., Annu. Rev. Immunol. 5: 305-324 (1987)), das Rinderpapillomvirus (Rasmussen et al., Meth. Enzymol. 139: 642-654 (1987)) oder ein Mitglied der Gruppe der Herpesviren wie z.B. das Epstein-Barr-Virus (Margolskee et al., Mol. Cell. Biol. 8: 2837-2847 (1988)).
In einer anderen Ausführungsform sind die Antisense-, Ribozym- und Tripelhelix-Nucleotide darauf ausgelegt, die Translation oder die Transkription der Delta-5-Desaturase zu hemmen. Um dies zu erreichen, sollten die verwendeten Oligonucleotide auf der Grundlage relevanter Sequenzen konzipiert sein, die für die Delta-5-Desaturase-Kontrollregion einmalig sind. Zum Beispiel sollten die Oligonucleotide, und ohne dass dies als Einschränkung zu verstehen ist, nicht innerhalb jener Regionen liegen, in denen die Nucleotidsequenz eines zur Debatte stehenden Polynucleotids die höchste Homologie zu derjenigen von anderen Polynucleotiden von Fettsäureenzymen aufweist, was hierin als „einmalige Regionen" bezeichnet wird.
Im Fall von Antisense-Molekülen ist es bevorzugt, dass die Sequenz aus den einmaligen Regionen ausgewählt wird. Es ist auch bevorzugt, dass die Sequenz mindestens 18 Nucleotide lang ist, um eine ausreichend starke Anlagerung an die Sequenz der Ziel-mRNA zu erreichen, um die Translation der Sequenz zu verhindern (Izant, J.G. und Weintraub, H. Cell 36: 1007-1015 (1984); Rosenberg et al., Nature 313: 703-706 (1985)).
Im Fall des „Hammerhead"-Typs von Ribozymen ist es ebenfalls bevorzugt, dass die Zielsequenzen der Ribozyme aus den einmaligen Regionen ausgewählt werden. Ribozyme sind RNA-Moleküle, die eine hochspezifische Endoribonuclease-Aktivität besitzen. Hammerhead-Ribozyme enthalten eine hybridisierende Region, welche eine komplementäre Nucleotidsequenz zu wenigstens einem Teil der Ziel-RNA aufweist, und eine katalytische Region, die darauf abgestimmt ist, die Ziel-RNA zu spalten. Die hybridisierende Region enthält neun oder mehr Nucleotide. Deswegen haben die Hammerhead-Ribozyme der vorliegenden Erfindung eine hybridisierende Region, die komplementär zu den vorstehend aufgeführten Sequenzen ist, und eine Länge von mindestens neun Nucleotiden aufweist. Die Konstruktion und die Herstellung solcher Ribozyme ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt und ist in Haseloff, J. und Gerlach, W.L., Nature 334: 585-591 (1988) ausführlicher beschrieben.
Die Ribozyme der vorliegenden Erfindung umfassen auch RNA-Endoribonucleasen (hierin folgend „Ribozyme vom Cech-Typ") wie z.B. dasjenige, welches natürlich in Tetrahymena thermophila vorkommt (bekannt als IVS- oder L-19 IVS-RNA) und das von Thomas Cech und Mitarbeitern genau beschrieben worden ist (Zaug et al., Science 224: 574-578 (1984); Zaug, A.J. und Cech, T.R., Science 231: 470-475 (1986); Zaug et al., Nature 324: 429-433 (1986); veröffentlichte internationale Patentanmeldung Nr. WO 88/04300 von University Patents Inc., Juni 1988; Been, M.D. und Cech, T.R., Cell 47: 207-216 (1986)). Die Endoribonucleasen vom Cech-Typ haben ein aktives Zentrum von acht Basenpaaren, welche an die Sequenz der Ziel-RNA hybridisiert, wonach eine Spaltung der Ziel-RNA stattfindet. Die Erfindung umspannt jene Ribozyme vom Cech-Typ, die auf Zielsequenzen eines aktiven Zentrums von acht Basenpaaren gerichtet sind, welche in einem zur Debatte stehenden Polynucleotid, aber nicht in anderen Polynucleotiden für Fettsäureenzyme vorliegen.
Die Verbindungen können auf eine Vielzahl von Methoden verabreicht werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Verwendung von Liposomen als Abgabevehikel. Nackte DNA- oder RNA-Moleküle können ebenfalls eingesetzt werden, sofern diese in einer Form vorliegen, die resistent gegenüber Abbau ist, wie z.B. durch eine Modifikation der Enden, durch die Ausblidung von circulären Molekülen oder durch die Verwendung alternativer Bindungen, einschließlich Phosphothionat- und Thiophosphoryl-modifizierter Bindungen. Außerdem kann die Abgabe der Nucleinsäure über einen erleichterten Transport erfolgen, wobei die Nucleinsäuremoleküle an Poly-Lysin oder Transferrin gekoppelt sind. Nucleinsäure kann auch durch einen beliebigen der verschiedenen viralen Träger in Zellen transportiert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Retrovirus, Vaccinia, AAV und Adenovirus.
Alternativ kann ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül konstruiert werden, welches ein solches Antisense-, Ribozym-, Tripelhelix- oder zur Debatte stehendes Polynucleotidmolekül codiert oder ein solches darstellt. Bei diesem Nucleinsäuremolekül kann es sich entweder um RNA oder DNA handeln. Falls die Nucleinsäure eine RNA codiert, ist es bevorzugt, dass die Sequenz mit einem regulatorischen Element funktionell verknüpft ist, so dass ausreichend viele Kopien des gewünschten RNA-Produkts erzeugt werden. Das regulatorische Element kann entweder eine konstitutive oder eine regulierte Transkription der Sequenz erlauben. In vivo, d.h. innerhalb von Zellen oder innerhalb von Zellen eines Organismus, kann ein Transfervektor wie z.B. ein bakterielles Plasmid oder eine virale RNA oder DNA, welche eine oder mehrere der RNAs codiert, in Zellen transfiziert werden (z.B. Llewellyn et al., J. Mol. Biol. 195: 115-123 (1987); Hanahan et al., J. Mol. Biol. 166: 557-580 (1983)). Einmal im Inneren der Zelle angelangt, kann der Transfervektor replizieren und von zellulären Polymerasen transkribiert werden, um die RNA zu erzeugen, oder er kann in das Genom der Wirtszelle integriert werden. Alternativ kann ein Transfervektor, der Sequenzen enthält, die eine oder mehrere der RNAs codieren, in Zellen transfiziert werden oder durch Mikromanipulationstechniken wie z.B. durch Mikroinjektion in Zellen eingeführt werden, so dass der Transfervektor oder ein Teil davon in das Genom der Wirtszelle integriert wird.
Zusammensetzung, Formulierung und Verabreichung von Arzneimitteln Arzneimittel können auf eine Weise hergestellt werden, die an sich bekannt ist, z.B. mit Hilfe von herkömmlichen Misch-, Lösungs-, Granulierungs-, Drageebildungs-, Verreibungs-, Emulgier-, Verkapselungs-, Einschluss- oder Lyophilisationsprozessen.
Arzneimittel können demnach auf herkömmliche Weise formuliert werden, wobei ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger verwendet werden, umfassend Excipienten und Hilfsstoffe, welche die Verarbeitung der aktiven Verbindungen zu Zubereitungsformen erleichtern, die pharmazeutisch eingesetzt werden können. Eine geeignete Formulierung hängt von dem gewählten Verabreichungsweg ab.
Für eine Injektion können die Wirkstoffe der Erfindung in wässriger Lösung formuliert werden, bevorzugt in physiologisch kompatiblen Puffern wie z.B. Hanks-Lösung, Ringer-Lösung oder physiologischem Kochsalzpuffer. Für eine Verabreichung über die Schleimhaut werden Eindringmittel in der Formulierung verwendet, die für die zu permeierende Barriere zweckdienlich sind. Solche Eindringmittel sind allgemein auf dem Fachgebiet bekannt.
Für eine orale Verabreichung lassen sich die Verbindungen leicht durch Kombinieren der aktiven Verbindungen mit auf dem Fachgebiet wohlbekannten pharmazeutisch verträglichen Trägern formulieren. Solche Träger ermöglichen eine Formulierung der hierin beschriebenen Verbindungen als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirupe, Aufschlämmungen, Suspensionen und dergleichen für eine orale Aufnahme durch einen zu behandelnden Patienten. Pharmazeutische Zubereitungen zur oralen Verwendung lassen sich mit einem festen Excipienten erhalten, wobei ein so erhaltenes Gemisch wahlweise gemahlen wird und das Gemisch von Granula, gegebenenfalls nach Zugabe geeigneter Hilfsstoffe, verarbeitet wird, um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten. Geeignete Excipienten sind insbesondere Füllstoffe wie z.B. Zucker, einschließlich Lactose, Saccharose, Mannit oder Sorbit; Cellulosepräparate wie zum Beispiel Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffel stärke, Gelatine, Tragantgummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natrium-Carboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Gegebenenfalls können Zerfallsmittel wie quervernetztes Polyvinylpyrralidon, Agar oder Alginsäure oder ein Salz davon wie z.B. Natriumalginat hinzugefügt werden.
Drageekerne werden mit geeigneten Beschichtungen versehen. Zu diesem Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen eingesetzt werden, die wahlweise Gummi arabicum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Carbopol-Gel, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische enthalten. Zur Identifizierung oder um verschiedene Dosiskombinationen von aktiven Verbindungen zu kennzeichnen können zu den Tabletten- oder Drageebeschichtungen Farbstoffe oder Pigmente hinzugefügt werden.
Zu Arzneimitteln, die oral verwendet werden können, gehören aus Gelatine hergestellte Push-fit-Kapseln („push-fit") ebenso wie weiche, verschlossene Kapseln, die aus Gelatine und einem Weichmacher wie z.B. Glycerin oder Sorbit hergestellt werden. Die Push-fit-Kapseln können die aktiven Inhaltsstoffe in Beimischung mit einem Füllstoff wie z.B. Lactose, Bindemitteln wie z.B. Stärken und/oder Gleitmitteln wie z.B. Talk oder Magnesiumstearat und wahlweise Stabilisatoren enthalten. In weichen Kapseln können die aktiven Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten wie z.B. Fettölen, flüssigem Paraffin oder flüssigen Polyethylenglycolen gelöst oder suspendiert sein. Außerdem können Stabilisatoren hinzugefügt werden. Alle Formulierungen zur oralen Verabreichung sollten in Dosierungen vorliegen, die für eine solche Verabreichungsform geeignet sind.
Für eine bukkale Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Lutschbonbons annehmen, die auf herkömmliche Weise formuliert sind.
Für eine Verabreichung per Inhalation werden die Verbindungen für den wie hierin beschriebenen Zweck zweckmäßigerweise in Form einer Darreichung über ein Aerosol-Spray aus Druckbehältern oder einem Zerstäuber abgegeben, wobei ein geeignetes Treibmittel eingesetzt wird, z.B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder ein anderes geeignetes Gas. Im Fall eines unter Druck stehenden Aerosols kann die Dosierungseinheit dadurch bestimmt werden, indem ein Ventil bereitgestellt wird, welches eine abgemessene Menge abgibt. Kapseln und Patronen aus z.B. Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder einem Insufflator können so formuliert werden, dass sie ein Pulvergemisch der Verbindung und eine geeignete Pulvergrundlage wie z.B. Lactose oder Stärke enthalten.
Die Verbindungen können für parenterale Verabreichung durch Injektion formuliert werden, z.B. durch eine Bolus-Injektion oder eine Dauerinfusion. Formulierungen zur Injektion können in Form einer Einheitsdosierung dargereicht werden, z.B. in Ampullen oder in Mehrfachdosis-Behältern mit einem hinzugefügten Konservierungsmittel. Die Zusammensetzungen können solche Formen wie z.B. Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln annehmen und Formulierungsmittel wie z.B. Suspensions-, Stabilisierungs- und/oder Dispergiermittel enthalten.
Pharmazeutische Formulierungen zur parenteralen Verabreichung umfassen wässrige Lösungen der aktiven Verbindungen in Wasser-löslicher Form. Außerdem lassen sich Suspensionen der aktiven Verbindungen als zweckdienliche ölige Injektionssuspensionen herstellen. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel umfassen Fettöle wie z.B. Sesamöl oder synthetische Fettsäureester wie z.B. Ethyloleat oder Triglyceride oder Liposomen. Wässrige Injektionslösungen können Stoffe enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie z.B. Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit oder Dextran. Wahlweise kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren oder Stoffe enthalten, welche die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um die Herstellung von hoch konzentrierten Lösungen zu ermöglichen.
Alternativ kann der aktive Inhaltsstoff in Pulverform zur Rekonstitution vor dem Gebrauch mit einem geeigneten Vehikel, z.B. sterilem, Pyrogen-freiem Wasser, vorliegen.
Die Verbindungen können auch in rektalen Zusammensetzungen formuliert werden, wie z.B. als Zäpfchen oder Dauerklistier, welche z.B. übliche Zäpfchen-Basisstoffe wie z.B. Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten.
Zusätzlich zu den zuvor beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen auch als ein Depotpräparat formuliert werden. Solche lang wirkenden Formulierungen können durch Implantation (zum Beispiel subkutan oder intramuskulär) oder durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden. So können die Verbindungen zum Beispiel mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (zum Beispiel als eine Emulsion in einem verträglichen Öl) oder als Ionenaustauschharze oder als schwer lösliche Derivate, z.B. als ein schwer lösliches Salz, formuliert werden.
Ein pharmazeutischer Träger für die hydrophoben Verbindungen der Erfindung ist ein Verschnittmittel-System, umfassend Benzylalkohol, einen unpolaren grenzflächenaktiven Stoff, ein mit Wasser mischbares organisches Polymer und eine wässrige Phase. Natürlich können die Verhältnisse eines Cosolvent-Systems erheblich variiert werden, ohne seine Löslichkeits- und Toxizitätseigenschaften zu zerstören. Darüber hinaus kann die Identität des Verschnittmittel-Systems verändert werden.
Alternativ können andere Abgabesysteme für hydrophobe pharmazeutische Verbindungen verwendet werden. Liposomen und Emulsionen sind wohlbekannte Beispiele für Abgabevehikel oder Träger für hydrophobe Arzneistoffe. Bestimmte organische Lösungsmittel wie z.B. Dimethylsulfoxid können ebenfalls verwendet werden, obwohl gewöhnlich auf Kosten einer höheren Toxizität. Zusätzlich können die Verbindungen mit Hilfe eines Systems mit verlängerter Freisetzung abgegeben werden, wie z.B. semi-permeablen Matrices fester hydrophober Polymere, welche den therapeutischen Wirkstoff enthalten. Verschiedene Materialien für die verlängerte Freisetzung haben sich etabliert und sind den Fachleuten wohlbekannt. Kapseln für die verlängerte Freisetzung können, je nach ihrer chemischen Beschaffenheit, die Verbindungen für ein paar Wochen bis zu über 100 Tagen freisetzen. Je nach der chemischen Beschaffenheit und der biologischen Stabilität des therapeutischen Reagenzes können zusätzliche Strategien für die Stabilisierung des Proteins genutzt werden.
Die Arzneimittel können auch geeignete, feste oder in der Gelphase vorliegende Träger oder Excipienten umfassen. Beispiele für solche Träger oder Excipienten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zucker, Stärken, Cellulosederivate, Gelatine und Polymere wie z.B. Polyethylenglycole.
Viele der hierin beschriebenen Verbindungen können als Salze mit pharmazeutisch verträglichen Gegenionen zur Verfügung gestellt werden. Pharmazeutisch verträgliche Salze können mit vielen Säuren gebildet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Milchsäure, Tartarsäure, Apfelsäure, Bernsteinsäure etc.. Salze neigen dazu, in wässrigen oder anderen protonischen Lösungsmitteln, welche die entsprechenden freien Basenformen darstellen, besser löslich zu sein.
Geeignete Verabreichungswege können zum Beispiel orale, rektale, transmukosale, transdermale oder intestinale Verabreichung; parenterale Abgabe, einschließlich intramuskuläre, subkutane, intramedullare Injektionen ebenso wie intrathekale, direkt intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale, intranasale oder intraokulare Injektionen umfassen.
Alternativ kann man die Verbindung in einer lokalen statt einer systemischen Weise verabreichen, zum Beispiel über eine direkte Injektion der Verbindung in ein betroffenes Gebiet, häufig in Form einer Depotformulierung oder einer Formulierung mit verlängerter Freisetzung.
Darüber hinaus kann man den Arzneistoff in einem zielgerichteten Arzneistoffabgabesystem verabreichen, zum Beispiel in einem Liposom, das mit einem für die betroffenen Zellen spezifischen Antikörper beschichtet ist. Die Liposomen werden auf die Zellen zielgerichtet sein und von den Zellen selektiv aufgenommen werden.
Die Arzneimittel werden im Allgemeinen in einer Menge verabreicht, welche für die Behandlung oder die Vorbeugung einer spezifischen Indikation oder von spezifischen Indikationen wirksam ist. Es ist ersichtlich, dass die optimale Dosierung für jede Behandlungsmodalität und Indikation mit Hilfe von Standardmethoden zu ermitteln ist, wobei die Indikation, deren Schweregrad, der Verabreichungsweg, erschwerende Umstände und dergleichen zu berücksichtigen sind. Bei der Therapie oder zur Prophylaxe kann der aktive Wirkstoff einem Individuum als eine injizierbare Zusammensetzung verabreicht werden, zum Beispiel als eine sterile wässrige Dispersion, die vorzugsweise isotonisch ist. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich ferner auf diejenige Menge der Verbindung, welche ausreicht, zu einer Verbesserung der Symptome zu führen, die mit solchen Funktionsstörungen einhergehen. Methoden zur Formulierung und Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Anmeldung können in Mack, E.W., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, 13. Ausgabe (1990) gefunden werden. Bei einer Verabreichung an Säuger und insbesondere an Menschen ist zu erwarten, dass die tägliche Dosierungsmenge des Wirkstoffs in einem Bereich von 0,001 mg/kg bis 10 mg/kg liegt, üblicherweise um 0,01 mg/kg liegt. Der Arzt wird auf jeden Fall die tatsächliche Dosierung ermitteln, die für ein Individuum am besten geeignet ist, und wird diese je nach Alter, Gewicht und Ansprechen des jeweiligen Individuums anpassen. Die vorstehend angegebenen Dosierungen sind beispielhaft für den durchschnittlichen Fall. Es kann selbstverständlich Einzelfälle geben, in denen höhere oder niedrigere Dosierungsbereiche gerechtfertigt sind und solche sind innerhalb des Geltungsbereichs dieser Erfindung.
So stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screenen und Auswählen von Verbindungen bereit, welche Störungen des Fettstoffwechsels fördern, sowie ein Verfahren zum Screenen und Auswählen von Verbindungen, welche Störungen des Fettstoffwechsels ebenso wie die diabetische Neuropathie behandeln oder hemmen. Die ausgewählten Antagonisten und Agonisten können zum Beispiel verabreicht werden, um progressive und akute Funktionsstörungen zu hemmen, wie z.B. arteriellen Bluthochdruck, Hypercholesterinämie, atherosklerotische Herzkrankheit, chronisch entzündliche und Autoimmun-Funktionsstörungen, allergisches Ekzem und andere atopische Funktionsstörungen und Krebserkrankungen, wozu menschlicher Bauchspeicheldrüsenkrebs gehört.
Antagonisten, Agonisten und andere Verbindungen, welche durch die Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung identifiziert werden, können allein oder in Verbindung mit anderen Verbindungen wie z.B. therapeutischen Verbindungen angewandt werden. Die Arzneimittel können auf jede beliebige wirksame, zweckmäße Weise, wozu zum Beispiel eine Verabreichung durch direkte Mikroinjektion in das betroffene Gebiet gehört, oder auf intravenöse oder andere Wege verabreicht werden. Diese Zusammensetzungen können in Kombination mit (einem) nicht sterilen oder sterilen Träger oder Trägern zur Verwendung bei Zellen, Geweben oder Organismen eingesetzt werden, wie z.B. als ein pharmazeutischer Träger, der für die Verabreichung an ein Individuum geeignet ist. Solche Zusammensetzungen umfassen zum Beispiel einen Medienzusatzstof oder eine therapeutisch wirksame Menge von Antagonisten oder Agonisten der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten. Zu solchen Trägern gehören, ohne hierauf beschränkt zu sein, Salzlösung, gepufferte Salzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon. Die Formulierung wird so zubereitet, dass sie sich für die Verabreichungsart eignet.
Die vorliegende Anmeldung lehrt ferner diagnostische und pharmazeutische Packungen und Kits, welche einen oder mehrere Behälter umfassen, die mit einem oder mehreren Inhaltsstoffen der zuvor erwähnten Zusammensetzungen der Erfindung gefüllt sind. Einem solchen Behälter (solchen Behältern) kann eine Packungsbeilage in einer Form beigefügt sein, die von einer Regierungsbehörde vorgeschrieben ist, welche die Herstellung, den Gebrauch und den Verkauf von Arzneimitteln oder biologischen Produkten regelt, welche die Zulassung durch die Behörde für die Herstellung, den Gebrauch oder den Verkauf des Produkts für eine Anwendung bei Menschen widerspiegelt.
Die Arzneimittel werden im Allgemeinen in einer Menge verabreicht, welche für die Behandlung oder die Vorbeugung einer spezifischen Indikation oder von spezifischen Indikationen wirksam ist. Es ist ersichtlich, dass die optimale Dosierung für jede Behandlungsmodalität und Indikation mit Hilfe von Standardmethoden zu ermitteln ist, wobei die Indikation, deren Schweregrad, der Verabreichungsweg, erschwerende Umstände und dergleichen zu berücksichtigen sind. Bei der Therapie oder zur Prophylaxe kann der aktive Wirkstoff einem Individuum als eine injizierbare Zusammensetzung verabreicht werden, zum Beispiel als eine sterile wässrige Dispersion, die vorzugsweise isotonisch ist. Bei einer Verabreichung an Säuger und insbesondere an Menschen ist zu erwarten, dass die tägliche Dosierungsmenge des Wirkstoffs in einem Bereich von 0,001 mg/kg bis 10 mg/kg liegt, üblicherweise um 0,01 mg/kg liegt. Der Arzt wird auf jeden Fall die tatsächliche Dosierung ermitteln, die für ein Individuum am besten geeignet ist, und wird diese je nach Alter, Gewicht und Ansprechen des jeweiligen Individuums anpassen. Die vorstehend angegebenen Dosierungen sind beispielhaft für den durchschnittlichen Fall. Es kann selbstverständlich Einzelfälle geben, in denen höhere oder niedrigere Dosierungsbereiche gerechtfertigt sind, und solche sind innerhalb des Geltungsbereichs dieser Erfindung.
Es ist selbstverständlich, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die hierin beschriebenen speziellen Methoden, Protokolle, Zelllinien, Vektoren und Reagenzien beschränkt ist. Im Allgemeinen sind die nachfolgend beschriebenen Labormethoden in der Zellkultur und der Molekulargenetik diejenigen, die wohlbekannt sind und auf dem Fachgebiet gewöhnlich eingesetzt werden. Es werden Standardtechniken für rekombinante Nucleinsäure-Verfahren, die Synthese von Polynucleotiden, die Züchtung von Mikroben, Transformation, Transfektion etc. eingesetzt. Im Allgemeinen werden enzymatische Reaktionen und Reinigungsschritte gemäß den Vorschriften des Herstellers durchgeführt. Obwohl bei der Ausführung oder der Überprüfung der vorliegenden Erfindung beliebige Methoden und Materialien eingesetzt werden können, die den hierin beschriebenen ähnlich oder gleichwertig sind, werden die ausgewählten Methoden, Vorrichtungen und Materialien nachstehend beschrieben.
Um ein vollständiges Verständnis der Erfindung zu erleichtern, haben die nachstehend definierten Begriffe die folgende Bedeutung:

Agonist bezieht sich auf ein beliebiges Molekül oder einen beliebigen pharmazeutischen Wirkstoff wie z.B. einen Arzneistoff oder ein Hormon, welches/r die Aktivität eines anderen Moleküls verstärkt.
Antagonist ist ein beliebiges Molekül oder ein beliebiger pharmazeutischer Wirkstoff wie z.B. ein Arzneistoff oder ein Hormon, welches/r die Aktivität eines anderen Moleküls hemmt oder auslöscht.
Kontrollregion bezieht sich auf eine ein Gen oder eine Mehrzahl von Genen oder von Fragmenten davon enthaltende Nucleinsäuresequenz, welche dazu in der Lage oder dafür erforderlich ist, die Initiation, die Termination zu unterstützen oder zu behindern oder anderweitig die Transkription eines Gens zu regulieren, wobei die Kontrollregion einen Promotor, einen Enhancer, einen Silencer und/oder ein beliebiges anderes regulatorisches Element umfassen kann. Eine Kontrollregion kann auch eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die unabhängig oder ausschließlich dazu genügen kann oder auch nicht, die Transkription zu beginnen, zu beenden oder anderweitig zu regulieren, die jedoch in der Lage ist, eine solche Regulation in Verbindung mit anderen Nucleinsäuresequenzen zu bewirken.
Desaturase bezieht sich auf eine Fettsäure-Desaturase, bei der es sich um ein Enzym handelt, welches dazu in der Lage ist, eine Doppelbindung in der Kohlenwasserstoff-Region eines Fettsäure-Moleküls zu erzeugen.
Fettsäuren sind eine Klasse von Verbindungen, umfassend eine lange gesättigte oder einfach oder mehrfach ungesättigte Kohlenwasserstoffkette und eine endständige Carboxylgruppe.
Fettsäure-Delta-5-Desaturase (D5D) ist ein Enzym, das dazu in der Lage ist, eine Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffatomen 5 und 6 von der Carboxylgruppe aus in einem Fettsäuremolekül zu erzeugen.
Fettsäure-Delta-6-Desaturase ist ein Enzym, das dazu in der Lage ist, eine Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffatomen 6 und 7 von der Carboxylgruppe aus in einem Fettsäuremolekül zu erzeugen.
Funktionelles Enzym, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein biologisch aktives oder nicht aktives Protein mit einer bekannten enzymatischen Aktivität.
Enhancer ist eine Nucleinsäuresequenz, umfassend ein regulatorisches DNA-Element, welches die Transkription verstärkt oder erhöht, wenn es von einem spezifischen Transkriptionsfaktor oder -faktoren gebunden wird. Ein Enhancer ist im Allgemeinen, aber nicht ausschließlich, außerhalb der proximalen Promotorregion eines Zielgens gelegen und kann mehrere Kilobasen (kb) oder mehr von der Transkriptionsstartstelle des Zielgens entfernt liegen. Darüber hinaus kann ein Enhancer in beiden Orientierungen und in jeder Lage (stromaufwärts oder stromabwärts relativ zum Promotor) funktionieren, um erhöhte Genexpressionsspiegel zu bewirken und zu erzeugen, wenn er von spezifischen Faktoren gebunden wird. Außerdem bezieht sich ein Enhancer gemäß der vorliegenden Erfindung auch auf ein Verbindung (d.h. eine Testkomponente), welche die enzymatische Aktivität von Fettsäure-Desaturase erhöht oder diese fördert und/oder die Transkription des Gens erhöht oder fördert, welches eine Fettsäure-Desaturase codiert.
Gen bezieht sich auf ein Nucleinsäuremolekül oder einen Teil davon, dessen Sequenz Information einschließt, welche für die normale regulierte Produktion eines bestimmten Proteins oder einer bestimmten Polypeptidkette benötigt wird. Eine „heterologe" Region eines Nucleinsäure-Konstrukts (d.h. ein heterologes Gen) ist ein identifizierbarer DNA-Abschnitt innerhalb eines größeren Nucleinsäure-Konstrukts, welchen man in der Natur nicht mit den anderen genetischen Komponenten des Konstrukts verknüpft findet. Demnach wird das Gen, wenn das heterologe Gen ein Fettsäure-Desaturase-Gen eines Säugers codiert, normalerweise von einem Promotor flankiert sein, welcher die strukturelle genomische DNA in dem Genom des Quellorganismus nicht flankiert.
Wirtssystem kann eine Zelle, ein Gewebe, ein Organ, einen Organismus oder einen beliebigen Teil davon umfassen, welche/s/r eine Umgebung oder Bedingungen bereitstellt, welche die Transkription und/oder die Transkription einer exogenen Polynucleotidsequenz erlauben oder diese ermöglichen, gefolgt von einer anschließenden Translation, um ein funktionelles Protein oder Polypeptid zu ergeben.
Inhibitor bezieht sich auf einen Stoff oder eine Verbindung (d.h. Testkomponente), welcher (welche) die enzymatische Aktivität von Fettsäure-Desaturase vermindert oder verhindert oder die Transkription des eine Fettsäure-Desaturase codierenden Gens vermindert oder unterdrückt.
Identität, Ähnlichkeit oder homolog beziehen sich auf Beziehungen zwischen zwei oder mehreren Polynucleotidsequenzen, wie sie durch Vergleichen der Sequenzen bestimmt werden. Je nach Lage des Falls bedeutet Identität auf dem Fachgebiet auch den Grad der Sequenzverwandtschaft zwischen Polynucleotidsequenzen, wie er durch die Übereinstimmung zwischen Folgen solcher Sequenzen ermittelt wird. Sowohl Identität als auch Ähnlichkeit können leicht berechnet werden (Lesk, A.M., Hrsg., 1988, Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York; Smith, D.W., Hrsg., 1993, Biocomputing: Informatics and Genome Project, Academic Press, New York; Griffin, A.M. und Griffin, H.G., Hrsg., 1994, Computer Analysis of Sequence Data, Teil 1, Humana Press, New Jersey; von Heijne, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, New York und Gribskov, M. und Devereux, J., Hrsg., 1991, Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, New York). Obschon es eine Reihe von Methoden gibt, um Identität und Ähnlichkeit zwischen zwei Polynucleotidsequenzen zu messen, sind beide Begriffe Fachleuten wohlbekannt (von Heijne, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, New York; Gribskov, M. und Devereux, J., Hrsg., 1991, Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, New York; Carillo, H. und Lipman, D., SIAM J Applied Math. 48: 1073 (1988)). Verfahren, die üblicherweise eingesetzt werden, um Identität und Ähnlichkeit zwischen Sequenzen zu ermitteln, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf jene, die in Carillo, H. und Lipman, D., SIAM J Applied Math. 48: 1073 (1988) offenbart sind. Verfahren zur Bestimmung von Identität und Ähnlichkeit sind in Computerprogrammen verschlüsselt. Computerprogramm-Methoden zur Bestimmung von Identität und Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf das GCG Programm-Packet (Devereux et al., Nucl. Acids Res. 12(1): 387-395 (1984), BLASTP, BLASTN und FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)).
Isoliert bedeutet, „von Menschenhand" aus seinem natürlichen Zustand verändert, d.h. dass es, falls es in der Natur vorkommt, es verändert oder aus seiner ursprünglichen Umgebung entfernt worden ist oder beides. Zum Beispiel ist ein natürlich vorkommendes Polynucleotid, das natürlich in einem lebenden Organismus in seinem natürlichen Zustand vorhanden ist, nicht „isoliert", aber dasselbe Polynucleotid, das von in seinem natürlichen Zustand gleichzeitig vorhandenen Materialien getrennt wird, ist, so wie der Begriff hierin verwendet wird, „isoliert". Als Teil von oder nach der Isolierung können solche Polynucleotide mit anderen Polynucleotiden, z.B. mit DNA verknüpft werden, zum Beispiel zur Mutagenese, um Fusionsproteine zu bilden und zur Vermehrung oder zur Expression in einem Wirt. Man kann die isolierten Polynucleotide, allein oder verknüpft mit anderen Polynucleotiden wie z.B. Vektoren, in Wirtszellen in Kultur oder in ganze Organismen einführen. Eingeführt in Wirtszellen in Kultur oder in ganze Organismen würde eine solche DNA, so wie der Begriff hierin verwendet wird, immer noch isoliert sein, weil sie nicht in ihrer natürlich vorkommenden Form oder Umgebung vorläge. Auf ähnliche Weise können die Polynucleotide zum Beispiel in einer Zusammensetzung wie z.B. als Medienformulierungen, als Lösungen für die Einführung von Polynucleotiden beispielsweise in Zellen, als Zusammensetzungen oder Lösungen für chemische und enzymatische Reaktionen, welche nicht natürlich vorkommende Zusammensetzungen darstellen und darin in der Bedeutung dieses Begriffs, wie er hierin verwendet wird, isolierte Polynucleotide bleiben, vorliegen.
Nucleinsäure-Konstrukt bezieht sich auf ein beliebiges genetisches Element, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Plasmide und Vektoren, welche Polynucleotidsequenzen aufnehmen. Zum Beispiel kann ein Nucleinsäure-Konstrukt ein Vektor sein, der einen Promotor oder eine Kontrollregion umfasst, welche mit einem heterologen Gen funktionell verknüpft ist.
Funktionell verknüpft, wie hierin verwendet, zeigt die Verbindung eines Promotors oder einer Kontrollregion eines Nucleinsäure-Konstrukts mit einem heterologen Gen auf eine solche Weise an, dass die Anwesenheit oder die Modulation des Promotors oder der Kontrollregion die Transkription des heterologen Gens beeinflusst, einschließlich Genen für Reportersequenzen. Funktionell verknüpfte Sequenzen können auch zwei Abschnitte umfassen, die auf dasselbe RNA-Transkript transkribiert werden. So sind zwei Sequenzen wie z.B. ein Promotor und eine Reportergensequenz funktionell verknüpft, wenn die in dem Promotor beginnende Transkription ein RNA-Transkript der Reportersequenz erzeugt.
Promotor bezieht sich auf ein Nucleinsäuresequenz, umfassend ein regulatorisches DNA-Element, welches in der Lage ist, eine RNA-Polymerase direkt oder indirekt zu binden, um die Transkription eines stromabwärts (in 3'-Richtung) gelegenen Gens zu initiieren. Gemäß der vorliegenden Erfindung schließt ein Promotor eines Nucleinsäure-Konstrukts ein Nucleotidsequenz ein, wobei die Nucleotidsequenz mit einem heterologen Gen auf eine Weise verknüpft sein kann, dass die Induktion des Promotors die Transkription des heterologen Gens beeinflusst.
Rekombinant bezieht sich auf rekombinierte oder neue Kombinationen von Nucleinsäuresequenzen, Genen oder Fragmenten davon, welche durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden und sich von einer natürlich vorkommenden Nucleinsäuresequenz unterscheiden.
Regulatorisches Element bezieht sich auf eine Desoxyribonucleotidsequenz, umfassend die gesamte oder einen Teil von einer Nucleinsäuresequenz, an welche ein aktiviertes transkriptionelles regulatorisches Protein oder ein ein oder mehrere aktivierte transkriptionelle regulatorische Proteine umfassender Komplex bindet, so dass die Expression eines verbundenen Gens oder verbundener Gene einschließlich heterologer Gene transkriptionell moduliert wird.
Reportergen ist eine Nucleinsäuresequenz, welche ein Polypeptid oder ein Protein codiert, das ansonsten nicht von der Wirtszelle oder dem Wirtssystem produziert wird oder das in minimalen oder vernachlässigbaren Mengen in der Wirtszelle oder dem Wirtssystem produziert wird und das mittels verschiedener bekannter Methoden nachweisbar ist, so dass man das Reportergen-Produkt quantitativ testen kann, um das Niveau der transkriptionellen Aktivität in einer Wirtszelle oder einem Wirtssystem zu untersuchen. Beispiele umfassen Gene für Luciferase, Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), β-Galactosidase, sezernierte placentare alkalische Phosphatase und andere sezernierte Enzyme.
Silencer bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz oder einen Abschnitt einer DNA-Kontrollregion, so dass die Anwesenheit der Silencer-Sequenz in der Region eines Zielgens die Transkription des Zielgens am Promotor durch seine Wirkungen als ein einzelner DNA-Abschnitt oder durch die Wirkungen von in trans agierenden Faktoren unterdrückt, welche an diese genetische Elemente binden und in der Folge eine negative Kontrolle auf die Expression eines Zielgens bewirken.
Stringente Hybridisierungsbedingungen sind diejenigen, welche stringent genug sind, um für Spezifität zu sorgen, die Anzahl von Fehlpaarungen zu verringern und dennoch genügend flexibel sind, um die Bildung von stabilen Hybriden in einer akzeptablen Rate zu gestatten. Solche Bedingungen sind Fachleuten bekannt (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Nur als Beispiel kann eine stringente Hybridisierung mit kurzen Nucleotiden 5-10°C unter des T_m durchgeführt werden, wobei hohe Konzentrationen der Sonde wie z.B. 0,01-1,0 pMol/ml eingesetzt werden. Bevorzugt bedeutet der Begriff „stringente Bedingungen", dass eine Hybridisierung nur dann auftritt, wenn mindestens eine 95%ige und bevorzugt eine mindestens 97%ige Identität zwischen den Sequenzen vorliegt.
Marker bezieht sich auf eine spezifische kurze Aminosäuresequenz oder eine Oligonucleotidsequenz, wobei diese Aminosäure- oder Nucleinsäuresequenz zum Beispiel ein V5-Epitop, welches mit einem im Handel erhältlichen Antikörper erkannt werden kann, oder eine Folge von sechs Histidinresten umfassen oder codieren kann. In der Praxis erleichtert ein Marker die anschließende Identifizierung und Aufreinigung eines mit einem Marker versehenen Proteins.
Mit einem Marker versehenes Protein, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Protein, das eine verknüpfte Marker-Sequenz umfasst. Gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich ein mit einem Marker versehenes Protein auf ein Polypeptid einer Fettsäure-Desaturase eines Säugers, das am Carboxylende der Desaturase-Aminosäuresequenz mit einem V5-Epitop und sechs Histidinresten verknüpft ist.
Testkomponenten, wie hierin verwendet, umfassen kleine Moleküle (z.B. kleine organische Moleküle), pharmakologische Verbindungen oder Wirkstoffe, Peptide, Proteine, Antikörper oder Antikörperfragmente und Nucleinsäuresequenzen, einschließlich DNA- und RNA-Sequenzen.
Transkriptionell die Expression eines verbundenen Gens oder verbundener Gene modulieren bedeutet, die Transkriptionsrate eines solchen Gens oder solcher Gene zu verändern.
Transfektion bezieht sich auf einen Prozess, in dem exogene oder heterologe DNA (d.h. ein Nucleinsäure-Konstrukt) in eine eukaryontische Empfänger-Wirtszelle eingeführt wird. Daher bezeichnet man den Erwerb von exogener DNA einer Wirtszelle bei eukaryontischen Zellen als Transfektion. Es sollte beachtet werden, dass eukaryontische Transfektion analog zu einer bakteriellen Transformation ist, wodurch Bakterienzellen exogene oder heterologe DNA erwerben. In Prokaryonten und Eukaryonten (zum Beispiel Hefe und Säugerzellen) eingeführte DNA kann auf einem episomalen Element wie z.B. einem Plasmid beibehalten oder in das Wirtsgenom integriert werden. Was eukaryontische Zellen anbelangt, ist eine stabil transfizierte Zelle eine, in der die eingeführte DNA in ein Chromosom integriert worden ist, so dass sie durch Replikation der Chromosomen an Tochterzellen vererbt wird. Diese Stabilität zeigt sich an der Fähigkeit der eukaryontischen Zelle, Zelllinien oder Clone zu etablieren, welche aus einer Population von Tochterzellen bestehen, welche die eingeführte DNA enthalten.
Transfektion/Transformation, wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Prozess, durch den exogene oder heterologe DNA (z.B. ein Nucleinsäure-Konstrukt) in eine eukaryontische oder prokaryontische Wirtszelle oder in ein Wirtssystem eingeführt worden ist.
Transformation bezieht sich auf einen Prozess, durch den exogene oder heterologe DNA (d.h. ein Nucleinsäurekonstrukt) in eine prokaryontische Empfängerwirtszelle eingeführt wird. Deswegen wird in prokaryontischen Zellen der Erwerb von exogener DNA durch eine Wirtszelle als Transformation bezeichnet. Man sollte beachten, dass bakterielle Transformation analog zur eukaryontischen Transfektion ist. Darüber hinaus sollte man ebenfalls beachten, dass sich Transformation in Eukaryonten auf die Umwandlung oder die Transformation eukaryontischer Zellen in einen Zustand unbeschränkten Wachstums in Kultur bezieht, ähnlich einem tumorigenen Zustand. In Prokaryonten und Eukaryonten (zum Beispiel Hefe und Säugerzellen) eingeführte DNA kann auf einem episomalen Element wie z.B. einem Plasmid beibehalten oder in das Wirtsgenom integriert werden. Was prokaryontische Zellen anbelangt, ist eine stabil transformierte Bakterienzelle eine, in der die eingeführte DNA in ein Chromosom integriert worden ist, so dass sie durch Replikation der Chromosomen an Tochterzellen vererbt wird. Diese Stabilität zeigt sich an der Fähigkeit der prokaryontischen Zelle, Zelllinien oder Clone zu etablieren, welche aus einer Population von Tochterzellen bestehen, welche die eingeführte DNA enthalten.

Die hierin verwendete Terminologie dient nur dem Zweck, bestimmte Ausführungsformen zu beschreiben und ist nicht gedacht, den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung zu beschränken, welcher nur durch die angefügten Ansprüche beschränkt ist. Soweit nicht anderweitig definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselben Bedeutungen wie sie gewöhnlich von einem durchschnittlich begabten Fachmann des Fachgebiets verstanden werden, zu dem diese Erfindung gehört.
Die vorliegende Erfindung wird weiter beschrieben und wird besser zu verstehen sein, indem man auf die nachstehend aufgeführten Arbeitsbeispiele verweist. Diese nicht beschränkenden Beispiele sollen nur als veranschaulichend für die Prinzipien der Erfindung angesehen werden. Da einem Fachmann zahlreiche Modifikationen und Veränderungen einfallen werden, ist es nicht gewünscht, die Erfindung auf die exakte, gezeigte und beschriebene Konstruktion und Ausführung zu beschränken. Dementsprechend können alle geeigneten Modifikationen und Äquivalente verwendet werden und fallen in den Geltungsbereich der Erfindung und der angefügten Ansprüche.
BEISPIELE
Beispiel 1 – Clonierung der Desaturase-Gene von Ratte und Mensch
(Referenzbeispiel)
RNA-Extraktion:
Gesamt-RNA wurde aus Rattenleber oder aus der menschlichen Zelllinie Chang (ATCC Nr. CCL-13) extrahiert, wobei die TRIzol-Reagenzienlösong (Gibco-BRL), wie vom Hersteller beschrieben, eingesetzt wurde.
Reverse Transkription:
Etwa 1 μg von jeder RNA-Probe wurde in 3 mM MgCl₂, 75 mM KCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2 ng/μl Zufallsprimer (Perkin-Elmer), 1,0 mM von jedem dNTP, 2,0 U/μl RNase Inhibitor (Perkin-Elmer) und 10 U/μl MuLV-reverse Transkriptase (Perkin-Elmer) revers transkribiert. Die Reaktionen wurden für 30 Min. bei 42°C in einem Endvolumen von 20 μl durchgeführt. Das Enzym wurde dann für 5 Min. bei 94°C inaktiviert.
Amplifikation von Desaturase-Genen mittels PCR und Clonierung in einen Hefevektor:
Aliquote (5 μl) der reverse Transkriptions-Reaktionen wurden mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert, wobei Primer eingesetzt wurden, die so konstruiert waren, dass sie cDNA erzeugten, welche der codierenden-Sequenz für das menschliche Desaturase-Gen entsprach.
Das hD5D-Gen wurde für die Clonierung in die Vektoren pYES2 und pYES2/CT (Invitrogen) in einem zweischrittigen Prozess mit zwei Primer-Sätzen amplifiziert. Die ursprünglichen Vorwärts- und Rückwärts-Primer für die Clonierung des hD5D-Gens in den Vektor pYES2 waren
5'-CACGACGAATTCCGTCGCCAGGCCAGCTATGG-3' (SEQ ID NO.5) bzw.
5'-CACTATCTCGAGCTGGGCAGGGTGGCTGTTGT-3', (SEQ ID NO.6)
Die Translationsstart- und Stoppcodons (oder ein Teil davon) sind durch Fettdruck angezeigt. Das PCR-Produkt enthielt einzelne EcoRI- und XhoI-Stellen (unterstrichen) und wurde an diesen Stellen in den Vektor pYES2 cloniert. Dieses Konstrukt wurde pYh5006.1 genannt.
Die Vorwärts- und Rückwärts-Primer, welche dafür eingesetzt wurden, das hD5D-Gen von dem vorstehend beschriebenen Vektorkonstrukt (pYn5006.1) zu amplifizieren, waren
5'-CACGCGAAGCTTAAAAATGGCCCCCGACCCGG-3' (SEQ ID NO.7) bzw.
5'-CACGCGTCTAGATTATTGGTGAAGATAGGCATCTAGCCAGCGCT-3' (SEQ ID NO.8)
Die Translationsstart- und Stoppcodons sind in Fettdruck gezeigt. Dieses PCR-Produkt enthielt einzelne HindIII – und XbaI-Restriktionsstellen (unterstrichen) und wurde an diesen Stellen in den Vektor pYES2 cloniert. Der Rückwärts-Primer für die Clonierung des hD5D-Gens aus pYh5006.1 in den Vektor pYES2/CT (Invitrogen), welcher einen C-terminalen Marker für den Protein-Nachweis und die Aufreinigung enthält, war
5'-CACGCGTCTAGATTGGTGAAGATAGGCATCTAGCCAGAGCTG-3' (SEQ ID NO. 9);
der Vorwärts-Primer war derselbe wie derjenige, der für die Konstruktion von pYES2 verwendet wurde. Der Rückwärts-Primer weist kein Stoppcodon auf und setzt das Gen daher in dasselbe Leseraster mit dem C-terminalen Marker. Die Konstrukte pYES2/CT und pYES2, welche das hD5D-Gen enthalten, wurden pTh5009.1 bzw. pYh5006.3 genannt (5 bzw. 6).
Die Vorwärts- und Rückwärts-Primer für das rD5D waren
5'-CACGCGAAGCTTAAAAATGGCCCCCGACCCGG-3' (SEQ ID NO.10) bzw.
5'-CACGCGTCTAGATTATTGGTGAAGATAGGCATCTAGCCAGCGCT-3' (SEQ ID NO. 11)
für die Clonierung in den Vektor pYES2. Obwohl diese Primer für das hD5D-Gen konstruiert waren, wurde das rD5D-Gen von DNA aus Rattenleber amplifiziert. Das PCR-Produkt enthielt einzelne HindIII – und XbaI-Stellen (unterstrichen), die an die Translationsstart- bzw. Stoppcodons angrenzten (angezeigt durch Fettdruck). Das rD5D-Genkonstrukt in dem Vektor pYES2 wurde pYr5014.1 genannt (7).
Die PCR wurde mit der Advantage-HF-Polymerase (Clontech) gemäß den Vorschriften des Herstellers durchgeführt. Die PCR-Produkte wurde mit Hilfe des QIAquick Gelextraktions-Kits (Qiagen, Deutschland) gelgereinigt.
Die aufgereinigten PCR-Produkte und die Hefe-Expressionsvektoren pYES2 und pYES2/CT wurden mit spezifischen Restriktionsenzymen in Übereinstimmung mit den während der Amplifikation erzeugten Restriktionsstellen verdaut und aufgereinigt. Die verdauten Vektor- und PCR-Produkte wurden ligiert und in kompetente E. coli, Stamm INFαF' (für hD5D) oder Stamm TOP10 (für rD5D) (Invitrogen) transformiert, und auf LB-Agarplatten selektiert, die Ampicillin enthielten. Die durch Selektion erhaltenen Kolonien wurden amplifiziert und Plasmid-DNA wurde mit dem QIAprep Spin Miniprep-Kit (Qiagen) isoliert. Alle Plasmidkonstruktionen wurden mittels DNA-Sequenz-Analyse bestätigt. Transformation von Saccharomyces cerevisiae, Stamm INVSc1 (Invitrogen) mit den Plasmiden wurde mit der Lithiumacetat-Methode (Invitrogen) durchgeführt und rekombinante Hefezellen wurden auf synthetischem Minimalmedium ohne Uracil (SC-U) selektiert.
Konstruktion des Hefestamms: Der Genotyp von INVSc1 ist (Mata/Matα his3Δ1 leu2/leu2 trp1-289/trp1-289 ura3-52/ura3-52). Nachdem Saccharomyces cerevisiae, wie zuvor beschrieben, mit den Desaturase-Genkonstrukten transformiert worden ist, waren die so erhaltenen Stämme außer der Anwesenheit der Desaturase-Konstrukte isogen zu INVSc1.
Beispiel 2 – Clonierung und Identifizierung der menschlichen Desaturase-Kontrollregion
Die hD5D-Kontrollregion wurde aus der genomischen DNA von menschlichen Leukocyten durch zwei Runden von PCR-Reaktionen cloniert. Die erste PCR-Reaktion verwendete die folgenden Primer: einen Rückwärts-Primer, der an der Position +127 der codierenden Sequenz von hD5D begann (5'-CACCTTACGGTCGATCACTA-3'; SEQ ID NO: 12) und einen Vorwärts-Primer, der an der Position –1357 stromaufwärts von dem Translationsstartcodon ATG begann (5'-CTCAGTGCTTGGGACAGTTA-3'; SEQ ID NO: 13).
Die PCR-Amplifikation wurde in einem Perkin-Elmer GeneAMP-PCR-System 9700-Instrument in einem Reaktionsvolumen von 50 μl durchgeführt, enthaltend: 0,5 μg genomische DNA, 0,4 μM von jedem Primer, 1 × dNTP-Gemisch (Clontech, CA), 1 × PCR-Reaktionspuffer (Clontech) und 1 × Advantage-Polymerase-Gemisch (Clontech).
Die Bedingungen für die PCR-Reaktion waren:
7 Zyklen bei 94°C für 2 Sekunden, 72°C für 3 Minuten
32 Zyklen bei 94°C für 2 Sekunden, 67°C für 3 Minuten
67°C für 4 Minuten
Die PCR-Produkte wurde mit Hilfe des QIAquick-Gelextraktions-Kits (Qiagen) gelgereinigt und in den TA-Clonierungs-Vektor pCRII (Invitrogen) eingesetzt. Das so erhaltene Plasmid, welches pCh4012.1 genannt wurde, wurde als Matrize in einer zweiten PCR-Reaktion eingesetzt, die darauf abzielte, die hD5D-Kontrollregion ohne den Teil der codierenden Sequenz zu clonieren.
Die für die zweite PCR eingesetzten Vorwärts- und Rückwärts-Primer waren
5'-GACGAGCTCCTCAGTGCTTGGGACAGTTATGTTT-3' (SEQ ID NO.14) bzw.
5'-GACGAGCTCAGCTGGCCTGGCGA-3' (SEQ ID NO. 15)
Der Vorwärts-Primer beginnt an Position –1357 der hD5D-Kontrollregion und der Rückwärts-Primer beginnt an Position –1 stromaufwärts von dem ATG. Beide Primer enthielten SacI-Erkennungsstellen für die Clonierung in die SacI-Stellen der Vektoren pCAT3-Basic und pGL3-Basic. Die PCR-Bedingungen waren dieselben, wie zuvor bei der Verwendung von pCh4012.1 beschrieben. Das gelgereinigte PCR-Produkt und die Vektoren pCAT3-Basic und pGL3-Basic wurden mit dem Restriktionsenzym SacI verdaut, ligiert und in den kompetenten E. coli-Stamm TOP10 (Invitrogen) transformiert. Kolonien wurden auf Platten selektiert, die Ampicillin enthielten. Durch Selektion erhaltene Kolonien wurden amplifiziert und Plasmid-DNA wurde mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep-Kits (Qiagen) isoliert. Die Transformanten wurden mittels Restriktionsanalyse durchmustert und durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Die 1357 bp große Kontrollregion, die in die Vektoren pCAT3-Basic und pGL3-Basic cloniert worden war, wurde pBh4013.1 (8) bzw. pGh4014.1 (9) genannt.
Beispiel 3 – Transfektion von Zellen
Die Zelllinien ZR-75-1 und HepG2 werden mit 5 μg der Plasmide pBh4013.1 und pGh4014.1, wobei 5 μl Lipofectamine 2000-Reagenz (Gibco-BRL) eingesetzt wird, in einer Platte mit 6 Vertiefungen, wie vom Hersteller beschrieben, transfiziert. Die Kontrollplasmide pCAT-3-CTL und pCAT3-Basic oder pGL3-CTL und pGL3-Basic werden ebenfalls als Positiv- bzw. Negativkontrollen transfiziert. In allen Fällen werden 5 μg des Plasmids pCMV-β-Gal (pCMV-β-Galactosidase-Kontrollvektor, Clontech) co-transfiziert und als interne Kontrolle verwendet, um die Transfektionseffizienz zwischen jeder Transfektion zu standardisieren.
Beispiel 4 – CAT (Chloramphenicolacetyltransferase) – Enzymtest
Für die CAT-Tests werden die transfizierten Zellen 48 Stunden nach der Transfektion geerntet und es werden zelluläre Protein-Extrakte hergestellt, wobei 1 × Reporter-Lysepuffer (Promega) eingesetzt wird. Der CAT-Test wird mit dem CAT Enzyme Assay System von Promega durchgeführt, wobei die Protokolle der Firma befolgt werden. Im Wesentlichen werden etwa 20 μg Protein-Extrakt mit 75 μCi [1,2-¹⁴C]-Chloramphenicol (NEN, MA) und 25 μg von in dem Kit mitgelieferten n-Butyryl-Coenzym A inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird dann durch Zugabe von 300 μl von gemischten Xylolen gestoppt. Die Xylol-Phase wird zweimal mit 100 μl 0,25 M Tris-HCl (pH 8,0) extrahiert; 200 μl der oberen Xylol-Phase werden mit 10 ml Scintillationsflüssigkeit (Ready-Safe, Beckman, CA) kombiniert und die Radioaktivität wird in einen Flüssig-Scintillationsmessgerät gezählt. Eine Standardkurve wird mit reinem CAT-Enzym aufgenommen, um zu gewährleisten, dass die Extrakte ausreichend hoch verdünnt sind, um eine enzymatische Reaktion zu ergeben, welche innerhalb des linearen Bereichs der Standardkurve liegt.
Die β-Galactosidase-Enzymaktivität wird als interne Kontrolle verwendet, um die Transfektionseffizienz zwischen Transfektionen zu standardisieren. Derselbe Protein-Extrakt wird mit 1 × Reporter-Lysepuffer auf 150 μl verdünnt und mit dem gleichen Volumen 2 × Assay-Puffer (Beta-Galactosidase Enzyme Assay System, Promega) inkubiert, welcher 200 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,3, 2 mM MgCl₂, 100 mM β-Mercaptoethanol und 1,33 mg/ml o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG) enthält. Das Reaktionsgemisch wird für 30 Min. bis 1 Std. bei 37°C inkubiert (bis sich eine leichte gelbe Farbe entwickelt). Die Reaktion wird durch Zugabe von 500 μl 1 M Natriumcarbonat gestoppt und die Extinktion spektrophotometrisch bei 420 nm bestimmt. Die Ergebnisse eines typischen CAT-Test5 sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Basalaktivität des D5D- und D6D-Promotors in der Zelllinie ZR-75-1

* Auf Kontrollen normalisierte Aktivität
pRh4007.1 (10)
pRh4002.1 (11)

Beispiel 5 – Luciferase – Enzymtest
Für die Luciferase-Tests werden die transfizierten Zellen 48 Std. nach Transfektion geerntet und es werden zelluläre Protein-Extrakte hergestellt, wobei 1 × Reporter-Lysepuffer (Promega) gemäß dem Protokoll der Firma eingesetzt wird. Der Luciferase-Test wird mit dem Luciferase Enzyme Assay System (Promega) durchgeführt, wobei die Empfehlungen des Herstellers befolgt werden.
Beta-Galactosidase-Enzymaktivität wird als interne Kontrolle verwendet, um, wie in Beispiel 4 beschrieben, die Transfektionseffizienz zwischen Transfektionen zu standardisieren.
Beispiel 6 – Funktionelle Analyse der Delta-5-Desaturase in mit pYr5014.1 transformierter Saccharomyces cerevisiae (Referenzbeispiel)
Chemikalien und Radiochemikalien:
Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren wurde von Difco (Becton Dickinson Co) gekauft. Fettsäure-freies Rinderserumalbumin, Tris-HCl, Tergit, Kohlenhydrate, Aminosäuren und Fettsäuren wurden von Sigma-Aldrich Canada (Oakville, ON, Kanada) bezogen. Alle organischen Lösungsmittel (HPLC-Qualität) wurden von Fisher-Scientific (Fair Lawn, NJ) bezogen. [1-¹⁴C]-Alpha-Linolensäure und [1-¹⁴C]-Dihomogammalinolensäure (99% radiochemische Reinheit); spezifische Aktivität: 52 μCi/μMol) wurden von NEN (Boston, MA, USA) gekauft. Diese Fettsäuren wurden mit KOH (0,1 M) verseift und in SC-U-Medium mit 1% Tergit aufgelöst.
Inkubation:
Mit pYr5014.1 transformierte Saccharomyces cerevisiae wurden in einem 125 ml-Erlenmayerkolben inkubiert, der 10 ml SC-U-Medium, 1% Tergit (O.D. 0,4, ungefähr 3,2 × 10⁶ Zellen/ml) und 2 μM (1 μCi) der Kaliumsalze von entweder [1-¹⁴C]-Alpha-Linolensäure oder [1-¹⁴C]-Dihomogammalinolensäure enthielt. Nach 5 Std. Inkubation in einem Orbital-Schüttler bei 270 UpM und 30°C erreichten die Zellen die Log-Phase und die Expression des Transgens wurde mit Galactose (2% Endkonzentration) induziert. Die Hefen wurden weiter für 19 Std. inkubiert, bis sie durch Zentrifugation bei 5000 × g für 10 Min. bei 4°C geerntet wurden.
Die Zellen wurden mit Tris-HCl-Puffer (100 mM, pH 8,0) gewaschen, der 0,1% BSA enthielt, und Gesamtlipide wurden, wie nachstehend beschrieben, extrahiert. Die Radioaktivität von Aliquoten des Inkubationsmediums, des Überstands und der Zellen wurde durch Flüssigszintillationszählung mit einem LS6500-Szintillationssystem (Beckman) bestimmt.
Die mit dem Vektor pYES2 transformierte Wirtshefe wurde als Negativkontrolle verwendet.
Lipidextraktion:
Gesamtlipide wurden mit Chloroform/Methanol (2:1 Vol./Vol.) gemäß der Methode von Folch et al., J. Biol. Chem 226: 497-509 (1957) aus den Zellen extrahiert. Die Gesamtlipidextrakte wurden mit Bortrifluorid in Methanol für 30 Min. bei 90°C methyliert. Die so erhaltenen Methylester (FAME) wurden, wie nachstehend beschrieben, untersucht.
Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)-Analyse:
Analysen der radioaktiv markierten FAMEs wurden bei 205 nm auf einem Hewlett Packard (1090, Serie II)-Chromatographen, ausgestattet mit einem Diodenarray-Detektorsatz, einem Radioisotopen-Detektor (Modell 171, Beckman, Fullerton, KA) mit einer festen Szintillations-Kartusche (97% Effizienz für ¹⁴C-Nachweis) und einer Beckman ODS Umkehrphasen-(C-18)-Säule (250 mm × 4,6 mm inn. Durchm.; 5 μm Partikelgröße), die an eine Vorsäule mit einem μBondapak C-18-Einsatz (Beckman) angebunden war, durchgeführt. FAMEs wurden isokratisch mit Acetonitril/Wasser (95:5, Vol./Vol.) bei einer Flussrate von 1 ml/min aufgetrennt und wurden durch Vergleich mit bestätigten Standards identifiziert. Alternativ werden Fettsäuremethylester durch Kapillarsäulen-Gaschromatographie (GC) analysiert.
Ergebnisse:
Die Untersuchung durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (RP-HPLC) ergab, dass in mit pYr5014.1 transformierter Hefe nur [1-¹⁴C]-Dihomogammalinolensäure zu Arachidonsäure (20:4n-6, AA) umgewandelt wurde (Beispiel 1, 12). Eine solche Enzymaktivität wurde nicht in der Wirtshefe nachgewiesen, die mit pYES2 transformiert war (13). [1-¹⁴C]-Alpha-Linolensäure wurde nicht desaturiert. Dieser Befund bestätigte, dass pYr5014.1 eine Delta-5-Desaturase statt einer Delta-6-Desaturase enthält. Tabelle 2 Prozentsatz der Substratumwandlung und der Radioaktivität, die in mit pYr5014.1 transformierten Saccharomyces cerevisiae-Zellen 19 Std. nach der Induktion mit Galactose wiedergefunden wurde
Die Werte sind der Mittelwert ± SA („SA"; Standardabweichung) von drei Hefekulturen, welche von derselben transformierten Kolonie abgeleitet wurden. OD₆₀₀: 6,7 ± 1,9
Schlussfolgerung:
Die funktionelle Analyse des in dem transgenen Plasmid pYr5014.1 enthaltenen Rattengens bestätigte, dass das Gen eine Fettsäure-Delta-5-Desaturase codiert, welche auf Dihomogammalinolensäure (20:3n-6) aktiv ist.
Beispiel 7 – Funktionelle Analyse der Delta-5-Desaturase in mit pYr5014.1 oder pTh5009.1 transformierter Saccharomyces cerevisiae unter Verwendung von Δ^8,11,14,17 Eicosatetraensäure (20:4n-3, ETA) als Substrat (Referenzbeispiel)
Chemikalien und Radiochemikalien:
Chemikalien und Kulturmedien sind in Beispiel 6 beschrieben worden. [1-¹⁴C]-Δ^8,11,14,17 Eicosatetraensäure (99% radiochemische Reinheit); spezifische Aktivität: 55 μCi/μMol) wurde von ARC (St. Louis, MO, USA) gekauft, mit KOH (0,1 M) verseift und in SC-U-Medium mit 1% Tergit aufgelöst.
Inkubation:
Mit pYr5014.1 oder pTh5009.1 transformierte Saccharomyces cerevisiae wurden in einem 125 ml-Erlenmeyerkolben inkubiert, der 10 ml SC-U-Medium, 1% Tergit (O.D. 0,4, ungefähr 3,2 × 10⁶ Zellen/ml) und 2 μM (1 μCi) der Kaliumsalze [1-¹⁴C]-20:4n-3 enthielt. Die Expression des Transgens wurde mit Galactose (2% Endkonzentration) induziert. Nach 24 Std. Inkubation in einem Orbital-Inkubator bei 270 UpM und 30°C wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 5000 × g für 10 Min. bei 4°C geerntet.
Die Zellen wurden mit Tris-HCl-Puffer (100 mM, pH 8,0) gewaschen, der 0,1% BSA enthielt, und Gesamtlipide wurden, wie in Beispiel 6 beschrieben, extrahiert. Die Radioaktivität von Aliquoten des Inkubationsmediums, des Überstands und der Zellen wurde durch Flüssigszintillationszählung mit einem LS6500-Szintillationssystem (Beckman) bestimmt.
Die mit dem Vektor pYES2 transformierte Wirtshefe wurde als Negativkontrolle verwendet.
Lipidextraktion und HPLC-Analyse:
Gesamtlipide wurden, wie in Beispiel 6 beschrieben, mit Chloroform/Methanol (2:1 Vol./Vol.) aus den Zellen extrahiert, methyliert und untersucht.
Ergebnisse:
Die Untersuchung durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (RP-HPLC) ergab, dass in mit pYr5014.1 oder pTh5009.1 transformierter Hefe 68% der [1-¹⁴C]-Δ^8,11,14,17 Eicosatetraensäure (20:4n-3; ETA) in Eicosapentaensäure (20:5n-3, EPA) umgewandelt wurden (14). Eine solche Enzymaktivität wurde nicht in der Wirtshefe nachgewiesen, die mit pYES2 transformiert war (15).
Schlussfolgerung:
Diese Befunde bestätigten und erweiterten diejenigen, die in Beispiel 6 beschrieben sind. Die Ergebnisse der Erfinder sind die ersten, welche die Umwandlung von sowohl DGLA in AA (Beispiel 6) als auch von ETA in EPA durch dieselbe rekombinante Delta-5-Desaturase eines Säugers zeigen.
Beispiel 8 – Funktionelle Analyse von Delta-5-Desaturase in Sphäroplasten aus Saccharomyces cerevisiae, welche entweder mit pYr5014.1 oder mit pTh5009.1 transformiert sind (Referenzbeispiel)
Chemikalien und Radiochemikalien:
DTT (Dithiothreit), Lyticase, Sorbit, Tergit, Tris- HCl, Fettsäure-freies Rinderserumalbumin, Kohlenhydrate, Aminosäuren und Fettsäuren wurden von Sigma-Aldrich Canada bezogen. Alle organischen Lösungsmittel (HPLC-Qualität) wurden von Fisher-Scientific bezogen. Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren wurde von Difco gekauft. [1-¹⁴C]-Dihomogammalinolensäure (99% radiochemische Reinheit); spezifische Aktivität: 52 μCi/μMol) wurde von NEN gekauft. Diese Fettsäure wurde mit KOH (0,1 M) verseift und in SC-U-Medium mit 1% Raffinose und 1% Tergit aufgelöst.
Herstellung von Sphäroplasten:
Kulturen von Saccharomyces cerevisiae, die entweder mit pYr5014.1 oder mit pTh5009.1 transformiert worden waren, ließ man in SC-U-Medium mit 1% Raffinose und 2% Galactose wachsen, um die Expression des Gens zu induzieren, das die Fettsäure-Delta-5-Desaturase codiert. Nach 16 Std. Inkubation wurden die Zellen bei 2060 × g für 5 Min. bei 4°C abzentrifugiert, einmal mit destilliertem Wasser gewaschen und nochmals zentrifugiert. Das Volumen und das Gewicht des Zellpellets wurde gemessen. Die Zellen wurden (1:2 Gew./Vol.) in 0,1 M Tris.SO₄ (pH 9,4), 10 mM DTT resuspendiert und bei 30°C inkubiert. Nach 10 Min. Inkubation wurde das Zellpellet durch Zentrifugation gewonnen, einmal (1:20 Gew./Vol.) mit 1,2 M Sorbit gewaschen und (1:1, Gew./Vol.) in 1,2 M Sorbit, 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) suspendiert, wie anderswo beschrieben (Daum et al., J. Biol. Chem 257: 13028-13033 (1982)). Der bei 15.800 × g (1 Min.) erhaltene Überstand der Lyticase wurde zu der Zellsuspension in einer Konzentration von 2000 U/ml hinzugegeben und die Suspension bei 30°C unter Schütteln mit 50 UpM inkubiert. Die Umwandlung in Sphäroplasten wurde nach 40 Min. Inkubation überprüft, indem die Suspension mit destilliertem Wasser verdünnt wurde, gefolgt von einer Beobachtung unter dem Mikroskop (Schatz, G. und Kovac, L. Meth. Enzymol. 31A: 627-632 (1974)). Nach 70 Min. Inkubation waren ungefähr 90% der Zellen in Sphäroplasten umgewandelt.
Inkubation:
Sphäroplasten wurden durch Zentrifugation bei 2060 × g für 5 Min. bei 4°C geerntet, einmal mit 1,2 M Sorbit gewaschen und in SC-U-Medium mit 1% Raffinose, 1% Tergit, 1,2 M Sorbit und 2% Galactose resuspendiert, um die Induktionsbedingungen aufrechtzuerhalten und um einen OD₆₀₀-Messwert von ungefähr 2,5 bis 3 zu ergeben. Ein Aliquot von 10 ml der Sphäroplasten-Suspension wurde in 125 ml- Erlenmeyerkolben transferiert und mit 2 μM (1 μCi) Delta-5-Desaturase-Substrat, [1-¹⁴C]-Dihomogammalinolensäure, bei 30°C in einem Orbitalinkubator bei 270 UpM inkubiert. Nach 150 Min. Inkubation wurde die Zelldichte bestimmt (OD₆₀₀) und Sphäroplasten wurden durch Zentrifugation geerntet und mit Tris-HCl-Puffer (100 mM, pH 8,0) gewaschen, der 0,1% BSA enthielt. Gesamtlipide wurden, wie nachstehend beschrieben, extrahiert. Die Radioaktivität von Aliquoten der Zellsuspension, des Überstands und des Sphäroplasten-Extrakts wurde durch Flüssigszintillationszählung mit einem LS6500-Szintillationssystem (Beckman) bestimmt.
Extraktion und Analyse der Lipide:
Gesamtlipide wurden mit Chloroform/Methanol extrahiert und Fettsäuren unter Verwendung von BF₃ in Methanol methyliert und mittels HPLC analysiert, wie in Beispiel 6 beschrieben. Alternativ werden die Fettsäuremethylester durch Kapillarsäulen-Gaschromatographie (GC) analysiert.
Ergebnisse:
Ein ähnlicher Prozentsatz von Radioaktivität aus [1-¹⁴C]-Dihomogammalinolensäure, die zu dem Inkubationsmedium hinzugefügt worden war, wurde in Sphäroplasten von Hefe wiedergefunden, welche entweder mit pYr5014.1 oder mit pTh5009.1 transformiert worden waren, die die Delta-5-Desaturase-Gene von Ratte bzw. Mensch enthalten (Beispiel 1). Allerdings waren Sphäroplasten, die aus mit pYr5014.1 transformierten Hefezellen hergestellt worden waren, in der Lage, 3,5 Mal mehr Arachidonsäure (20:4n-6) aus Dihomogammalinolensäure (20:3n-6) zu produzieren als diejenigen, die mit pTh5009.1 transformiert worden waren (Beispiel 1). Tabelle 3 Prozentsatz der Substratumwandlung und der in Sphäroplasten von mit pYr5014.1 oder mit pTh5009.1 transformierter Saccharomyces cerevisiae 2 Std. nach der Inkubation mit [1-¹⁴C]-Dihomogammalinolensäure wiedergefundenen Radioaktivität
Werte sind der Mittelwert ± SA von drei Bestimmungen. OD₆₀₀ 2,5-3,5.
Die Genexpression wurde in Hefe 16 Std. vor der Inkubation mit 20:3n-6 induziert.
Schlussfolgerung:
Unter diesen experimentellen Bedingungen sind Sphäroplasten von mit pYr5014.1 oder mit pTh5009.1 transformierter Saccharomyces cerevisiae in der Lage, Dihomogammalinolensäure innerhalb von 2 Std. Inkubation mit der Fettsäure zu einem beträchtlichen Nachweisgrad zu desaturieren.
Beispiel 9 – Nachweis von menschlicher Delta-5-Desaturase in Saccharomyces cerevisiae (Referenzbeispiel)
Wachstum und Induktion der Expression:
Man ließ Hefezellen unter selektivem Druck in SC-U + 2% Raffinose bei 30°C in einem Schüttelinkubator wachsen, wobei eine Standardprozedur (Invitrogen) verwendet wurde. Es wurde eine Übernacht-Vorkultur von jeder der transformierten Hefezellen hergestellt und Aliquote wurden entnommen, um ein größeres Volumen anzuimpfen, welches für das Experiment eingesetzt wurde. Bei Erreichen einer optischen Dichte (OD₆₀₀ = 0,4-1,0) wurden die Zellen aufgeteilt und bei 2060 × g für 5 Min. geerntet. Ein Teil wurde bei –20°C eingefroren gelagert und als Induktionszeit Null verwendet, während der zweite Teil in SC-U + 2% Galactose resuspendiert und bei 30°C in einem Orbitalschüttler bei 200 UpM inkubiert wurde. Es wurde eine Zeitkurve für die Proteininduktion des clonierten Gens bei 0, 4, 8, 24 Std. bestimmt, indem ein Aliquot der Zellen entnommen wurde, die man in der Gegenwart von Galactose hatte wachsen lassen, diese erntete und lagerte.
Es wurde dann eine Proteinextraktion von den Proben durchgeführt, indem ein Zellaufschluss-Puffer (50 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 1 mM EDTA, 5% Glycerin), wie von Invitrogen beschrieben, mit leichten Modifikationen verwendet wurde, um Sphäroplasten herzustellen. Die Zellen wurden mit Lyticase (Sigma), einem die Zellwand verdauenden Enzym, in einer Endkonzentration von 2 Einheiten/ml des Aufschlusspuffers behandelt, um Sphäroplasten zu bilden. Die Bildung von Sphäroplasten wurde mikroskopisch verfolgt. Die Zellen wurden von der Lyticase frei gewaschen, geerntet, gewogen und in einem entsprechenden Volumen Aufschlusspuffer mit 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid resuspendiert. Es wurde etwa ein halbes Volumen von mit Säure gewaschenen Glaskügelchen von ungefähr 0,5 mm Größe zugegeben und die Zellen wurden durch dreimaliges Verwirbeln in einem Kühlraum (30 Sek. Verwirbeln und 30 Sek. auf Eis) aufgebrochen. Der Protein-Rohextrakt wurde bei 700 × g für Min. gewonnen. Der Rohextrakt wurde für die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)-Analyse und das Western-Blot-Verfahren eingesetzt.
SDS-PAGE und Western-Blot-Verfahren:
Gleiche Mengen von Rohproteinextrakt wurden mit Probenauftragspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2% SDS, 10 mM DTT, 0,1% Bromphenolblau, 10% Glycerin) gemischt und bei 100°C für 5 Minuten gekocht. Die Proben, Molekulargewichtsstandards (Cruz Marker von Santa Cruz Biotechnology Inc.) und Kontrollen wurden auf ein vorgefertigtes 10% SDS-Polyacrylamidgel geladen, wobei eine Standardprozedur verwendet wurde (Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Die Proteinproben wurden bei einer konstanten Spannung von 100 V aufgetrennt, wobei Elektrophoresepuffer verwendet wurde. Nach der Elektrophorese wurde das Gel entweder mit Coomassie-Blau gefärbt, um das Vorhandensein von Protein zu bestimmen, oder das Protein wurde elektrophoretisch auf eine PVDF-Membran (BioRad) transferiert. Nach dem Transfer wurde die Membran mit einer Blockierungslösung blockiert und mit einer 1:10.000-Verdünnung von anti-V5-HRP-Antikörper, wie vom Hersteller (Invitrogen) beschrieben, inkubiert. Die Membran wurde gewaschen und die Meerrettichperoxidase-Reaktion wurde mit dem Enhanced Chemiluminescence-Reagenz ECL (Amersham Pharmacia Biotech) nachgewiesen. Die Membran wurde in einer Kassette für 1-20 Minuten gegenüber einem Hyperfilm-ECL-Film (Amersham) exponiert. Der Film wurde entwickelt und die Signale wurden mit einem Agfa DualScan 1200T (Agfa) gescannt. Die Quantifizierung wurde mit Hilfe eines Gel Doc 2000 (BioRad) vorgenommen.
Ergebnisse:
Tabelle 4 Zeitkurve der Proteinexpression der menschlichen Delta-5-Desaturase
Tabelle 4 zeigt den relativen Prozentsatz des mit einem Marker versehenen hD5D-Proteins (von pTh5009.1) in transformierten Hefezellen unter Galactose-Induktion während eines 24-stündigen Zeitverlaufs. Wie erwartet, ist das mit einem Marker versehene Enzym zum Zeitpunkt 0 nicht nachweisbar. Das Protein wird nach 4 Stunden nachgewiesen und reichert sich während 24 Stunden an. Das Kontrollplasmid (pYES2/CT) zeigte kein nachweisbares Protein (ND) während des Verlaufs des Experiments.
Beispiel 10 – Hemmung der Delta-5-Desaturase-Aktivität in ganzen Zellen und in Sphäroplasten von mit pYr5014.1 und pTh5009.1 transformierter Saccharomyces cerevisiae (Referenzbeispiel)
Pilze, Mikroalgen und Rattenleber-Mikrosomen sind in verschiedenen Laboratorien eingesetzt worden, um Inhibitoren der Fettsäure-Delta-5-Desaturase zu testen. Kawashima et al., Biosci. Biotech. Biochem. 60: 1672-1676 (1996) haben eine Vielzahl von Verbindungen wie z.B. Alkylester von Gallussäure, Sesamin, Episesamin, Sesaminol, Sesamolin, Diferuloylmethan, Nicardipin und Nifedipin, welche die Aktivität der Delta-5-Desaturase auf Dihomogammalinolensäure modulieren, beschrieben. Vor kurzem ist auch p-Isopentoxyanilin (Obukowicz et al., Biochem. Pharmacol. 55: 1045-1058 (1998)) verwendet worden, um Fettsäure-Delta-5-Desaturase in Mikrosomen aus Rattenleber zu hemmen.
3,4,5-Trihydroxybenzoesäurepropylester (n-Propylgallat) ist ein nicht kompetitiver Inhibitor von Fettsäure-Desaturasen (Kawashima et al., Biosci. Biotech. Biochem. 60: 1672-1676 (1996)), welcher gewöhnlich in Fetten und Ölen als Antioxidans zugefügt wird. Er wurde aufgrund seiner beträchtlichen inhibitorischen Wirkungen auf Delta-5-Desaturase und seiner hohen Löslichkeit in Wasser oder Ethanol für dieses Beispiel ausgewählt.
In dem vorliegenden Beispiel wird Saccharomyces cerevisiae, die Fettsäure-Delta-5-Desaturasen von Ratte oder Mensch enthält, als ein neues Modell für ein Screening nach Inhibitoren (oder Verstärkern) der Fettsäure-Delta-5-Desaturase von Säugern verwendet. Rattenleber-Mikrosomen wurden eingesetzt, um diese Tests zu untermauern.
Chemikalien und Radiochemikalien:
Der Propylester von 3,4,5-Trihydroxybenzoesäure-(n-Propylgallat) und andere Chemikalien, die für die Herstellung von Sphäroplasten benötigt wurden, wurden, wie zuvor in Beispiel 8 beschrieben, von Sigma-Aldrich Canada bezogen. [1-¹⁴C]-Dihomogammalinolensäure (DGLA, 99% radiochemische Reinheit); spezifische Aktivität: 52 μCi/μMol) wurde von NEN gekauft. Diese Fettsäure wurde mit KOH (0,1 M) verseift und in SC-U-Medium mit 1% Tergit aufgelöst.
Herstellung von Sphäroplasten:
Kulturen von Saccharomyces cerevisiae, die entweder mit pYr5014.1 oder mit pTh5009.1 transformiert worden waren, ließ man in SC-U-Medium mit 1% Raffinose und 2% Galactose wachsen, um die Expression des Gens zu induzieren, das die Fettsäure-Delta-5-Desaturase codiert. Nach 16 Std. Inkubation wurden die Sphäroplasten, wie zuvor in Beispiel 8 beschrieben, hergestellt.
Inkubation der Sphäroplasten:
Sphäroplasten wurden durch Zentrifugation bei 2060 × g für 5 Min. bei 4°C geerntet und einmal mit 1,2 M Sorbit gewaschen. Die Sphäroplasten wurden in SC-U-Medium mit 1% Tergitol, 1,2 M Sorbit und 2% Galactose resuspendiert, um die Induktionsbedingungen aufrechtzuerhalten und um einen OD₆₀₀-Messwert von ungefähr 2,5 bis 3,0 zu ergeben. Ein Aliquot von 10 ml der Sphäroplasten-Suspension wurde in 125 ml-Erlenmeyerkolben transferiert und mit 200 μl n-Propylgallat in Ethanol (die Endkonzentration in der Kultur lag in einem Bereich von 0,25 bis 8,00 mM) bei 30°C in einem Orbitalinkubator bei 270 UpM inkubiert. Nach 30 Min. Inkubation wurde 1 μCi [1-¹⁴C]-Dihomogammalinolensäure zu den Kulturen in einer Endkonzentration von 2 μM zugegeben und weiter für 120 Min. inkubiert. An diesem Zeitpunkt wurden Trübungsmessungen bei OD₆₀₀ durchgeführt, die Sphäroplasten wurden durch Zentrifugation geerntet und mit Tris-HCl-Puffer (100 mM, pH 8,0) gewaschen, der 0,1% BSA enthielt. Gesamtlipide wurden, wie in Beispiel 8 beschrieben, extrahiert und analysiert.
Inkubation von ganzer Hefe:
Mit pYr5014.1 oder mit pTh5009.1 transformierte Saccharomyces cerevisiae wurden in einem 125 ml-Erlenmeyerkolben inkubiert, der 9 ml SC-U-Medium mit 1% Tergit (O.D. 0,4, ungefähr 3,2 × 10⁶ Zellen/ml) und 200 μl n-Propylgallat in Ethanol (die Endkonzentration in der Kultur lag in einem Bereich von 1,7 bis 14,0 mM) enthielt. Nach 1 Std. Inkubation in einem Orbitalinkubator bei 270 UpM und 30°C wurde 1 μCi des Kaliumsalzes von (1-¹⁴C]-Dihomogammalinolensäure (aufgelöst in SC-U-Medium und 1% Tergit) zu der Zellsuspension in einer Endkonzentration von 2 μM zugegeben. Nach 5 Std. Inkubation mit dem Inhibitor erreichten die Zellen die Log-Phase und die Expression des Transgens wurde durch Zugabe von 1 ml Galactose zu einer Endkonzentration von 2% induziert. Die Hefe wurde weiter für 19 Std. inkubiert (OD₆₀₀ – Bereich: 5-10), bis sie durch Zentrifugation bei 5000 × g für 10 Min. bei 4°C geerntet wurde. Die Zellen wurden mit Tris-HCl – Puffer (100 mM, pH 8,0) gewaschen, der 0,1% BSA enthielt, und Gesamtlipide wurden, wie in Beispiel 6 beschrieben, extrahiert und analysiert.
Berechnungen:
Die Delta-5-Desaturase-Aktivität wurde bestimmt, indem die Umwandlung von radioaktiv markierter Dihomogammalinolensäure zu Arachidonsäure (20:3n-6 zu 20:4n-6) gemessen wurde. Die prozentuale Inhibition wurde, wie anderswo beschrieben, berechnet (Kawashima et al., Biosci. Biotech. Biochem. 60: 1672-1676 (1996)):
% Inhibition = 100 (Aktivität ohne den Inhibitor – Aktivität mit dem Inhibitor)/Aktivität ohne den Inhibitor
Ergebnisse:
Die Umwandlung von Dihomogammalinolensäure zu Arachidonsäure (20:3n-6 zu 20:4n-6) in Sphäroplasten aus Saccharomyces cerevisiae, die mit den Plasmiden transformiert worden ist, welche die Delta-5-Desaturase codieren, wurde von n-Propylgallat bei den in den Tabellen 4 und 5 gezeigten Konzentrationen gehemmt. Die konsistenten OD₆₀₀-Messwerte (d.h. die konstante Zellzahl) und die ähnlichen Mengen an Radioaktivität, die in den Zellen bei Konzentrationen von n-Propylgallat zwischen 0,7-4,0 mM wiedergefunden werden, weisen darauf hin, dass der Inhibitor nicht die Aufnahme des Substrats beeinflusste und dass er nicht cytotoxisch war. Allerdings war die Zellzahl bei Konzentrationen > 4,0 mM leicht vermindert und die in diesen Zellen wiedergefundene Radioaktivität von dem Fettsäuresubstrat war erheblich vermindert, was zeigt, dass diese Konzentrationen für Sphäroplasten toxisch sein können. Tabelle 5 Hemmung der menschlichen Delta-5-Desaturase in Sphäroplasten von Saccharomyces cerevisiae, die mit pTh5009.1 transformiert sind und mit [1-¹⁴C]-Dihomogammalinolensäure und n-Propylgallat inkubiert werden
Werte sind der Mittelwert von drei Bestimmungen Tabelle 6 Hemmung der Ratten-Delta-5-Desaturase in Sphäroplasten von Saccharomyces cerevisiae, die mit pYr5014.1 transformiert sind und mit [1-¹⁴C]-Dihomogammalinolensäure und n-Propylgallat inkubiert werden
Werte sind der Mittelwert von drei Bestimmungen
Die Induktion der Desaturase-Genexpression für 16 Std. vor der Zugabe des Inhibitors gewährleistete, dass die beobachtete Verringerung der Substratumwandlung nicht auf eine Hemmung der Transkription oder der Translation der Gene zurückzuführen war.
Die hemmende Wirkung von n-Propylgallat wurde auch in der ganzen Hefe nachgewiesen, in welcher das Desaturase-Gen nach der Zugabe des Inhibitors induziert wurde (Tabellen 7 und 8). Tabelle 7 Hemmung der menschlichen Delta-5-Desaturase in ganzen Zellen von Saccharomyces cerevisiae, die mit pTh5009.1 transformiert sind und mit [1-¹⁴C]-Dihomogammalinolensäure und n-Propylgallat inkubiert werden
Werte sind der Mittelwert von drei Bestimmungen Tabelle 8 Hemmung der Ratten-Delta-5-Desaturase in ganzen Zellen von Saccharomyces cerevisiae, die mit pYr5014.1 transformiert sind und mit [1-¹⁴C]-Dihomogammalinolensäure und n-Propylgallat inkubiert werden
Werte sind der Mittelwert von drei Bestimmungen
Schlussfolgerungen:
Hefe-Sphäroplasten, welche Delta-5-Desaturasen enthalten, sollten als das Modell der Wahl für Desaturase-Tests betrachtet werden, weil geringere Konzentrationen von Inhibitoren (als jene, die bei der ganzen Hefe verwendet werden) erforderlich sind, um nachweisbare Veränderungen in der Enzymaktivität zu erhalten. In diesem Modell sind die Löslichkeitsbeschränkungen des Inhibitors vermindert. Darüber hinaus ist die Aufnahme von Desaturase-Substraten höher als in ganzer Hefe, was dabei hilft, die Nachweisgrenze zu erhöhen (Tabellen 2-5). Diese Tests sollten unter Verwendung von Konzentrationen des Inhibitors durchgeführt werden, die unterhalb der cytotoxischen Werte liegen. Die Stärke dieses neuen Modells für das Arzneistoff-Screening unter Verwendung von Säuger-Desaturasen in Hefe wird durch Ergebnisse unterstützt, die man mit dem herkömmlichen Verfahren von Rattenlebermikrosomen erhalten hat (siehe Beispiel 13).
Zusammengefasst lässt sich sagen, dass Sphäroplasten von Saccharomyces cerevisiae, die Delta-5-Desaturasen von Säugern enthalten, für das Screening von Inhibitoren und Verstärkern der Enzyme nützlich sind.
Obgleich Ausführungsformen der Erfindung zum Zweck der Veranschaulichung offenbart worden sind, ist es ersichtlich, dass Variationen oder Modifikationen des offenbarten Systems innerhalb des Geltungsbereichs der vorliegenden Ausführungsformen liegen.
Beispiel 11 – Screening von Delta-5-Desaturase-Modulatoren mit Hilfe von Mikrosomen aus Saccharomyces cerevisiae, die menschliche Desaturasen oder Säuger-Desaturasen enthalten (Referenzbeispiel)
Zubereitung von Hefe-Mikrosomen:
Zwei bis 5 l von mit pYr5014.1 oder pTh5009.1 transformierten Saccharomyces cerevisiae werden mit einer Zelldichte von etwa 3,2 × 10⁵ Zellen/ml (OD₆₀₀ 0,4) unter Verwendung von SC-U-Medium gestartet. Nach 8 Std. Inkubation bei 30°C auf einem Orbitalinkubator bei 270 UpM wird Galactose in einer Endkonzentration von 2% zugegeben. Die Hefe wird weiter für 12 Std. inkubiert, durch Zentrifugation bei 2060 × g für 10 Minuten bei 4°C geerntet und mit Wasser gewaschen. Das Zellpellet wird in 1/3 seines Volumens in Isolierungspuffer resuspendiert, der 80 mM Hepes-KOH (pH 7,2) und 10 mM KCl und 320 mM Saccharose, 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und eine EDTA-freie Tablette eines Proteaseinhibitor-Cocktails (1 Tablette pro 10 g Zellpellet; Complete, Roche, Deutschland) enthält. Die Zellsuspension wird in einen Mörser geschüttet, der flüssigen N₂ enthält, und mit Sand unter Verwendung eines Keramik-Pistills vermahlen. Das Hefepulver wird in ein konisches Reaktionsröhrchen transferiert, zu welchem Isolierungspuffer hinzugegeben wird (2/3 des Pelletvolumens). Der Sand wird durch Zentrifugationen bei 57 × g für 1 Min. entfernt und die Suspension wird weiter für 20 Min. bei 10.000 × g zentrifugiert, um Zelltrümmer, Kerne und Mitochondrien abzutrennen. Der Überstand wird dann für 1 Std. bei 106.000 × g zentrifugiert, um das Mikrosomenpellet zu erhalten, welches in 700 μl Isolierungspuffer resuspendiert wird. Man misst die Proteinkonzentration der Mikrosomensuspension mit einer beliebigen auf dem Fachgebiet bekannten Methode.
Inkubation von Delta-5-Desaturase-Modulatoren mit Hefe-Mikrosomen:
Die Aktivität der Delta-5-Desaturase wird bestimmt, indem man die Umwandlung von [1-¹⁴C] 20:3n-6 (Dihomogammalinolensäure) zu [1-¹⁴C] 20:4n-6 (Arachidonsäure) misst. Die Reaktionen werden gestartet, indem man 500 μg mikrosomales Protein von Hefe zu vorinkubierten Röhrchen hinzugibt, welche 0,20 μCi des Fettsäure-Substrats in einer Endkonzentration von 33 μM in 0,25 ml der Inkubationslösung enthalten, die 80 mM Hepes-KOH (pH 7,2) und 43,2 mM MgCl₂, ATP (1,0 mM), NADH (500 μM) und Coenzym A (10 μM) sowie eine Reihe von Konzentrationen der Enzymmodulatoren enthält. Die Röhrchen werden heftig verwirbelt und die Reaktionen werden nach 15-minütiger Inkubation in einem Schüttelwasserbad (37°C) durch Zugabe von 2 ml von 10% (Gew./Vol.) KOH in Ethanol gestoppt. Die Lipide in dem Inkubationsgemisch werden für 45 Min. bei 80°C unter N₂ verseift. Man lässt die Proben für 5 Min. auf Eis stehen und säuert sie dann mit HCl an. Die Fettsäuren werden mit Hexan extrahiert und mit BF₃/Methanol für 30 Min. bei 90°C verestert. Die Fettsäuremethylester, das Substrat und das Produkt der enzymatischen Reaktion werden mittels HPLC, wie in Beispiel 6 beschrieben, untersucht. Die Ergebnisse sind in pMol Arachidonsäure ausgedrückt, die pro mg mikrosomales Protein pro Minute hergestellt werden. Alternativ werden die Fettsäuremethylester durch Kapillarsäulen- Gaschromatographie (GC) analysiert.
Beispiel 12 – Screening von Delta-5-Desaturase-Modulatoren unter Verwendung von aufgereinigten Enzymen, welche aus Saccharomyces cerevisiae gewonnen werden, die menschliche Desaturasen oder Säuger-Desaturasen exprimieren
(Referenzbeispiel)
Isolierung der Delta-5-Desaturase aus Hefe-Mikrosomen:
Hefe-Mikrosomen, die Delta-5-Desaturase enthalten, welche mit einem 6×His-Marker versehen ist, werden mit Zwittergent 3-14 oder mit Gemischen von Desoxycholat/Triton X-100 (2%, Gew./Gew.) für 2 Std. bei 4°C gerührt, um die Delta-5-Desaturase zu solubilisieren. Alternativ können Hefe-Mikrosomen mit 2,5% (Vol./Vol.) Wasser in Aceton behandelt werden, um die Solubilisierungsstärke der Detergenzien zu verbessern. Das Gemisch wird für 1 Std. bei 106.000 × g zentrifugiert. Der das Enzym enthaltende Überstand wird auf eine vor-äquilibrierte Chelat-bildende HiTrap-Säule (mit Ni⁺⁺ beladenes Iminodiacetat), (Pharmacia) geladen, die an ein Fast Protein-Flüssigchromatographie-System (Pharmacia) angeschlossen ist. Die Säule wird mit 50 mM Natriumphosphat (pH 8,0) gewaschen. Das mit einem Marker versehene Protein wird mit Natriumphosphat-Puffer eluiert, der Imidazol (0-500 mM) enthält, und durch Ultrafiltration unter Verwendung von Centriprep-Konzentratoren (Amicon, MA) aufkonzentriert.
Inkubation der Delta-5-Desaturase-Modulatoren mit aufgereinigtem Enzym:
Das konzentrierte Enzym wird bei 30-37°C in Tris-HCl-Puffer (pH 7,2) inkubiert, der 1 mM NADH, 80 μM Cytochrom b₅, 4 μM NADH-Cytochrom b₅-Reduktase, 6 mM Ei-Phosphatidylcholin, 2% Triton X-100, 0,4% Natrium-desoxycholat, radioaktiv markiertes Dihomogammalinolenyl-CoA als Enzymsubstrat sowie eine Reihe von Konzentrationen von jedem Enzymmodulator enthält. Nach 15-90 Min. Inkubation wird die Reaktion gestoppt und Fettsäuren, Substrat und Produkt der enzymatischen Reaktion werden, wie in Beispiel 6 beschrieben, analysiert.
Alternativ können die Enzymaktivität und die Wirkung von Modulatoren der Enzymaktivität über die Rate der NADH-Oxidation in Gegenwart und in Abwesenheit von Dihomogammalinolenyl-CoA gemessen werden.
Beispiel 13 – Validierung der in den Beispielen 9 bis 11 beschriebenen Tests mit Hilfe von Rattenleber-Mikrosomen (Referenzbeispiel)
Herstellung von Rattenleber-Mikrosomen:
Wistar-Ratten unter einer leichten Halothan (15% in Mineralöl)-Anästhesie wurden durch Ausbluten während Zeiten von hoher Enzymaktivität geopfert. Die Leberorgane wurden unmittelbar mit kalter 0,9% NaCl-Lösung gespült, gewogen und mit Scheren zerkleinert. Alle Prozeduren werden, soweit nicht anders angegeben, bei 4°C durchgeführt. Die Leberorgane werden in einer Lösung (1:3 Gew./Vol.) homogenisiert, die 0,25 M Saccharose, 62 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0), 0,15 M KCl, 1,5 mM N-Acetylcystein, 5 mM MgCl₂ und 0,1 mM EDTA enthielt, wobei 4 Stöße eines Potter-Elvehjem-Gewebehomogenisators eingesetzt werden. Das Homogenat wird für 20 Min. bei 10.400 × g zentrifugiert, um Mitochondrien und Zelltrümmer zu beseitigen. Der Überstand wird durch ein dreilagiges Seihtuch gefiltert und für 60 Min. bei 105.000 × g zentrifugiert. Das mikrosomale Pellet wird mit einem kleinen Glas-Teflon-Homogenisator in derselben Homogenisierungslösung sanft resuspendiert und bei –70°C gelagert. Die Abwesenheit einer Kontamination mit Mitochondrien wird enzymatisch getestet. Die Proteinkonzentration wird mit Hilfe von Rinderserumalbumin als Standard gemessen.
Inkubation von Rattenleber-Mikrosomen mit Delta-5-Desaturase-Modulatoren:
Die Reaktionen werden durch Zugabe von 2 mg mikrosomalem Protein zu vorinkubierten Röhrchen gestartet, die 0,20 μCi des Fettsäuresubstrats (DGLA) in einer Endkonzentration von 33,3 μM in 1,5 ml des Homogenisierungslösung enthalten, welche NaF (42 mM), Niacinamid (0,33 mM), ATP (1,57 mM), NADH (1,0 mM), Coenzym A (0,09 mM) und eine Reihe von Konzentrationen der Enzymmodulatoren enthält. N-Propylgallat wurde zu dem Inkubationsmedium in einer Endkonzentration von 0,02-0,32 mM hinzugefügt. Die Röhrchen werden heftig verwirbelt und die Reaktionen werden nach 15-minütiger Inkubation in einem Schüttelwasserbad (37°C) gestoppt und die Fettsäuren analysiert, wie in Beispiel 6 beschrieben. Alternativ werden die Fettsäuremethylester durch Kapillarsäulen-Gaschromatographie (GC) analysiert.
Tabelle 11 zeigt die in vitro-Hemmung von Delta-5-Desaturase mit verschiedenen Konzentrationen von N-Propylgallat in Rattenleber-Mikrosomen. Ein Plateau wurde bei einer Konzentration des Inhibitors in einem Bereich von 0,08-0,32 mM erreicht. Tabelle 9 Inhibition der Delta-5-Desaturase-Aktivität in Rattenleber-Mikrosomen, welche mit [1-¹⁴C]-Dihomogammalinolensäure und N-Propylgallat inkubiert werden
Die Werte sind die Mittelwerte von drei Bestimmungen. Enzymaktivität ohne Inhibitor: 394 pMol/mg mikrosomales Protein/Min.
Beispiel 14 – Screening von Delta-5- und Delta-6-Desaturase-Modulatoren unter Verwendung von ganzen Zellen, Sphäroplasten oder Mikrosomen von Saccharomyces cerevisiae, die Delta-5- oder Delta-6-Desaturasen von Mensch oder von Säugern enthalten (Referenzbeispiel)
Dieses Verfahren eignet sich für das gleichzeitige Arzneistoff-Screening beider Fettsäure-Desaturasen unter denselben experimentellen Bedingungen. Die Spezifität jedes Arzneistoffs für jedes Enzym lässt sich durch dieses Verfahren schnell bestimmen.
Co-Expression von Delta-5- und Delta-6-Desaturasen von Mensch oder von Säugern in Hefe:
Delta-6- und Delta-5-Desaturase-Gene werden in zwei separate Hefe-Vektoren cloniert (konstitutiv oder induzierbar), die unterschiedliche Nährstoff-Selek tionsmarker aufweisen, zum Beispiel URA3- und LEU2-Gene, welche Uracil- und Leucin-Prototrophie für die Selektion in Hefe übertragen. Ein Hefestamm, der einen auxotrophen Bedarf für Uracil und Leucin aufweist, wird mit den zwei Plasmiden transformiert. Hefezellen, welche die Plasmide enthalten, werden auf synthetischem Minimalmedium selektiert, dem sowohl Uracil als auch Leucin fehlt. Die Aktivität der zwei Desaturasen wird dann getestet und für das Screening von Modulatoren verwendet.
Alternativ werden bi-direktionale Hefe-Vektoren, zum Beispiel die pBEVY-Plasmide (Miller et al., Nucl. Acids Res. 26: 3577-3583 (1998)) dazu verwendet, die Desaturase-Gene zu co-exprimieren. Die pBEVY-Plasmide sorgen entweder für eine konstitutive oder für eine Galactose-induzierte Expression exogener Gene.
Die Fettsäure-Desaturase-Gene werden stromabwärts von dem konstitutiven Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GPD)- bzw. dem Alkoholdehydrogenase 1 (ADH1)-Promotor cloniert, wobei Methoden eingesetzt werden, die Fachleuten bekannt sind. Alternativ werden die Gene auf beiden Seiten des bi-direktionalen, Galactose-induzierbaren Promotors GAL1/GAL10 cloniert. Ein geeigneter Hefestamm (der für einen Nährstoff-Bedarf wie z.B. für Uracil auxotroph ist) wird mit Desaturase-Konstrukten transformiert (die z.B. Uracil-Prototrophie übertragen). Solche Hefe-Transformanten werden in SC-U-Medium selektiert. Die durch Selektion gewonnenen Transformanten lässt man auf zweckdienlichen Medien wachsen, um eine konstitutive oder induzierbare Expression der zwei Proteine zu ermöglichen.
Das vorliegende Verfahren verwendet bi-direktionale Vektoren, die Fettsäure-Delta-5- und Delta-6-Desaturasen von Säugern exprimieren, um gleichzeitig nach einzigartigen Modulatoren von beiden oder einer der beiden Aktivitäten zu screenen, die therapeutische, diagnostische oder Ernährungsfunktion haben können.
Ganze Hefe oder Sphäroplasten:
Der enzymatische Test mit Modulatoren von beiden Enzymen ist ähnlich jenem, der vorstehend beschrieben worden ist (Beispiel 10). In diesem Modell werden die radioaktiv markierten Substrate für Delta-6- und Delta-5- Desaturasen, Alpha-Linolensäure (18:3n-3) bzw. DGLA (20:3n-6), beide zu dem Inkubationsmedium hinzugegeben. Nach 2-19 Std. Inkubation werden die übrig gebliebenen radioaktiv markierten Substrate und Produkte (Stearidonsäure, 18:4n-3 bzw. Arachidonsäure, 20:4n-6) der enzymatischen Reaktion, wie in Beispiel 6 beschrieben, mittels HPLC analysiert. Alternativ werden die Fettsäuremethylester durch Kapillarsäulen-Gaschromatographie (GC) analysiert.
Mikrosomen:
Mikrosomen von Hefe, die menschliche Delta-6- und Delta-5-Desaturasen oder sowohl Delta-6- als auch Delta-5-Desaturasen von Säugern (z.B. Ratten) enthält, erhält man, wie zuvor beschrieben (Beispiel 11). Die Inkubation ist ähnlich derjenigen, die für die Mikrosomen eingesetzt wurde, die nur eine menschliche Desaturase oder eine Säuger-Desaturase enthalten, mit der Ausnahme, dass radioaktiv markierte Alpha-Linolensäure (18:3n-3) und DGLA (20:3n-6)-Substrate für Delta-5- bzw. für Delta-6-Desaturasen beide zusammen mit einer Reihe von verschiedenen Konzentrationen von Desaturase-Modulatoren zu dem Inkubationsmedium hinzugegeben werden. Die Produkte der enzymatischen Reaktion werden, wie in Beispiel 6 beschrieben, mittels HPLC analysiert. Alternativ werden die Fettsäuremethylester durch Kapillarsäulen-Gaschromatographie (GC) analysiert.
Beispiel 15 – Erzeugung von polyclonalen Antikörpern gegen das zur Debatte stehende Polynucleotid (Referenzbeispiel)
Abschnitte der codierenden Sequenz des zur Debatte stehenden Polynucleotids werden als Fusionsprotein in E. coli exprimiert. Das überexprimierte Protein wird durch Gelelution aufgereinigt und dazu verwendet, Kaninchen und Mäuse zu immunisieren, wobei ein Verfahren verwendet wird, das ähnlich demjenigen ist, das von Harlow, E. und Lane, D. (Hrsg.), 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York beschrieben worden ist. Es ist gezeigt worden, dass dieses Verfahren Antikörper gegen verschiedene andere Proteine erzeugt (Kraemer et al., J. Lipid Res. 34: 663-671 (1993)).
In Kürze, ein Stück der codierenden Sequenz, welche von dem zur Debatte stehenden Polynucleotid ausgewählt worden ist, wird als ein Fusionsprotein in dem Plasmid pET5A (Novagen, Inc., Madison, WI) cloniert. Nach Induktion mit IPTG wird die Überexpression des Fusionsproteins mit dem erwarteten Molekulargewicht durch SDS-PAGE überprüft. Das Fusionsprotein wird durch Elektroelution aus dem Gel aufgereinigt. Die Identifizierung des Proteins als dem zur Debatte stehenden Polypeptid-Fusionsprodukt wird durch Proteinsequenzierung am N-Terminus überprüft. Als nächstes wird das aufgereinigte Protein als Immunogen in Kaninchen eingesetzt. Die Kaninchen werden mit 100 μg des Proteins in komplettem Freundschem Adjuvans immunisiert und es erfolgt zweimal in dreiwöchentlichem Abstand eine Auffrischung, zuerst mit 100 μg des Immunogens in inkomplettem Freundschem Adjuvans, gefolgt von 100 μg des Immunogens in PBS. Antikörper-enthaltendes Serum wird zwei Wochen danach entnommen.
Dieses Verfahren wird wiederholt, um Antikörper gegen die mutierten Formen des zur Debatte stehenden Polypeptids zu erzeugen. Diese Antikörper, in Verbindung mit Antikörpern gegen das zur Debatte stehende Wildtyp-Polypeptid, werden dazu verwendet, das Vorhandensein und die relative Menge der mutierten Formen in verschiedenen Geweben und biologischen Flüssigkeiten nachzuweisen.
Beispiel 16 – Erzeugung von monoclonalen Antikörpern, die spezifisch für das zur Debatte stehende Polypeptid sind (Referenzbeispiel)
Monoclonale Antikörper werden nach dem folgenden Protokoll erzeugt. Mäuse werden mit Immunogen immunisiert, umfassend das intakte zur Debatte stehende Polypeptid oder dessen Peptide (Wildtyp oder mutiert), die unter Verwendung von Glutaraldehyd oder EDC, wie es wohlbekannt ist, an das KLH („keyhole limpet hemocyanin") konjugiert worden sind.
Das Immunogen wird mit einem Adjuvans gemischt. Jede Maus erhält vier Injektionen von 10 bis 100 μg des Immunogens, und nach der vierten Injektion werden den Mäusen Blutproben entnommen, um festzustellen, ob das Serum Antikörper gegen das Immunogen enthält. Der Serumtiter wird über ELISA oder RIA bestimmt. Mäuse mit Seren, die auf das Vorhandensein von Antikörper gegen das Immunogen hinweisen, werden für die Hybridomerzeugung ausgewählt.
Den immunen Mäusen wird die Milz entnommen und es wird eine Einzelzellsuspension hergestellt (Harlow, E. und Lane, D. (Hrsg.), 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York). Zellfusionen werden, im Wesentlichen wie von Köhler, G. und Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975) beschrieben, durchgeführt. In Kürze, P3.65.3-Myelomzellen (American Type Culture Collection, Rockville, MD) werden mit immunen Milzzellen fusioniert, indem Polyethylenglycol, wie von Harlow, E. und Lane, D. (Hrsg.), 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York beschrieben, verwendet wird. Die Zellen werden in einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen/Vertiefung in Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen ausplattiert. Einzelne Vertiefungen werden auf Wachstum untersucht und die Überstände von Vertiefungen mit Wachstum werden mit Hilfe von ELISA oder RIA auf das Vorhandensein spezifischer Antikörper gegen das zur Debatte stehende Polypeptid getestet, wobei Wildtyp- oder mutiertes Zielprotein verwendet wird. Zellen in positiven Vertiefungen werden expandiert und subcloniert, um die Monoclonalität zu etablieren und zu bestätigen.
Clone mit den gewünschten Eigenschaften werden expandiert und als Ascites in Mäusen oder in einem Hohlfaser-System wachsen gelassen, um genügende Mengen an Antikörper für die Charakterisierung und die Testentwicklung zu produzieren.
Beispiel 17 – Sandwich-Test für das zur Debatte stehende Polypeptid (Referenzbeispiel)
Ein monoclonaler Antikörper wird an eine feste Oberfläche wie z.B. eine Platte, ein Röhrchen, ein Kügelchen oder ein Partikel gebunden. Bevorzugt wird der Antikörper an die Oberfläche der Vertiefung einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen gebunden. 100 μl einer Probe (z.B. Serum, Urin, Gewebecytosol), welche das zur Debatte stehende Polypeptid/Protein (Wildtyp oder mutiert) enthält, wird zu dem Antikörper an der Festphase hinzugefügt. Die Probe wird für 2 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Als nächstes wird die Probenflüssigkeit abgeschüttet und die Festphase wird mit Puffer gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen. 100 μl von einem zweiten monoclonalen Antikörper (gegen eine unterschiedliche Determinante auf dem zur Debatte stehenden Polypeptid/Protein) wird zu der Festphase hinzugegeben. Dieser Antikörper ist mit einem Detektormolekül (z.B. ¹²⁵I, einem Enzym, einem Fluorophor oder einem Chromophor) markiert, und die Festphase mit dem zweiten Antikörper wird für 2 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Der zweite Antikörper wird abgeschüttet und die Festphase wird mit Puffer gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen.
Die Menge an gebundener Markierung, welche proportional zu der Menge des zur Debatte stehenden Polypeptids/Proteins ist, welches in der Probe vorliegt, wird quantifiziert. Es werden getrennte Tests durchgeführt, wobei monoclonale Antikörper verwendet werden, die spezifisch für das zur Debatte stehende Wildtyp-Polypeptid sind, ebenso wie monoclonale Antikörper, die spezifisch für jede der in dem zur Debatte stehenden Polypeptid identifizierten Mutationen sind.
LITERATURVERZEICHNIS

US-Patent Nr.3,817,837, June, 1974, Rubinstein et al.
US-Patent Nr. 3,850,752, Nov., 1974, Schuurs et al.
US-Patent Nr. 3,939,350, Feb., 1976, Kronick et al.
US-Patent Nr. 3,996,345, Dec., 1976 Ullman et al.
US-Patent Nr. 4,277,437, July, 1981, Maggio
US-Patent Nr. 4,275,149, June, 1981, Litman et al.
US-Patent Nr. 4,366,241, Dec., 1982, Tom et al.
US-Patent Nr. 4,816,567, Mar., 1989, Cabilly et al.
Internationale Patentanmeldung Nr. WO 88/04300, Juni, 1988, Cech et al.
Internationale Veröffentlichung des Patentzusammenarbeitsvertrags Nr. WO 93/05182, März, 1993, Bruice, T.W.
Aki et al., 1999, Boichem. Biophys. Res. Commun., 255:575-579
Altschul et al., 1990, J. Molec. Biol., 215:403-410
Anderson et al., 1998, Anticancer Res., 18:791-800
Arisaka et al., 1986, J. Paediatr. Gastroenterol. Nutr., 5:878-882
Ausubel et al., 1994-, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.
Been M.D. und Cech T.R., 1986, Cell, 47:207-216
Booyens et al., 1985, Med. Hypotheses, 18:53-64
Brenner et al., 1968, Am. J. Physiol., 215:63-70
Calder P.C., 1998, Braz. J. Med. Biol. Res., 4:467-490
Calviello et al., 1998, Int. J. Cancer, 75:699-705
Copsey D.N. und Delnatte S.Y.J., 1988, Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs, Stockton Press, New York.
Carillo H. und Lipman D., 1988, SIAM J. Applied Math., 48:1073
Chavali S.R. und Forse R.A., 1999, Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids, 48:347-352
Cho et al., 1999a, J. Biol. Chem., 274:471-477
Goding J.W., 1996, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 3. Auflage, Academic Press, New York
Gribskov M. und Devereux J., Hrsg., 1991, Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, New York
Griffin A.M. und Griffin H.G., Hrsg., 1994, Computer Analysis of Sequence Data, Part J. Humana Press, New Jersey
Guthrie C. und Fink G., 1991, Meth. Enzymol., 194
Hanahan et al., 1983, J. Mol. Biol., 166:557-580
Hansen A. E., 1933, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 31:1160-1161
Harbige L.S., 1998, Proc. Nutr. Soc., 4:555,562
Harlow E. und Lane D. (Hrsg.), 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Harbour Press, Cold
Haseloff J. und Gerlach W.L., 1988, Nature, 334:585-591
Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281
Izant J.G. und Weintaub H., 1984, Cell, 36:1007-1015
James et al., 2000, Am J. Clin. Nutr., 71:343S-348S
Jiang et al., 1995a, Cancer Res., 55:5043-5048
Jiang et al., 1995b, Br. J. Cancer, 71:744-752
Jiang et al., 1997, Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids, 56:307-316
Cho et al., 1999b, J. Biol Chem., 274:37335-37339
Coste et al., 1999, J. Nutr. Biochem., 10:411-420
Curtis et al., 2000, J. Biol. Chem. 275:721-724
Dang et al., 1989, Lipids, 24:882-889
Das U., 1995, Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids, 52:387-391
Daum et al., 1982, J. Biol. Chem., 257:13028-13033
de Antueno et al., 1994, Lipids, 29:327-331
Deutcher M., (Herausgeber), 1990, Guide to Protein Purification, Meth in Enzymol, 182
Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res., 12(1):387-395
Dobner P. und Engelmann B., 1998, Am. J. P?hysiol., 275:E777-E784
du Toit et al., 1994, Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty, 51:121-124
Faas F.H. und Carter W.J., 1980, Lipids, 15:953-961
Falconer et al., 1994, Br. J. Cancer, 69:826-832
Folch et al., 1957, J. Biol. Chem., 226:497-509
Fujiwara et al., 1983, Biochem. Biophys. Res. Commmun., 110:36-41
Fujiwara et al., 1984, Arch. Biochem. Biophys., 233:402-407
Gadek et al., 1999, Crit. Care Med. 27:1409-1420
Jiang et al., 1998a, Br. J. Cancer, 77:731-738
Jiang et al., 1998b, Biochem. Biophys. Res. Commun., 244:414-420
Jiang et al., 2000, Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids, 62:119-127
Johnston M., 1987, Microbiol. Rev., 51:458-476
Julu P., 1998, in Essential Fatty Acids and Eicosanoids, AOCS Press, III., U.S.A. S. 168-175
Kawashima et al., 1996, Biosci. Biotech. Biochem., 60:1672-1676
Keen et al., 1993, Diabetes Care, 16:8-15
Khan et al., 1995, Cell. Signal., 7:171-184
Köhler G. und Milstein C., 1975, Nature, 256:495-497
Kraemer et al., 1993, J. Lipid Res., 34:663-671
Lai et al., 1996, Br. J. Cancer, 74:1375-1383
Leonard et al., 2000, Biochem. J., 347:719-724
Lesk A.M., Hrsg., 1988, Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York
Lippiello et al., 1991, Metabolism 40:571-576
Llewellyn et al., 1987, J. Mol. Biol., 195:115-123
Lue et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7:3446-3451
Mack E.W., 1990, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 13. Auflage
Manku et al., 1984, Br. J. Dermatol., 110:643-680
Margolskee et al., 1988, Mol. Cell. Biol., 8:2837-2847
Marquardt et al., 2000, Genomics, 66:175-183
Mayser et al., 1998, J. Am. Acad. Dermatol. 38:539-547
McLaughlin et al., 1988, J. Virol., 62:1963-1973
Miller et al., 1998, Nucl. Acid Res., 26:3577-3583
Mimouni V. und Poisson J.P., 1992, Biochem. Biophys. Acta, 1123:296-302
Moss et. al., 1987, Annu. Rev. Immunol., 5:305-324
Navarro et al., 2000, J. Rheumatol., 27:298-303
Nishi et al., 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1490:106-108
Obukowicz et al., 1998, Biochem. Pharmacol., 55:1045-1058
Okano et al., 1988, EMBO J., 7:3407-3412
Orkin et al., 1988, Prog. Med. Genet., 7:130-142
Plumb et al., 1993, Br. J. Cancer, 67:728-733
Rasmussen et al., 1987, Meth. Enzymol., 139:642-654
Rosenberg et al., 1985, Nature, 313:703-706
Russo et al., 1997, Hypertension, 4:1058-1063
Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbour, N.Y.
Schatz G. und Kovac L., 1974, Meth. Enzymol., 31A:627-632
Seegers et al., 1997, Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids, 56:271-280
Smith D.W., Hrsg., 1993, Biocomputing: Informatics and Genome Project, Acdemic Press, New York
Takeda et al., 1993, Anticancer Res., 13:193-199
Tilvis R. S. und Miettinen T. A., 1985, J. Clin. Endocrinol. Metab., 61:741-745
Todd et al., 1999, Plant J., 17:119-130
van Doormaal et al., 1988, Diabetologia, 31:576-584
von Heijne G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, New York
Waldmann T.A., 1991, Science, 252:1657-1662
Watanabe T. und Kuroda Y., 1999, J. Med. Invest., 46:173-177
Weber et al., 1994, J. Nat. Cancer Inst., 86:638-639
Wigmore et al., 1997, Clin. Sci., 92; 215-221
Wright S und Burton J.L., 1982, Lancet, 2:1120-1122
Zaug et al., 1984, Science, 224:574-578
Zaug A.J. und Cech T.R., 1986, Science, 231:470-475
Zaug et al., 1986, Nature, 324:429-433

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nucleinsäure, bestehend aus einer DNA-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) der DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1; (b) einem Fragment der Sequenz von (a), welches mindestens 15 Nucleotide hat und welches in der Lage ist, die Transkription eines Gens zu regulieren; (c) einer DNA-Sequenz, welche zu mindestens 90% homolog zu der Sequenz von (a) ist und welche in der Lage ist, die Transkription eines Gens zu regulieren; (d) einer DNA-Sequenz, welche unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an die Sequenz von (a), (b) oder (c) hybridisiert, und welche in der Lage ist, die Transkription eines Gens zu regulieren; mit der Maßgabe, dass die DNA-Sequenz nicht die folgende DNA-Sequenz ist:
Nucleinsäure nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz eine Kontrollregion eines Gens der menschlichen Delta-5-Desaturase ist.
Rekombinantes Nucleinsäuremolekül, umfassend die Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 und ein Reportergen, wobei die Nucleinsäure eine Kontrollregion ist, welche transkriptionell mit dem Reportergen verbunden ist, um die Transkription des Reportergens effektiv zu initiieren, zu beenden oder zu regulieren.
Rekombinantes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 3, wobei das Reportergen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Luciferase, Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), beta-Galactosidase, plazentarer alkalischer Phosphatase, Glucuronid-Synthetase und Grün fluoreszierendem Protein (GFP).
Rekombinantes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 4, wobei das Reportergen Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) oder Luciferase ist.
Vektorkonstrukt, enthaltend das rekombinante Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei das Vektorkonstrukt in der Lage ist, das Reportergen zu exprimieren, um ein Reportergenprodukt zu erzeugen, welches nach dem Einführen des Vektorkonstrukts in eine geeignete Wirtszelle oder in ein geeignetes Wirtssystem nachgewiesen werden kann.
Wirtszelle oder Wirtssystem, transformiert oder transfiziert mit dem Vektorkonstrukt nach Anspruch 6.
Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei die Wirtszelle eine Säugerzelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 8, wobei die Säugerzelle eine menschliche Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 9, wobei die Säugerzelle von der menschlichen Krebszelllinie ZR-75-1 oder HepG2 stammt.
Verfahren zum Screenen eines Modulators, welcher in der Lage ist, die transkriptionelle Expression des Gens für das menschliche Delta-5-Desaturase-Enzyms zu modulieren oder zu regulieren, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Wirtssystems, enthaltend die Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, und ein Reportergen, welches funktionell mit der Nucleinsäure verknüpft ist, wobei die Nucleinsäure eine Kontrollregion ist, welche wirksam ist, ein Transkriptionsniveau des Reportergens zu initiieren, zu beenden oder zu regulieren; (b) Inkontaktbringen des Wirtssystems mit einer Testkomponente; (c) Auswerten des Transkriptionsniveaus des Reportergens, wobei eine messbare Differenz im Transkriptionsniveau des Reportergens in Gegenwart der Testkomponente verglichen mit einer Kontrolle unter identischen Bedingungen, aber in Abwesenheit der Testkomponente, ein Indikator für die Fähigkeit der Testkomponente ist, die Expression des Delta-5-Desaturase-Gens transkriptionell zu modulieren oder zu regulieren; und (d) Auswählen der Testkomponente, welche diese Fähigkeit besitzt, als Modulator.