JP2004512049A - 脂質代謝を調節する化合物をスクリーニングする方法 - Google Patents

Abstract

糖尿病性神経障害を始めとする脂質代謝異常に関係する疾患の治療に使用する、薬物活性な化合物の発見に有用な薬物スクリーニング検定が教示される。特に、δ−５−デサチュラーゼ遺伝子の制御領域が、デサチュラーゼ酵素の活性を調節するかまたはデサチュラーゼ遺伝子の発現レベルを調節する、ヌクレオチド、タンパク質、化合物および／または他の薬理作用物質を同定するのに役立つ薬物スクリーニング法の標的として教示される。デサチュラーゼ酵素と相互作用し、脂肪酸プロフィールを変化させる成分を検出するための細胞ベース検定および細胞ライセート検定が教示される。さらに、細胞ベース検定および細胞ライセート検定は、デサチュラーゼ遺伝子の発現を制御する機能的要素および調節要素を同定し、また、デサチュラーゼ遺伝子の転写活性を調節する成分をスクリーニングするために用いられる。ラットδ−５−デサチュラーゼの遺伝子も教示される。

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、脂質代謝に関与する脂肪酸デサチュラーゼ酵素の活性を抑制または促進し、かつ／またはデサチュラーゼ遺伝子の発現レベルを効果的に調節する、ヌクレオチド、タンパク質、化合物および／または薬理作用物質の同定に関する。
【０００２】
（発明の背景）
糖尿病は、そのうちの１つがインスリン欠乏またはインスリン抵抗性に関連する脂質代謝の変化である、遺伝により決定される疾患の集合を表す。糖尿病は、特定の長期間の合併症になりやすい。医学的問題の範囲としては、心血管疾患、網膜症、腎症および神経障害などがある。後者の状態は、運動および感覚神経における神経伝導速度の低下をもたらす末梢神経系の神経病理学的障害である。糖尿病性末梢神経障害は、必須脂肪酸の異常な代謝と連結していると思われる（ジュル　ピー（Ｊｕｌｕ　Ｐ．）、１９９８年、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄｓ　ａｎｄ　Ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄｓ、ＡＯＣＳプレス（ＡＯＣＳ　Ｐｒｅｓｓ）、米国イリノイ州、１６８〜１７５ページ）。この脂質代謝の異常または変化は、膜リン脂質におけるｎ−６脂肪酸の取込みの欠如に反映されている（コステら（Ｃｏｓｔｅ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９９年、Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１０巻、４１１〜４２０ページ）。動物における実験的糖尿病試験からの証拠は、不飽和化および伸長システムによる多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡｓ）の生合成が阻害されることを示している。スコティアファーマシューティカルズ（Ｓｃｏｔｉａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（英国）社により支援された多施設共同臨床試験で、軽度糖尿病性神経障害を有する患者へのγ−リノレン酸（ＧＬＡ）のようなｎ−６脂肪酸の供給により疾患の経過が改善することが示された（キーンら（Ｋｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｅ、第１６巻、８〜１５ページ）。
【０００３】
ＰＵＦＡｓはまた、細胞周期停止、アポトーシスの誘導、有糸分裂（シーガーズら（Ｓｅｅｇｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｓ　Ｌｅｕｋｏｔ．Ｅｓｓｅｎｔ．Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄｓ．第５６巻、２７１〜２８０ページおよびレイら（Ｌａｉ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９６年、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、第７４巻、１３７５〜１３８３ページ）および細胞増殖（カルビエロら（Ｃａｌｖｉｅｌｌｏ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９８年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、第７５巻、６９９〜７０５ページ）の阻害、腫瘍内皮接着の減少、内皮のギャップ結合の連絡の改善（ジアンら（Ｊｉａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．）、１９７７年、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ　Ｌｅｕｋｏｔ．Ｅｓｓｅｎｔ．Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄｓ、第５６巻、３０７〜３１６ページ）、ウロキナーゼの阻害（ドゥトイトら（ｄｕ　Ｔｏｉｔ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ　Ｌｅｕｋｏｔ．Ｅｓｓｅｎｔ．Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄｓ、第５１巻、１２１〜１２４ページ）、癌細胞に対する成長因子の作用の低下（ジアンら（Ｊｉａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９５年ｂ、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、第７１巻、７４４〜７５２ページ）、多剤耐性の逆転（ウェーバーら（Ｗｅｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年、Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．第８６巻、６３８〜６３９ページ）および化学療法薬の細胞傷害性作用の増加（プラムら（Ｐｌｕｍｂ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３年、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、第６７巻、７２８〜７３３ページおよびアンダーソンら（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９８年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．第１８巻、７９１〜８００ページ）をもたらすことが知られている。
【０００４】
ｎ−３およびｎ−６脂肪酸は同様な代謝経路を辿り、個々の酵素が両ＰＵＦＡ系列における類似の基質に作用するものと思われる。ｎ−６経路においては、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、２０：３ｎ−６）が、δ−５−デサチュラーゼ（Ｄ５Ｄ）として知られている酵素による不飽和化により、アラキドン酸（ＡＡ、２０：４ｎ−６）に変換される。この酵素は、ｎ−３経路においてδ８、１１、１４、１７エイコサテトラエン酸（２０：４ｎ−３）からエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）も生成する。
【０００５】
δ−５−デサチュラーゼは、二重結合をカルボキシル基と既存の二重結合との間のアシル鎖に導入する「フロント−エンド」デサチュラーゼとして知られる酵素のサブクラスに属している。δ−５−デサチュラーゼは、電子伝達系に関連する３つの主要なタンパク質からなる系の一部である小胞体の膜に結合した酵素である（藤原ら（Ｆｕｊｉｗａｒａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８３年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｍｕｍ．第１１０巻、３６〜４１ページおよび１９８４年、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．第２３３巻、４０２〜４０７ページ）。ヒトδ−５−デサチュラーゼのクローニング、発現および脂肪酸調節は、以前に記載されている（チョーら（Ｃｈｏ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９９年ｂ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７４巻、３７３３５〜３７３３９ページ、レオナードら（Ｌｅｏｎａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．）、２０００年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第３４７巻、７１９〜７２４ページおよびマーカードら（Ｍａｒｑｕａｒｄｔ　ｅｔ　ａｌ．）、２０００年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ第６６巻、１７５〜１８３ページ）。
【０００６】
δ−５−デサチュラーゼの直接的生成物であるアラキドン酸（ＡＡ）とエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）はいずれも、様々な疾患に関連する重要なＰＵＦＡｓと提唱されている。ＡＡおよびＥＰＡおよびそれらの各エイコサノイド誘導体間の細胞における慢性的不均衡は、健康上重大な意味を有する可能性がある。この不均衡は、動脈高血圧、高コレステロール血症、アテローム動脈硬化性心疾患、慢性炎症および自己免疫疾患、アレルギー性湿疹および他のアトピー性疾患に関与する（ブーエンズら（Ｂｏｏｙｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８５年、Ｍｅｄ．Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ、第１８巻、５３〜６０ページ）。これに関しては、冠動脈性心疾患患者の１群の血漿リン脂質画分の脂肪酸検定から、ＡＡ、ＥＰＡ、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の濃度が低いことが明らかにされた。本態性高血圧患者では、リノール酸（ＬＡ）とＡＡも低い（ダス　ユー（Ｄａｓ　Ｕ．）、１９９５年、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ　Ｌｅｕｋｏｔ．Ｅｓｓｅｎｔ．Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄｓ、第５２巻、３８７〜３９１ページ）。さらに、エイコサノイド前駆体および特にＡＡの生物学的利用能は、いくつかの血管機能に影響を及ぼすと思われ、また、高血圧の病因または合併症と関係がある（ルッソーら（Ｒｕｓｓｏ　ｅｔ　ａｌ．）、１９７７年、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、第４巻、１０５８〜１０６３ページ）。ホスファチジルコリン（ＰＣ）のＡＡ含有種の割合は、高コレステロール血症患者の血漿では低かった。ＡＡを含有する同じＰＣ種は患者の血小板では減小した（ドブナー　ピーおよびエンゲルマン　ビー（Ｄｏｂｎｅｒ　Ｐ．ａｎｄ　Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ　Ｂ．）、１９９８年、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．第２７５巻、Ｅ７７７〜Ｅ７８４ページ）。
【０００７】
エイコサノイドおよび他の生理活性分子の前駆体としての役割を果たすことに加えて、ＡＡは二次メッセンジャーとして機能している可能性がある（カーンら（Ｋｈａｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９５年、Ｃｅｌｌ．Ｓｉｇｎａｌ．第７巻、１７１〜１８４ページ）。
【０００８】
炎症誘発性エイコサノイドであるプロスタグランジンＥ_２およびロイコトリエンＢ_４は、現代の西洋の食事の高ｎ−６および低ｎ−３多価不飽和脂肪酸含量により高い細胞濃度に維持されているＡＡから誘導される（ジェームスら（Ｊａｍｅｓ　ｅｔ　ａｌ．）、２０００年、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．第７１巻、３４３Ｓ〜３４８Ｓページ）。最近の結果から、δ−５−デサチュラーゼを阻害することにより、プロスタグランジンＥ_２の産生を減らすことが可能で、かつ同時に慢性関節リウマチなどの炎症過程を減らせることが示唆された（チャバリ　エス　アール（Ｃｈａｖａｌｉ　Ｓ．Ｒ．）、およびフォース　アール　エー（Ｆｏｒｓｅ　Ｒ．Ａ．）、１９９９年、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ　Ｌｅｕｋｏｔ．Ｅｓｓｅｎｔ．Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄｓ、第６１巻、３４７〜３５２ページ、ナバローら（Ｎａｖａｒｒｏ　ｅｔ　ａｌ．）、２０００年、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２０００年、第２７巻、２９８〜３０３ページ）。実際に、ＡＡ由来のエイコサノイドは炎症誘発性であり、免疫系の細胞の機能を調節する。魚油を摂取することにより、細胞膜中のＡＡがＥＰＡにより置換される。これにより、産生されるエイコサノイドの量が変化し、それらのバランスが変化する。ＥＰＡに富む油を摂取することにより、リンパ球増殖の減小、Ｔ細胞媒介性細胞傷害、ナチュラルキラー細胞活性、マクロファージ媒介性細胞傷害、単球および好中球化学走化性、主要組織適合性ＩＩ発現および抗原提示、炎症誘発性サイトカインの産生（インターロイキン１および６、腫瘍壊死因子）ならびに接着分子の発現が減少する（カルダー　ピー　シー（Ｃａｌｄｅｒ　Ｐ．Ｃ．）、１９９８年、Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．第４巻、４６７〜４９０ページ）。実験的に誘発したＴ細胞媒介性自己免疫疾患において、必須脂肪酸欠乏食またはｎ−３脂肪酸添加食は疾患を悪化させるのに対して、ｎ−６脂肪酸はその重症度防止または低下させるように思われる。遺伝子発現、シグナル伝達経路、エイコサノイドおよびサイトカインの産生、ならびに抗酸化酵素の作用の調節はすべて、食事性ｎ−６およびｎ−３脂肪酸が免疫系および自己免疫疾患に対して及ぼす作用の機構である（ハービゲ　エル　エス（Ｈａｒｂｉｇｅ　Ｌ．Ｓ．）、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎｕｔｒ．Ｓｏｃ．第４巻、５５５〜５６２ページ）。
【０００９】
アトピー性皮膚炎（湿疹）患者は低いレベルの、ＡＡを始めとするδ−５−デサチュラーゼ生成物を有する（ハウゼン　エー　イー（Ｈａｕｓｅｎ　Ａ．Ｅ．）、１９３３年、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．第３１巻、１１６０〜１１６１ページ）。これらの所見は、湿疹患者が低いレベルの血清ＡＡを有していた他の試験（マンクら（Ｍａｎｋｕ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８４年、Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．第１１０巻、６４３〜６８０ページ）と一致している。アトピー性湿疹におけるｎ−６ＰＵＦＡの補給の治療上の有用性が報告された（ライト　エスおよびバートン　ジェー　エル（Ｗｒｉｇｈｔ　Ｓ．ａｎｄ　Ｂｕｒｔｏｎ　Ｊ．Ｌ．）、１９８２年、Ｌａｎｃｅｔ、第２巻、１１２０〜１１２２ページ）。ＥＰＡおよびＤＨＡを含む軟膏を用いた場合にも有益な効果が得られた（ワタナベ　ティーおよびクロダ　ワイ（Ｗａｔａｎａｂｅ　Ｔ．ａｎｄ　Ｋｕｒｏｄａ　Ｙ．）、１９９９年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｉｎｖｅｓｔ．第４６巻、１７３〜１７７ページ）ので、これらの療法はｎ−６ＰＵＦＡｓに限定されない。
【００１０】
乾癬は他の関連疾患である。乾癬は、遊離ＡＡとその炎症誘発性代謝物の著しい増加を特徴とする多因子性皮膚疾患である。エイコサノイド合成におけるＡＡと競合する別の前駆体（すなわち、ＥＰＡ）を供給すると、炎症性および化学走化性がより低い誘導体の産生により炎症誘発作用が減弱し、同時に慢性斑状乾癬が減少する（メイサーら（Ｍａｙｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９８年、Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．第３８巻、５３９〜５４７ページ）。
【００１１】
同様に、急性肺損傷を特徴とする急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）は、活性化された肺内マクロファージおよび好中球からのＡＡ由来の炎症メディエータおよび有毒な酸素ラジカルの過剰放出と関連づけられる。抗炎症性状態に有利であるＥＰＡとＧＬＡとを配合した栄養処方剤の補給が、ＡＲＤＳを有するか、あるいはＡＲＤＳを発症する危険がある患者の臨床管理における合併療法として用いられている（ガデクら（Ｇａｄｅｋ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９９年、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ　Ｍｅｄ．第２７巻、１４０９〜１４２０ページ）。
【００１２】
一般に脂質蓄積および特にＡＡと、ヒト関節病理の組織学的重症度との関連も存在する（リッピエロら（Ｌｉｐｐｉｅｌｌｏ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９１年、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、第４０巻、５７１〜５７６ページ）。最近の所見は、ｎ−３脂肪酸の補給が関節軟骨変性（ＡＣＤ）に関与している異化因子の発現を調節する分子的機構に影響を及ぼすことを示している。これは、関節疾患を引き起こし、広げる生理学的パラメーターの軽減におけるｎ−３ＰＵＦＡｓの有益な役割を示している（カーティスら（Ｃｕｒｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ．）、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７５巻７２１〜７２４ページ）。
【００１３】
ＡＡとＥＰＡは、哺乳類細胞の癌に対して様々な作用を有する。複数の試験で、ｎ−３およびｎ−６ＰＵＦＡｓおよび／またはそれらの代謝物が、腫瘍サプレッサーの発現を調節し（ジアンら（Ｊｉａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．）、２０００年、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ　Ｌｅｕｋｏｔ．Ｅｓｓｅｎｔ．Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄｓ、第６２巻、１１９〜１２７ページ）、抗腫瘍転移機構を誘導し（ジアンら（Ｊｉａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９８年ａ、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、第７７巻、７３１〜７３８ページおよび１９９８年ｂ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．第２４４巻、４１４〜４２０ページ）、Ｅ−カドヘリン、デスモグレインおよびβ−カテニンなどの細胞接着分子の発現を調節する（ジアンら（Ｊｉａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．第５５巻、５０４３〜５０４８ページおよび（ジアンら（Ｊｉａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．）、２０００年、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ　Ｌｅｕｋｏｔ．Ｅｓｓｅｎｔ．Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄｓ、第６２巻、１１９〜１２７ページ）ことができることが示された。
【００１４】
特に、ＥＰＡは、ヒト膵癌細胞株の増殖をｉｎ　ｖｉｔｒｏで有意に阻害し（ファルコーナーら（Ｆａｌｃｏｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、第６９巻、８２６〜８３２ページ）、膵癌悪疫質を有する患者における急性期反応をダウンレギュレートする（ウィグモアら（Ｗｉｇｍｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．第９２巻、２１５〜２２１ページ）と報告された。また、ＥＰＡへの曝露後に、悪性腫瘍細胞がはるかに高いレベルの潜在的に細胞傷害性のスーパーオキシドラジカルと脂質過酸化産物を生成することが示された（タケダら（Ｔａｋｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．第１３巻、１９３〜１９９ページ）。
【００１５】
種々の研究室で脂肪酸δ−５−デサチュラーゼの阻害を試験するために菌類、微小藻類およびラット肝ミクロソームが使用された（カワシマら（Ｋａｗａｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９６年、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第６０巻、１６７２〜１６７６ページおよびオブコウィツら（Ｏｂｕｋｏｗｉｃｚ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．第５５巻、１０４５〜１０５８ページ）。しかし、様々な種を使用するこれらのモデルは、それらの種を薬物スクリーニングに用いるには、所望の標的、すなわちヒトδ−５−デサチュラーゼに十分に近くないという事実により制約される。したがって、哺乳類および特にヒト脂肪酸デサチュラーゼの活性を調節する作用物質を同定するための改善されたモデルおよび方法を開発することが望ましい。細胞全体、スフェロプラストおよびミクロソーム中での、あるいはデサチュラーゼを過剰発現する形質転換酵母から精製された酵素としての、ヒトδ−５−デサチュラーゼの使用は、該酵素のモジュレーターの化学ライブラリーを試験する実際的なアプローチである。形質転換酵母モデルは、ヒトまたは哺乳類組織を用いて薬物スクリーニング用に大量のこれらの酵素を得る場合に生ずると思われる潜在的な倫理的問題も解消する。
【００１６】
これに関して、ヒトおよび他の動物種の遺伝子およびそれらの対応するタンパク質のＰＵＦＡ代謝における役割と機能を立証するために、ヒトおよび他の動物種から分離された遺伝物質の発現を試験するために操作し得る実験的モデルが必要である。これは、代謝経路におけるタンパク質の特有の役割とそのタンパク質をコードする遺伝子の発現との関係が、わずかな偏りがしばしば異常な生理学的過程を引き起こし得るように、通常よく調整されている事象であるという事実を認識すると、特に必要である。さらに、そのような系は、糖尿病性神経障害のような特定の病理学的状態に連結する脂質代謝の変化の異常または不均衡を矯正するために、ＤＮＡまたはタンパク質レベルで作用する候補薬物標的の発見および同定を容易にするものと思われる。
そのような系の開発に向けて、δ−５−デサチュラーゼ遺伝子の制御領域の位置を突きとめることは重要である。
【００１７】
（発明の概要）
本発明は、（ａ）配列番号１；（ｂ）少なくとも１５ヌクレオチドを有する（ａ）のフラグメント；（ｃ）（ａ）と少なくとも９０％相同な配列；および（ｄ）ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で（ａ）、（ｂ）または（ｃ）とハイブリッド形成する配列；からなる群から選択されるＤＮＡ配列を有する分離核酸を教示している。本発明は、ヒトδ−５−デサチュラーゼ遺伝子の制御領域を含む。
【００１８】
本発明は、（ａ）配列番号２；（ｂ）少なくとも１５ヌクレオチドを有する（ａ）のフラグメント；（ｃ）（ａ）と少なくとも９０％相同な配列；および（ｄ）ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で（ａ）、（ｂ）または（ｃ）とハイブリッド形成する配列；からなる群から選択されるＤＮＡ配列を有する分離核酸を教示している。本発明は、ラットδ−５−デサチュラーゼ遺伝子をコードするヌクレオチド配列の制御領域を含む。
【００１９】
本発明は、（ａ）配列番号３；（ｂ）少なくとも１５ヌクレオチドを有する（ａ）のフラグメント；（ｃ）（ａ）またはその塩と少なくとも９０％相同な配列；からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する分離ポリペプチドを教示している。本発明は、ラットδ−５−デサチュラーゼタンパク質を表すポリペプチド配列を含む。
【００２０】
本発明は、哺乳類δ−５−デサチュラーゼ遺伝子の制御領域とリポーター遺伝子とを有し、制御領域が、リポーター遺伝子の転写を効果的に開始、終結または調節するように、リポーター遺伝子と転写的に連結されている、組換え核酸分子を教示している。リポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、胎盤性アルカリホスファターゼ、グルクロニドシンテターゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびヒト成長ホルモンからなる群から選択することが可能である。
【００２１】
本発明はまた、本発明の組換え核酸分子を含有し、適切な宿主細胞または宿主系へのベクター構築物の導入時に検出し得るリポーター遺伝子産物を生成するリポーター遺伝子を発現することができる、ベクター構築物を教示している。本発明はさらに、ベクター構築物を用いて形質転換またはトランスフェクションした宿主細胞または宿主系を教示している。宿主細胞は、哺乳類細胞またはヒト細胞であってよい。哺乳類細胞は、ヒト細胞株ＺＲ−７５−１またはＨｅｐＧ２に由来するものであってよい。
【００２２】
本発明はまた、哺乳類δ−５−デサチュラーゼ遺伝子の転写時の発現を調節または制御することができるモジュレーターをスクリーニングする方法であって、哺乳類δ−５−デサチュラーゼ遺伝子の制御領域と、制御領域に作動的に連結されているリポーター遺伝子とを含み、制御領域がリポーター遺伝子の転写の開始、終結またはその転写レベルを調節するのに有効である、宿主系を提供する工程：宿主系を試験成分と接触させる工程；試験成分が非存在である以外は同一条件下にある対照と比較した場合の、試験成分の存在下でのリポーター遺伝子の転写レベルの測定可能な差が、転写を介して前記δ−５−デサチュラーゼ遺伝子の発現を調節または制御する試験成分の能力の指標である、前記リポーター遺伝子の転写レベルを評価する工程；および前記能力を示す試験成分を前記モジュレーターとして選択する工程；からなる方法も教示している。制御領域は、配列番号１またはそのフラグメントによって表されるＤＮＡを有していてもよい（図１を参照）。
【００２３】
本発明はさらに、機能的哺乳類δ−５−デサチュラーゼ酵素の酵素活性を調節することができるモジュレーターをスクリーニングする方法であって、プロモーター領域に作動的に連結されている哺乳類δ−５−デサチュラーゼ酵素をコードする核酸配列を含み、プロモーター領域が核酸配列の発現の開始、終結またはその発現レベルを調節するのに有効である、宿主系を提供する工程；宿主系を試験成分と接触させる工程；試験成分が非存在である以外は同一の条件下にある対照と比較した場合の、試験成分の存在下での脂質代謝または連結補因子のレベルの測定可能な差が、δ−５−デサチュラーゼ酵素活性を調節する試験成分の能力の指標である、前記δ−５−デサチュラーゼの酵素活性を評価する工程；および前記能力を示す試験成分を前記モジュレーターとして選択する工程；からなる方法を教示している。δ−５−デサチュラーゼ酵素は、ラット（配列番号３）またはヒト由来のものであってよい。
【００２４】
本発明はさらに、機能的哺乳類δ−５−デサチュラーゼ酵素の酵素活性を調節することができるモジュレーターをスクリーニングする方法であって、宿主系の精製δ−５−デサチュラーゼタンパク質を提供する工程；宿主系を試験成分と接触させる工程と；試験成分が非存在である以外は同一条件下にある対照と比較した場合の試験成分の存在下での脂質代謝または連結補因子のレベルの測定可能な差が、δ−５−デサチュラーゼ酵素活性を調節する試験成分の能力の指標である、前記δ−５−デサチュラーゼの酵素活性を評価する工程；および前記能力を示す試験成分を前記モジュレーターとして選択する工程；からなる方法を教示している。δ−５−デサチュラーゼ酵素は、哺乳類（ラット、配列番号３）またはヒト由来のものであってよい。
【００２５】
本発明は、スクリーニング方法が、脂質代謝の調節に関与し、かつ／または糖尿病性神経障害を含む疾患に影響を及ぼす遺伝子、遺伝子産物、タンパク質または化合物を変化させる試験化合物を同定するための検定である、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載のモジュレーターをスクリーニングする方法を教示している。
【００２６】
本発明は、本発明のスクリーニング方法により同定されるモジュレーターを含む。モジュレーターは精製された形態であってよい。本発明は、そのようなモジュレーターと、医薬として許容できる担体または希釈剤とからなる医薬組成物を含む。
【００２７】
本発明はまた、糖尿病性神経障害などの脂質代謝異常に関係する疾患を含む疾患の治療のための、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載のモジュレーターまたは組成物の使用方法を教示している。
【００２８】
本発明はさらに、ラット分離δ−５−デサチュラーゼ遺伝子（配列番号２）ならびに連結されたタグ配列（タグ付きヒト配列については図４を参照）を有するδ−５−デサチュラーゼタンパク質を教示し、タグ配列がＶ５エピトープまたは６ヒスチジン残基（６×Ｈｉｓ）であるδ−５−デサチュラーゼタンパク質を含む。
【００２９】
本発明はさらに、同じ宿主系内の機能的哺乳類δ−５および／またはδ−６−デサチュラーゼ酵素の酵素活性を調節することができるモジュレーターをスクリーニングする方法であって、プロモーター領域と作動的に連結されている哺乳類δ−５およびδ−６−デサチュラーゼ酵素をコードする核酸配列を含み、プロモーター領域が該核酸配列の発現の開始、終結またはその発現レベルを調節するのに有効である、宿主系を提供する工程；宿主系を試験成分と接触させる工程；試験成分が非存在である以外は同一条件下にある対照と比較した場合の、試験成分の存在下での脂質代謝または連結補因子のレベルの測定可能な差が、δ−５−デサチュラーゼ酵素活性を調節する試験成分の能力の指標である、δ−５−デサチュラーゼの酵素活性を同時に評価する工程；および前記能力を示す試験成分を前記モジュレーターとして選択する工程；からなる方法を教示している。δ−５−デサチュラーゼ酵素は、ラット（配列番号３）またはヒト由来のものであってよい。
【００３０】
本発明はさらに、動脈高血圧、高コレステロール血症、アテローム動脈硬化性心疾患、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギー性湿疹および他のアトピー性疾患などの脂肪酸代謝に関係する疾患の治療のための、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のモジュレーターまたは組成物の使用方法を教示している。
以下の説明において、本発明の好ましい実施形態を例示する添付図面を参照しながら、本発明をより詳細に説明する。
【００３１】
（実施形態の詳細な説明）
本発明は、天然脂肪酸の経口補給が、特定の疾患状態によく見られる既存の代謝欠損を解消する上で、ある程度の治療上の利益をもたらしたという所見から発展した。しかし、治療的介入の新たな戦略に取り組むためには、脂質レベルおよび脂質補給を測定するという域を超えて、実際の酵素活性およびこれらの酵素がコードされている遺伝子の発現の調節を直接測定することが必要であった。ＰＵＦＡｓの代謝変換の経路は一般的に知られているが、これらの経路に沿って用いられる様々な酵素の発現を担っている固有に関係するヒト遺伝子はこれまでのところほとんど特徴づけられていない。現在のところ、新たに分離されたヒトデサチュラーゼ遺伝子は、既知の機能の他の遺伝子と相同の配列を示しているが、この情報のみでは、これらの遺伝子とそれらがコードしているタンパク質との間に存在すると思われる可能なタイプの関係に関しての徴候が得られるにすぎない（チョーら（Ｃｈｏ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９９年ａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７４巻、４７１〜４７７ページ）。したがって、ゲノムのそのような有用な部分（例えば、デサチュラーゼ遺伝子）の分離と同定には、この種の情報を、それらの遺伝子を分離してきた細胞または生物体の生物学的側面と、より十分に統合する能力を発展させる必要が生ずる。
【００３２】
これに関しては、本発明は、ヒトおよび他の動物種の遺伝子およびそれらのコードされたタンパク質のＰＵＦＡ代謝における役割と機能を立証するために、ヒトおよび他の動物種から分離された遺伝物質の発現を試験するために操作し得る実験的モデルを開発した。代謝経路におけるタンパク質の特有の役割とそのタンパク質をコードする遺伝子の発現との関係は、わずかな偏りがしばしば異常な生理学的過程を引き起こし得るような、通常よく調整されている事象である。したがってこのような系は、糖尿病性神経障害のような特定の病理学的状態に連結する脂質代謝の変化の異常または不均衡を矯正するために、ＤＮＡまたはタンパク質レベルで作用する候補薬物の発見と同定を容易にする。
【００３３】
本発明は特に、薬物スクリーニング法における哺乳類δ−５−デサチュラーゼ（Ｄ５Ｄ）酵素の発現の制御ならびに発現ベクターおよび宿主系におけるその核酸およびアミノ酸配列の使用を対象とする。発明者らは、ヒトＤ５Ｄ遺伝子の制御領域（すなわち、プロモーターおよび他の調節要素）を分離し、クローニングし、同定した。Ｄ５Ｄ遺伝子発現の制御を担っている遺伝要素が、デサチュラーゼ遺伝子コード領域（すなわちアミノ酸コード配列）とは別に分離され、Ｄ５Ｄ遺伝子発現を調節する作用因子の検定に用いられている。したがって、本明細書で提供する薬物スクリーニング法は、脂質代謝異常に関連する疾患を含む特定の病理学的疾患の治療および／または予防にその後に用いるためにＤ５Ｄ活性またはＤ５Ｄ遺伝子発現のレベルを調節する試験成分を同定するようにデザインされている。
【００３４】
したがって、Ｄ５Ｄ遺伝子の制御領域のクローニングは、Ｄ５Ｄ遺伝子発現の役割を詳細に検討し、代謝障害に関連する変化をなくすかまたは制御するその修飾物を誘発するための強力な手段となる。Ｄ５Ｄ遺伝子のプロモーター、エンハンサーおよびサイレンサー領域の同定と特徴づけを行うことにより、発明者らは、Ｄ５Ｄの制御領域にある別個の調節要素を同定し、理解することができ、また、Ｄ５Ｄ遺伝子発現の潜在的な薬理学的モジュレーターを発見することができる。
【００３５】
Ｄ５Ｄ制御領域
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による実験的研究により、ＧｅｎＢａｎｋでＡＣ００４７７０と注釈を付けられたｈＤ５Ｄのイントロン／エキソン構造（ＢＣ２６９７３０＿２）は本質的に正しいことが示された。ヒト肝ｃＤＮＡにおける５’−ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）を用いたこのデサチュラーゼについての更なる研究により、この遺伝子について代替（ａｌｔｅｎａｔｅ）スプライシングの存在が明らかにされた。この結論には、多数の別個のクローンの５’末端のＤＮＡ配列決定により到達した。他の研究者（チョーら（Ｃｈｏ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９９年ｂ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７４巻、３７３３５〜３７３３９ページおよびレオナードら（Ｌｅｏｎａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．）、２０００年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第３４７巻、７１９〜７２４ページ）ならびに出願人らにより、ｈＤ５Ｄは活性なδ−５−デサチュラーゼをコードする遺伝子であることが示された。
【００３６】
これに関して、酵母細胞をヒトＤ５Ｄ遺伝子を含むｐＴｈ５００９．１（図５を参照）またはｐＹＥＳ２／ＣＴで形質転換した。ｐＴｈ５００９．１で形質転換した酵母はＤＧＬＡの２９％をＡＡに変換したのに対して、ｐＹＥＳ２／ＣＴで形質転換した酵母ではそのような変換はなかった。そのような形質転換酵母はα−リノレン酸を不飽和化しなかった。
【００３７】
Ｄ５ＤをＲＴ−ＰＣＲによりクローニングした。最初に、ランダムプライマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて、哺乳類脂肪酸デサチュラーゼを発現している組織から抽出した全ＲＮＡの逆転写によりｃＤＮＡを生成した。デサチュラーゼｃＤＮＡのその後の増幅は、ｈＤ５Ｄ遺伝子のコード配列に対応するように特別にデザインされた前方向および逆方向プライマーを用いたＰＣＲにより行った。
【００３８】
哺乳類デサチュラーゼｃＤＮＡの増幅のためにデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＣＲによる増幅後の発現ベクターへのクローニングを促進するための、１または複数のエンドヌクレアーゼ認識部位を含んでいてよい。本発明では、哺乳類デサチュラーゼ遺伝子をクローニングするのに用いる前方向および逆方向プライマーは、それぞれＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩまたはＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限部位を含んでいる。
【００３９】
任意選択で、オリゴヌクレオチドプライマーは、哺乳類デサチュラーゼをコードするｃＤＮＡ配列と作動的に連結していなければならない（すなわち、それぞれデサチュラーゼコード配列の５’末端における上流または３’末端における下流にある）翻訳開始または終結コドンを、そのようなコドンがクローニングベクターに備えられている限り、欠いていてもよい。
【００４０】
翻訳開始および終結コドンは、それぞれ前方向および逆方向プライマー配列内に備えることができるが、例外として、タグ付き構成配列を作るのに用いられるプライマーは終結コドンを欠いていた。
【００４１】
発現ベクター挿入するためのｒＤ５ＤおよびｈＤ５Ｄ　ｃＤＮＡｓのクローニングに有用である前方向および逆方向プライマーの例を、以下の実施例１に示す。
【００４２】
ヌクレオチド＋１から＋１３４４に及ぶｒＤ５Ｄ　ｃＤＮＡフラグメントは、ラット肝組織から抽出した全ＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲによりクローンした。機能的に活性なｒＤ５Ｄをコードするヌクレオチド配列を図２に示す（配列番号２）。ｒＤ５Ｄタンパク質は、図３に示す推定アミノ酸配列（配列番号３）により表される。
【００４３】
ヌクレオチド＋１から＋１３３５に及ぶｈＤ５Ｄ　ｃＤＮＡフラグメントは、ヒト細胞株Ｃｈａｎｇ（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ−１３）から全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅によりクローンした。機能的に活性なｈＤ５Ｄをコードするヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ１９９５９６として報告されている。コードされたｈＤ５Ｄは、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＡＦ２９３７８に報告されているアミノ酸配列により表される。
【００４４】
ｈＤ５Ｄ制御領域は、ヒト白血球ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅によりクローンした。最初のＰＣＲ反応において、発明者らの研究室で調製されたヒトゲノムＤＮＡが、鋳型としての役割を果たした。ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＣ００４７７０に従って、それぞれｈＤ５Ｄ　ＣＤＳの位置＋１２６およびＡＴＧの配列上流の位置−１３５７に始まる合成逆方向および前方向プライマーを用いて１４８３ｂｐのフラグメントを生成させた。
【００４５】
翻訳開始コドンＡＴＧからヌクレオチド位置＋１２６から−１３５７までのｈＤ５Ｄ制御領域をクローニングするのに用いた逆方向および前方向プライマーを、以下の実施例２に示す。
【００４６】
予想されるフラグメントサイズに対応するＰＣＲ産物を回収し、ＴＡクローニングベクター、好ましくはｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、次いで、配列決定を行った。ＴＡクローニング用の線状クローニングベクターは、ＰＣＲ産物と３’デオキシアデノシン（Ａ）オーバーハングとの効率のよい連結反応を可能にするために、単一の３’デオキシチミジン（Ｔ）残基オーバーハングを含んでいる。ＰＣＲ増幅のＤＮＡ産物は、Ｔａｑポリメラーゼの活性が鋳型非依存性であるため、単一の３’Ａオーバーハングを含んでいる。
【００４７】
ｐＣＲＩＩ／ｈＤ５Ｄ制御領域構築物（ｐＣｈ４０１２．１）はｈＤ５Ｄ　ＣＤＳの１２６ｂｐを含む。本発明において言及するｈＤ５Ｄの制御領域は、ＡＴＧから位置−１から始まり、−１３５７で終わる。このフラグメントのサイズは１３５７ｂｐである。この配列は配列番号１により表される（図１）。
【００４８】
ｐＣＲＩＩクローニングベクターへの挿入後の１３５７ｂｐのｈＤ５Ｄ制御領域のリポーターベクターへのサブクローニングは、新しいセットの前方向および逆方向プライマーを用いたＰＣＲ増幅により行った。ＰＣＲ反応は、ｐＣｈ４０１２．１構築物を鋳型として用いたｈＤ５Ｄ　ＣＤＳの１２６ｂｐ部分を除去する役割も果たした。ｈＤ５Ｄ制御領域のサブクローニングに用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＣＲ増幅後の発現ベクターへの挿入および連結反応を促進するために１つまたは複数のエンドヌクレアーゼ認識部位を含む追加のヌクレオチド配列を含むことが有利であると思われる。本発明では、前方向および逆方向プライマーは、その両末端にＳａｃＩ制限部位を含む。任意選択で、オリゴヌクレオチドプライマーは、遺伝子産物をコードする異種核酸配列に作動的に連結する翻訳開始コドン（すなわち、逆方向プライマーの５’末端における下流に位置する）を含んでいてよい。本発明の実施形態では、翻訳開始コドンは、逆方向プライマー配列内には備えられていないが、その代わりに、制御領域の３’末端に連結される異種核酸配列の５’末端から供給される。
【００４９】
翻訳開始コドンＡＴＧから位置−１３５７から−１までのｈＤ５Ｄ制御領域をクローニングするのに用いた前方向および逆方向プライマーの例を、以下の実施例３に示す。
【００５０】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）は、本発明のＤＮＡ配列のクローニングおよび複製用の好ましい特定の原核宿主である。一方、酵母、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、哺乳類デサチュラーゼコード配列の発現に用いられる好ましい宿主である。
【００５１】
ベクター構築物
したがって、本発明のベクター構築物は、真核細胞および原核細胞中でのその増殖および選択のための必須要素を含んでいる。本発明の発現ベクターは、複製起点、誘導プロモーターおよび２つの選択マーカー遺伝子から本質的になるｐＹＥＳ２およびｐＹＥＳ２／ＣＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含む。特に、ｐＹＥＳ２／ＣＴベクターは、翻訳産物であるタグ付きデサチュラーゼタンパク質を市販の抗体および／またはアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて容易に同定かつ／または精製することを可能にするタグ（例えば、Ｖ５／６ｘＨｉｓエピトープ）をコードする短いＤＮＡ配列も含んでいる。ｐＹＥＳ２およびｐＹＥＳ２／ＣＴベクターは、酵母における選択のためのウラシル原栄養体と、ガラクトースの存在下で活性化され、クローニング部位の上流に位置する発現のためのＧＡＬ１ガラクトース誘導プロモーターとを与える。ガラクトース誘導プロモーター（ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ１０）は、酵母でのタンパク質の高レベルかつ調節された発現のために広範に用いられている（ルーら（Ｌｕｅ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８７年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第７巻、３４４６〜３４５１ページおよびジョンストン　エム（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ　Ｍ．）、１９８７年、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．第５１巻、４５８〜４７６ページ）。ＧＡＬプロモーターからの転写は、ガラクトースが存在するときにプロモーター領域に結合し、転写を活性化するＧＡＬ４タンパク質により活性化される。ガラクトースの非存在下では、拮抗物質ＧＡＬ８０がＧＡＬ４に結合し、ＧＡＬ４が転写を活性化するのを妨げる。ガラクトースの添加により、ＧＡＬ８０がＧＡＬ４による活性化を阻害するのが防止される。
【００５２】
発現ベクターは、哺乳類デサチュラーゼをコードするｃＤＮＡと配向し作動的に連結した翻訳開始または終結（例えば停止）配列（すなわち、それぞれデサチュラーゼコード配列の５’末端の上流または３’末端の下流に位置する）を含んでいてよい。しかし、翻訳開始または終結コドンは、ｐＹＥＳ２ベクターへの哺乳類デサチュラーゼ遺伝子のクローニングを促進するために用いられる前方向および逆方向プライマー配列内にそれぞれ備えられていてもよい（実施例１を参照）。ｐＹＥＳ２／ＣＴへのクローニングのための前方向および逆方向プライマーは、デサチュラーゼ−Ｖ５／６×Ｈｉｓタグ付きタンパク質を発現するようにデザインされている（実施例１を参照）。
【００５３】
宿主系
本発明は、アミノ酸コード領域を含む哺乳類Ｄ５Ｄ遺伝子の一部を含み、脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子の転写を開始することができる異種プロモーターを有する組換え核酸構築物を提供する。アミノ酸コード領域は、ヒトＤ５Ｄ遺伝子由来のものである。特に、本発明は、好ましくは誘導される異種プロモーター領域と、機能的哺乳類（例えば、ヒトまたはラット）Ｄ５Ｄをコードする核酸配列と、終末領域とを有し、それにより、核酸配列の発現を効果的に制御するようにプロモーター領域が作動的に核酸配列と連結する、核酸構築物を提供する。代わりに、組換え核酸構築物は、宿主系において機能し得る異種転写終末領域を含んでいてもよい。組換え核酸構築物は、宿主系に挿入し得る発現ベクターの一部としてクローニングされる。
【００５４】
哺乳類（例えば、ヒトまたはラット）Ｄ５Ｄ遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、タグ付きタンパク質をコードする異種配列に連結させてもよい。Ｄ５Ｄを発現する宿主系のスクリーニングのために、市販の抗体により認識されるタグ付きデサチュラーゼタンパク質をコードすることは有用であると思われる。タグ付きタンパク質は、脂肪酸デサチュラーゼが切断され、異種部分から精製されるように、Ｄ５Ｄコード配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように工学設計することもできる。
【００５５】
本発明の他の態様は、哺乳類Ｄ５Ｄ遺伝子の制御領域とリポーター遺伝子を含む組換え核酸構築物を対象とする。制御領域は、ヒトＤ５Ｄ遺伝子由来のものである。制御領域がリポーター配列の転写または翻訳を効果的に開始し、終結または調節するように、制御領域とリポーター配列が作動的に連結されている。組換え核酸構築物は、次に宿主系に挿入される発現ベクターの一部としてクローニングされる。
【００５６】
したがって、宿主系を、プロモーター領域と終末領域が実働可能で、したがって、機能的に活性なデサチュラーゼ酵素の高レベルの発現を達成するのに使用し得るような、Ｄ５Ｄ遺伝子の核酸配列を含む核酸構築物で形質転換／トランスフェクションする。デサチュラーゼ酵素活性を増大または低下させる試験成分は、それぞれエンハンサーまたは阻害剤である。したがって、特定の試験成分を、組織中の活性でかつ調節されたＤ５Ｄ酵素のレベルに関連する疾患を治療するための製剤の処方の基礎または治療薬の刷新として使用し得る。
【００５７】
形質転換／トランスフェクションされた宿主細胞は、導入されたベクター構築物に含まれているマーカー遺伝子の選択により同定される。したがって、導入されたマーカー遺伝子は、抗生物質耐性を与えるか、または必須成長因子または酵素をコードし、形質転換／トランスフェクションされた宿主中で発現したときの選択培地での成長を可能にする。一般的に、形質転換／トランスフェクションされる宿主は、選択培地で成長する能力により選択される。選択培地は、抗生物質を含むか、または、非形質転換／非トランスフェクション宿主の成長に必要な必須成長栄養素を欠いていてよい。大腸菌細胞および酵母細胞の形質変換は、ｐＹＥＳ２およびｐＹＥＳ２／ＣＴベクターに存在する選択マーカー遺伝子（例えば、β−ラクタマーゼまたはＵＲＡ３）に基づいて、それぞれアンピシリン含有培地およびウラシル欠損培地での選択により判定した。
【００５８】
無細胞発現系は、上記の機能的哺乳類デサチュラーゼのコード配列を含む核酸構築物をｉｎ　ｖｉｔｒｏ使用のためにデザインされた適切な発現ベクターに入れ、ｍＲＮＡ依存性ウサギ網赤血球ライセートのような細胞ライセート中でｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写／翻訳を行うことにより実現される。必要な場合、必須補因子およびアミノ酸のような追加の成分を系に組み込むことができる。肝臓、脳、心臓等の動物器官および酵母を含む微生物のような多くの様々な源からの酵素の活性を試験するために、ミクロソーム系を用いて成功を収めている（デ　アンチュエノら（ｄｅ　Ａｎｔｕｅｎｏ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年、Ｌｉｐｉｄｓ、第２９巻、３２７〜３３１ページ、トッドら（Ｔｏｄｄ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９９年、Ｐｌａｎｔ．Ｊ．第１７巻、１１９〜１３０ページ、ニシら（Ｎｉｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．）、２０００年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第１４９０巻、１０６〜１０８ページ）。
【００５９】
ミクロソーム宿主系は、上記の機能的哺乳類デサチュラーゼのコード配列を含む核酸構築物で宿主系を形質転換／トランスフェクションし、ミクロソームを分離することにより実現される（オースベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年〜、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョン　ワイリー　アンド　サンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク州ニューヨーク）。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写／翻訳は、ウサギ網赤血球ライセートと必須補因子とを加えて行う。所望ならば、標識アミノ酸を加えることができる。そのようなｉｎ　ｖｉｔｒｏ発現ベクターは、用いる系に必要な発現シグナルの一部または全部を提供することができる。これらの方法は当該技術分野において周知であり、系の各成分は市販されている。反応混合物は、例えばポリペプチドをその酵素比活性を測定することによって直接測定するか、あるいは合成されたポリペプチドを精製してから、その酵素比活性を測定する。
【００６０】
哺乳類Ｄ５Ｄ遺伝子発現のレベルの調節に関与している制御領域の検定に用いる細胞系は、哺乳類細胞株ＺＲ−７５−１（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−１５００）またはＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−８０６５）である。
【００６１】
そのような研究に広く使用されているリポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルチランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ、エステラーゼ、アルカリホスファターゼ、ポロテアーゼのような酵素ならびに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびヒト成長ホルモンのような他のタンパク質があるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、リポーター遺伝子は、生成された酵素の量と、したがってリポーター遺伝子の発現のレベルと相関する、酵素比活性のレベルにより検出されるＣＡＴまたはルシフェラーゼである。
【００６２】
原核細胞または真核細胞でのその実施可能性のための必須要素を含む、本発明のリポーターベクターは、ｐＣＡＴ−３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社コーポレーション社、米国ウィスコンシン州）である。ゲノムＤＮＡから得られる哺乳類デサチュラーゼ制御領域を、通常の方法により適正な向き（５’から３’へ）で、追加の制御要素含むかまたは含まないリポーター遺伝子の開始コドンに隣接して（５’）連結させる。３’からリポーター遺伝子のコード配列までの領域は、転写終結およびポリアデニル化部位、例えばＳＶ４０ポリＡ部位を含む。リポーターベクター中で作動的に連結しているデサチュラーゼ制御領域およびリポーター遺伝子を、クローニング宿主、好ましくは大腸菌へトランスフォームさせる。第２の宿主、好ましくは哺乳類細胞株ＺＲ−７５−１またはＨｅｐＧ２への後続のトランスフェクション用の十分な量の組換え構築物を調製するために、宿主を培養し、複製ベクターを回収する。
【００６３】
宿主系および薬物スクリーニング
本発明は、Ｄ５Ｄ遺伝子発現を転写レベルで促進または抑制するかあるいはＤ５Ｄ活性を調節する、ヌクレオチド、タンパク質、化合物または薬理作用物質をスクリーニングする方法を含む。このため、そのような促進性または抑制性成分を検出するために、細胞に基づく検定、細胞ライセート検定および／または精製酵素検定を用いる。
【００６４】
Ｄ５Ｄ遺伝子発現は、糖尿病および連結疾患、動脈高血圧、高コレステロール血症、アテローム動脈硬化性心疾患、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギー性湿疹および他のアトピー性疾患、慢性関節リウマチのような炎症性過程、リンパ球増殖の減小、Ｔ細胞媒介性細胞傷害、ナチュラルキラー細胞活性、マクロファージ媒介性細胞傷害、単球および好中球化学走化性、主要組織適合性クラスＩＩ発現および抗原提示、炎症誘発性サイトカイン（インターロイキン１および６、腫瘍壊死因子）の産生および接着分子発現の減少、湿疹、乾癬、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、間接軟骨変性（ＡＣＤ）ならびに癌に関与する。
【００６５】
発明者のヒト糖尿病臨床試験で、１型糖尿病患者の血漿および赤血球リン脂質中のＡＡおよびＥＰＡが低いことを示すデータが得られた。この試験は、ｎ−６ＰＵＦＡｓの腸内投与により軽度糖尿病性神経障害の神経生理学的パラメーターが改善されたスコティアファーマシューティカルズ（Ｓｃｏｔｉａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）社支援の多施設共同臨床試験（キーンら（Ｋｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｅ、第１６巻、８〜１５ページ）を裏づけ、拡張している。長鎖ｎ−６脂肪酸の濃度の低下が報告された（アリサカら（Ａｒｉｓａｋａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８６年、Ｊ．Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｎｕｔｒ．第５巻、８７８〜８８２ページ、ティルビス　アール　エスおよびミエッティネン　ティー　エー（Ｔｉｌｖｉｓ　Ｒ．Ｓ．ａｎｄ　Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ　Ｔ．Ａ．、１９８５年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．第６１巻、７４１〜７４５ページおよびバン　ドールマールら（ｖａｎ　Ｄｏｏｒｍａａｌ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８８年、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、第３１巻、５７６〜５８４ページ）。ＤＧＬＡの濃度は１型糖尿病群において低下しなかった。このことは、ＡＡの低下がδ−５−デサチュラーゼ活性の低下に起因する可能性を示している。
【００６６】
発明者の糖尿病ラット試験で、ストレプトゾトシン誘発性糖尿病ラットにおける血漿リン脂質ＡＡ含量が２週および７週にそれぞれ３１％および２７％低下した。ヒト糖尿病試験と同様に、ＤＧＬＡ濃度は対照と比べて変化しないままであり、したがって、ＡＡおよびＥＰＡの濃度の低下はδ−５−デサチュラーゼ活性の検出された低下と一致していた。糖尿病におけるデサチュラーゼ系の活性の低下は、ブレンナーら（Ｂｒｅｎｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）、１９６８年、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．第２１５巻、６３〜７０ページにより最初に報告された。その後、この所見は立証され（ミモウニ　ブイ　およびポアッソン　ジェー　ピー（Ｍｉｍｏｕｎｉ　Ｖ．ａｎｄ　Ｐｏｉｓｓｏｎ　Ｊ．Ｐ．）、１９９２年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第１１２３巻、２９６〜３０２ページ、ダンら（Ｄａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８９年、Ｌｉｐｉｄｓ、第２４巻、８８２〜８８９ページならびにファース　エフ　エッチおよびカーター　ダブリュ　ジェー（Ｆａａｓ　Ｆ．Ｈ．ａｎｄ　Ｃａｒｔｅｒ　Ｗ．Ｊ．）、１９８０年、Ｌｉｐｉｄｓ、第１５巻、９５３〜９６１ページ）、糖尿病の二次性合併症の発現における重要な因子であるとみなされている。ストレプトゾトシン糖尿病ラット試験で、糖尿病ラットの肝ミクロソーム中のδ−５−デサチュラーゼ活性が対照ラットと比較して３７％低いことが確認された。これらの所見は、δ−５−デサチュラーゼが糖尿病における潜在的な薬物標的であり、また、薬物スクリーニング検定用の有用な脂質代謝化合物でもある。
【００６７】
本発明は、哺乳類Ｄ５Ｄ遺伝子の転写レベルを調節または制御するヌクレオチド、タンパク質、化合物および／または薬物を同定するための薬物スクリーニング方法をその特徴とする。この方法は（１）哺乳類δ−５−デサチュラーゼ遺伝子の制御領域と異種核酸配列（例えば、リポーター遺伝子）とを有し、制御領域が、核酸配列の転写を効果的に開始、終結または調節するように、リポーター遺伝子と作動的に連結されている、それらすべてが新規の核酸構築物を含む発現ベクターを用いて細胞または細胞ライセートに導入されている、新規の核酸構築物を提供する工程；（２）細胞または細胞ライセートを試験成分と接触させる工程；（３）試験成分が核酸配列の転写レベルを変化させることができるかどうかを判定する工程；および（４）そのような活性を示す成分を選択する工程；を含む。これに関して、特定の試験成分を、Ｄ５Ｄ遺伝子発現のレベルに連結する疾患を治療するための製剤の処方の基礎または治療薬の刷新として使用し得る。レポーター配列の転写レベルを増大または低下させる試験成分は、それぞれエンハンサーまたは阻害剤である。
【００６８】
特に、本発明は、デサチュラーゼ遺伝子の発現のレベルに連結するＤ５Ｄ制御領域の有用かつ機能的部分ならびに制御領域内の様々な機能および調節要素の同定の方法を具体化している。遺伝子発現のレベルの変化をもたらすデサチュラーゼ制御領域の機能的部分は、該領域の様々なセグメントの操作（例えば、欠失、部位特異的突然変異誘発など）ならびにモジュレーターの直接または間接的効果により決定される。
【００６９】
薬物スクリーニング法を実施するための宿主系は、菌類または哺乳類細胞を含む真核細胞であってよい。より具体的には、本発明の実施形態は、哺乳類Ｄ５Ｄの酵素活性を調節する候補薬物をために丸ごとの細胞としての形質転換した酵母、スフェロプラスト、細胞ホモジネート、細胞小器官（例えば、ミクロソーム等）または精製酵素を用いる薬物スクリーニング検定に関する。本発明の実施形態では、宿主酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ＩＮＶＳｃ１株（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社、カリフォルニア州）を、哺乳類Ｄ５Ｄコード配列を含む酵母発現ベクターｐＹＥＳ２またはｐＹＥＳ２／ＣＴ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社）で形質転換する。酵母細胞を本発明の方法で使用するために選択した理由は、（１）脂肪酸δ−５−デサチュラーゼ活性を示さなかった（アキら（Ａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９９年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．第２５５巻、５７５〜５７９ページ）、（２）それらの転写および翻訳過程が哺乳類細胞で起こっている過程と、同一でないとしても、類似している、（３）しばしば哺乳類細胞よりも遺伝的操作の影響を受けやすく、はるかに速やかに増殖する（グスリー　シーおよびフィンク　ジー（Ｇｕｔｈｒｉｅ　Ｃ．ａｎｄ　Ｆｉｎｋ　Ｇ．）、１９９１年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４巻）からである。したがって、酵母細胞は、真核遺伝子発現の、また哺乳類Ｄ５Ｄ活性のモジュレーションを試験するための優れたモデルである。
【００７０】
酵母細胞のような宿主細胞が本発明によるＤＮＡ構築物で形質転換されるとき、宿主細胞はデサチュラーゼ活性を調節する試験成分を同定する検定に用いられる。Ｄ５Ｄ活性を調節する試験成分は、（１）形質転換した宿主細胞を試験成分と一定時間接触させ、（２）脂質代謝のレベル（すなわち、基質から生成する生成物のレベル）または処理細胞内の連結補因子のレベルを測定することにより同定する。次いで、１つの細胞におけるこの代謝レベルを、試験成分が存在しない場合の代謝レベルと比較する。もしあるとすれば、代謝レベルの差は問題の試験成分がＤ５Ｄ活性を調節するかどうかを示している。さらに、処理細胞と無処理細胞間で生じた脂質代謝レベルの大きさは、デサチュラーゼ活性のモジュレーターとしての当該化合物の強さの相対的指標となる。デサチュラーゼ活性のモジュレーターとしての該化合物の強さを立証するために、ラット肝ミクロソームを好ましい宿主系とともに用いる。
【００７１】
Ｄ５Ｄ遺伝子発現の調節を観察し、Ｄ５Ｄ遺伝子制御領域または調節要素により駆動されるリポーター遺伝子の発現を調節する試験成分を同定するために、宿主系として哺乳類細胞を用いた薬物スクリーニング検定も行われる。哺乳類Ｄ５Ｄ制御配列を含むリポーターベクターｐＣＡＴ−３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でトランスフェクションされる宿主系として、ＺＲ−７５−１またはＨｅｐＧ２細胞株を用いることが好ましい。
【００７２】
ＺＲ−７５−１のような好ましい宿主細胞株が本発明によるリポーターＤＮＡ構築物でトランスフェクションされるとき、それは、機能的に活性な調節要素／オリゴヌクレオチド配列を介して遺伝子転写レベルを調節する試験成分を同定するための検定に用いられる。遺伝子転写レベルを変化させる試験成分は、（１）トランスフェクションされた宿主細胞を試験成分と一定時間接触させ、（２）処理細胞内の遺伝子発現レベル（例えば、ＣＡＴ活性）を測定することにより同定することが可能である。この発現レベルを、化合物が存在しない場合のレポーター遺伝子のそれと比較する。もしあるとすれば、遺伝子発現レベルの間の差は問題の化合物がＤＮＡ調節要素の機能を変化させるかどうかを示している。さらに、処理細胞と無処理細胞間で発現したレポーター産物のレベルの大きさは、転写ＤＮＡ調節要素によるＤ５Ｄ遺伝子転写のモジュレーターとしての該化合物の強さの相対的指標となる。
【００７３】
１実施形態では、高処理能力スクリーニングプロトコールを用いて、デサチュラーゼ制御領域に対する作用により哺乳類Ｄ５Ｄ遺伝子の転写を調節または制御する能力について多数の試験化合物を調査する。したがって、転写系のデザインにより、Ｄ５Ｄ遺伝子発現を変化させ、それにより機能的Ｄ５Ｄ酵素の組織濃度を増加または減少させる（その生理学的意義は脂質代謝の正常化を含む）可能性のある治療薬としての大規模な選択対象の成分をスクリーニングすることが可能となる。
【００７４】
本明細書に記載する薬物スクリーニング法では、宿主系は、機能的タンパク質またはポリペプチドを生成するための転写および／または転写に続く翻訳を許容するかまたは可能にする環境または条件を提供する、細胞、組織、器官、生物体またはその一部であってよい。生物体には哺乳類などの動物が含まれる。本発明の１実施形態では、薬物スクリーニング法が、原核細胞または真核細胞を用いて実施される。本発明のいくつかの実施形態では、真核細胞は酵母細胞および哺乳類細胞を含む。
【００７５】
拮抗物質としては、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに結合し、それによりその活性を阻害または消失させる小有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体が挙げられる。拮抗物質はまた、δ−５−デサチュラーゼ誘発性活性を誘発せず、それの結果、基質結合を妨害することによりδ−５−デサチュラーゼの作用を妨げる結合性分子のような結合性分子上の同じ部位に結合する密接に関連したタンパク質または抗体のような小有機分子、ペプチド、ポリペプチドであってもよい。
【００７６】
拮抗物質としては、ポリペプチドの結合部位に結合して該結合部位を占有し、それにより、通常の生物学的活性が妨げられるように細胞結合分子への結合を妨げる小分子がある。小分子の例として、小有機分子、ペプチドまたはペプチド様分子が挙げられるが、これらに限定されない。他の拮抗物質としては、アンチセンス分子が挙げられる（これらの分子の記述についてはオカノら（Ｏｋａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．）１９８８年、ＥＭＢＯ　Ｊ．第７巻、３４０７〜３４１２ページを参照）。選択的モジュレーターとしては、例えば、δ−５−デサチュラーゼまたはδ−５−デサチュラーゼ核酸に特異的に結合する抗体および他のタンパク質またはペプチド、δ−５−デサチュラーゼ（標的生体分子選択的に結合するオリゴヌクレオチドを選択する方法を記載している１９９３年３月１８日に公開された特許強力条約国際公開第ＷＯ９３／０５１８２号を参照）またはδ−５−デサチュラーゼ核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）に特異的に結合するオリゴヌクレオチドおよびδ−５−デサチュラーゼまたはδ−５−デサチュラーゼ核酸に特異的に結合する他の非ペプチド天然または合成化合物などであってよい。
【００７７】
選択的モジュレーターの開発の標的は、例えば（１）他のタンパク質に接触しかつ／またはδ−５−デサチュラーゼを細胞内に局在化するδ−５−デサチュラーゼの領域、および（２）基質に結合するδ−５−デサチュラーゼの領域などである。
【００７８】
抗体
タンパク質に基づく試験に関して、本明細書に記載のような標準的な免疫学的技術、融合タンパク質または合成ペプチドを用いてδ−５−デサチュラーゼ遺伝子産物に対する抗体を発生させることが可能である。モノクローナル抗体も、ワルドマン　ティー　エー（Ｗａｌｄｍａｎｎ　Ｔ．Ａ．）、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５２巻、１６５７〜１６６２ページならびにハーロー　イーおよびレーン　ディー（Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ．）（編）、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドハーバープレス（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク州コールドハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ））に記載されているような現在では慣用の技術を用いて生産することが可能である。抗体フラグメント、すなわちＦａｂフラグメントを同様に用いることが可能であることも認識されよう。試験試料を抗体に結合せ、遺伝子産物への結合を検出する免疫検定、例えばＥＬＩＳＡｓは、脂肪酸調節遺伝子産物の存在と量を測定する迅速かつ効率のよい方法であり得る。
【００７９】
したがって、本発明は、ヒトおよび哺乳類（例えばラット）δ−５−デサチュラーゼに対して、ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体およびそのフラグメントならびに免疫学的な結合性相当物も提供し、それらは対象ポリペプチドおよびそのフラグメントもしくは対象ポリヌクレオチド領域、特に、対象ポリペプチド遺伝子座またはその一部に由来するポリヌクレオチド配列に特異的に結合することができる。「抗体」という術語は、同種分子または複数の異なる分子からなる血清製剤のような混合物を指す。ポリペプチドをペプチド合成装置で合成により調製し、担体分子（例えば、カサガイのヘモシアニン）に結合させ、ウサギに数ヶ月間にわたり注射する。ウサギ血清を対象ポリペプチドまたはフラグメントに対する免疫反応性について試験する。モノクローナル抗体は、タンパク質ポリペプチド、融合タンパク質またはそのフラグメントをマウスに注射して調製することができる。モノクローナル抗体をＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、対象ポリペプチドまたはそのフラグメントに対する特異的免疫反応性について試験する（ハーロー　イーおよびレーン　ディー（Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ．）（編）、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドハーバープレス（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク州コールドハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ））。これらの抗体は、検定ならびに医薬品に有用である。
【００８０】
十分な量の所望のポリペプチドが得られたならば、様々な目的のために用いることができる。一般的な用途は、結合に特異的な抗体の生産である。これらの抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってよく、当該技術分野においてよく知られているｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏ法により生産することができる。ポリクローナル抗体の生産のために、適切な標的免疫系、一般的にマウスやウサギを選択する。ほぼ精製された抗原を、動物について適切な方法により、また免疫学者によく知られている他のパラメーターにより決定される方法で免疫系に提示する。一般的な注射部位は、足の肉球、筋肉内、腹腔内または皮内である。もちろん、他の動物種をマウスまたはウサギの代わりに用いてもよい。次いで、ポリクローナル抗体を当該技術分野において知られている手法を用いて精製し、所望の特異性が得られるように調整する。
【００８１】
免疫学的反応を通常の免疫検定により検定する。通常、そのような免疫検定は、例えば、同じ細胞により産生された抗原の源の、抗原と同じ方法でのある程度の精製を必要とする。様々な免疫検定法が当該技術分野においてよく知られている（ハーロー　イーおよびレーン　ディー（Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ．）（編）、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドハーバープレス（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク州コールドハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ）、またはゴーディング　ジェー　ダブリュ（Ｇｏｄｉｎｇ　Ｊ．Ｗ．）、１９９６年、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク）。
【００８２】
１０^−８Ｍ^−１または好ましくは１０^−９〜１０^−１０Ｍ^−１の、またはより強い親和力を有するモノクローナル抗体は一般的に、例えば、ハーロー　イーおよびレーン　ディー（Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ．）（編）、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドハーバープレス（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク州コールドハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ）またはゴーディング　ジェー　ダブリュ（Ｇｏｄｉｎｇ　Ｊ．Ｗ．）、１９９６年、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨークに記載されているように標準的方法により調製することができる。その概要を述べると、適切な動物を選択し、望ましい免疫化プロトコールに従う。適切な期間後に、その動物の脾臓を切除し、個々の脾臓細胞を適切な選択条件下で一般的に不死化骨髄腫細胞に融合させる。その後、細胞をクローン別に分離し、各クローンの上清を、抗原の所望の領域に対して特異的な適切な抗体のそれらの産生について試験する。
【００８３】
他の適切な手法は、リンパ球を抗原性ポリペプチド、あるいはファージまたは類似のベクター中の抗体のライブラリーの選択にｉｎ　ｖｉｔｒｏで曝露させる方法である（フーセら（Ｈｕｓｅ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４６巻、１２７５〜１２８１ページ）。本発明のポリペプチドおよび抗体は、修飾を施して、あるいは施さずに用いることができる。しばしば、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを提供する物質を共有結合または非共有結合により結合させて標識する。様々な標識および複合法が知られており、科学および特許文献に広範に報告されている。適切な標識としては、放射性ヌクレオチド、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光物質、化学発光体、磁気粒子等がある。そのような標識の使用を教示している特許は、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号および第４，３６６，２４１号などである。また、組換え免疫グロブリンを生産してもよい（米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。
【００８４】
薬物デザイン
δ−５−デサチュラーゼ遺伝子機能の調節は、δ−５−デサチュラーゼ制御領域の構造または機能の様々な側面と相互作用するようにデザインし得る治療薬または薬物を使用することにより達成することが可能である。例えば、薬物または抗体は、制御領域の折りたたみ構造に結合して、欠陥のある構造を是正し得る。あるいは、薬物は特定の機能残基に結合して、基質または補因子に対するその親和力を増加させ得る。薬物または作用物質の有効性は、δ−５−デサチュラーゼ遺伝子タンパク質が発現する細胞系中でｉｎ　ｖｉｔｒｏで調節をモニターするスクリーニングプログラムにより確認することが可能である。あるいは、構造と機能との相関の知識、および様々なＮＦ１突然変異タンパク質における特異的欠陥の知識から、δ−５−デサチュラーゼ遺伝子活性を調節するように薬物をデザインすることが可能である（コプゼイ　ディー　エヌおよびデルナッテ　エス　ワイ　ジェー（Ｃｏｐｓｅｙ　Ｄ．Ｎ．ａｎｄ　Ｄｅｌｎａｔｔｅ　Ｓ．Ｙ．Ｊ．）、１９８８年、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｄｒｕｇｓ、ストックトンプレス（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク）。
【００８５】
遺伝子治療
δ−５−デサチュラーゼの発現をｉｎ　ｖｉｖｏで調節するために、本発明による種々の遺伝子治療法を用いることができる。アンチセンスＤＮＡ分子を工学設計し、用いることによって、δ−５−デサチュラーゼＤＮＡをｉｎ　ｖｉｖｏで遮断することができる。別の選択肢では、δ−５−デサチュラーゼ制御領域配列の５’領域とハイブリッド形成し、３重らせん構造を形成するようにデザインしたオリゴヌクレオチドを用いて、δ−５−デサチュラーゼの転写を阻害または減少させることができる。さらに別の選択肢では、全長野生型δ−５−デサチュラーゼ制御領域をコードする核酸を、さもなければ野生型δ−５−デサチュラーゼ産物を十分な量であるいは全く産生することができない細胞にｉｎ　ｖｉｖｏで導入することができる。
【００８６】
例えば、従来の置換療法では、遺伝子産物またはその機能的同等物を治療上有効な量で患者に投与する。δ−５−デサチュラーゼタンパク質は、ドイチャー　エム（Ｄｅｕｔｃｈｅｒ　Ｍ．）（編）１９９０年、Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第１８２巻に記載されているような通常の手法を用いて精製することが可能である。治療用の十分な量の遺伝子産物またはタンパク質は、例えば、培養細胞系または合成による製造により得ることが可能である。遺伝子産物を刺激または置換する薬物療法も用いることが可能である。送達媒介体およびスキームを、投与する特定のタンパク質または薬物に対して特別に適応させることが可能である。
【００８７】
遺伝子を患者の細胞またはベクター（患者に遺伝子産物をｉｎ　ｖｉｖｏで供給する）に送達するための組換え技術を用いる遺伝子治療も、本発明の範囲内であると考えられる。レトロウイルスは、体細胞遺伝子治療における実験用の好ましいベクターとみなされており、感染効率が高く、安定な組込みと発現を示す（オーキンら（Ｏｒｋｉｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８８年、Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．第７巻、１３０〜１４２ページ）。例えば、δ−５−デサチュラーゼｃＤＮＡはレトロウイルスベクターにクローニングすることが可能で、レトロウイルスＬＴＲ（長末端重複）からのその内因性プロモーターから駆動される。使用し得る他の送達系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（マクラウフリンら（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８８年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６２巻、１９６３〜１９７３ページ）、ワクシニアウイルス（モスら（Ｍｏｓｓ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８７年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第５巻、３０５〜３２４ページ）、ウシパピローマウイルス（ラスムッセンら（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８７年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第１３９巻、６４２〜６５４ページ）またはエプスタインバーウイルスのようなヘルペスウイルス群のメンバー（マルゴルスキーら（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８８年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第８巻、２８３７〜２８４７ページ）などである。
【００８８】
他の実施形態では、アンチセンス、リボザイムおよび３重らせんヌクレオチドをδ−５−デサチュラーゼの翻訳または転写を阻害するようにデザインする。これを実現するために、使用するオリゴヌクレオチドは、δ−５−デサチュラーゼ制御領域に特有の連結配列に基づいてデザインすべきである。例えば、限定の意図はないが、オリゴヌクレオチドは、対象ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が他の脂肪酸酵素ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列とほぼ相同である領域（本明細書では「固有領域」と称する）の中に入るべきでない。
【００８９】
アンチセンス分子の場合、配列を固有領域から選択することが好ましい。また、配列の翻訳を防ぐために標的ｍＲＮＡ配列との十分に強いアニーリングを実現するために、配列の長さが少なくとも１８ヌクレオチドであることも好ましい（イザント　ジェー　ジーおよびワイントラウプ　エッチ（Ｉｚａｎｔ　Ｊ．Ｇ．ａｎｄ　Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ　Ｈ．）、１９８４年、Ｃｅｌｌ、第３６巻、１００７〜１０１５ページ、ローゼンブルグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ、第３１３巻、７０３〜７０６ページ）。
【００９０】
「ハンマーヘッド」タイプのリボザイムの場合、リボザイムの標的配列を固有領域から選択することが好ましい。リボザイムは、高度に特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するＲＮＡ分子である。ハンマーヘッドリボザイムは、標的ＲＮＡの少なくとも一部とヌクレオチド配列が相補的であるハイブリッド形成領域と標的ＲＮＡを開裂するように構成された触媒領域とからなる。ハイブリッド形成領域は、９個またはそれ以上のヌクレオチドを含んでいる。したがって、本発明のハンマーヘッドリボザイムは、上記の配列と相補的であり、長さが少なくとも９ヌクレオチドであるハイブリッド形成領域を有する。そのようなリボザイムの構成と生産は当該技術分野においてよく知られており、ハーゼロフ　ジェーおよびゲルラヒ　ダブリュ　エル（Ｈａｓｅｌｏｆｆ　Ｊ．ａｎｄ　Ｇｅｒｌａｃｈ　Ｗ．Ｌ．）、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、第３３４巻、５８５〜５９１ページにより十分に記載されている。
【００９１】
本発明のリボザイムは、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ　Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａに自然に存在し（ＩＶＳまたはＬ−１９　ＩＶＳ　ＲＮＡとして知られている）、トーマス　セヒ（Ｔｈｏｍａｓ　Ｃｅｃｈ）および共同研究者らにより広範に記載されているもののようなＲＮＡエンドリボヌクレアーゼも含む（以後「Ｃｅｃｈタイプリボザイム」と称する）（ザウら（Ｚａｕｇ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２２４巻、５７４〜５７８ページ、ザウ　エー　ジェーおよびセヒ　ティー　アール（Ｚａｕｇ　Ａ．Ｊ．ａｎｄ　Ｃｅｃｈ　Ｔ．Ｒ．）、１９８６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３１巻、４７０〜４７５ページ、ザウら（Ｚａｕｇ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ、第３２４巻、４２９〜４３３ページ、ユニバーシティパテントインコーポレイティド社により１９８８年６月に公表された国際特許公開第ＷＯ８８／０４３００号、ビーン　エム　ディーおよびセヒ　ティー　アール（Ｂｅｅｎ　Ｍ．Ｄ．ａｎｄ　Ｃｅｃｈ　Ｔ．Ｒ．）、１９８６年、Ｃｅｌｌ、第４７巻、２０７〜２１６ページ）。Ｃｅｃｈエンドリボヌクレアーゼは、標的ＲＮＡ配列とハイブリッド形成し、その後、標的ＲＮＡの開裂が起こる８塩基対活性部位を有する。本発明は、対象ポリヌクレオチドに存在するが、脂肪酸酵素の他のポリヌクレオチドに存在しない８塩基対活性部位配列を標的とするＣｅｃｈタイプリボザイムを含む。
【００９２】
化合物は、送達媒介体としてのリポソームの使用を含むがこれに限定されない、当該技術分野において知られている様々な方法により投与することが可能である。裸のＤＮＡおよびＲＮＡも、末端の修飾、円形分子の形成、あるいはホスホチオネートおよびチオホスホリル修飾結合などの別の結合の使用によるなど、分解に対して抵抗性のある形態である場合には使用することができる。さらに、核酸の送達は、核酸分子がポリリシンまたはトランスフェリンに結合している輸送により促進される可能性がある。核酸は、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ＡＡＶおよびアデノウイルスを含むが、これらに限定されない様々なウイルス担体のいずれかにより細胞中に輸送することもできる。
【００９３】
あるいは、そのようなアンチセンスのリボザイム、３重らせんまたは対象ポリヌクレオチドをコードまたはこれらのいずれかである組換え核酸分子を構築することが可能である。核酸分子はＲＮＡでもＤＮＡでもよい。もし核酸がＲＮＡをコードしている場合、所望のＲＮＡ産物の十分なコピーが生産されるように、その配列を作動的に調節要素に連結させることが好ましい。調節要素は、配列の構成的または調節的転写を可能にする。ｉｎ　ｖｉｖｏすなわち、細胞すなわち生物の細胞内では、１つまたは複数のＲＮＡｓをコードする細菌プラスミドまたはウイルスＲＮＡまたはＤＮＡのような転移ベクターを細胞にトランスフェクションすることができる（例えば、レウェリンら（Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８７年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１９５巻、１１５〜１２３ページ、ハナハンら（Ｈａｎａｈａｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８３年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１６６巻、５５７〜５８０ページ）。細胞内では、転移ベクターは、複製することができ、細胞ポリメラーゼにより転写されて、ＲＮＡを生産するか、あるいは宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。あるいは、転移ベクターまたはその一部が宿主細胞のゲノムに組み込まれるように、１つまたは複数のＲＮＡｓをコードする配列を含む転移ベクターをマイクロインジェクションのようなマイクロマニュピュレーション法により細胞にトランスフェクションするか、細胞に導入することができる。
【００９４】
医薬組成物の組成、製剤および投与
本発明の医薬組成物は、それ自体知られている方法、例えば、通常の混合、溶解、造粒、糖衣丸調製、研和、乳化、カプセル封入、封入または凍結乾燥工程により製造することができる。
【００９５】
したがって、本発明に従って使用する医薬組成物は、医薬として使用し得る製剤への活性化合物の処理を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容できる担体を用いて通常の方法で調合することができる。適切な製剤は、選択する投与経路によって決まる。
【００９６】
注射の場合、本発明の薬剤は、水溶液、好ましくは、ハンクス液、リンガー液または生理食塩水緩衝液のような生理学的に適合する緩衝液を用いて調合することができる。経粘膜投与の場合、透過すべきバリアに適した浸透剤を製剤に用いる。そのような浸透剤は当該技術分野において一般的に知られている。
【００９７】
経口投与の場合、活性化合物を当分野で知られている医薬として許容できる担体と混合することにより、該化合物を容易に調合することが可能である。そのような担体は、本発明の化合物を、治療する患者が経口摂取するための錠剤、丸薬、糖衣丸、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤等に調合することを可能にする。経口投与用製剤は、固体賦形剤を用いて、任意選択で、望ましい場合、錠剤または糖衣丸コアを得るために適切な補助剤を添加した後に、得られた混合物を粉砕し、粒剤の混合物を処理して、得ることが可能である。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールなどの糖のような増量剤、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のようなセルロース製剤である。望ましい場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような崩壊剤を加えてもよい。
【００９８】
糖衣丸コアは、適切なコーティングを施す。この目的のために、任意選択でアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液および有機溶媒または溶媒混合物を含んでいてもよい濃糖溶液を用いることができる。活性化合物の用量の異なる組合せを識別または特徴づけのために、染料または含量を錠剤または糖衣丸コーティングに加えてもよい。
【００９９】
経口で使用し得る製剤には、ゼラチン製の押しばめカプセルならびにゼラチンとグリセロールまたはソルビトールのような可塑剤で調製した軟性封入カプセルなどがある。押しばめカプセルには、ラクトースのような増量剤、デンプンのような結合材および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤および任意選択で安定剤との混合物の形で有効成分を含めることが可能である。軟性カプセルにおいては、活性化合物は脂肪油、流動パラフィンまたは液状ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解または懸濁してよい。さらに、安定剤を加えてもよい。経口投与用のすべての製剤は、そのような投与に適した用量のものであるべきである。
【０１００】
口腔内投与の場合、組成物は、通常の方法で調合した錠剤またはトローチ剤の形態とすることができる。
吸入投与の場合、本発明に従って使用する化合物は、加圧容器または噴霧器からの、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素または他の適切なガスを用いたエアゾール噴霧の形で適宜送達する。加圧エアゾールの場合、用量単位は計測量を送達する弁を設けることにより決定することができる。吸入器または注入器用の例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物とラクトースまたはデンプンのような適切な粉末基剤との粉末混合物を含むものを調合することができる。
【０１０１】
化合物は、注射、例えばボーラス注射または持続注入による非経口投与用に製剤化することができる。注射用製剤は、ユニット剤形、例えば、保存料を加えてアンプルまたは複数回分容器入りとすることができる。組成物は、油性または水性賦形剤中懸濁剤、溶液または乳剤のような形態とすることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤のような調合助剤を含んでいてよい。
【０１０２】
非経口投与用製剤としては、水溶性の形態の活性化合物の水溶液などがある。さらに、活性化合物の懸濁剤を適切な油性懸濁注射剤として調製することができる。適切な親油性溶媒または媒介体としては、ゴマ油のような脂肪油もしくはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステルもしくはリポソームなどがある。水性懸濁注射剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのような懸濁剤の粘度を増加させる物質を含んでいてよい。任意選択で、懸濁剤は、適切な安定化剤または高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために化合物の溶解度を増加させる薬剤も含んでいてよい。
【０１０３】
あるいは、有効成分は、使用前に適切な賦形剤、例えば、発熱物質非含有滅菌水で構成するために粉末状であってよい。
化合物は、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドのような通常の坐剤基剤を含む坐剤または停留浣腸剤のような直腸内組成物として製剤化してもよい。
【０１０４】
前述の製剤に加えて、化合物をデポ製剤として調合してもよい。そのような長時間作用性製剤は、植込み（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば化合物を適切な高分子または疎水性物質（例えば許容し得る油中乳剤として）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいはやや溶けにくい誘導体として、例えばやや溶けにくい塩として製剤化してもよい。
【０１０５】
本発明の疎水性化合物用の薬剤担体は、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機高分子および水相からなる共溶媒系である。当然、共溶媒系の割合は、その溶解性および毒性特性を失うことなく、著しく変化することがある。さらに、共溶媒成分の同一性も変化する可能性がある。
【０１０６】
あるいは、疎水性薬剤化合物の他の送達系を用いることができる。リポソームおよび乳剤は、疎水性薬物の送達媒介体または担体のよく知られている例である。通常毒性がより大きいという犠牲を払うが、ジメチルスルホキシドのような特定の有機溶媒も用いることができる。さらに、化合物は、治療薬を含む疎水性固体高分子の半透過性マトリックスのような徐放性システムを用いて送達することができる。様々な徐放性材料が確立されており、当業者によく知られている。徐放性カプセル剤は、それらの化学的性質によって、化合物を数週間から最長１００日間放出する。治療薬の化学的性質および生物学的安定性によっては、タンパク質の安定化の追加戦略を用いてもよい。
【０１０７】
医薬組成物は、適切な固体またはゲル相担体または賦形剤を含んでいてもよい。そのような担体または賦形剤としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリエチレングリコールのような高分子などがあるが、これらに限定されない。
【０１０８】
本発明の化合物の多くは、製薬学的に適合する対イオンを有する塩として提供される。製薬学的に適合する塩は、塩化水素、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含むがこれらに限定されない多くの酸を用いて形成されていてよい。塩は、水性または遊離塩基形に対応する他のプロトン性溶媒により溶けやすい傾向がある。
【０１０９】
適切な投与経路は、例えば、経口、直腸内、経粘膜、経皮または腸内投与、筋肉内、皮下、脊髄内注射などの非経口的送達、ならびに髄膜内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内または眼内注射などである。
【０１１０】
あるいは、化合物を全身的でなく、局所的に、例えば、罹患部位への化合物の直接注射により、しばしばデポ製剤または徐放性製剤として投与することができる。
【０１１１】
さらに、薬剤を標的指向型薬物送達系、例えば、罹患細胞に特異的な抗体で被覆したリポソームに入れて投与することができる。そのリポソームは、当該細胞を標的とし、それによって選択的に取り込まれるであろう。
【０１１２】
医薬組成物は一般的に、特定の適応症または複数の適応症の治療または予防に有効な量で投与する。最適用量は、各治療様式および適応症ごとの標準的方法により、その重症度、投与経路、複雑化条件等を考慮に入れて決定することは理解される。治療でまたは予防として、活性物質を注射用組成物、例えば、好ましくは等張性の無菌の水性分散剤として投与することができる。治療上有効な用量は、そのような疾患に伴う症状の改善をもたらすのに有効な化合物の量を指す。本出願の化合物の製剤および投与の技術は、マック　イー　ダブリュ（Ｍａｃｋ　Ｅ．Ｗ．）、１９９０年、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、マックパブリッシングカンパニー社（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ）、米国ペンシルバニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）、第１３版に見いだすことができる。哺乳類、特にヒトへの投与の場合、活性物質の１日投与量は０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、一般的に約０．０１ｍｇ／ｋｇであると予想される。いずれにしても医師は、個人にとって最も適切で、年齢、体重および個人の反応により異なる実際の投与量を決定する。上記の用量は平均的な場合の例示である。もちろんより高いまたはより低い用量範囲が正当である個別の例があり得る。そのようなものは本発明の範囲内である。
【０１１３】
したがって、本発明は、脂質代謝障害を促進する化合物をスクリーニングし、選択する方法、および脂質代謝障害ならびに糖尿病性神経障害を治療または抑制する化合物をスクリーニングし、選択する方法を提供する。選択される拮抗物質および作用物質は、例えば、動脈高血圧、高コレステロール血症、アテローム動脈硬化性心疾患、慢性炎症性疾患および自己免疫疾患、アレルギー性湿疹および他のアトピー性疾患ならびにヒト膵臓癌を含む癌のような進行性および急性疾患を抑制するために投与することができる。
【０１１４】
本発明の拮抗物質、作用物質および他の化合物は、単独または治療用化合物のような他の化合物とともに用いることができる。医薬組成物は、例えば、罹患部位への直接マイクロインジェクションまたは静脈内または他の経路による投与を含む効果的で都合のよい方法で投与することができる。本発明のこれらの組成物は、対象への投与に適した薬剤担体のような非滅菌または滅菌担体もしくは細胞、組織または生物体用の担体と組み合わせて用いることができる。そのような組成物は、例えば、培地添加物もしくは本発明の治療上有効な量の拮抗物質または作用物質および医薬として許容できる担体または賦形剤からなっている。そのような担体としては、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびその組合せなどがあるが、これらに限定されない。製剤は、投与の様式に適するように調製する。
【０１１５】
本発明はさらに、本発明の前述の組成物の１つまたは複数の成分を充てんした１つまたは複数の容器を含む診断用および薬剤パックならびにキットを提供する。そのような容器が医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府当局により規定された形式で届出することが可能であることに関連して、ヒト投与用の製剤の製造、使用または販売を規制する当局による承認を反映している。
【０１１６】
医薬組成物は一般的に、特定の適応症または複数の適応症の治療または予防に有効な量で投与する。最適用量は、各治療様式および適応症ごとの標準的方法により、その重症度、投与経路、複雑化条件等を考慮に入れて決定することは理解される。治療でまたは予防として、活性物質を注射用組成物、例えば、好ましくは等張性の無菌の水性分散剤として投与することができる。哺乳類および特にヒトへの投与の場合、活性物質の１日投与量は０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、一般的に約０．０１ｍｇ／ｋｇであると予想される。いずれにしても医師は、個人にとって最も適切で、年齢、体重および個人の反応により異なる実際の投与量を決定する。上記の用量は平均的な場合の例示である。もちろんより高いまたはより低い用量範囲が正当である個別の例があり得、そのような例は本発明の範囲内である。
【０１１７】
本発明が、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール、細胞株、ベクターおよび試薬に限定されないことは勿論である。一般的に、下記の細胞培養および分子遺伝学における実験手順は当該技術分野においてよく知られているものであり、一般的に用いられている。組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、微生物培養、形質転換、トランスフェクション等に標準的手法が使用される。一般的に、酵素反応および精製工程は、製造者の仕様に従って実施する。本明細書に記載されているものと類似または同等のあらゆる方法および材料を、本発明の実施またはテストに使用することが可能ではあるが、選択した方法、装置および材料を以下に説明する。
【０１１８】
本発明の完全な理解を促進するために、以下で定義する用語は以下の意味を有している。
「作用物質」は、他の分子の活性を増大させる薬物またはホルモンのようなあらゆる分子または薬剤を指す。
【０１１９】
「拮抗物質」は、他の分子の活性を阻害または消失させる薬物またはホルモンのようなあらゆる分子または薬剤を指す。
「制御領域」は、遺伝子の転写を開始、終結を支援または妨げること、また他の状況では調節することができる、または必要とする１つの遺伝子または複数の遺伝子もしくはそのフラグメントを指す。制御領域はプロモーター、エンハンサー、サイレンサーおよび／または他の調節要素を含み得る。制御領域は、単独でまたは独占して、転写を十分に開始、終結あるいは調節し得るか、またはし得ないが、他の核酸配列と協力してそのような調節を行い得る核酸配列を含むこともできる核酸配列も含み得る。
【０１２０】
「デサチュラーゼ」は、脂肪酸分子の炭化水素領域における二重結合を生成させることができる酵素である脂肪酸デサチュラーゼを指す。
「脂肪酸」は、長い飽和もしくは１価または多価不飽和炭化水素鎖と末端カルボキシル基とからなる化合物のクラスである。
【０１２１】
「脂肪酸δ−５−デサチュラーゼ（Ｄ５Ｄ）」は、脂肪酸分子におけるカルボキシル基から数えて炭素５と炭素６の間に二重結合を生成させることができる酵素である。
【０１２２】
「脂肪酸δ−６−デサチュラーゼ」は、脂肪酸分子におけるカルボキシル基から数えて炭素６と炭素７の間に二重結合を生成させることができる酵素である。
本明細書で用いている「機能酵素」は、既知の酵素活性を有する生物学的に活性または不活性のタンパク質を指す。
【０１２３】
「エンハンサー」は、特定の１つの転写因子または複数の転写因子により結合されたときに、転写を促進または増大させるＤＮＡ調節要素からなる核酸配列である。エンハンサーは、必ずという訳ではないが、一般的に、標的遺伝子の近位プロモーターの外側にあって、標的遺伝子の転写開始部位から数キロ塩基（ｋｂ）の位置にある。さらに、エンハンサーは、特定の因子により結合されたとき、いずれの方向にもいずれの位置においても（プロモーターに対して上流または下流）機能し、作用して高いレベルの遺伝子発現をもたらす。さらに、本発明によれば、エンハンサーは脂肪酸デサチュラーゼの酵素活性を増大または促進し、かつ／または脂肪酸デサチュラーゼをコードする遺伝子の転写を増大または促進する化合物（すなわち、試験成分）も指す。
【０１２４】
「遺伝子」は、その配列が特定のタンパク質またはポリペプチド鎖の制御された正常な生産に必要な情報を含む核酸分子またはその一部を指す。核酸構築物の「異種」領域（すなわち、異種遺伝子）は、本来は該構築物の他の遺伝子成分に連結して認められないより大きい核酸構築物内のＤＮＡの識別可能なセグメントである。したがって、異種遺伝子が哺乳類脂肪酸デサチュラーゼをコードしているとき、該遺伝子には通常、源生物体のゲノムにおける構造ゲノムＤＮＡに隣接していないプロモーターが隣接する。
【０１２５】
「宿主系」は、転写および／または外因性ポリヌクレオチド配列による転写と続く機能タンパク質またはポリペプチドを生成する翻訳を可能にする環境または条件を提供する細胞、組織、器官、生物体またはその一部からなる。
【０１２６】
「阻害剤」は、脂肪酸デサチュラーゼの酵素活性を低下または阻害するか、もしくは脂肪酸デサチュラーゼをコードする遺伝子の転写を低減または抑制する化合物（すなわち、試験成分）を指す。
【０１２７】
「同一性」、「類似性」または「相同性」は、配列を比較することによって判定される２つまたは複数のポリヌクレオチド配列間の関係を指す。当該技術分野では、同一性は、そのような配列ストリング（ｓｔｒｉｎｇ）間の一致によって判定されるポリヌクレオチド配列間の配列関係の程度も意味する。同一性と類似性とは容易に計算し得る（レスク　エー　エム（Ｌｅｓｋ　Ａ．Ｍ．）編、１９８８年、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、オックスフォードユニバーシティプレス（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク）、スミス　ディー　ダブリュ（Ｓｍｉｔｈ　Ｄ．Ｗ．）編、１９９３年、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔ、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク）、グリフィン　エー　エムおよびグリフィン　エッチ　ジー（Ｇｒｉｆｆｉｎ　Ａ．Ｍ．ａｎｄ　Ｇｒｉｆｆｉｎ　Ｈ．Ｇ．）編、１９９４年、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ　１、フマナプレス（Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニュージャージー）、フォンヘイネ　ジー（ｖｏｎＨｅｉｊｎｅ　Ｇ．）、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク）およびグリブスコフ　エムおよびデベラウフ　ジェー（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ　Ｍ．ａｎｄ　Ｄｅｖｅｒｅｕｘ　Ｊ．）編、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐｒｉｍｅｒ、エムストックトンプレス（Ｍ　Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク）。２つのポリヌクレオチド配列間の同一性と類似性を測定する多くの方法が存在するが、両用語は当業者によく知られている（フォンハイネ　ジー（ｖｏｎ　Ｈｅｉｊｎｅ　Ｇ．）、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク）、グリブスコフ　エムおよびデベラウフ　ジェー（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ　Ｍ．ａｎｄ　Ｄｅｖｅｒｅｕｘ　Ｊ．）編、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐｒｉｍｅｒ、エムストックトンプレス（Ｍ　Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク）およびカリロ　エッチおよびリップマン　ディー（Ｃａｒｉｌｌｏ　Ｈ．ａｎｄ　Ｌｉｐｍａｎ　Ｄ．）、１９８８年、ＳＬＡＭ　Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ、第４８巻、１０７３ページ）。配列間の同一性と類似性を測定するのに一般的に用いられている方法としては、カリロ　エッチおよびリップマン　ディー（Ｃａｒｉｌｌｏ　Ｈ．ａｎｄ　Ｌｉｐｍａｎ　Ｄ．）、１９８８年、ＳＬＡＭ　Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ、第４８巻、１０７３ページに記載されている方法があるが、これに限定されない。同一性と類似性を測定する方法は、コンピュータプログラムに組み込まれている。２つの配列間の同一性と類似性を測定するコンピュータプログラムの方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（デベラウフら（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８４年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．第１２巻１号、３６７〜３９５ページ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（アルチュールら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９０年、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、第２１５巻、４０３〜４１０ページ）などがあるが、これらに限定されない。
【０１２８】
「分離」は、その自然状態から「人に手により」変化した、すなわち、天然に存在している場合、変化したか、その元の環境から除去された、またはその両方であることを意味する。例えば、生存生物体に自然に存在する自生ポリヌクレオチドは「分離」されていないが、その自然状態の共存する物質から分離された同じポリヌクレオチドは、この用語が本明細書において用いられているように「分離」されている。その一部としてまたは分離後に、例えば、そのようなポリヌクレオチドを突然変異誘発のため、融合タンパク質を形成させるため、また宿主中での増殖または発現のためにＤＮＡのような他のポリヌクレオチドに結合させる。単独またはベクターのような他のポリヌクレオチドに結合した分離ポリヌクレオチドは、培養中または丸ごとの生物体中の宿主細胞に導入し得る。培養中または丸ごとの生物体中の宿主細胞に導入されたとき、天然に存在している形で、あるいは環境中に存在していないため、この用語が本明細書で用いられているように、そのようなＤＮＡは分離されていない。同様に、ポリヌクレオチドは、例えば、培地製剤、ポリヌクレオチドの導入用の溶液のような組成物中に、また例えば、天然に存在しない組成物である化学または酵素反応用の細胞、組成物または溶液中に存在する可能性があり、この場合にも分離ポリヌクレオチドは、本明細書で用いられているようなこの用語の意味の範囲内にある。
【０１２９】
「核酸構築物」は、ポリヌクレオチド配列に組み込まれるプラスミドまたはベクターを含むが、これらに限定されない遺伝子要素を指す。例えば、核酸構築物は、異種遺伝子に作動的に連結されているプロモーターまたは制御領域からなるベクターであってよい。
【０１３０】
本明細書で用いられている「作動的に連結されている」とは、プロモーターまたは制御領域の存在またはモジュレーションが、リポーター配列の遺伝子を含む異種遺伝子の転写に影響を及ぼすような核酸構築物のプロモーターまたは制御領域と異種遺伝子との連結を示す。作動的に連結されている配列は、同じＲＮＡ転写物上で転写される２つのセグメントも含むことがある。したがって、プロモーターおよびリポーター配列のような２つの配列は、プロモーターにおいて開始する転写がリポーター配列のＲＮＡ転写物を生成させるならば、作動的に連結されている。
【０１３１】
「プロモーター」は、下流（３’方向）遺伝子の転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼを直接または間接的に結合することができるＤＮＡ調節要素からなる核酸配列を指す。本発明によれば、ヌクレオチド配列を含む核酸構築物のプロモーターで、プロモーターの誘導が異種遺伝子の転写に影響を及ぼすようにヌクレオチド配列が異種遺伝子に連結されている。
【０１３２】
「組換え」は、組換えＤＮＡ技術により生成され、天然に存在する核酸配列と異なる核酸配列、遺伝子またはそのフラグメントの組換えまたは新規の組合せを指す。
【０１３３】
「調節要素」は、異種遺伝子を含む連結遺伝子または遺伝子の発現を転写を介して調節するように、活性化転写調節タンパク質もしくは１つまたは複数の活性化転写調節タンパク質からなる複合体が結合する核酸配列の全体または一部からなるデオキシリボヌクレオチド配列を指す。
【０１３４】
「リポーター遺伝子」は、宿主細胞または宿主系により他の状況では生産されないか、あるいは宿主細胞または宿主系において最小限または無視し得る量で生産され、リポーター遺伝子産物が定量的に測定して宿主細胞または宿主系における転写活性のレベルを分析することができるような様々な既知の方法により検出可能であるポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列である。例としては、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ、分泌性胎盤性アルカリホスファターゼおよび他の分泌性酵素の遺伝子などがある。
【０１３５】
「サイレンサー」は、標的遺伝子の領域におけるサイレンサー配列が、プロモーターにおける標的遺伝子の転写を、別個のＤＮＡセグメントとしてのその作用により、あるいは、これらの遺伝子要素に結合し、その結果、標的遺伝子の発現に対して負の制御をもたらすトランス作用因子の作用により抑制するようなＤＮＡ制御領域の核酸配列またはセグメントを指す。
【０１３６】
「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」は、特異性を与えるに十分に厳密で、ミスマッチの数を低減し、許容できる速度で安定な雑種の生成を可能にするに十分に柔軟である条件である。そのような条件は当業者に知られている（サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）。例のみとして、短いヌクレオチドを用いたストリンジェントなハイブリッド形成は、０．０１〜０．１ｐｍｏｌ／ｍｌのような高濃度のプローブを用いてＴ_Ｍ以下で５〜１０℃で実施することができる。好ましくは「ストリンジェントな条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、好ましくは９７％の同一性が存在するならば、ハイブリッド形成が起こることを意味する。
【０１３７】
「タグ」は、特定の短いアミノ酸配列またはオリゴヌクレオチド配列を指し、前記アミノ酸または核酸配列が、例えば、市販の抗体または６ヒスチジン残基のストリングにより認識されるＶ５エピトープを構成またはコードする。実際には、タグはタグ付きタンパク質のその後の識別および精製を容易にする。
【０１３８】
本明細書で用いている「タグ付きタンパク質」は、連結したタグ配列を構成するタンパク質を指す。本発明に従って、タグ付きタンパク質は、デサチュラーゼアミノ酸配列のカルボキシル末端におけるＶ５エピトープおよび６ヒスチジン残基に連結した哺乳類脂肪酸デサチュラーゼポリペプチドを指す。
【０１３９】
本明細書で用いている「試験成分」は、小分子（例えば、小有機分子）、薬剤化合物または薬物、ペプチド、タンパク質、抗体または抗体フラグメント、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸配列を含む。
【０１４０】
「１または複数の連結遺伝子の発現を転写的に調節する」ことは、そのような１または複数の遺伝子の転写の速度を変化させることを意味する。
「トランスフェクション」は、外因性または異種ＤＮＡ（すなわち核酸構築物）がレシピエント真核宿主細胞に導入される過程を指す。したがって、真核細胞においては、宿主細胞への外因性ＤＮＡの獲得をトランスフェクションと称する。真核トランスフェクションは、細菌細胞が外因性または異種ＤＮＡを獲得する細菌形質転換と類似していることに注意すべきである。原核細胞および真核細胞（例えば、酵母および哺乳類細胞）において、導入されたＤＮＡはプラスミドのようなエピソーム要素上に維持されるか、宿主ゲノムに組み込まれる。真核細胞に関しては、安定にトランスフェクションされた細胞は、導入されたＤＮＡが染色体に組み込まれ、その結果、それが染色体複製により娘細胞に引き継がれるものである。この安定性は、導入ＤＮＡを含んだ娘細胞集団からなる細胞系または細胞クローンを、その真核細胞が樹立できることによって示される。
【０１４１】
本明細書で用いている「トランスフェクション／形質転換」は、外因性または異種ＤＮＡ（すなわち核酸構築物）が真核または原核宿主細胞または宿主系に導入された過程を指す。
【０１４２】
「形質転換」は、外因性または異種ＤＮＡ（すなわち核酸構築物）がレシピエント原核宿主細胞に導入される過程を指す。したがって、原核細胞においては、宿主細胞への外因性ＤＮＡの獲得を形質転換と称する。細菌形質転換は真核トランスフェクションと類似していることに注意すべきである。さらに、真核細胞における形質転換は、腫瘍化状態と類似した、真核細胞の培養中の無制限増殖の状態への転換または形質転換を指すことにも注意すべきである。原核細胞および真核細胞（例えば、酵母および哺乳類細胞）において、導入されたＤＮＡはプラスミドのようなエピソーム要素上に維持されるか、宿主ゲノムに組み込まれる。原核細胞に関しては、安定に形質転換された細菌細胞は、導入されたＤＮＡが染色体に組み込まれ、その結果、それが染色体複製により娘細胞に引き継がれるものである。この安定性は、原核細胞が細胞株を樹立する能力を有すること、またはクローンが導入されたＤＮＡを含む娘細胞の集団からなっていることにより立証される。
【０１４３】
本明細書で用いた用語は、特定の実施形態を説明するためのものであり、特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではない。別に定義しない限り、本明細書で用いたすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的の理解している意味と同じ意味を持つものとする。
【０１４４】
本発明は、下記の有用な実施例を参照することで、さらに詳しく説明されると共に、より十分な理解が得られよう。これらの非限定的実施例は、本発明の原理の例示にすぎないと考えるべきである。当業者にとっては多くの改変例および変更例が容易であるため、本発明を、図示すると共に説明したそのままの構成と操作に限定することは望ましくない。したがって、すべての適切な改変例や等価物を使用することができ、それらは本発明および特許請求の範囲に包含される。
【０１４５】
（実施例）
実施例１−ラットおよびヒトデサチュラーゼ遺伝子のクローニング
ＲＮＡ抽出：製造者により説明されているように、ラット肝またはヒト細胞株Ｃｈａｎｇ（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ−１３）からＴＲＩｚｏｌ試薬溶液を用いて全ＲＮＡを抽出した。
【０１４６】
逆転写：約１μｇの各ＲＮＡ試料を３ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、７５ｍＭ　ＫＣｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２ｎｇ／μｌのランダムプライマー（パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ））、各１．０ｍＭ　ｄＮＴＰ、２．０Ｕ／μｌのＲＮアーゼ阻害剤（パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ））および１０Ｕ／μｌのＭｕＬＶ逆転写酵素（パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ））を用いて逆転写した。反応は、最終体積２０μｌで４２℃で３０分間行った。次いで、酵素を９４℃で５分間不活性化した。
【０１４７】
ＰＣＲによるデサチュラーゼ遺伝子の増幅および酵母ベクターでのクローニング：ヒトデサチュラーゼ遺伝子のコード配列に対応するｃＤＮＡを生じるようにデザインされたプライマーを用いて、逆転写反応のアリコート（５μｌ）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。
【０１４８】
ｐＹＥＳ２およびｐＹＥＳ２／ＣＴベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中でのクローニングのために２組のプライマーを用いてｈＤ５Ｄ遺伝子を２段階の工程で増幅した。ｐＹＥＳ２ベクターへのｈＤ５Ｄ遺伝子のクローニングのための最初の前方向および逆方向プライマーはそれぞれ
【０１４９】
５’−ＣＡＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣＣＧＴＣＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＴ［ＡＴＧＧ］−３’（配列番号５）および
５’−ＣＡＣＴＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＧＧＴＧＧＣＴＧＴＴＧ［Ｔ］−３’（配列番号６）であった。翻訳開始および終結コドン（またはその一部）は［］で括った箇所である。ＰＣＲ産物は、単一ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位（下線）を含み、これらの部位でｐＹＥＳ２ベクターへクローニングした。この構築物をｐＹｈ５００６．１と命名した。
【０１５０】
上記のベクター構築物（ｐＹｈ５００６．１）からのｈＤ５Ｄ遺伝子を増幅するのに用いた前方向および逆方向プライマーはそれぞれ
５’−ＣＡＣＧＣＧＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡ［ＡＴＧ］ＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＧＧ−３’（配列番号７）および
５’−ＣＡＣＧＣＧＴＣＴＡＧＡ［ＴＴＡ］ＴＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＡＧＧＣＡＴＣＴＡＧＣＣＡＧＣＧＣＴ−３’（配列番号８）である。
【０１５１】
翻訳開始および終結コドンは［］で括った箇所である。このＰＣＲ産物は、単一ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限部位（下線）を含み、これらの部位でｐＹＥＳ２ベクターへクローンした。ｐＹｈ５００６．１からのｈＤ５Ｄ遺伝子をｐＹＥＳ２／ＣＴベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へクローニングするための逆方向プライマーは、タンパク質の検出と精製のためのＣ末端タグを含み、５’−ＣＡＣＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＡＧＧＣＡＴＣＴＡＧＣＣＡＧＡＧＣＴＧ−３’（配列番号９）であり、前方向プライマーはｐＹＥＳ２の構築に用いたものと同じであった。逆方向プライマーは停止コドンを有さず、したがって、遺伝子をＣ末端タグと同じフレームに入れる。ｈＤ５Ｄ遺伝子を含むｐＹＥＳ２／ＣＴおよびｐＹＥＳ２構築物をそれぞれ、ｐＴｈ５００９．１およびｐＹｈ５００６．３と命名した（それぞれ図５および６）。
【０１５２】
ｐＹＥＳ２ベクターへのクローニング用のｒＤ５Ｄの前方向および逆方向プライマーはそれぞれ
５’−ＣＡＣＧＣＧＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡ［ＡＴＧ］ＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＧＧ−３’（配列番号１０）および
５’−ＣＡＣＧＣＧＴＣＴＡＧＡ［ＴＴＡ］ＴＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＡＧＧＣＡＴＣＴＡＧＣＣＡＧＣＧＣＴ−３’（配列番号１１）であった。
【０１５３】
これらのプライマーはｈＤ５Ｄ遺伝子用にデザインされていたが、ｒＤ５Ｄ遺伝子をラット肝ｃＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物は、それぞれ翻訳開始および停止コドン（［　］で括った箇所）に隣接したＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａｌ部位（下線）を含んでいた。ｐＹＥＳ２ベクター中のｒＤ５Ｄ遺伝子構築物をｐＹｒ５０１４．１と命名した（図７）。
【０１５４】
Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦポリメラーゼ（クロンテク社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用い、製造者の指示に従ってＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＱＩＡクイックゲル抽出キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）を用いてゲル精製した。
【０１５５】
精製ＰＣＲ産物と酵母発現ベクターｐＹＥＳ２およびｐＹＥＳ２／ＣＴを、増幅中に生じた制限部位に従った特異的制限酵素を用いて消化し、精製した。消化されたベクターおよびＰＣＲ産物を連結し、コンピテント大腸菌株ＩＮＶαＦ’（ｈＤ５Ｄ用）または株ＴＯＰ１０（ｒＤ５Ｄ用）（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ））に入れて形質転換させ、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で選択した。選択したコロニーを増幅し、プラススミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ　ｓｐｉｎ　ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて分離した。すべてのプラスミド構築物は、ＤＮＡ配列分析により確認した。プラスミドを用いたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＩＮＶＳｃ１（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ））の形質転換を、酢酸リチウム法（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ））を用いて行い、ウラシル欠損合成最少培地（ＳＣ−Ｕ）上で組換え酵母細胞を選択した。
【０１５６】
酵母株の構築：ＩＮＶＳｃ１の遺伝子型は（Ｍａｔａ／Ｍａｔα　ｈｉｓ３Δ１／ｈｉｓ３Δ１　ｌｅｕ２／ｌｅｕ２　ｔｒｐ１−２８９／ｔｒｐ１−２８９　ｕｒａ３−５２／ｕｒａ３−５２）である。前述のようにデサチュラーゼ遺伝子でＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを形質転換した後、得られた株は、デサチュラーゼ構築物を除いて、ＩＮＶＳｃ１と同質遺伝子であった。
【０１５７】
実施例２−ヒトデサチュラーゼ制御領域のクローニングおよび同定
ｈＤ５Ｄ制御領域をヒト白血球ゲノムＤＮＡから２ラウンドのＰＣＲ反応によりクローニングした。最初のＰＣＲ反応では以下のプライマー、すなわち、ｈＤ５Ｄコード配列の位置＋１２７から始まる逆方向プライマー（５’−ＣＡＣＣＴＴＡＣＧＧＴＣＧＡＴＣＡＣＴＡ−３’；配列番号１２）、および翻訳開始コドンＡＴＧから上流側位置−１３５７から始まる前方向プライマー（５’−ＣＴＣＡＧＴＧＣＴＴＧＧＧＡＣＡＧＴＴＡ−３’；配列番号１３）を用いた。
【０１５８】
ＰＣＲ増幅は、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＧｅｎｅＡＭＰ　ＰＣＲシステム９７００機器を用い、０．５μｇのゲノムＤＮＡ、０．４μＭの各プライマー、１×ｄＮＴＰミックス（クロンテク社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、米国カリフォルニア州）、１×ＰＣＲ反応緩衝液（クロンテク社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））および１×Ａｄｖａｎｔａｇｅポリメラーゼミックス（クロンテク社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を含む５０μｌの反応体積で行った。
【０１５９】
ＰＣＲ反応の条件は
９４℃で２秒間を７サイクル、７２℃で３分間
９４℃で２秒間を３２サイクル、６７℃で３分間
６７℃で４分間
とした。
ＰＣＲ産物をＱＩＡクイックゲル抽出キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いてゲル精製し、ＴＡクローニングベクターｐＣＲＩＩ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ））に挿入した。得られたｐＣｈ４０１２．１と呼ばれるプラスミドを、コード配列の部分を含まないｈＤ５Ｄ制御領域をクローニングすることを目的とした２回目ＰＣＲ反応における鋳型として用いた。
【０１６０】
２回目のＰＣＲ反応に用いた前方向および逆方向プライマーはそれぞれ
５’−ＧＡＣＧＡＧＣＴＣＣＴＣＡＧＴＧＣＴＴＧＧＧＡＣＡＧＴＴＡＴＧＴＴＴ−３’（配列番号１４）および
５’−ＧＡＣＧＡＧＣＴＣＡＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＣＧＡ−３’（配列番号１５）であった。前方向プライマーはｈＤ５Ｄ制御領域の位置−１３５７から始まり、逆方向プライマーはＡＴＧから上流側位置−１から始まる。両プライマーは、ｐＣＡＴ３−ＢａｓｉｃおよびｐＧＬ３−ＢａｓｉｃベクターのＳａｃＩ部位へのクローニングのためのＳａｃＩ認識部位を含んでいた。ＰＣＲ条件は、前述と同じであり、ｐＣｈ４０１２．１を用いた。ゲル精製ＰＣＲ産物とｐＣＡＴ３−ＢａｓｉｃおよびｐＧＬ３−ＢａｓｉｃベクターをＳａｃＩ制限酵素で消化し、連結し、コンピテント大腸菌株ＴＯＰ１０（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ））に形質転換させた。コロニーをアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で選択した。選択したコロニーを増幅し、プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ　ｓｐｉｎ　ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて分離した。形質転換細胞を制限分析によりスクリーニングし、ＤＮＡ配列決定により確認した。ｐＣＡＴ３−ＢａｓｉｃおよびｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクターでクローニングされた１３５７ｂｐのｈＤ５Ｄ制御領域をそれぞれｐＢｈ４０１３．１（図８）およびｐＧｈ４０１４．１（図９）と命名した。
【０１６１】
実施例３−細胞トランスフェクション
細胞株ＺＲ−７５−１およびＨｅｐＧ２を、製造者により説明されたように６ウエルプレートで、５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００試薬（ギブコＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ））を用いて５μｇのプラスミドｐＢｈ４０１３．１およびｐＧｈ４０１４．１でトランスフェクションした。対照プラスミドｐＣＡＴ−３−ＣＴＬおよびｐＣＡＴ３−ＢａｓｉｃまたはｐＧＬ３−ＣＴＬおよびｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃもそれぞれ陽性および陰性対照としてトランスフェクションした。すべての場合に、各トランスフェクション間のトランスフェクション効率を標準化するため、５μｇのプラスミドｐＣＭＶ−β−Ｇａｌ（ｐＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼ対照ベクター；クロンテク社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を同時トランスフェクションし、内部対照として用いた。
【０１６２】
実施例４−ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）酵素検定
ＣＡＴ検定のために、トランスフェクションした細胞をトランスフェクションの４８時間後に収集し、１×レポーターライシス（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ｌｙｓｉｓ）緩衝液（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて細胞タンパク質抽出物を調製する。ＣＡＴ検定は、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）製のＣＡＴ酵素検定システムを用い当社のプロトコールに従って行う。本質的に、約２０μｇのタンパク質抽出物をキットに備えられている７５μＣｉの［１，２−^１４Ｃ］−クロラムフェニコール（ＮＥＮ、米国マサチューセッツ州）および２５μｇのｎ−ブチリルコエンザイムＡとともにインキュベートする。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートする。次いで、３００μｌの混合キシレンを添加して、反応を停止させた。キシレン相を１００μｌの０．２５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐｈ８．０）で２回抽出した。上の２００μｌのキシレン相を１０ｍｌのシンチレーション液（Ｒｅａｄｙ−Ｓａｆｅ、ベックマン社（Ｂｅｃｋｍａｎ）、米国カリフォルニア州）と合わせ、液体シンチレーションカウンターで放射能を計測した。純ＣＡＴ酵素を用いて標準曲線を作製し、抽出物が標準曲線の直線範囲に入る酵素反応をもたらすに十分希釈されていることを確認する。
【０１６３】
各トランスフェクション間のトランスフェクション効率を標準化するために、β−ガラクトシダーゼ酵素活性を内部対照として用いた。同じタンパク質抽出物を１×レポーターライシス緩衝液で１５０μｌに希釈し、２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）、２ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、１００ｍＭβ−メルカプトエタノールおよび１．３３ｍｇ／ｍｌ　ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を含む同じ体積の２Ｘ検定緩衝液（β−ガラクトシダーゼ酵素検定システム、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））とともにインキュベートする。反応混合物を３７℃で３０分間ないし１時間インキュベートする（淡黄色を呈するまで）。５００μｌの１Ｍ炭酸ナトリウムを加えて反応を停止させ、分光側光法により４２０ｎｍで吸光度を測定する。典型的なＣＡＴ検定の結果を表１に示す。
【表１】

【０１６４】
実施例５−ルシフェラーゼ酵素検定
ルシフェラーゼ検定のために、トランスフェクションした細胞をトランスフェクションの４８時間後に収集し、１×レポーターライシス緩衝液（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、当社のプロトコールに従って細胞タンパク質抽出物を調製する。ルシフェラーゼ検定は、ルシフェラーゼＣＡＴ酵素検定システム（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用い当社の推奨事項に従って行った。
実施例４に記載のように、トランスフェクション間のトランスフェクション効率を標準化するためにβ−ガラクトシダーゼ酵素活性を内部対照として用いた。
【０１６５】
実施例６−ｐＹｒ５０１４．１で形質転換したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるδ−５−デサチュラーゼの機能分析
【０１６６】
化学物質および放射性化学物質：アミノ酸を含まない酵母窒素ベース（ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ）はＤｉｆｃｏ（ベクトンディッキンソンカンパニー（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｓｏｎ　Ｃｏ））から購入した。脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン、トリス−ＨＣｌ、テルギトール、炭水化物、アミノ酸および脂肪酸は、シグマアルドリッチカナダ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃａｎａｄａ）、カナダオンタリオ州オークビレ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ）から入手した。すべての有機溶媒（ＨＰＣＬ用）はフィッシャーサイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、米国ニュージャージー州フェアローン（Ｆａｉｒ　Ｌａｗｎ）から入手した。
【０１６７】
［１−^１４Ｃ］−α−リノレン酸および［１−^１４Ｃ］−ジホモ−γ−リノレン酸（放射化学純度９９％、比放射能５２μＣｉ／μｍｏｌ）はＮＥＮ（米国マサチューセッツ州ボストン）から購入した。これらの脂肪酸はＫＯＨ（０．１Ｍ）でけん化し、１％テルギトールを含むＳＣ−Ｕ培地に溶解した。
【０１６８】
インキュベーション：ｐＹｒ５０１４．１で形質転換したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを、１０ｍｌのＳＣ−Ｕ培地、１％テルギトール（Ｏ．Ｄ．０．４、約３．２×１０^６細胞／ｍｌ）および２μＭ（１μＣｉ）の［１−^１４Ｃ］−α−リノレン酸または［１−^１４Ｃ］−ジホモ−γ−リノレン酸のカリウム塩を含む１２５ｍｌ三角フラスコ中でインキュベートした。オービタルインキュベータ中２７０ｒｐｍ、３０℃で５時間インキュベートした後、細胞は対数期に達したので、導入遺伝子発現をガラクトース（最終濃度２％）で誘導した。酵母をさらに１９時間インキュベートし、５０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離して、酵母を収集した。
【０１６９】
細胞を、０．１％ＢＳＡを含むトリス−ＨＣｌ（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）で洗浄し、下記のように総脂質を抽出した。インキュベーション培地、上清および細胞のアリコートの試料の放射能をＬＳ６５００シンチレーションシステム（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ））を用い、液体シンチレーション計数法で測定した。
【０１７０】
ｐＹＥＳ２ベクターで形質転換した宿主酵母を陰性対照として用いた。
脂質の抽出：フォルヒら（Ｆｏｌｃｈ　ｅｔ　ａｌ．）、１９５７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２２６巻、４９７〜５０９ページの方法に従って、クロロホルム／メタノール（２：１体積比）で細胞から総脂質を抽出した。総脂質抽出物を三フッ化ホウ素を用いてメタノール中９０℃で３０分間メチル化した。得られたメチルエステル（ＦＡＭＥ）を下記のように分析した。
【０１７１】
高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）分析：２０５ｎｍに設定したダイオードアレイ検出器、固体シンチレーションカートリッジ（^１４Ｃ検出効率９７％）を備えた放射性同位体検出器（１７１型、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）、米国カリフォルニア州フラートン（Ｆｕｋｋｅｒｔｏｎ））およびμＢｏｎｄａｐａｋ　Ｃ−１８ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）インサートを含む前置カラムを取り付けた逆相ＯＤＳ（Ｃ−１８）ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）カラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ内径、粒子径５μｍ）を装着したヒューレットパッカード（Ｈａｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ）（１０９０、シリーズＩＩ）クロマトグラフ装置を用いて放射性標識ＦＡＭＥｓの分析を行った。ＦＡＭＥｓを１ｍｌ／分の流量のアセトニトリル／水（９５：５体積比）を用いてアイソクラクティックで分離し、標準品と比較して同定した。あるいは、脂肪酸メチルエステルをキャピラリーカラムガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した。
【０１７２】
結果：逆相高性能液体クロマトグラフ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による分析から、ｐＹｒ５０１４．１で形質転換した酵母においては［１−^１４Ｃ］−ジホモ−γ−リノレン酸のみがアラキドン酸（２０：４ｎ−６、ＡＡ）に変換されたことが明らかになった（実施例１、図１２）。ｐＹＥＳ２で形質転換した宿主酵母ではそのような酵素活性は検出されなかった（図１３）。［１−^１４Ｃ］−α−リノレン酸は不飽和化されなかった。この所見から、ｐＹｒ５０１４．１は、δ−６−デサチュラーゼではなく、δ−５−デサチュラーゼを含んでいることが確認された。
【０１７３】
【表２】

結論：トランスジェニックプラスミドｐＹｒ５０１４．１に含まれているラット遺伝子の機能分析から、この遺伝子は、ジホモ−γ−リノレン酸（２０：３ｎ−６）に対して活性である脂肪酸δ−５−デサチュラーゼをコードすることが確認された。
【０１７４】
実施例７−ｐＹｒ５０１４．１またはｐＴｈ５００９．１で形質転換したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるΔ^{８，１１，１４，１７}エイコサテトラエン酸（２０：４ｎ−３、ＥＴＡ）を基質として用いたδ−５−デサチュラーゼの機能分析
【０１７５】
化学物質および放射性化学物質：化学物質および培地は実施例６で説明した。［１−１４Ｃ］−Δ^{８，１１，１４，１７}エイコサテトラエン酸（放射化学純度９９％、比放射能５５μＣｉ／μｍｏｌ）はＡＲＣ、米国ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ）から購入し、ＫＯＨ（０．１Ｍ）でけん化し、１％テルギトールを含むＳＣ−Ｕ培地に溶解した。
【０１７６】
インキュベーション：ｐＹｒ５０１４．１またはｐＴｈ５００９．１で形質転換したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを、１０ｍｌのＳＣ−Ｕ培地、１％テルギトール（Ｏ．Ｄ．０．４、約３．２×１０^６細胞／ｍｌ）および２μＭ（１μＣｉ）の［１−^１４Ｃ］−２０：４ｎ−３のカリウム塩を含む１２５ｍｌ三角フラスコ中でインキュベートした。導入遺伝子発現をガラクトース（最終濃度２％）で誘導した。オービタルインキュベータ中２７０ｒｐｍ、３０℃で２４時間インキュベートした後、５０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離して、酵母細胞を収集した。
【０１７７】
細胞を、０．１％ＢＳＡを含むトリス−ＨＣｌ（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）で洗浄し、実施例６に記載したように総脂質を抽出した。インキュベーション培地、上清および細胞のアリコートの放射能をＬＳ６５００シンチレーションシステム（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ））を用い、液体シンチレーション計数法で測定した。
【０１７８】
ｐＹＥＳ２ベクターで形質転換した宿主酵母を陰性対照として用いた。
脂質の抽出およびＨＰＬＣ分析：実施例６で説明したように、クロロホルム／メタノール（２：１体積比）で細胞から総脂質を抽出した。
結果：逆相高性能液体クロマトグラフ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による分析から、７−ｐＹｒ５０１４．１またはｐＴｈ５００９．１で形質転換した酵母においては［１−^１４Ｃ］−Δ^{８，１１，１４，１７}エイコサテトラエン酸（２０：４ｎ−３、ＥＴＡ）の６８％がエイコサペンタエン酸（２０：５ｎ−３、ＥＰＡ）に変換された（図１４）。ｐＹＥＳ２で形質転換した宿主酵母ではそのような酵素活性は検出されなかった（図１５）。
【０１７９】
結論：これらの所見は実施例６で説明した所見を確認し、拡張するものであった。発明者らの結果は、同じ哺乳類組換え５−デサチュラーゼによるＤＧＬＡのＡＡへの（実施例６）およびＥＴＡのＥＰＡへの変換を立証している最初の結果である。
【０１８０】
実施例８−ｐＹｒ５０１４．１またはｐＴｈ５００９．１で形質転換したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのスフェロプラストにおけるδ−５−デサチュラーゼの機能分析
【０１８１】
化学物質および放射性化学物質：ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、リティカーゼ、ソルビトール、テルギトール、トリス−ＨＣｌ、脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン、炭水化物、アミノ酸および脂肪酸は、シグマアルドリッチカナダ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃａｎａｄａ）から入手した。すべての有機溶媒（ＨＰＣＬ用）はフィッシャーサイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により供給された。ミノ酸を含まない酵母窒素ベースはＤｉｆｃｏから購入した。［１−^１４Ｃ］−ジホモ−γ−リノレン酸（放射化学純度９９％、比放射能５２μＣｉ／μｍｏｌ）はＮＥＮから購入した。脂肪酸はＫＯＨ（０．１Ｍ）でけん化し、１％ラフィノースおよび１％テルギトールを含むＳＣ−Ｕ培地に溶解した。
【０１８２】
スフェロプラストの調製：脂肪酸δ−５−デサチュラーゼをコードする遺伝子の発現を誘導するために、ｐＹｒ５０１４．１またはｐＴｈ５００９．１で形質転換したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの培養を１％ラフィノースおよび２％ガラクトースを含むＳＣ−Ｕ培地中で生育させた。１６時間のインキュベーション後に、細胞を２０６０×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、蒸留水で１回洗浄し、再び遠心分離した。細胞ペレットの体積と重量を測定した。細胞を０．１Ｍトリス−ＳＯ_４（ｐＨ９．４）、１０ｍＭ　ＤＤＴに懸濁し（１：２重量／体積比）、３０℃でインキュベートした。他所（ダウムら（Ｄａｕｍ　ｅｔ　ａｌ．）１９８２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５７巻、１３０２８〜１３０３３）に記載のように、１０分間のインキュベーションの後に、遠心分離により細胞ペレットを得、１．２Ｍソルビトールで１回洗浄し（１：２０重量／体積比）、１．２Ｍソルビトール、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁した（１：１重量／体積比）。リティカーゼの１５，８００×ｇ（１分間）上清を細胞懸濁液に２０００Ｕ／ｍｌの濃度で加え、懸濁液を５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃でインキュベートした。スフェロプラストへの転換は、４０分間インキュベートした後、懸濁液を蒸留水で希釈し、その後、顕微鏡下で観察することにより確認した（シャッツ　ジーおよびコバック　エル（Ｓｃｈａｔｚ　Ｇ．ａｎｄ　Ｋｏｖａｃ　Ｌ．）、１９７４年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第３１Ａ巻、６２７〜６３２ページ）。７０分間インキュベートした後、約９０％の細胞がスフェロプラストに転換されていた。
【０１８３】
インキュベーション：スフェロプラストを２０６０×ｇ、４℃で５分間遠心分離して、収集し、１．２Ｍソルビトールで１回洗浄し、１％ラフィノース、１％テルギトール、１．２Ｍソルビトールおよび２％ガラクトースを含むＳＣ−Ｕ培地に再懸濁し、誘導条件を維持して、約２．５〜３のＯ．Ｄ．_６００の読み取り値を得た。スフェロプラスト懸濁液のアリコート１０ｍｌを１２５ｍｌ三角フラスコに移し、２μＭ（１μＣｉ）のδ−５−デサチュラーゼ、［１−^１４Ｃ］−ジホモ−γ−リノレン酸とともにオービタルインキュベータ中２７０ｒｐｍ、３０℃でインキュベートした。１５０分間のインキュベーション後に、細胞密度を測定し（Ｏ．Ｄ．_６００）、遠心分離により収集し、０．１％ＢＳＡを含むトリス−ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）で洗浄した。総脂質を下記のように抽出した。細胞懸濁液、上清およびスフェロプラスト抽出物のアリコートの放射能をＬＳ６５００シンチレーションシステム（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ））を用い、液体シンチレーション計数法で測定した。
【０１８４】
脂質の抽出および分析：実施例６に記載のように、総脂質をクロロホルム／メタノールで抽出し、脂肪酸をＢＦ_３を用いてメチル化し、ＨＰＬＣにより分析した。あるいは、脂肪酸メチルエステルをキャピラリーカラムガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析する。
【０１８５】
結果：インキュベーション培地に加えた［１−^１４Ｃ］−ジホモ−γ−リノレン酸からの同様な割合の放射能が、それぞれラットおよびヒトδ−５−デサチュラーゼ遺伝子（実施例１）を含む酵母のスフェロプラスト中に回収された。しかし、ｐＹｒ５０１４．１で形質転換した酵母細胞から調製したスフェロプラストは、ｐＴｈ５００９．１（実施例１）で形質転換したものよりも、ジホモ−γ−リノレン酸（２０：３ｎ−６）から３．５倍多いアラキドン酸（２０：４ｎ−６）を産生することができた。
【０１８６】
【表３】

結論：これらの実験条件下では、ｐＹｒ５０１４．１またはｐＴｈ５００９．１で形質転換したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから得られたスフェロプラストは、脂肪酸との２時間以内のインキュベーションで実質的な検出レベルでジホモ−γ−リノレン酸を不飽和化することができる。
【０１８７】
実施例９−Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のヒトδ−５−デサチュラーゼの検出
生育および発現の誘導：酵母細胞を、標準的手順（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いてインキュベーション振とう器中で選択的圧力下ＳＣ−Ｕ＋２％ラフィノース中３０℃で生育させた。形質転換酵母細胞のそれぞれの一夜前培養を調製し、アリコートを採取し、より大きい体積を実験に用いた。光学濃度（Ｏ．Ｄ．_６００＝０．４〜１．０）に到達時に、細胞を分割し、２０６０×ｇ、５分間で収集した。１つの部分を−２０℃で凍結保存し、ゼロインキュベーション時間として用い、第２の部分をＳＣ−Ｕ＋２％ガラクトースに懸濁し、オービタル振とう器で２００ｒｐｍ、３０℃でインキュベートした。ガラクトースの存在下で生育した細胞からアリコートを採取して、クローン化遺伝子のタンパク質誘導の時間経過を０、４、８、２４時間目に評価した。
【０１８８】
次いで、試料について、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により記載されたように、そしてスフェロプラストを調製するためにわずかな修正を加え、細胞破壊緩衝液（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５％グリセロール）を用いてタンパク質を抽出した。細胞を、スフェロプラストを形成させるために細胞壁消化酵素であるリティカーゼ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で２単位／ｍｌ細胞破壊緩衝液の最終濃度で処理した。スフェロプラスト形成は顕微鏡によりモニターした。細胞を洗浄して、リティカーゼを除き、収集し、重量を測定して、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルを含む対応する体積の細胞破壊緩衝液に再懸濁した。約半分の体積の約０．５ｍｍ径の酸洗いしたガラスビーズを加え、低温室で細胞を３回ボルテックスにより破壊した（３０秒ボルテックス、３０秒氷上）。粗タンパク質抽出物を７００×ｇ、３分間で回収した。粗抽出物を硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析およびウェスタンブロッティングのために用いた。
【０１８９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング：等量の粗タンパク質抽出物と試料ローディング緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ８．０、２％ＳＤＳ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、０．１％ブロモフェノールブルー、１０％グリセロール）とを混合し、１００℃で５分間煮沸した。試料、分子量標準（サンタクルスバイオテクノロジーインコーポレーテッド社（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）製のＣｒｕｚマーカー）および対照を、標準的手順（サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバープレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ））を用いて１０％プレキャストＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に加えた。タンパク質試料は、電気泳動緩衝液を用いて１００Ｖの低電圧で分離した。電気泳動の後、ゲルをクーマシーブルーで染色してタンパク質の存在を評価するか、タンパク質を電気泳動によりＰＶＤＦ膜（バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））に転移した。転移後、膜をブロッキング溶液でブロックし、供給業者（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））により記載されているように１：１０，０００の希釈度のＶ５−ＨＲＰ抗体とともにインキュベートした。膜を洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ反応をＥｎｈａｎｃｅｄ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ試薬ＥＣＬ（アマーシャムファーマシアバイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃ．））で検出した。膜をカセット中でＨｙｐｅｒｆｉｌｍ−ＥＣＬフィルム（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に１〜２０分間曝露させる。フィルムを現像し、Ａｇｆａ　ＤｕａｌＳｃａｎ　１２００Ｔ（Ａｇｆａ）を用いてシグナルをスキャンした。Ｇｅｌ　Ｄｏｃ　２０００（ＢｉｏＲａｄ）を用いて定量を行った。
【０１９０】
結果：
【０１９１】
【表４】

表６は、２４時間の時間経過中のガラクトース誘導下の形質転換細胞中のｈＤ５Ｄタグ付きタンパク質（ｐＴｈ５００９．１からの）の相対的割合を示す。予想どおり、０時間目にはタグ付き酵素は検出されていない。タンパク質は４時間後に検出され、２４時間まで蓄積する。対照プラスミド（ｐＹＥＳ２／ＣＴ）は実験中に検出可能なタンパク質を示さなかった。
【０１９２】
実施例１０−ｐＹｒ５０１４．１およびｐＴｈ５００９．１で形質転換したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの全細胞およびスフェロプラスト中のδ−５−デサチュラーゼ活性の阻害
【０１９３】
種々の研究室で脂肪酸δ−５−デサチュラーゼの阻害を試験するために菌類、微小藻類およびラット肝ミクロソームが使用された。カワシマら（Ｋａｗａｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９６年、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第６０巻、１６７２〜１６７６ページは、ジホモ−γ−リノレン酸に対するδ−５−デサチュラーゼの活性を調節する没食子酸のアルキルエステル、セサミン、エピセサミン、セサミノール、セサモリン、ジフェルロイルメタン、ニカルジピンおよびニフェジピンのような様々な化合物を記載した。最近、ｐ−イソペントキシアニリン（オブコウィツら（Ｏｂｕｋｏｗｉｃｚ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．第５５巻、１０４５〜１０５８ページ）もラット肝ミクロソームにおける脂肪酸δ−５−デサチュラーゼを阻害するために用いられた。
【０１９４】
３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸プロピルエステル（ｎ−プロピル没食子酸）は、脂肪および油に抗酸化剤として一般的に添加されている脂肪酸デサチュラーゼの非競合的阻害剤である（カワシマら（Ｋａｗａｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９６年、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第６０巻、１６７２〜１６７６ページ）。これは、δ−５−デサチュラーゼに対する実質的な阻害作用があり、また、水やエタノールに対する溶解度が高いため、この実施例に選択した。
【０１９５】
本実施例では、ラットまたはヒト脂肪酸δ−５−デサチュラーゼを含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを、哺乳類脂肪酸δ−５−デサチュラーゼの阻害剤（またはエンハンサー）のスクリーニングのための新規モデルとして用いている。ラット肝ミクロソームはこれらの検定を裏づけるために用いた。
【０１９６】
化学物質および放射化学物質：３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸のプロピルエステル（ｎ−没食子酸プロピル）およびスフェロプラストの生産に必要な他の化学物質は、実施例８で既に述べたようにシグマアルドリッチカナダ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃａｎａｄａ）から入手した。［１−^１４Ｃ］ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、放射化学純度９９％、比放射能５２μＣｉ／μｍｏｌ）はＮＥＮから購入した。脂肪酸はＫＯＨ（０．１Ｍ）でけん化し、１％テルギトールを含むＳＣ−Ｕ培地に溶解した。
【０１９７】
スフェロプラストの調製：脂肪酸δ−５−デサチュラーゼをコードする遺伝子の発現を誘導するために、ｐＹｒ５０１４．１またはｐＴｈ５００９．１で形質転換したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの培養を１％ラフィノースおよび２％ガラクトースを含むＳＣ−Ｕ培地中で生育させた。１６時間のインキュベーション後に、実施例８で既に述べたようにスフェロプラストを調製した。
【０１９８】
スフェロプラストのインキュベーション：スフェロプラストを４℃で２０６０×ｇ、５分間で遠心分離して収集し、１．２Ｍソルビトールで１回洗浄した。スフェロプラストを、１％テルギトール、１．２Ｍソルビトールおよび２％ガラクトースを含むＳＣ−Ｕ培地に懸濁して、誘導条件を維持し、約２．５〜３．０のＯ．Ｄ．_６０００の読み取り値を得た。スフェロプラスト懸濁液の試料の一部１０ｍｌを１２５ｍｌ三角フラスコに移し、２００μｌのｎ−没食子酸プロピルのエタノール溶液（培地中最終濃度範囲０．２５〜８．００ｍＭ）とともにオービタルインキュベータ中２７０ｒｐｍ、３０℃でインキュベートした。３０分間のインキュベーション後に、１μＣｉの［１−^１４Ｃ］−ジホモ−γ−リノレン酸を２μＭの最終濃度で培地に加え、さらに１２０分間インキュベートした。この時点で、Ｏ．Ｄ．_６０００の濁度の読み取り値を測定し、スフェロプラストを遠心分離により収集し、０．１％ＢＳＡを含むトリス−ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）で洗浄した。総脂質を抽出し、実施例６で述べたように分析した。
【０１９９】
丸ごとの酵母のインキュベーション：ｐＹｒ５０１４．１またはｐＴｈ５００９．１で形質転換したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを、１％テルギトール（Ｏ．Ｄ．_６００００．４、約３．２×１０^６細胞／ｍｌ）および２００μｌのｎ−没食子酸プロピルのエタノール溶液（培地中最終濃度範囲１．７〜１４．０ｍＭ）を含む９ｍｌのＳＣ−Ｕ培地を入れた１２５ｍｌ三角フラスコ中でインキュベートした。オービタルインキュベータ中２７０ｒｐｍ、３０℃での１時間のインキュベーションの後に、１μＣｉの［１−^１４Ｃ］−ジホモ−γ−リノレン酸カリウム塩（ＳＣ−Ｕ培地および１％テルギトールに溶解）を細胞懸濁液に２μＭの最終濃度で加えた。阻害剤との５時間のインキュベーションの後に、細胞は対数期に到達したので、１ｍｌのガラクトースを２％の最終濃度で加えて、導入遺伝子発現を誘導した。酵母をさらに１９時間インキュベート（Ｏ．Ｄ．_６０００範囲：５〜１０）し、５０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離して、酵母を収集した。細胞を、０．１％ＢＳＡを含むトリス−ＨＣｌ（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）で洗浄し、実施例６で述べたように総脂質を抽出し、分析した。
【０２００】
計算：δ−５−デサチュラーゼ活性は、放射性標識ジホモ−γ−リノレン酸のアラキドン酸への転換（２０：３ｎ−６から２０：４ｎ−６への）を測定することにより決定した。阻害率は他所（カワシマら（Ｋａｗａｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９６年、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第６０巻、１６７２〜１６７６年）に記載されているように計算した。
【０２０１】
阻害率（％）＝１００（阻害剤を加えない場合の活性−阻害剤を加えた場合の活性）／阻害剤を加えない場合の活性
結果：δ−５−デサチュラーゼをコードするプラスミドで形質転換したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのスフェロプラストにおけるジホモ−γ−リノレン酸のアラキドン酸への転換（２０：３ｎ−６から２０：４ｎ−６への）は、表４および５に示す濃度でｎ−没食子酸プロピルにより阻害された。０．７〜４．０ｍＭのｎ−没食子酸プロピルの濃度では、Ｏ．Ｄ．_６０００の読み取り値が変わらず（すなわち細胞数が一定）、細胞中に回収された放射能レベルが同様であったことから、阻害剤は基質の取り込みに影響を及ぼさず、また、細胞傷害性を有さないことがわかった。しかし、４．０ｍＭを超える濃度では、細胞数がわずかに低下し、脂肪酸基質からそれらの細胞中に回収された放射能がかなり減少したことは、これらの濃度はスフェロプラストに対して有毒であることを示している。
【０２０２】
【表５】

【表６】

阻害剤の添加前の１６時間にわたりデサチュラーゼ遺伝子発現の誘導がなされたことは、認められた基質の転換の低下は遺伝子の転写や翻訳の阻害に起因したものではないことを保証するものであった。
【０２０３】
ｎ−没食子酸プロピルの阻害作用は、阻害剤の添加後にデサチュラーゼ遺伝子を誘導した丸ごとの酵母においても検出された（表７および８）。
【０２０４】
【表７】

【０２０５】
【表８】

結論：δ−５−デサチュラーゼを含む酵母スフェロプラストは、酵素活性の検出可能な変化を得るのにより低い濃度の阻害剤（丸ごとの酵母について用いる場合よりも）が必要であることから、デサチュラーゼ検定のための優れたモデルとみなすべきである。このモデルでは、阻害剤の溶解度の制約は少ない。さらに、デサチュラーゼ基質の取込み量が、検出の閾値の増加を助長する丸ごとの酵母よりも多い（表２〜５）。これらの検定は、細胞傷害性レベルより低い濃度の阻害剤を用いて実施すべきである。哺乳類デサチュラーゼを用いる薬物スクリーニング用のこの新規モデルの長所は、ラット肝ミクロソームという伝統的な方法を用いて得られた結果により裏づけられている（実施例１３を参照）。
【０２０６】
要約すると、哺乳類δ−５−デサチュラーゼを含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから得られるスフェロプラストは、酵素の阻害剤およびエンハンサーをスクリーニングする際に有用なものである。
【０２０７】
本発明の実施形態は例示の目的で開示したが、開示した装置の変形形態または変更形態が本発明の実施形態の範囲内にあることは認識されよう。
実施例１１−ヒトまたは哺乳類デサチュラーゼを含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのミクロソームを用いるδ−５−デサチュラーゼモジュレーターのスクリーニング
【０２０８】
酵母ミクロソームの調製：ｐＹｒ５０１４．１またはｐＴｈ５００９．１で形質転換したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２〜５ｌを、ＳＣ−Ｕ培地を用い、約３．２×１０^５細胞／ｍｌ（Ｏ．Ｄ．_６００００．４）の密度で開始する。オービタルインキュベータ中２７０ｒｐｍ、３０℃で８時間インキュベートした後、ガラクトースを２％の最終濃度で加える。酵母をさらに１２時間インキュベートし、２０６０×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離により収集し、水で洗浄する。細胞ペレットをその体積の１／３で、８０ｍＭ　Ｈｅｏｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．２）、１０ｍＭ　ＫＣｌおよび３２０ｍＭのスクロース、２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルのＥＤＴＡ非含有錠剤（１０ｇの細胞ペレット当たり１錠）を含む分離緩衝液に再懸濁する。細胞懸濁液を液体Ｎ_２を含む乳鉢に注入し、セラミック乳棒を用いて砂とともに粉砕する。酵母粉末をコニカル試験管に移し、分離緩衝液を加える（ペレットの体積の２／３）。砂を５７×ｇで１分間遠心分離することにより除去し、懸濁液をさらに１００，０００×ｇで２０分間遠心分離して、細胞破片、核およびミトコンドリアを分離した。次いで、上清を１０６，０００×ｇで１時間遠心分離して、ミクロソームペレットを得、それを７００μｌの分離緩衝液に再懸濁する。ミクロソーム懸濁液のタンパク質濃度を当該技術分野で知られている技術により測定する。
【０２０９】
δ−５−デサチュラーゼモジュレーターの酵母ミクロソームとのインキュベーション：δ−５−デサチュラーゼの活性は、［１−^１４Ｃ］２０：３ｎ−６（ジホモ−γ−リノレン酸）の［１−^１４Ｃ］２０：４ｎ−６（アラキドン酸）への転換を測定することにより決定した。反応は、８０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．２）および４３．２ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、ＡＴＰ（１．０ｍＭ）、ＮＡＤＨ（５００μＭ）および補酵素Ａ（１０μＭ）ならびに一連の濃度の酵素モジュレーターを含む０．２５ｍｌのインキュベーション溶液中３３μＭの最終濃度の０．２０μＣｉ基質脂肪酸を入れたプレインキュベート済み試験管に、５００μｇの酵母ミクロソームを加えて開始する。試験管を激しくボルテックスし、振とう水浴中で１５分間インキュベート（３７℃）した後、２ｍｌの１０％（重量／体積）ＫＯＨエタノール溶液を加えて、反応を停止させる。インキュベーション混合物中の脂質をＮ_２雰囲気中８０℃で４５分間けん化する。試料を氷中５分間放置し、次いで、ＨＣｌで酸性化する。脂肪酸をヘキサンで抽出し、ＢＦ_３／メタノールで９０℃で３０分間エステル化する。脂肪酸メチルエステル、基質および酵素反応の生成物を実施例６に記載のようにＨＰＬＣにより分析する。結果は、ミクロソームタンパク質１ｍｇ当たり、１分当たりに生成したアラキドン酸のｐｍｏｌ数で表す。あるいは、脂肪酸メチルエステルをキャピラリーカラムガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析する。
【０２１０】
実施例１２−ヒトまたは哺乳類デサチュラーゼを発現したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから得られた精製酵素を用いるδ−５−デサチュラーゼモジュレーターのスクリーニング
【０２１１】
酵母ミクロソームからのδ−５−デサチュラーゼの分離：６×Ｈｉｓでタグ付けしたδ−５−デサチュラーゼを含む酵母ミクロソームをＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４またはデオキシコール酸塩／トリトンＸ−１００（２重量％）の混合物とともに４℃で２時間かき混ぜて、δ−５−デサチュラーゼを可溶化する。あるいは、酵母ミクロソームは、２．５体積％アセトン中水で処理して、洗剤の可溶化能を改善することが可能である。混合物を１０６，０００×ｇで１時間遠心分離する。酵素を含む上清を、迅速タンパク質液体クロマトグラフィーシステム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））に装着した前平衡化ＨｉＴｒａｐキレート化（Ｎｉ^＋＋固定イミノジアセテート）カラムに加える。カラムを５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）で洗浄する。タグ付きタンパク質を、イミダゾール（０〜５００ｍＭ）を含むリン酸ナトリウム緩衝液で溶離し、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）、マサチューセッツ州）濃縮器を用いて限外ろ過により濃縮する。
【０２１２】
δ−５−デサチュラーゼモジュレーターの精製酵素とのインキュベーション：濃縮酵素を、１ｍＭ　ＮＡＤＨ、８０μＭのシトクロムｂ_５、４μＭのＮＡＤＨ−シトクロムｂ_５レダクターゼ、６ｍＭ卵ホスファチジルコリン、２％トリトンＸ−１００、０．４％デオキシコール酸ナトリウム、酵素基質としての放射性標識ジホモ−γ−リノレニル−ＣｏＡおよび一連の濃度の各酵素モジュレーターを含むトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）中で３０〜３７℃でインキュベートした。１５〜９０分間のインキュベーションの後、反応を停止させ、脂肪酸、基質および酵素反応の基質を実施例６に記載のように分析する。
【０２１３】
あるいは、酵素活性および酵素活性に対するモジュレーターの影響を、ジホモ−γ−リノレニル−ＣｏＡの存在下および非存在下でのＮＡＤＨ酸化速度により測定することが可能である。
【０２１４】
実施例１３−実施例９〜１１に記載の検定のラット肝ミクロソームを用いたバリデーション
ラット肝ミクロソームの調製：高酵素活性の期間中にＷｉｓｔａｒラットを軽ハロタン（鉱油中１５％）下で放血により屠殺した。肝臓をただちに冷０．９％ＮａＣｌ溶液でリンスし、重量を測定し、はさみで細切した。別に指定しない限り、すべての操作は４℃で行う。肝臓を、０．２５Ｍスクロース、６２ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１．５ｍＭ　Ｎ−アセチルシステイン、５ｍＭ　ＭｇＣｌ_２および０．１Ｍ　ＥＤＴＡを含む溶液中（１：３ｗ／ｖ）で４ストロークのＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ組織ホモジナイザーを用いてホモジナイズする。ホモジネートを１０，４００×ｇで２０分間遠心分離し、ミトコンドリアと細胞破片を除去する。上清を３層チーズクロスでろ過し、１０５，０００×ｇで６０分間遠心分離する。ミクロソームペレットを小ガラス／テフロンホモジナイザーで同じホモジナイゼーション溶液に緩やかに再懸濁し、−７０℃で保存する。ミトコンドリア汚染がないことを酵素的に評価する。ウシ血清アルブミンを標準としてタンパク質濃度を測定する。
【０２１５】
ラット肝ミクロソームのδ−５−デサチュラーゼモジュレーターとのインキュベーション：反応は、ＮａＦ（４２ｍＭ）、ナイアシンアミド（０．３３ｍＭ）、ＡＴＰ（１．５７ｍＭ）、ＮＡＤＨ（１．０ｍＭ）、補酵素Ａ（０．０９ｍＭ）および一連の濃度の酵素モジュレーターを含む１．５ｍｌのインキュベーション溶液中３３．３μＭの最終濃度の０．２０μＣｉ基質脂肪酸（ＤＧＬＡ）を入れたプレインキュベート済の試験管に、２ｍｇのミクロソームタンパク質を加えて開始する。インキュベーション培地にｎ−没食子酸プロピルを０．０２〜０．３２ｍＭの最終濃度で加えた。試験管を激しくボルテックスし、振とう水浴中（３７℃）で１５分間インキュベートした後、反応を停止させ、実施例６に記載のように脂肪酸を分析する。あるいは、脂肪酸メチルエステルをキャピラリーカラムガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析する。
【０２１６】
表１１にラット肝ミクロソーム中の種々の濃度のｎ−没食子酸プロピルによるδ−５−デサチュラーゼのｉｎ　ｖｉｔｒｏ阻害を示す。０．０８〜０．３２ｍＭの範囲の阻害剤の濃度でプラトーに達した。
【０２１７】
【表９】

実施例１４−ヒトまたは哺乳類δ−５およびδ−６−デサチュラーゼを含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ全細胞、スフェロプラストまたはミクロソームを用いたδ−５およびδ−６−デサチュラーゼモジュレーターのスクリーニング
【０２１８】
この方法は、同じ実験条件下での両脂肪酸デサチュラーゼの同時薬物スクリーニングに適している。各酵素に対する各薬物の特異性は、この本法で速やかに決定される。
【０２１９】
酵母におけるヒトまたは哺乳類δ−５およびδ−６−デサチュラーゼの同時発現：δ−５およびδ−６−デサチュラーゼ遺伝子を、異なる栄養選択マーカー、例えば、酵母における選択のためのウラシルおよびロイシン原栄養性を与えるＵＲＡ３およびＬＥＵ２遺伝子を有する２つの別の酵母ベクター（構成または選択）中にクローニングする。ウラシルおよびロイシンに対する栄養要求性を有する酵母株を２つのプラスミドで形質転換する。これらのプラスミドを含む酵母細胞をウラシルおよびロイシンを欠く合成最少培地上で選択する。次いで、２種のデサチュラーゼの活性を分析し、モジュレーターのスクリーニングに用いる。
【０２２０】
あるいは、２方向性酵母ベクター、例えば、ｐＢＥＶＹプラスミド（ミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８８年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．第２６巻、３５７７〜３５８３ページ）を用いてデサチュラーゼを同時発現させる。ｐＢＥＶＹプラスミドは、外因性遺伝子の構成性またはガラクトース誘導性発現をもたらす。
【０２２１】
脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子を、当業者に知られている方法を用いて、それぞれ構成性グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモーターおよびアルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ１）プロモーターの下流にクローニングする。あるいは、遺伝子を２方向ガラクトース誘導性プロモーターＧＡＬ１／ＧＡＬ１０の両側にクローニングする。適切な酵母株（栄養、例えばウラシルに対して栄養要求性）をデサチュラーゼ構築物（例えば、ウラシル原栄養性を与える）で形質転換する。そのような酵母形質転換体をＳＣ−Ｕ培地で選択する。選択した形質転換体を適切な培地中で生育させて、２つのタンパク質の構成性またはガラクトース誘導性発現を可能にする。
【０２２２】
この方法は、哺乳類脂肪酸δ−５およびδ−６−デサチュラーゼを発現する２方向性ベクターを用いて、治療、診断または栄養機能を有する可能性がある両方またはいずれかの活性の特有のモジュレーターを同時にスクリーニングするものである。
【０２２３】
全細胞またはスフェロプラスト：両酵素のモジュレーターに関する酵素検定は、上記（実施例１０）と同様である。このモデルでは、δ−５およびδ−６−デサチュラーゼに対する放射性基質であるα−リノール（１８：３ｎ−３）およびＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）酸をそれぞれインキュベーション培地に加える。２〜１９時間のインキュベーションの後に、残りの放射性標識基質と酵素反応の生成物（それぞれステアリドン酸、１８：４ｎ−３、およびアラキドン酸、２０：４ｎ−６）を実施例６に記載のようにＨＰＬＣにより分析する。あるいは、脂肪酸メチルエステルをキャピラリーカラムガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析する。
【０２２４】
ミクロソーム：ヒトδ−６およびδ−５−デサチュラーゼまたは両哺乳類（例えば、ラット）δ−６およびδ−５−デサチュラーゼを含む酵母のミクロソームを前述（実施例１１）のように得る。インキュベーションは、δ−５およびδ−６−デサチュラーゼに対する基質である、それぞれ放射標識α−リノレン酸（１８：３ｎ−３）およびＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）の両方を一連の異なる濃度のデサチュラーゼモジュレーターとともにインキュベーション培地に加えることを除いて、１つのヒトまたは哺乳類デサチュラーゼのみを含むミクロソームについて用いたのと同様である。酵素反応の生成物を実施例６に記載のようにＨＰＬＣにより分析する。あるいは、脂肪酸メチルエステルをキャピラリーカラムガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析する。
【０２２５】
実施例１５−対象ポリヌクレオチドに対するポリクローナル抗体の作成
対象ポリヌクレオチドコード配列のセグメントを大腸菌において融合タンパク質として発現させる。ハーロウ　イーおよびレーン　ディー（Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ．）（編）、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドハーバープレス（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨークコールドハーバー）により記載の手順と同様な手順を用いて、過剰発現タンパク質をゲル溶出により精製し、ウサギおよびマウスを免疫化するために用いる。この手順は、他の様々なタンパク質に対する抗体を発生させることが示された（クレマーら（Ｋｒａｅｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．第３４巻、６６３〜６７１ページ）。
【０２２６】
その概要を記載すると、対象ポリヌクレオチドコード配列から選択したコード配列のひと続きを融合タンパク質としてプラスミドＰＥＴ５Ａ（ノバーゲンインコーポレーティッド社（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））にクローニングする。ＩＰＴＧで誘導した後、予想される分子量を有する融合タンパク質の過剰発現をＳＤＳ／ＰＡＧＥにより立証する。融合タンパク質を電気溶出によってゲルから精製する。対象ポリペプチド融合産物としてのタンパク質の同定は、Ｎ末端におけるタンパク質配列決定により立証する。次に、精製タンパク質をウサギにおける免疫原として用いる。ウサギを完全フロイントアジュバンント中１００μｇタンパク質で免疫化し、３週間間隔で２回、最初は不完全フロイントアジュバンント中１００μｇ免疫原を、その後、ＰＢＳ中１００μｇ免疫原を追加投与する。その２週間後に抗体を含む血清を採取する。
【０２２７】
この手順を繰り返して、対象ポリペプチドの突然変異型に対する抗体を作成させる。これらの抗体を、野生型の対象ポリペプチドに対する抗体とともに用いて、種々の組織および生物体液中の突然変異型の存在および相対レベルを検出する。
【０２２８】
実施例１６−対象ポリヌクレオチドに対して特異的なモノクローナル抗体の作成
以下のプロトコールに従ってモノクローナル抗体を作成する。マウスを、よく知られているようにグルタルアルデヒドまたはＥＤＣを用いてカサガイヘモシアニンに結合させた完全な対象ポリペプチドまたはそのペプチド（野生型または突然変異体）からなる免疫原で免疫化する。
【０２２９】
免疫原をアジュバントと混合する。各マウスに１０〜１００μｇの免疫原を４回注射し、４回目の注射後に血液試料を採取して、血清が免疫原に対する抗体を含んでいるかどうかを調べる。血清力価をＥＬＩＳＡまたはＲＩＡにより測定する。免疫原に対する抗体の存在を示している血清を有するマウスをハイブリドーマの生産のために選択する。
【０２３０】
免疫マウスから脾臓を摘出し、単一細胞懸濁液を調製する（ハーロウ　イーおよびレーン　ディー（Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ．）（編）、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドハーバープレス（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨークコールドハーバー）。細胞融合は、コーラー　ジーおよびミルスタイン　シー（Ｋｏｈｌｅｒ　Ｇ．ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ．）、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻、４９５〜４９７ページにより記載されているとおりに行う。その概要を記載すると、Ｐ３．６５．３骨髄腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ））をハーロウ　イーおよびレーン　ディー（Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ．）（編）、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドハーバープレス（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨークコールドハーバーにより記載されているようにポリエチレングリコールを用いて免疫脾臓細胞と融合させる。細胞を９６ウエル組織培養プレートを用いて２×１０^５細胞／ウエルの密度で平板培養する。個々のウエルを生育について検査し、生育の見られるウエルの上清を対象ポリペプチド特異抗体の存在について、野生型または突然変異標的タンパク質を用いてＥＬＩＳＡまたはＲＩＡにより検査する。陽性ウエル中の細胞を増殖させ、サブクローニングし、確立し、モノクローン性を確認する。
【０２３１】
所望の特異性を有するクローンを拡張し、マウスまたは中空ファイバーシステム中で腹水症として増殖させて、特徴づけおよび検定開発用の十分な量の抗体を生成する。
【０２３２】
実施例１７−対象ポリペプチドのサンドウィッチ検定
モノクローナル抗体をプレート、チューブ、ビーズまたは粒子のような固体表面に付着させる。好ましくは、抗体を９６ウエルＥＬＩＳＡプレートのウエル表面に付着させる。対象ポリペプチド／タンパク質（野生型または突然変異体）を含む１００μｌ試料（例えば、血清、尿、組織細胞質ゾル）を固相抗体に加える。試料を室温で２時間インキュベートする。次に、試料液を傾斜し、固相を緩衝液で洗浄して、未結合物質を除去する。１００μｌの第２モノクローナル抗体（対象ポリペプチド／タンパク質上の異なる決定因子に対する）を固相に加える。この抗体を検出分子（例えば、^１２５Ｉ、酵素、フルオロフォア、またはクロモフォア）で標識し、第２抗体の付いた固相を室温で２時間インキュベートする。第２抗体を傾斜し、固相を緩衝液で洗浄して、未結合物質を除去する。
【０２３３】
試料中に存在する対象ポリペプチド／タンパク質の量に比例する結合標識の量を定量する。野生型対象ポリペプチドに対する特異的なモノクローナル抗体ならびに対象ポリペプチドにおいて同定された各突然変異型に対する特異的なモノクローナル抗体を用いて、それぞれの検定を行う。
【０２３４】
【表１０】

【０２３５】
なお、本明細書の実施例において、国際出願時の英文明細書では配列中の翻訳開始および終結コドンが太字で示されていたが、この翻訳文では便宜上、太字の箇所を［　］で括って表した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
翻訳開始コドンＡＴＧに対して−１３５７から−１まで番号づけしたヒトδ−５−デサチュラーゼ（ｈＤ５Ｄ）制御領域の核酸配列（配列番号１）を示す図。
【図２】
脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子のラットδ−５−デサチュラーゼ（ｒＤ５Ｄ）コード部分の核酸配列（配列番号２）を示す図。
【図３】
ｒＤ５Ｄ酵素のアミノ酸配列（配列番号３）を示す図。
【図４】
Ｃ末端タグ付きヒトＤ５Ｄ酵素のアミノ酸配列を示す図。
【図５】
Ｃ末端タグを含むプラスミドｐＴｈ５００９．１（７２１１ｂｐ）の概略図。ヒトδ−５−デサチュラーゼコード配列はＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩの制限部位の間に示されている。
【図６】
プラスミドｐＹｈ５００６．３（７１０８ｂｐ）の概略図。ヒトδ−５−デサチュラーゼコード配列はＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩの制限部位の間に示されている。
【図７】
プラスミドｐＹｒ５０１４．１（７１１７ｂｐ）の概略図。ラットδ−５−デサチュラーゼコード配列はＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩの制限部位の間に示されている。
【図８】
プラスミドｐＢｈ４０１３．１（５４１０ｂｐ）の概略図。ヒトδ−５−デサチュラーゼ制御領域はＳａｃＩの制限部位の間に示されている。
【図９】
プラスミドｐＧｈ４０１４．１（６１８１ｂｐ）の概略図。ヒトδ−５−デサチュラーゼ制御領域はＳａｃＩの制限部位の間に示されている。
【図１０】
プラスミドｐＲｈ４００７．１（５６３１ｂｐ）の概略図。ヒトδ−５−デサチュラーゼ制御領域はＳａｃＩとＸｈｏ１の制限部位の間に示されている。
【図１１】
プラスミドｐＲｈ４００２．１（５７５１ｂｐ）の概略図。ヒトδ−６−デサチュラーゼ制御領域はＫｐｎ１とＸｈｏ１の制限部位の間に示されている。
【図１２】
ジホモ−γ−リノレン酸［１−^１４Ｃ］−２０：３ｎ−６とともにインキュベートしたｐＹｒ５０１４．１で形質転換した酵母からの脂肪酸の放射性標識メチルエステルの高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）分析を示す図。
【図１３】
ジホモ−γ−リノレン酸［１−^１４Ｃ］−２０：３ｎ−６とともにインキュベートしたｐＹＥＳ２で形質転換した酵母からの脂肪酸の放射性標識メチルエステルの高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）分析を示す図。
【図１４】
エイコサテトラエン酸［１−^１４Ｃ］−２０：４ｎ−３とともにインキュベートしたｐＹｒ５０１４．１またはｐＴｈ５００９．１で形質転換した酵母からの脂肪酸の放射性標識メチルエステルの高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）分析を示す図。
【図１５】
エイコサテトラエン酸［１−^１４Ｃ］−２０：４ｎ−３とともにインキュベートしたｐＹＥＳ２で形質転換した酵母からの脂肪酸の放射性標識メチルエステルの高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）分析を示す図。

Claims (39)

1. （ａ）配列番号１；
   （ｂ）少なくとも１５ヌクレオチドを有する（ａ）のフラグメント；
   （ｃ）（ａ）と少なくとも９０％相同な配列；および
   （ｄ）ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で（ａ）、（ｂ）または（ｃ）とハイブリッド形成する配列；からなる群から選択されるＤＮＡ配列を有する分離核酸。
2. （ａ）配列番号２；
   （ｂ）少なくとも１５ヌクレオチドを有する（ａ）のフラグメント；
   （ｃ）（ａ）と少なくとも９０％相同な配列；および
   （ｄ）ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で（ａ）、（ｂ）または（ｃ）とハイブリッド形成する配列；からなる群から選択されるＤＮＡ配列を有する分離核酸。
3. （ａ）配列番号３；
   （ｂ）少なくとも１５アミノ酸を有する（ａ）のフラグメント；
   （ｃ）（ａ）またはその塩と少なくとも９０％相同な配列；からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する分離ポリペプチド。
4. 前記ＤＮＡ配列がヒトδ−５−デサチュラーゼ遺伝子の制御領域を含む請求項１の分離核酸。
5. 前記ＤＮＡ配列がラットδ−５−デサチュラーゼ遺伝子をコードする請求項２の分離核酸。
6. ポリペプチド配列がラットδ−５−デサチュラーゼタンパク質を表す請求項３の分離ポリペプチド。
7. 哺乳類δ−５−デサチュラーゼ遺伝子の制御領域とリポーター遺伝子とを有し、該制御領域が、リポーター遺伝子の転写を効果的に開始、終結または調節するように、リポーター遺伝子と転写的に連結されている、組換え核酸分子。
8. 請求項１および４に記載の哺乳類δ−５−デサチュラーゼ遺伝子の制御領域とリポーター遺伝子とからなり、該制御領域が、該リポーター遺伝子の転写を効果的に開始、終結または調節するように、該リポーター遺伝子と転写的に連結されている、組換え核酸分子。
9. 前記リポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、胎盤性アルカリホスファターゼ、グルクロニドシンテターゼおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）からなる群から選択される、請求項７または８に記載の組換え核酸分子。
10. 前記リポーター遺伝子がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）またはルシフェラーゼである請求項９に記載の組換え核酸分子。
11. 請求項７〜１０のいずれか１項に記載の組換え核酸分子を含有し、適切な宿主細胞または宿主系へのベクター構築物の導入時に検出し得るリポーター遺伝子産物を生成するリポーター遺伝子を発現することができる、ベクター構築物。
12. 請求項１１に記載のベクター構築物を用いて形質転換またはトランスフェクションした宿主細胞または宿主系。
13. 宿主細胞が哺乳類細胞である請求項１２に記載の宿主細胞。
14. 哺乳類細胞がヒト細胞である請求項１３に記載の宿主細胞。
15. 哺乳類細胞がヒト癌細胞株であるＺＲ−７５−１またはＨｅｐＧ２に由来するものである請求項１４に記載の宿主細胞。
16. 哺乳類δ−５−デサチュラーゼ酵素遺伝子の転写時の発現を調節または制御することができるモジュレーターをスクリーニングする方法であって、
    （ａ）哺乳類δ−５−デサチュラーゼ遺伝子の制御領域と該制御領域に作動的に連結されているリポーター遺伝子とを含み、該制御領域がリポーター遺伝子の転写の開始、終結またはその転写レベルを調節するのに有効である、宿主系を提供する工程；
    （ｂ）宿主系を試験成分と接触させる工程；
    （ｃ）試験成分が非存在である以外は同一条件下にある対照と比較した場合の、試験成分の存在下での前記リポーター遺伝子の転写レベルの測定可能な差が、転写を介して前記δ−５−デサチュラーゼ遺伝子の発現を調節または制御する試験成分の能力の指標である、前記リポーター遺伝子の転写レベルを評価する工程；および
    （ｄ）前記能力を示す試験成分を前記モジュレーターとして選択する工程；からなる方法。
17. 制御領域が配列番号１により表されるＤＮＡ配列またはそのフラグメントを有する、請求項１６に記載の方法。
18. 機能的哺乳類δ−５−デサチュラーゼ酵素の酵素活性を調節することができるモジュレーターをスクリーニングする方法であって、
    （ａ）プロモーター領域に作動的に連結されている哺乳類δ−５−デサチュラーゼ酵素をコードする核酸配列を含み、該プロモーター領域が核酸配列の発現の開始、終結またはその発現のレベルを調節するのに有効である、宿主系を提供する工程；
    （ｂ）宿主系を試験成分と接触させる工程；
    （ｃ）試験成分が非存在である以外は同一条件下にある対照と比較した場合の、試験成分の存在下での脂質代謝または連結補因子のレベルの測定可能な差が、δ−５−デサチュラーゼ酵素活性を調節する試験成分の能力の指標である、前記δ−５−デサチュラーゼの酵素活性を評価する工程；および
    （ｄ）前記能力を示す試験成分を前記モジュレーターとして選択する工程；からなる方法。
19. 哺乳類δ−５−デサチュラーゼ酵素がラットまたはヒトδ−５−デサチュラーゼである請求項１８に記載の方法。
20. スクリーニング方法が脂質代謝を調節するモジュレーターを同定するための検定法である請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の試験成分をスクリーニングする方法。
21. スクリーニング方法が糖尿病性神経障害を変化させるモジュレーターを同定するための検定法である請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の試験成分をスクリーニングする方法。
22. 請求項１６〜２１のいずれか１項に記載のスクリーニング方法により同定されるモジュレーター。
23. 前記モジュレーターが精製された形態である請求項２２に記載のモジュレーター。
24. 請求項２２または２３に記載のモジュレーターと、医薬として許容できる担体または希釈剤とからなる医薬組成物。
25. 脂質代謝異常の治療のための、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のモジュレーターまたは組成物の使用方法。
26. 糖尿病性神経障害の治療のための、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のモジュレーターまたは組成物の使用方法。
27. ヒト糖尿病性神経障害の治療のための、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のモジュレーターまたは組成物の使用方法。
28. 分離ラットδ−５−デサチュラーゼ。
29. 連結したタグ配列を有するδ−５−デサチュラーゼタンパク質。
30. タグ配列がＶ５エピトープまたは６×ヒスチジンタグである、請求項２９に記載のδ−５−デサチュラーゼタンパク質。
31. 哺乳類δ−５−デサチュラーゼが精製された形態である、請求項１８に記載の方法。
32. 請求項３のポリペプチドと免疫反応性の抗体またはその免疫原性部分。
33. 抗原が宿主系において生成される、ヒトδ−５−デサチュラーゼのポリペプチドと免疫反応性の抗体またはその免疫原性部分。
34. 同じ宿主系内の機能的哺乳類δ５デサチュラーゼ酵素かδ−６−デサチュラーゼ酵素の少なくともいずれか一方の酵素活性を調節することができるモジュレーターをスクリーニングする方法であって、
    （ａ）プロモーター領域と作動的に連結されている哺乳類δ−５およびδ−６−デサチュラーゼ酵素の両方をコードする核酸配列を含み、該プロモーター領域の該核酸配列の発現の開始、終結またはその発現のレベルを調節するのに有効である、宿主系を提供する工程；
    （ｂ）宿主系を試験成分と接触させる工程；
    （ｃ）試験成分が非存在である以外は同一条件下にある対照と比較した場合の、試験成分の存在下での脂質代謝または連結補因子のレベルの測定可能な差が、δ−５デサチュラーゼ酵素活性またはδ−６−デサチュラーゼ酵素活性の少なくともいずれか一方を調節する試験成分の能力の指標である、前記δ−５およびδ−６−デサチュラーゼの酵素活性を同時に評価する工程；および
    （ｄ）前記能力を示す試験成分を前記モジュレーターとして選択する工程；からなる方法。
35. 糖尿病、動脈高血圧、高コレステロール血症、アテローム動脈硬化性心疾患、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギー性湿疹および他のアトピー性疾患、慢性関節リウマチのような炎症性過程、リンパ球増殖の減小、Ｔ細胞媒介性細胞傷害、ナチュラルキラー細胞活性、マクロファージ媒介性細胞傷害、単球および好中球化学走化性、主要組織適合性クラスＩＩ発現および抗原提示、炎症誘発性サイトカイン（インターロイキン１および６、腫瘍壊死因子）の産生および接着分子発現の減少、湿疹、乾癬、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、間接軟骨変性（ＡＣＤ）ならびに癌からなる群から選択される疾患の治療のための請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のモジュレーターまたは医薬組成物の使用方法。
36. 動脈高血圧、高コレステロール血症、アテローム動脈硬化性心疾患、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギー性湿疹および他のアトピー性疾患、慢性関節リウマチのような炎症性過程、リンパ球増殖の減小、Ｔ細胞媒介性細胞傷害、ナチュラルキラー細胞活性、マクロファージ媒介性細胞傷害、単球および好中球化学走化性、主要組織適合性クラスＩＩ発現および抗原提示、炎症誘発性サイトカイン（インターロイキン１および６、腫瘍壊死因子）の産生および接着分子発現の減少、湿疹、乾癬、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、間接軟骨変性（ＡＣＤ）ならびに癌からなる群から選択される疾患の治療のためのｎ−没食子酸プロピルの使用方法。
37. スクリーニング方法がｎ−３脂質代謝経路、すなわち１８：３ｎ−３から２２：６ｎ−３への転換を調節するモジュレーターを同定するための検定法である請求項２０に記載の方法。
38. スクリーニング方法がｎ−９脂質代謝経路、すなわち１６：０から２２：４ｎ−９への転換を調節するモジュレーターを同定するための検定法である請求項２０に記載の方法。
39. スクリーニング方法がｎ−６脂質代謝経路、すなわち１８：２ｎ−６から２２：５ｎ−６への転換を調節するモジュレーターを同定するための検定法である請求項２０に記載の方法。

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