DE60109549T2

DE60109549T2 - Verfahren zur Trennung von 5-Hydroxycreatinin

Info

Publication number: DE60109549T2
Application number: DE60109549T
Authority: DE
Inventors: Ko Yashiro-cho Nakamura; Katsumi Hachioji-shi Kawano
Original assignee: Nippon Zoki Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Nippon Zoki Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2000-10-03
Filing date: 2001-10-02
Publication date: 2006-04-06
Anticipated expiration: 2021-10-03
Also published as: ES2236106T3; JP2002107350A; US20020137224A1; EP1195373A2; US6696301B2; ATE291571T1; DE60109549D1; EP1195373A3; EP1195373B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Abtrennung von 5-Hydroxykreatinin (5-HC), das bei der Bestimmung dieser Verbindung in einem Test einsetzbar ist, um eine Vielzahl von Krankheiten, speziell Störungen der Nierenfunktion und systemischen oxidativen Streß, nachzuweisen.
Stand der Technik
5-HC ist ein Zwischenprodukt bei der Herstellung von Methylguanidin, das eines der Hauptharntoxine ist, die sich im Blut von Patienten, welche an Nierenversagen leiden, ansammeln. Es wurde gezeigt, daß 5-HC durch nicht-enzymatische Oxidation von Kreatinin produziert wird. 5-HC wird im Serum von gesunden Personen nicht detektiert, wird aber im Serum von Personen, die an Nierenversagen leiden, vom Anfangsstadium an detektiert und sein Spiegel steigt mit der Schwere der Symptome an. Somit hat 5-HC die Aufmerksamkeit als Marker für Störungen der Nierenfunktion besetzt und seine Bestimmung wurde als zur Beurteilung des Krankheitszustandes und zum Nachweis von Nierenversagen bei einem Patienten in einem frühen Stadium wertvoll erachtet.
Es wird auch davon ausgegangen, daß Hydroxyradikale, die als sehr reaktiv bekannt sind, bei der nicht-enzymatischen Oxidation von Kreatinin beteiligt sind. So findet 5-HC als Index für die in vivo-Bildung von Hydroxyradikalen (Index für oxidativen Streß) große Aufmerksamkeit.
Folglich wurde vorgeschlagen, daß die Bestimmung von 5-HC als Marker für eine Störung der Nierenfunktion, z.B. Nierenversagen, diabetische Nephropathie und Nephritis, und auch als Marker für systemischen oxidativen Streß nützlich sein kann.
Was die Bestimmung von 5-HC als Marker für Nierenkrankheiten angeht, so ist ein Verfahren bekannt, das von Nakamura (einer der Erfinder der vorliegenden Erfindung) in den japanischen Patentanmeldungsveröffentlichungen Nr. 04/161854 und 05/119038 beschrieben wird. Nach diesem Verfahren wird 5-HC durch HPLC abgetrennt und das resultierende 5-HC wird hydrolysiert und in Methylguanidin umgewandelt, worauf sich eine quantitative Bestimmung mit Hilfe einer Fluoreszenzmarkierung anschließt.
Allerdings wird 5-HC unter Verwendung einer Kationen-Austauscherharzsäule und unter Verwendung von fünf Arten Auftrennungslösungsmittel abgetrennt, und zwar nach dem Verfahren, das von Higashidate et al. Bunseki Kagaku, 33, 366–370 (1984) beschrieben wird. Nach diesem Verfahren werden die folgenden Auftrennungslösungsmittel eins bis fünf verwendet:

1) Natriumcitrat/Salzsäure (pH 3,00) für 4,5 min,
2) Natriumcitrat/Salzsäure (pH 3,50) für 2,8 min,
3) Natriumcitrat/Salzsäure (pH 5,25) für 2,4 min,
4) Natriumcitrat/Borsäure/Natriumhydroxid (pH 10,00) für 2,3 min und
5) 1 M Natriumhydroxid für 30 min.

Demnach ist das obige Verfahren infolge der Notwendigkeit, vorab fünf verschiedene Auftrennungslösungsmittel herzustellen, ungünstig und außerdem ist das Verfahren selbst komplex und mühsam, da zum Beispiel eine Programmierung zur Änderung der Auftrennungslösungsmittel bzw. Trennungslösungsmittel und eine Kontrolle der Elutionszeiten notwendig sind. Darüber hinaus ist die Empfindlichkeit dieses Verfahren für 5-HC 0,5–1 nmol/ml (6,5–13 μg/dl), was zur Detektion geringer Änderungen beim 5-HC in einer Probe, die von einem lebenden Organismus stammt, nicht ausreichend ist.
Darüber hinaus offenbaren Nakamura et al., Nephron, 66, 140–146 (1994) ein Verfahren zur Abtrennung und Bestimmung von 5-HC unter Verwendung eines Auftrennungslösungsmittels, das 1 Teil Dimethylsulfoxid (DMSO) und 9 Teile 0,4 M Zitronensäure, eingestellt auf pH 5,25, umfaßt.
In diesem Verfahren ist die Elutionszeit 30 Minuten lang und dieses ist damit kein effizientes Verfahren. Außerdem ist die Empfindlichkeit für die Messung, die etwa 2 μg/dl beträgt, noch ungenügend, um geringe Änderungen bei 5-HC-Konzentrationen im Anfangsstadium von Störungen der Nierenfunktion zu messen und damit ist es insgesamt nicht zufriedenstellend.
Zusammenfassung der Erfindung
In Anbetracht der obigen Situation haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung intensive Forschungen betrieben, um ein Verfahren zur Abtrennung von 5-HC zu finden, das die Probleme des Standes der Technik überwindet.
Somit besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines hochempfindlichen und praktischen Verfahrens zur Abtrennung von 5-HC, das in einem Test einsetzbar ist, der 5-HC als Indikator für Nierenfunktionsstörungen, systematischen oxidativen Streß, usw. nützlich ist.
Als Resultat der Untersuchungen der Erfinder der vorliegenden Erfindung wurde das obige Problem gelöst, indem ein Verfahren zur Abtrennung von 5-Hydroxykreatinin bereitgestellt wird, das den Schritt der Durchführung einer High-Performance-Liquid-Chromatographie(HPLC)-Auftrennung mit einer Probe unter Verwendung eines stark sauren Kationenaustauscherharzes vom Sulfonsäuretyp einer Styrol-Divinylbenzol-Serie und eines Auftrennungslösungsmittels mit einem pH-Wert von 4,1–4,6 umfaßt.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist ein Beispiel für ein spezifisches System, das zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens anwendbar ist.
2 zeigt den Aufbau des spezifischen Systems, das zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wie es in 1 gezeigt ist, anwendbar ist.
3 ist ein Diagramm, das die pH-Abhängigkeit der Elutionszeit für 5-HC und andere Kontaminanten im Urin einer gesunden Person, bestimmt in Beispiel 1, zeigt.
Detaillierte Beschreibung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Abtrennung von 5-HC, das den Schritt der Durchführung einer High-Performance-Liquid-Chromatographie(HPLC)-Auftrennung mit einer Probe unter Verwendung eines stark sauren Kationenaustauscherharzes und eines Auftrennungslösungsmittels mit einem pH-Wert von 4,1–4,6 umfaßt.
Zum Detektieren des 5-HC, das von einer Probe durch das erfindungsgemäße Verfahren abgetrennt wurde, wird das abgetrennte 5-HC hydrolysiert und in Methylguanidin umgewandelt, welches dann nach vorheriger geeigneter Fluoreszenzmarkierung quantitativ bestimmt wird.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden detailliert erläutert werden.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete stark saure Kationenaustauscherharz ist ein Kationenaustauscherharz eines mit Sulfonsäure modifizierten Styrol-Divinylbenzolharzes, d.h. ein Styrol-Divinylbenzol-Copolymer mit Sulfonsäure-Gruppen, die in die Polymerketten eingeführt sind. Solche Harze sind auf dem Fachgebiet bekannt und verschiedene Arten derselben sind im Handel verfügbar, zum Beispiel "Guanidino Pack II" (Handelsbezeichnung, geliefert von Nippon Bunko K. K.), das ein Beispiel für ein bevorzugtes stark saures Kationenaustauscherharz im Kontext der vorliegenden Erfindung ist.
Das für die HPLC im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Auftrennungslösungsmittel ist ein Lösungsmittel mit einem pH-Wert von 4,1–4,6, vorzugsweise von 4,2–4,3. Beispiele für bevorzugte Lösungsmittel sind Citratpuffer, Phosphatpuffer usw. Citratpuffer ist bevorzugter und kann unter Verwendung von Natriumcitrat, Kaliumcitrat usw. hergestellt werden. Seine Konzentration kann geeigneterweise eingestellt werden und wenn Natriumcitrat verwendet wird, ist eine Lösungskonzentration von 0,30–0,45 M als Natriumionen bevorzugt.
Um ein hohes Trennungsvermögen zu erreichen, ist es bevorzugt, ein gemischtes Lösungsmittel vom Citrat/Dimethylsulfoxid(DMSO)-Typ als Auftrennungslösungsmittel, vorzugsweise ein Natriumcitrat/DMSO-Lösungsmittel, bei dem DMSO geeigneterweise einem Citratpuffer zugesetzt ist, zu verwenden.
Durch Zusatz von DMSO werden bevorzugte Effekte wie zum Beispiel Erhöhung der Fluoreszenzintensität und gute Trennung von Elutionspeaks erreicht. Die DMSO-Menge ist nicht besonders begrenzt, allerdings ist ein Auftrennungslösungsmittel, das bis zu 20 Gew.-% DMSO umfaßt, bevorzugt. Bevorzugter ist die Menge an DMSO 5–15 Gew.-%, am bevorzugtesten etwa 10 Gew.-%.
Der pH des Auftrennungslösungsmittels liegt im Bereich von 4,1 bis 4,6 und wird durch Zusatz einer Säure eingestellt. Die zu diesem Zweck zu verwendende Säure ist nicht spezifisch beschränkt und es kann eine beliebige Säure verwendet werden, die das Endresultat der 5-HC-Bestimmung nicht beeinflußt. Als Beispiel ist Salzsäure bevorzugt. Bei der Bestimmung von 5-HC in einer Probe, die aus Tieren, einschließlich Menschen stammt, zum Beispiel menschlicher Urin und menschliches Serum, ist es bevorzugt, daß der pH so gewählt wird, daß 5-HC am deutlichsten von anderen Kontaminanten abgetrennt wird. Wie es aus dem später diskutierten experimentellen Resultat deutlich wird (siehe Beispiel 1 und 3), ist ein pH von 4,2–4,3 bevorzugt, um eine Abtrennung von größeren Peaks von Kontaminanten, die vor und nach 5-HC eluiert werden, zu erreichen.
Der Probengegenstand gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ist vorzugsweise eine Körperflüssigkeit, zum Beispiel Blut, Serum oder Plasma; Urin usw., die von Tieren, bevorzugter von Säugern, einschließlich dem Menschen, stammt. Am vorteilhaftesten stammt die Probe vom Menschen und ist als Gegenstand für klinische Tests geeignet.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun spezifischer anhand von Beispielen erläutert, obgleich die vorliegende Erfindung keineswegs auf diese beschränkt wird.
In den Experimenten wurden das in den 1 und 2 dargestellte Trennungs- und Detektionssystem verwendet. "Guanidino Pack II" (hergestellt von Nippon Bunko K. K.), das eine Säule mit einer Größe von 6,0 mm (ϕ) × 35,0 mm ist, wurde als stark saures Kationenaustauscherharz eingesetzt.
Beispiel 1
Bedingungen zur Abtrennung von 5-HC
Bei einem stark sauren Kationenaustauscherharz variiert die Elutionszeit für die Zielsubstanz am stärksten in Abhängigkeit von der Ionenkonzentration und dem pH. Um die Elutionszeitabhängigkeit vom pH zu beurteilen, wurden gemischte Lösungsmittel, die 9 Teile 0,4 M Natriumcitrat-Lösung und 1 Teil DMSO umfaßten, mit unterschiedlichen Mengen an Salzsäure unter Veränderung des pH-Werts derselben innerhalb des Bereichs von 3–5 versetzt. Diese Lösungsmittel unterschieden sich nur bezüglich der Menge an zugesetzter Salzsäure.
Als Probe wurde entproteinierter Urin von einer gesunden Person verwendet. Die obigen Lösungsmittel mit unterschiedlichen pH-Werten wurden als Auftrennungslösungsmittel eingesetzt. Es wurde kein Umschalten auf 1 N Natriumhydroxid durchgeführt, sondern es wurde nur Auftrennungslösungsmittel verwendet. Unter Verwendung der Lösungsmittel mit unterschiedlichen pH-Werten in individuellen Experimenten wurde die resultierende Veränderung im Elutionsmuster für 5-HC und andere Bestandteile der Probe untersucht.
Die Resultate, die für einen pH-Bereich von 4–5 erhalten wurden, sind in 3 angegeben. Die Symbole g1–g7 wurden den Peaks anderer Kontaminanten als 5-HC zugeordnet. Fettgedruckte Linien in der Zeichnung bedeuten große Peaks. Wie zu ersehen ist, nimmt für einige Kontaminanten die Elutionszeit mit steigendem pH ab, während andere eine Erhöhung der Elutionszeit bei ansteigendem pH zeigen. In einigen Fällen wurde auch fast keine pH-Abhängigkeit der Elutionszeit beobachtet.
Das Resultat der obigen Experimente zeigt, daß die Peaks von 5-HC bzw. von anderen Kontaminanten bei einem pH von etwa 3,6 und 4,3 am effizientesten getrennt werden. Da bei einem pH von 4,3 die Elutionszeit für 5-HC kürzer ist, was aus praktischen Gründen bevorzugt ist, wurde in den folgenden Experimenten ein Auftrennungslösungsmittel verwendet, das auf pH 4,3 eingestellt war.
Beispiel 2
Kalibrierungskurvenstabilität und Detektionsgrenze für 5-HC
Eine 5-HC-Probe wurde mit 10% Trichloressigsäure (TCA) verdünnt, was zu Proben mit einer 5-HC-Konzentration von 20, 10, 4, 2, 1, 0,4 bzw. 0,2 μM führte. Es wurden Injektionsmengen von 0,1 ml jeder Probe gemessen. Jede verdünnte Probe wurde wiederholt gemessen und die Stabilität der Kalibrierungskurve bzw. Eichkurve wurde beurteilt. Als Kontrolle wurde eine Probe, die kein 5-HC enthielt gemessen, diese gab in keinem Experiment einen detektierbaren Peak (Peakhöhe = 0). Es wurde davon ausgegangen, daß eine Konzentration, die zu einem Variationskoeffizienten (CV) von weniger als 20% führt, einen in der Praxis meßbaren Bereich darstellt. Die Resultate sind in Tabelle 1 gezeigt.
Wie aus Tabelle 1 zu entnehmen ist, lieferten die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Daten bei einer Infusionsrate von 20 pM/0,1 ml (0,2 μM), eine Bestimmung einer CV der abgelesenen Werte von weit weniger als 20% und es ist wahrscheinlich, daß bis zu weitaus niedrigeren Konzentrationen stabile Daten verfügbar sind. Dies wurde in Beispiel 3 weiter verifiziert.
Beispiel 3
Stabilität der Eichkurve und Detektionsgrenze für 5-HC bei niedrigen Konzentrationen
Eine 5-HC-Probe wurde mit 10% TCA verdünnt, was zu Proben führte, die eine 5-HC-Konzentration von 2, 0,8, 0,4, 0,2, 0,08, 0,04 bzw. 0,02 μM hatten. Für jede Probe wurden Injektionsmengen von 0,1 ml abgemessen. Jede verdünnte Probe wurde wiederholt gemessen und die Stabilität der Kalibrierungskurve wurde beurteilt. Als Kontrolle wurde eine Probe, die kein 5-HC enthielt, gemessen, wobei diese in keinem Experiment einen detektierbaren Peak lieferte (Peakhöhe = 0). Eine Konzentration, die zu einem Variationskoeffizienten (CV) von weniger als 20% führte, wurde als eine angesehen, die einen in der Praxis meßbaren Bereich darstellt. Die Resultate sind in Tabelle 2 angegeben.
Wie aus Tabelle 2 zu ersehen ist, erreicht das erfindungsgemäße Verfahren eine CV der abgelesenen Werte von weniger als 20%, selbst bei einer so niedrigen Konzentration wie 0,02 μM. Die Kalibrierungskurve zeigt nach dem Verfahren der kleinsten Quadrate eine gute Linearität wie folgende: y = (31,339x) – (147,63R2) = 0,9988
Der y-Abschnitt ist –147,63, was etwa 1/5 des abgelesenen Wertes für 0,02 μM entspricht, was innerhalb des möglichen Fehlerbereichs von 1 SA liegt.
Beispiel 4
Untersuchung der Meßempfindlichkeit
Die obigen Beispiele 2 und 3 zeigen, daß der meßbare Bereich des erfindungsgemäßen Verfahren 0,02–20 μM (Infusion von 2–2000 pM/0,1 ml) ist. Die Kalibrierungskurve zeigte auch eine gute Linearität von der maximalen (20 μM) bis zur minimalen (0,02 μM) Konzentration und selbst bei einer Konzentration von Null. Selbst wenn keine Kalibrierungskurve mit Hilfe von Verdünnungsreihen hergestellt wird, kann so eine Kalibrierung durch eine absolute 1-Punkt-Bestimmung bei einer einzelnen Konzentration, z.B. 20 μM, durchgeführt werden.
Wenn man den 5-HC-Spiegel im Serum einer gesunden Person berücksichtigt, so kann ferner angenommen werden, daß es wahrscheinlich ist, daß bei Erreichung einer in der Praxis einsetzbaren Bestimmungsempfindlichkeit von 0,02 μM nahezu alle Proben, die Gegenstand einer Untersuchung in einem Test sein können, innerhalb eines meßbaren Bereichs liegen. Was Proben mit mehr als 20 μm angeht, so ist zumindest nach Verdünnung, wodurch die Konzentration in den obigen Bereich reduziert wird, ein genaue Bestimmung möglich.
Effekt der Erfindung
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist nur ein Auftrennungslösungsmittel erforderlich und die Zeit, die zur Durchführung eines Analysezyklus erforderlich ist, beträgt etwa 14 Minuten. Diese ist beträchtlich kürzer als bei herkömmlichen Verfahren. Bei einer HPLC-Einstellung können somit 100 Bestimmungen pro Tag durchgeführt werden und dies ist etwa das 2-fache dessen, was mit dem von Nakamura et al. beschriebenen, oben diskutierten Verfahren möglich ist.
Aus den obigen Resultaten wird auch klar, daß das erfindungsgemäße Verfahren ausreichend empfindlich ist, um die genaue Bestimmung von 5-HC in einer Konzentration von 0,02 μM (0,26 μg/dl) zu ermöglichen. Selbst in Blut einer gesunden Person kann 5-HC bestimmt werden, was zeigt, daß die vorliegende Erfindung im Vergleich zu Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, in hohem Maße empfindlich ist.
Als Grund für die hohe Empfindlichkeit wird angenommen, daß die für die Analyse notwendige Zeit verkürzt ist und daß die Zersetzungsrate von 5-HC reduziert ist, da das Auftrennungslösungsmittel saurer ist. Durch Kombination dieser zwei Effekte wird 5-HC während der Analyse kaum abgebaut.
Daher ist das erfindungsgemäße Verfahren ein sehr effizientes und nützliches Verfahren, um 5-HC in einer Probe abzutrennen und zu bestimmen, was praktische Anwendungen ermöglicht, die mit dem herkömmlichen Verfahren unmöglich waren.

Claims

Verfahren zur Abtrennung von 5-Hydroxykreatinin, das den Schritt der Durchführung einer High Performance Liquid Chromatography(HPLC)-Auftrennung mit einer Probe unter Verwendung eines stark sauren Kationenaustauscherharzes vom Sulfonsäuretyp der Styroldivinylbenzolserie und eines Auftrennlösungsmittels mit einem pH-Wert von 4,1–4,6 umfasst.
Verfahren gemäss Anspruch 1, worin das Auftrennlösungsmittel ausgewählt ist aus Citratpufferlösungsmitteln, Phosphatpufferlösungsmitteln und gemischten Citratpuffer/Dimethylsulfoxid-Lösungsmitteln.
Verfahren gemäss mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Lösungsmittel einen pH-Wert im Bereich von 4,2–4,3 aufweist.
Verfahren gemäss mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, worin zur Einstellung des pH-Werts auf den gewünschten Wert Salzsäure vorhanden ist.
Verfahren gemäss mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die der Auftrennung unterworfene Probe aus einem lebenden Körper erhalten wurde.
Verfahren gemäss Anspruch 5, worin die der Auftrennung unterworfene Probe aus Blut, Serum oder Urin erhalten wurde.
Verfahren gemäss Anspruch 5 oder 6, worin der lebende Körper ein Säuger ist, einschliesslich eines Menschen.
Verfahren gemäss mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, das ferner die Schritte der Hydrolyse des abgetrennten 5-HC und dessen Umwandlung in Methylguanidin und die quantitative Bestimmung des Methylguanidins, nachdem dieses fluoreszenzmarkiert wurde, umfasst.
Verwendung eines Lösungsmittels mit einem pH-Wert von 4,1–4,6 in Kombination mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz vom Sulfonsäuretyp der Styroldivinylbenzolserie zur Abtrennung von 5-Hydroxykreatinin aus einer Probe mittels High Performance Liquid Chromatography (HPLC).