ES2236106T3 - Metodo para la separacion de 5-hidroxicreatinina. - Google Patents
Metodo para la separacion de 5-hidroxicreatinina.Info
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Abstract
Método para la separación de 5-hidroxicreatinina, que comprende la etapa de someter una muestra a separación por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) usando una resina de intercambio catiónico fuertemente ácida de tipo ácido sulfónico de una serie estireno-divinilbenceno y un disolvente de separación que tiene un pH de 4, 1-4, 6.
Description
Método para la separación de
5-hidroxicreatinina.
La presente invención se refiere a un método para
la separación de 5-hidroxicreatinina
(5-HC), que es útil en la determinación de este
compuesto en un ensayo para detectar varias enfermedades,
especialmente trastornos de la función renal y agresión oxidativa
sistémica.
La 5-HC es conocida como un
intermedio en la producción de metilguanidina, que es una de las
principales toxinas urinarias acumuladas en la sangre de los
pacientes que padecen fallo renal. Se ha sabido que la
5-HC se produce por oxidación no enzimática de
creatinina. La 5-HC no se detecta en el suero de las
personas sanas, pero se detecta en el suero de las personas que
padecen fallo renal desde su fase inicial, y su nivel aumenta con la
gravedad de los síntomas. Por tanto, la 5-HC ha
ocupado la atención como un marcador para los trastornos de la
función renal y su determinación se ha considerado valiosa para
evaluar la enfermedad y para detectar el fallo renal en un paciente
en una fase
temprana.
temprana.
Se cree también que los radicales hidroxi, que se
sabe que son muy reactivos, participan en la oxidación no enzimática
de la creatinina. Por tanto, la 5-HC también genera
mucha atención como un índice para la formación de los radicales
hidroxi in vivo (índice para la agresión oxidativa).
Consecuentemente, se ha sugerido que la
determinación de 5-HC puede ser útil como un
marcador para los trastornos de la función renal tales como fallo
renal, neuropatía diabética y nefritis, y también como un marcador
para la agresión oxidativa sistémica.
En relación con la determinación de
5-HC como un marcador para los trastornos renales,
se conoce un método descrito por Nakamura (uno de los presentes
inventores) en la publicación de las solicitudes de patentes
japonesas Nº 04/161814 y 05/119038. Según este método la
5-HC se separa por HPLC y la resultante
5-HC se hidroliza y se convierte en metilguanidina
seguido por la determinación cuantitativa por medio de marcaje
fluores-
cente.
cente.
Sin embargo, la 5-HC se separa
usando una columna de resina de intercambio catiónico y aplicando
cinco clases de disolventes de separación según el método descrito
por Higashidate et al., Bunseki Kagaku, 33,
366-370 (1984). Según este método, se usan los
siguientes disolventes de separación del primero al quinto:
1) citrato de sodio/ ácido clorhídrico (pH 3,00)
durante 4,5 minutos.,
2) citrato de sodio/ ácido clorhídrico (pH 3,50)
durante 2,8 minutos.,
3) citrato de sodio/ ácido clorhídrico (pH 5,25)
durante 2,4 minutos.,
4) citrato de sodio/ ácido bórico/hidróxido de
sodio (pH 10,00) durante 2,3 minutos., y
5) hidróxido de sodio 1M durante 30 minutos.
Por tanto, el método anterior es desventajoso
debido a la necesidad de preparar cinco disolventes de separación
diferentes con antelación, y el propio método es complejo y pesado,
ya que, por ejemplo, se requiere la programación para el cambio de
los disolventes de separación y el control de los tiempos de
elución. Además, la sensibilidad de este método para
5-HC es 0,5-1 nmol/ml
(6,5-13 \mug/dL), que no es suficiente para
detectar cambios pequeños de 5-HC en una muestra
derivada de un organismo vivo.
Además, Nakamura et al., Nephron, 66,
140-146 (1994) describen un método para separar y
determinar 5-HC usando un disolvente de separación
que comprende 1 parte de dimetilsulfóxido (DMSO) y 9 partes de ácido
cítrico 0,4 M, ajustado a pH 5,25.
En este método el tiempo de elución dura 30
minutos y no es un método eficaz. También, la sensibilidad para la
medida, que es aproximadamente 2 \mug/dL, todavía es insuficiente
para medir los cambios pequeños de las concentraciones de
5-HC en la fase inicial de los trastornos de la
función renal y por tanto no es asimismo satisfac-
torio.
torio.
En vista de la situación anterior, en la presente
invención se ha llevado a cabo una investigación intensa pata
encontrar un método para separar 5-HC que resuelva
los problemas de la técnica anterior.
Por tanto, un objetivo de la presente invención
es proporcionar un método altamente sensible y práctico para la
separación de 5-HC útil en un ensayo para detectar
5-HC como un indicador de los trastornos de la
función renal, agresión oxidativa sistémica, etc.
Como resultado de los estudios de la presente
invención, se resolvió el problema anterior proporcionado un método
para la separación de 5-HC, que comprende la etapa
de someter una muestra a separación por cromatografía líquida de
alta resolución (HPLC), usando una resina de intercambio catiónico
fuertemente ácida de tipo ácido sulfónico de la serie
estireno-divinilbenceno y un disolvente de
separación que tiene un pH de 4,1-4,6.
La figura 1 es un ejemplo de un sistema
específico aplicable al desarrollo del método de la presente
invención.
La figura 2 muestra la constitución del sistema
específico aplicable al desarrollo del método de la presente
invención como muestra la Fig 1.
La figura 3 es un gráfico que muestra la
dependencia del pH del tiempo de elución para 5-HC y
otros contaminantes en la orina de una persona sana determinados en
el ejemplo 1.
La presente invención se refiere a un método para
la separación de 5-HC, que comprende la etapa de
someter una muestra a separación por cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC), usando una resina de intercambio catiónico
fuertemente ácida y un disolvente de separación que tiene un pH de
4,1-4,6.
Preferiblemente, para detectar
5-HC separada de una muestra por el presente
procedimiento, la 5-HC separada se hidroliza se
convierte en metilguanidina, que después se determina
cuantitativamente después de marcaje fluorescente previo
apropiado.
La presente invención se ilustrará en detalle a
continuación.
La resina de intercambio catiónico fuertemente
ácida usada en la presente invención es una resina de intercambio
catiónico de una resina de estireno-divinilbenceno
modificada con ácido sulfónico, es decir, un copolímero de
estireno-divinilbenceno que tiene grupos ácido
sulfónico introducidos en las cadenas del polímero. Tales resinas
son conocidas en la técnica, y están disponibles comercialmente
diferentes tipos de ellas, tales como "Guanidino Pack II"
(nombre comercial, suministrada por Nippon Bunko K. K.), que es un
ejemplo de una resina de intercambio catiónico fuertemente ácida
preferida dentro del contexto de la presente invención.
El disolvente de separación usado para HPLC en el
presente método de la invención es un disolvente que tiene un pH de
4,1-4,6, preferiblemente 4,2-4,3.
ejemplos de disolventes preferidos son tampón citrato, tampón
fosfato, etc. El tampón citrato es el más preferido, y se puede
preparar usando citrato de sodio, citrato de potasio, etc. Su
concentración se puede ajustar apropiadamente, cuando se usa citrato
de sodio, se prefiere una concentración de solución de
0,30-0,45 M en términos de iones sodio.
Para lograr una capacidad de separación alta se
prefiere usar un disolvente mezclado tipo citrato/dimetilsulfóxido
(DMSO) como disolvente de separación, preferiblemente un disolvente
citrato de sodio/DMSO, donde DMSO se añade apropiadamente al tampón
citrato.
Debido a la adición de DMSO, se obtienen los
efectos preferidos tales como aumento de la intensidad fluorescente
y buena separación de los picos de elución. La cantidad de DMSO no
está específicamente limitada, sin embargo, se prefiere un
disolvente de separación que comprenda hasta 20% en peso de DMSO.
Más preferiblemente, la cantidad de DMSO es de 5-15%
en peso, lo más preferiblemente aproximadamente 10% en peso.
El pH del disolvente de separación está dentro
del intervalo de 4,1-4,6 y se ajusta por adición de
un ácido. El ácido usado para este fin no está específicamente
limitado, y se puede usar cualquier ácido, lo que no influye en el
resultado final de la determinación de 5-HC. Como
ejemplo se prefiere el ácido clorhídrico. En la determinación de
5-HC en una muestra derivada de animales incluyendo
el ser humano, tal como orina humana y suero, se prefiere que el pH
se seleccione de modo que la 5-HC se separe lo más
claramente de otros contaminantes. Como es claro de los resultados
experimentales discutidos más tarde (véase ejemplo 1 y fig. 3), se
prefiere un pH de 4,2-4,3 para lograr la separación
de los picos grandes de los contaminantes eluidos antes y después de
5-HC.
La muestra sometida al presente método
preferiblemente es un fluido corporal, tal como sangre, suero o
plasma, orina, etc. derivada de animales, más preferiblemente de
mamíferos, incluyendo el ser humano. Lo más preferiblemente, la
muestra se deriva del ser humano, y es adecuada como materia para
ensayos clínicos.
\newpage
La presente invención se ilustrará ahora más
específicamente por medio de ejemplos, aunque la presente invención
no está limitada en absoluto por ellos.
En los experimentos, se usó el sistema de
separación y detección mostrado en las figuras 1 y 2. Se usó
"Guanidino Pack II" (fabricada por Nippon Bunko K. K.), que es
una columna que tiene un tamaño de 6,0 mm (\phi) x 35,0 mm, como
resina de intercambio catiónico fuertemente ácida.
En una resina de intercambio catiónico
fuertemente ácida, el tiempo de elución para la sustancia objetivo
varía principalmente dependiendo de la concentración de iones y del
pH. Por tanto, para evaluar la dependencia del tiempo de elución del
pH, se añadieron disolventes mezclados que comprenden 9 partes de
solución de citrato de sodio 0,4 M y 1 parte de DMSO con diferentes
cantidades de ácido clorhídrico para variar su pH dentro del
intervalo de 3-5. Estos disolventes eran diferentes
solamente con relación a la cantidad de ácido clorhídrico
añadida.
Se usó como muestra orina desproteinada de una
persona sana. Se usaron los disolventes anteriores que tienen
diferentes valores de pH como disolventes de separación. No se llevó
a cabo el cambio a hidróxido de sodio 1N y sólo se usó disolvente de
separación. Usando disolventes que tienen diferentes valores de pH
en experimentos individuales, se chequeó el cambio resultante en el
modelo de elución para 5-HC y otros constituyentes
de la muestra.
Los resultados obtenidos para un intervalo de pH
de 4-5 se muestran en la figura 3. Los símbolos
g1-g7 se asignaron a los picos de los otros
contaminantes distintos de 5-HC. Las líneas fuertes
en el dibujo significan picos grandes. Como se puede ver, para
algunos contaminantes el tiempo de elución disminuye con el aumento
de pH, mientras que otros muestran un aumento del tiempo de elución
con el aumento de pH. También, en algunos casos casi no se observa
dependencia del pH en el tiempo de elución.
El resultado de los experimentos anteriores
muestra que los picos de 5-HC y otros contaminantes,
respectivamente, se separaron más eficazmente a un pH de
aproximadamente 3,6 y 4,3. Ya que a pH de 4,3 el tiempo elución para
5-HC es más corto, lo que se prefiere por razones
prácticas, se usó un disolvente de separación ajustado a pH 4,3 en
los siguientes experimentos.
Se diluyó una muestra de 5-HC con
ácido tricloroacético al 10% (TCA) dando muestras que tienen una
concentración de 5-HC de 20, 10, 4, 2, 1, 0,4 y 0,2
\muM, respectivamente. Se midieron cantidades de inyección de 0,1
ml de cada muestra. Cada muestra diluida se midió repetidamente y se
evaluó la estabilidad de la curva de calibración. Como control, se
midió una muestra que no contiene 5-HC, que no da un
pico detectable en ningún experimento (altura del pico = 0). Una
concentración que da un coeficiente de variación (CV) de menos que
20% se consideró que representa un intervalo medible de forma
práctica. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
Como se puede extraer de la Tabla 1, según el
presente método los datos obtenidos a una tasa de infusión de 20
pM/0,1 ml (0,2 \muM), la determinación dio un CV de valores de
lectura mucho menores que 20%, y es probable que los datos estables
estén disponibles a concentraciones muy inferiores. Esto se verificó
además en el Ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
| SD = desviación estándar | |
| CV = coeficiente de variación | |
| a.U. = unidad arbitraria |
Se diluyó una muestra de 5-HC con
TCA al 10% dando muestras que tienen una concentración de
5-HC de 2, 0,8, 0,4, 0,2, 0,08, 0,04 y 0,02 \muM,
respectivamente. Se midieron cantidades de inyección de 0,1 ml de
cada muestra. Cada muestra diluida se midió repetidamente y se
evaluó la estabilidad de la curva de calibración. Como control, se
midió una muestra que no contiene 5-HC, que no da un
pico detectable en ningún experimento (altura del pico = 0). Una
concentración que da un coeficiente de variación (CV) de menos que
20% se consideró que representa un intervalo medible de forma
práctica. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Como se muestra de la Tabla 2, el presente método
logra un CV de los valores de lectura menor que 20% incluso a
concentraciones tan bajas como 0,02 \muM. La curva de calibración
por medio del método de los mínimos cuadrados mostró una bueno
linealidad como sigue.
Y \ = \
(31.339 x)-(147,63 \ R^{2}) \ = \
0,9988
El corte de y es -147,63, que corresponde a
aproximadamente 1/5 del valor de lectura para 0,02 \muM, que está
dentro del intervalo de error aceptable para 1SD.
| SD = desviación estándar | |
| CV = coeficiente de variación |
Los Ejemplos 2 y 3 anteriores muestran que el
intervalo medible del presente método es 0,02-20
\muM (infusión de 2-2000 pM/0,1 ml). También, la
curva de calibración mostró una buena linealidad de la concentración
máxima (20 \muM) a la mínima (0,02 \muM), e incluso a
concentración cero. Por tanto, incluso si no se prepara una curva de
calibración por medio de una serie de diluciones, se puede realizar
una calibración por una determinación absoluta de un punto a una
única concentración, por ejemplo 20 \muM.
Además, si se toma en consideración el nivel de
5-HC en el suero de una persona sana, se puede
asumir como probable, alcanzado una sensibilidad de determinación
útil de forma práctica de 0,02 \muM, que casi todas las muestras
que se pueden someter a investigación en un ensayo están dentro del
intervalo medible. Con relación a las muestras de más de 20 \muM
es posible una determinación precisa al menos después de la
dilución, reduciendo por tanto la concentración al intervalo
anterior.
Según el presente método, se requiere sólo un
disolvente de separación y el tiempo necesario para realizar la
medida de un ciclo de análisis es de aproximadamente 14 minutos.
Éste es considerablemente más corto que en los métodos
convencionales. Por tanto, con un uso de HPLC se pueden llevar a
cabo aproximadamente 100 determinaciones por día, lo que es
aproximadamente el doble comparado con el método descrito por
Nakamura et al discutido antes.
También, como es claro de los resultados
anteriores, el presente método es suficientemente sensible para
permitir la determinación precisa de 5-HC en una
concentración de 0,02 \muM (0,26 \mug(dl). Por tanto, se
puede determinar 5-HC incluso en la sangre de una
persona sana, lo que muestra que el presente método es altamente
sensible si se compara con los métodos mostrados en la técnica.
La razón de la alta sensibilidad se asume que es
que el tiempo necesario para el análisis es más corto y que, ya que
el disolvente de separación es más ácido, la tasa de descomposición
de 5-HC se reduce. Por combinación de estos dos
efectos, 5-HC se descompone difícilmente durante el
análisis.
Por tanto, el presente método es un método muy
eficaz y útil para separar y determinar 5-HC en una
muestra, lo que permite aplicaciones prácticas que han sido
imposibles con los métodos convencionales.
Claims (9)
1. Método para la separación de
5-hidroxicreatinina, que comprende la etapa de
someter una muestra a separación por cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) usando una resina de intercambio catiónico
fuertemente ácida de tipo ácido sulfónico de una serie
estireno-divinilbenceno y un disolvente de
separación que tiene un pH de 4,1-4,6.
2. Método de la reivindicación 1, en el que el
disolvente de separación se selecciona entre disolventes tampón
citrato, disolventes tampón fosfato y disolventes mezclados tampón
citrato/dimetilsulfóxido.
3. Método de cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, en el que el disolvente tiene un pH dentro del
intervalo de 4,2-4,3.
4. Método de cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, en el que está presente ácido clorhídrico para ajustar
el pH al valor deseado.
5. Método de cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, en el que la muestra que se somete a separación se
deriva de un ser vivo.
6. Método de la reivindicación 5, en el que la
muestra que se somete a separación se deriva de la sangre, el suero
o la orina.
7. Método de las reivindicaciones 5 ó 6, en el
que el ser vivo es un mamífero, incluyendo el ser humano.
8. Método de cualquiera de las reivindicaciones
precedentes, que comprende las etapas adicionales de hidrolizar la
5-HC separada y convertirla en metilguanidina, y
determinar cuantitativamente la metilguanidina después de someterla
a marcaje fluorescente.
9. Uso de un disolvente que tiene un pH de
4,1-4,6, en combinación con una resina de
intercambio catiónico fuertemente ácida de tipo ácido sulfónico de
una serie estireno-divinilbenceno, para la
separación de 5-hidroxicreatinina de una muestra por
medio de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
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