DE60027606T2

DE60027606T2 - Polyphenolisches protein enthaltende bioadhäsive zusammensetzung

Info

Publication number: DE60027606T2
Application number: DE60027606T
Authority: DE
Inventors: Magnus Qvist; Arne Hans HANSSON
Original assignee: BioPolymer Products of Sweden AB
Current assignee: Howmedica Osteonics Corp
Priority date: 1999-12-17
Filing date: 2000-12-14
Publication date: 2007-01-25
Anticipated expiration: 2020-12-15
Also published as: AU2417201A; US20050148050A1; DK1265971T3; EP1265971A1; ATE324417T1; CY1106984T1; ES2292060T3; DE60036236T2; ES2262557T3; EP1265971B1; DE60036236D1; PT1265971E; PT1589088E; US6867188B2; US20030065060A1; ATE371710T1; DK1589088T3; DE60027606D1; WO2001044401A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft biologisch abbaubare Zusammensetzungen, die bioadhäsive, biokompatible Polymere umfassen, sowie Verfahren, die verwendet werden, um Oberflächen zu bedecken und Strukturen an Augengeweben wie der Hornhaut zu befestigen. Polyphenolische Proteine, die aus Muscheln isoliert werden, die als „Muschel-adhäsives Protein" oder „MAP" bezeichnet werden, werden in Verbindung mit Polysacchariden verwendet, um eine starke adhäsive Bindung zu erreichen. Die Erfindung betrifft auch einen Kit, der aus einer MAP-Zubereitung, einer Zubereitung aus Polysacchariden, die vorzugsweise negativ geladen sind, und optional einem Oxidationsmittel wie Wasserstoffperoxid, Nitroprussidionen oder Periodationen besteht, der zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Abdeckung und Befestigung von Strukturen an Augengewebe wie der Hornhaut verwendet wird.
Hintergrund der Erfindung
Die Reparatur beschädigter Strukturen auf und in einem Auge und seiner Adnexe ist oft schwierig. Die Verwendung von Nähten in z. B. der Hornhaut bewirkt Unbehagen, Deformationen, Verspannungen und kann die Sehschärfe beeinträchtigen. Andere Augenkomponenten wie die Iris, Linsenstrukturen und die Retina sind schwierig oder kaum möglich zu nähen oder mit Klammern und verwandten Hilfsmitteln zu verbinden. Zudem induzieren Nähte und Klammern unweigerlich Reaktionen auf Fremdkörper sowie die Narbenbildung. Die Positionierung eines Implantats in okulare Strukturen, z. B. eine teilweise Dicken- oder eine penetrierende Keratoplastie oder eine Prothese in der Hornhaut, setzt die Verwendung von aufwendigen Techniken einschließlich der Verwendung der Haptik voraus, um es in der richtigen Position zu halten, was zu Irritationen und unerwünschten Nebenwirkungen führen kann. Dem entsprechend sind die derzeitigen Verfahren zur Reparatur von Strukturen auf, an und in einem Auge mit Unbehagen und der Möglichkeit der Induktion dauerhaften Schadens für die Sehschärfe assoziiert. Die Verwendung einer Zusammensetzung, die es Strukturen mit feuchten Oberflächen ermöglicht, in einer gewünschten Position befestigt zu werden, die für einen voraussagbaren Zeitraum ohne irgendeine Undurchsichtigkeit in optisch wichtigen Komponenten oder irgendeine Deformation, Narben oder nicht akzeptable Reaktionen auf Fremdkörper auszulösen haftend verbleiben, wäre daher sehr wünschenswert.
Polyphenolische Proteine, die vorzugsweise aus Muscheln isoliert werden, sind dahingehend bekannt, dass sie als Adhäsivmittel (Klebstoffe) wirken. Beispiele solcher Proteine sind zum Beispiel in der U.S. 4,585,585 zu finden. Deren breite Verwendung als Adhäsivmittel war mit Problemen verbunden, die sich auf die Aufreinigung und Charakterisierung der adhäsiven Proteine in ausreichenden Mengen beziehen. Zudem hat die Notwendigkeit geeigneter biokompatibler Vernetzungsmittel und anderer Hilfsmittel deren Verwendung eingeschränkt. Chemikalien wie bifunktionelle konjugierende Verbindungen und Enzyme sind üblicher Weise mit toxischen Reaktionen oder anderen biomedizinischen Nebenwirkungen assoziiert. Zusätzlich ist es schwierig, Enzyme unter Aufrechterhaltung einer hohen Aktivität unter Vermeidung einer Denaturierung und nachteiliger Wirkungen auf Zellen, Gewebe oder Organe ausgiebig aufzureinigen.
Muschel-adhäsives Protein (MAP) wird in einer Drüse in dem Fuss von Byssus-bildenden Muscheln, wie der gewöhnlichen blauen Muschel (Mytilus edulis), gebildet. Das Molekulargewicht des MAP aus Mytilis edulis beträgt ungefähr 130.000 Dalton und es wurde offenbart, dass es aus 75–80 nahe verwandten sich wiederholenden Peptidsequenzen besteht. Das Protein ist zusätzlich durch seine vielen dem epidermalen Wachstumsfaktor ähnlichen Wiederholungen gekennzeichnet. Es hat einen ungewöhnlich hohen Anteil an hydroxyhaltigen Aminosäuren wie Hydroxyprolin, Serin, Threonin, Tyrosin und der seltenen Aminosäure 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanin (Dopa) sowie Lysin. Es kann entweder aus natürlichen Quellen isoliert oder biotechnologisch hergestellt werden. Die U.S. 5,015,677 sowie die U.S. 4,585,585 offenbaren, dass MAP sehr starke adhäsive Eigenschaften nach der Oxidation und Polymerisation aufweist, z. B. durch die Aktivität des Enzyms Tyrosinase oder nach der Behandlung mit bifunktionellen Reagenzien. Es ist in biomedizinischen Anwendungen für ein Adhäsivmittel und eine Beschichtungszusammensetzung sehr wichtig, biologisch verträgliche und biologisch abbaubare Komponenten zu verwenden, die zudem per se keine oder bedingt durch eine Verunreinigung keine Entzündung oder toxische Reaktionen induzieren sollten. Füllmittel einschließlich Kollagene und Polysaccharide wurden hinzu gegeben, um die mechanischen Eigenschaften in den Fällen zu verbessern, in denen MAP verwendet wurde, um Gewebe und Strukturen miteinander zu verbinden, was weiter zu dem Risiko immunologischer Reaktionen beiträgt.
Es ist auch zuvor bekannt gewesen, dass es möglich ist, adhäsive Zusammensetzungen, die auf MAP basieren, für ophthalmologische Zwecke zu verwenden. Robin et al., Refractive and Corneal Surgery, Bd. 6, S. 302–306, und Robin et al., Arch. Ophthalmol, Bd. 106, S. 973–977, offenbaren beide auf MAP basierende Adhäsivmittel, die ein enzymatisches Polymerisationsmittel umfassen. Die U.S. 5,015,677 beschreibt auch ein MAP-basierendes Adhäsivmittel, das ein Vernetzungsmittel und optional eine Füllermittelsubstanz und ein Tensid enthält. Bevorzugte Vernetzungsmittel gemäß der U.S. 5,015,677 sind enzymatische Oxidationsmittel wie Catecholoxidase und Tyrosinase, aber manchmal auch chemische Vernetzungsmittel wie Glutaraldehyd und Formaldehyd. Beispiele von Füllmitteln sind Proteine wie Kollagen und Albumin und Polymere, die Kohlenhydratgruppen umfassen, wie Chitosan und Hyaluronan. Die U.S. 5,030,230 betrifft auch auf ein bioadhäsives Mittel, das MAP, Pilztyrosinase (Vernetzungsmittel), SDS (Natriumdodecylsulfat, ein Tensid) und Kollagen (Füllmittel) umfasst. Das bioadhäsive Mittel wird verwendet, um eine Hornhautprothese auf der Augenwand zu befestigen.
Ein Hauptproblem, das mit bekannten auf MAP basierenden bioadhäsiven Zusammensetzungen trotz der hervorragenden Eigenschaften des MAP per se assoziiert ist, ist das einige Bestandteile, insbesondere die derzeit verwendeten Vernetzungsmittel, lebendes Gewebe schädigen und/oder irritieren können und toxische und immunologische Reaktionen auslösen können. Chemische Vernetzungsmittel wie Glutaraldehyd und Formaldehyd sind im Allgemeinen für Menschen und Tiere toxisch und es ist daher sehr unangemessen, solche Mittel auf empfindliche Gewebe wie das Auge zu geben. Enzyme wie Catecholoxidase und Tyrosinase sind Proteine, und Proteine sind im Allgemeinen als potente Allergene anerkannt, insbesondere in dem Fall, in dem sie ursprünglich aus einer Spezies stammen, die nicht der Patient ist. Wegen deren oxidierenden und hydrolysierenden Fähigkeiten können sie zudem empfindliches Gewebe beschädigen. Trotz dieser ernst zu nehmenden Nachteile, die mit den derzeit verwendeten Vernetzungsmitteln assoziiert sind, wurde es als notwendig erachtet, diese mit zu umfassen, um eine ausreichende Härtung des bioadhäsiven Mittels zu erhalten. Die WO A1 94/28937 offenbart Protein-Polymerkonjugate als biokompatible Adhäsivmittel.
Dementsprechend gibt es einen Bedarf an einer auf MAP basierenden bioadhäsiven Zusammensetzung, die diese Nachteile ausräumt und somit die empfindlichen Gewebe wie das Auge weder beschädigt noch irritiert.
Zusammensetzung der Erfindung
Nun wurde überraschender Weise herausgefunden, dass eine nicht irritierende, nicht allergene und nicht toxische Zusammensetzung durch das Bereitstellen einer bioadhäsiven Zusammensetzung erhalten werden kann, die a) ein polyphenolisches Protein, das aus einer Byssus-bildenden Muschel abgeleitet ist, b) ein Polymer, das Kohlenhydratgruppen umfasst, und ein nicht enzymatisches Oxidationsmittel umfasst, wobei die Zusammensetzung wie in Anspruch 1 definiert ist. Die bioadhäsive Zusammensetzung enthält keinerlei Enzym oder chemisches Vernetzungsmittel. Optional kann die Zusammensetzung ein Oxidationsmittel und/oder ein Füllprotein enthalten. Vorzugsweise wird die Zusammensetzung als ein Kit aus wenigstens zwei Teilen bereitgestellt, nämlich jeweils das polyphenolische Protein und das Polymer, das die Kohlenhydratgruppen umfasst.
Definitionen
Wie sie hierin offenbart werden, beziehen sich die Begriffe „polyphenolisches Protein", „Muschel-adhäsives Protein" oder „MAP" auf ein bioadhäsives Protein, das aus Byssus-bildenden Muscheln abgeleitet ist. Beispiele solcher Muscheln sind die Muscheln der Gattungen Mytilus, Geukensia, Aulacomya, Phragmatopoma, Dreissenia und Brachiodontes. Geeignete Proteine wurden in einer Vielzahl von Veröffentlichungen offenbart, z. B. U.S. A 5,015,677, U.S. A 5,242,808, U.S. A 4,585,585, U.S. A 5,202,236, U.S. A 5,149,657, U.S. A 5,410,023, WO 97/34016 und U.S. A 5,574,134, Vreeland et al., J. Physiol., 34: 1–8 und Yu et al., Macromolecules, 31: 4739–4745. Diese umfassen ungefähr 30–300 Aminosäurereste und bestehen im Wesentlichen aus als Tandem gebundenen Peptideinheiten, die optional durch eine Verbindungssequenz aus 0–10 Aminosäuren getrennt sind. Ein kennzeichnendes Merkmal solcher Proteine ist eine vergleichbar hohe Menge positiv geladener Lysinreste und insbesondere die seltene Aminosäure DOPA (L-3,4-Dihydroxyphenylalanin). Ein polyphenolisches Protein, das zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, hat eine Aminosäuresequenz, bei der wenigstens 5% und vorzugsweise 6–25% der Aminosäurereste DOPA sind. Ein paar Beispiele von typischen Peptideinheiten werden unten wiedergegeben. Jedoch ist es wichtig, festzustellen, dass die Aminosäuresequenzen dieser Proteine variabel sind und dass der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht auf die unten beispielhaft aufgeführten Untersequenzen beschränkt ist, weil der Fachmann realisiert, dass bioadhäsive polyphenolische Proteine aus verschiedenen Quellen als äquivalent angesehen werden können:

a) Val-Gly-Gly-DOPA-Gly-DOPA-Gly-Ala-Lys
b) Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-diHyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys
c) Thr-Gly-DOPA-Gly-Pro-Gly-DOPA-Lys
d) Ala-Gly-DOPA-Gly-Gly-Leu-Lys
e) Gly-Pro-DOPA-Val-Pro-Asp-Gly-Pro-Tyr-Asp-Lys
f) Gly-Lys-Pro-Ser-Pro-DOPA-Asp-Pro-Gly-DOPA-Lys
g) Gly-DOPA-Lys
h) Thr-Gly-DOPA-Ser-Ala-Gly-DOPA-Lys
i) Gln-Thr-Gly-DOPA-Val-Pro-Gly-DOPA-Lys
j) Gln-Thr-Gly-DOPA-Asp-Pro-Gly-Tyr-Lys
k) Gln-Thr-Gly-DORA-Leu-Pro-Gly-DOPA-Lys

Wie er hierin offenbart wird, bezieht sich der Begriff „Polymer, das Kohlenhydratgruppen umfasst" auf ein natürlich vorkommendes oder synthetisches Polymer, das eine Vielzahl von Kohlenhydratgruppen umfasst. Die Polymere können aus diskreten Kohlenhydratgruppen bestehen, die durch Kohlenwasserstoffketten verbunden sind, die Polymere sind aber vorzugsweise Polysaccharide und noch mehr bevorzugt Polysaccharide, die geladene Gruppen umfassen. Beispiele von geeigneten Polymeren sind Heparin, Chondoitinsulfat, Chitosan und Hyaluronan.
Wie er hierin offenbart wird, bezieht sich der Begriff „pharmazeutisch verträgliche feine Filamente" auf dünne Fasern, die in Nähten, vorzugsweise ophthalmologischen Nähten, erwendet werden können. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sollte die Länge der Fasern 15 mm nicht überschreiten und sie liegen üblicher Weise in dem Bereich von 1–10 mm.
Wie er hierin offenbart wird, bezieht sich der Begriff „Füllprotein" auf ein Protein, das optional zu der bioadhäsiven Zusammensetzung hinzu gegeben wird, um eine bioadhäsive Zusammensetzung zu erhalten, die auf spezielle Anwendungen angepasst ist. Geeignete Füllproteine gemäß der vorliegenden Erfindung sind Kollagen, Kasein, Albumin, Elastin, Fibrin und Fibronectin.
Unter dem Begriff „enzymatisches Oxidationsmittel" ist ein Enzym mit der Fähigkeit zur Oxidation von MAP zu verstehen, um eine vollständige oder teilweise Vernetzung von MAP und/oder Polymeren und/oder Füllproteinen zu unterstützen. Beispiele solcher Enzyme gemäß dem Stand der Technik umfassen Chatecholoxidase und Tyrosinase.
Eine Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst kein enzymatisches Oxidationsmittel. Unter dem Begriff „nicht enzymatisches Oxidationsmittel" ist ein pharmazeutisch verträgliches Oxidationsmittel zu verstehen, das bei den eingesetzten Dosierungen weder toxisch noch irritierend ist. Beispiele solcher nicht enzymatischer Oxidationsmittel sind Wasserstoffperoxid und Natriumnitroprussid.
Unter dem Begriff „chemisches Vernetzungsmittel" ist eine Verbindung zu verstehen, die wenigstens zwei funktionelle Gruppen umfasst, die in der Lage sind, kovalent an MAP und/oder Polymere und/oder Füllproteine zu binden. Beispiele von solchen Verbindungen gemäß dem Stand der Technik umfassen Glutaraldehyd, Formaldehyd, Bis-(sulfosuccinimidyl)suberat und 3,3'-Dithiobis(sulfosuccinimidylpropionat). Eine Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst kein chemisches Vernetzungsmittel.
Eine Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst drei obligatorische Komponenten, nämlich a) ein bioadhäsives polyphenolisches Protein und b) ein Polymer, das Kohlenhydratgruppen umfasst, und c) ein nicht enzymatisches Oxidationsmittel. Es ist bevorzugt, dass die Zusammensetzung als ein Kit of Parts geliefert wird, in dem die oben genannten obligatorischen Komponenten in getrennten Zubereitungen umfasst sind. Diese Zubereitungen werden direkt vor der Verwendung vermischt. In der vollständigen Zusammensetzung haben sich die folgenden Konzentrationen als nützlich herausgestellt:

Komponente Konzentration (mg/ml)

Polyphenolisches Protein (Komponente a) 0,1–50, vorzugsweise 0,3–10

Polymer mit Kohlenhydratgruppen 0,1–50, vorzugsweise 0,3–30.
Das nicht enzymatische Oxidationsmittel kann Wasserstoffperoxid sein, das typischer Weise in einer Menge von 1–100 mg/ml, vorzugsweise ungefähr 10 mg/ml korrespondierend mit 1% (Gew./Vol.), mit umfasst ist. Andere solche Mittel sind Nitroprussidionen und Periodationen. Periodate wie Natriumperiodat sind typischer Weise in einer Konzentration von 2 mM in Bezug auf die Endzusammensetzung vorhanden. Zudem können pharmazeutisch verträgliche feine Filamente in einer Menge von 0,5–40 mg/ml, vorzugsweise 1–20 mg/ml, in der endgültigen Zusammensetzung mit umfasst sein.
In dem Fall, dass die Zusammensetzung als ein Kit of Parts zur Verfügung gestellt wird, wird jede Komponente in der gleichen oder einer höheren Konzentration bereit gestellt, aber die oben genannten Konzentrationsbereiche werden durch das Vermischen der Komponentenzubereitungen miteinander zur Herstellung der endgültigen Zusammensetzung erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun in den folgenden nicht einschränkenden Beispielen zusätzlich beschrieben werden.
Beispiel 1 (vergleichend)
Es wurde ausgiebig aufgereinigtes Muschel-adhäsives Protein (MAP), das von BioPolymer Products AB, Floda, Schweden, geliefert wurde, in 5% Essigsäure in einer Konzentration von 0,9 mg/ml verwendet und in der Dunkelheit in der Kälte (~8°C) gelagert. Heparin aus der Darmschleimhaut von Schweinen wurde von Sigma Chemical Co., St. Louise, Mo, USA (H 3393) erworben. Zusätzliche Laborchemikalien waren von der höchsten verfügbaren Reinheit und wurden von Sigma und Merck käuflich erworben.
Der pH-Wert der MAP-Lösung wurde auf einen leicht alkalischen pH-Wert, üblicher Weise auf 7,5–8,5, aber in zusätzlichen Experimenten bis auf ungefähr 9,5 angepasst. Die Experimente wurden an betäubten Ratten durchgeführt.
Die Hornhaut wurde deepithelialisiert. Eine Wunde wurde chirurgisch in der Mitte der Hornhaut mit der Hilfe eines Bohrers mit einem Durchmesser von 3 mm hergestellt. Die Bowmans-Membran und Stroma wurden mit einem Messer und einer feinen Schere bis runter in die Nähe der Descements-Membran ausgeschnitten. Ein Block Hornhautgewebe wurde dadurch isoliert und von seiner ursprünglichen Position entfernt. Wenigstens 5 μl MAP und 3 μl 10 mg/ml wässrige Heparinlösung wurden in die Wundhöhle verabreicht und danach wurden die kurz zuvor entfernten Hornhautgewebestücke wieder in die Höhle positioniert, um die Haftung und erneute Befestigung, die durch den MAP-Klebstoff vermittelt wird, zu testen. Haftungen wurden zwischen den Stromafragmenten und der Wundhöhle in der Hornhaut nach 5 Minuten erreicht, wie es sehr vorsichtig mit Hilfe einer opthalmologischen Pinzette und eines Operationsmikroskops getestet wurde. Die MAP-Klebstoffkombination fügte keinerlei offensichtliche zusätzliche Intensität in Bezug auf die Entzündungsreaktionen während der ersten Tage hinzu. Die Hornhautwunde wurde mit Epithel innerhalb von zwei Tagen bedeckt. Es konnten keine nachteiligen Wirkungen durch Sichtinspektion oder durch Mikroskopie erkannt werden, die mit der MAP-Zusammensetzung in Verbindung stehen.
Die histologischen Untersuchungen solcher Hornhäute, an denen nach 5 und 7 Tagen immer noch stromale Fragmente befestigt waren, zeigten, dass die MAP-Heparinkombination scheinbar die entzündliche Reaktion sowohl in der Hornhaut wie auch in dem Limbus und der Bindehaut im Vergleich zu solchen Spezies bei Tieren nicht verschlimmerten, die eine Wundhöhle in der Hornhaut für den gleichen Zeitraum hatten. Es gab an Stellen das Einwachsen von Epithelzellen in die Hornhautwunde unterhalb der erneut befestigten stromalen Fragmente, aber nicht in dem Ausmaß, dass sie losgelöst wurden.
Beispiel 2
Aufgereinigtes MAP (0,81 mg/ml, BioPolymer Products AB) in entweder 1% Zitronen- oder 1% Milchsure wurde auf einen pH-Wert von üblicher Weise 7,5–8,5, aber in einigen Experimenten bis auf ungefähr 9,5 angepasst. Heparin und die Laborchemikalien waren von der höchsten verfügbaren Reinheit und wurden von Sigma und Merck käuflich erworben. Die Experimente wurden an betäubten Ratten gemäß den Richtlinien der ethischen Genehmigungen durchgeführt.
Die Hornhaut wurde deepithelialisiert. Eine Wunde wurde chirurgisch in der Mitte durch etwa die Hälfte der Hornhaut mit der Hilfe eines Bohrers mit einem Durchmesser von 3 mm hergestellt. Die Bowmans-Membran und Stroma wurden mit einem Messer und einer feinen Schere bis runter in die Nähe der Descements-Membran ausgeschnitten. Ein Block Hornhautgewebe wurde dadurch isoliert und von seiner ursprünglichen Position entfernt. Wenigstens 5 μl MAP, 3 μl 10 mg/ml wässrige Heparinlösung und 2 μl 6% (Gew./Vol.) wässriges Wasserstoffperoxid wurden in die Wundhöhle entweder ein oder zwei Mal verabreicht. Danach wurden die kurz zuvor entfernten Hornhautgewebestücke wieder in die Höhle positioniert, um die Haftung und erneute Befestigung, die durch den MAP-Klebstoff vermittelt wird, zu testen. Eine Bindung wurde zwischen den Stromafragmenten und der Wundhöhle in der Hornhaut nach 5 Minuten erreicht, wie es sehr vorsichtig mit Hilfe einer opthalmologischen Pinzette und eines Operationsmikroskops getestet wurde. Die MAP-Klebstoffkombination fügte keinerlei offensichtliche zusätzliche Intensität in Bezug auf die Entzündungsreaktionen während der ersten Tage hinzu. Die Hornhautwunde wurde mit Epithel innerhalb von zwei Tagen bedeckt. Es konnten keine nachteiligen Wirkungen durch Sichtinspektion oder durch Mikroskopie erkannt werden, die mit der MAP-Zusammensetzung in Verbindung stehen.
Die histologischen Untersuchungen der Hornhäute mit gebundenen stromalen Fragmenten nach 5 und 7 Tagen zeigten, dass die MAP-Heparin-Kombination scheinbar die entzündliche Reaktion sowohl in der Hornhaut wie auch in dem Limbus und der Bindehaut im Vergleich zu solchen Spezies bei Tieren nicht verschlimmerten, die eine Wundhöhle in der Hornhaut für den gleichen Zeitraum hatten. Es gab an Stellen das Einwachsen von Epithelzellen in die Hornhautwunde unterhalb der erneut befestigten stromalen Fragmente, aber nicht in dem Ausmaß, dass sie bedingt durch den Kontakt mit Hornhautstroma losgelöst wurden.
Beispiel 3
Aufgereinigtes MAP (0,81 mg/ml, BioPolymer Products AB) in entweder 1% Zitronen- oder 1% Milchsure wurde auf einen pH-Wert von üblicher Weise 7,5–8,5, aber in einigen Experimenten bis auf ungefähr 9,5 angepasst. Chondroitinsulfat und die Laborchemikalien waren von der höchsten verfügbaren Reinheit und wurden von Sigma und Merck käuflich erworben. Die Experimente wurden an betäubten Ratten gemäß den Richtlinien der ethischen Genehmigungen durchgeführt.
Die Hornhaut wurde deepithelialisiert. Eine Wunde wurde chirurgisch in der Mitte durch etwa die Hälfte der Hornhaut mit der Hilfe eines Bohrers mit einem Durchmesser von 3 mm hergestellt. Die Bowmans-Membran und Stroma wurden mit einem Messer und einer feinen Schere bis runter in die Nähe der Descements-Membran ausgeschnitten. Ein Block Hornhautgewebe wurde dadurch isoliert und von seiner ursprünglichen Position entfernt. Wenigstens 5 μl MAP, 3 μl 24 mg/ml wässriges Chondroitinsulfat und 2 μl 6% (Gew./Vol.) wässriges Wasserstoffperoxid wurden in die Wundhöhle entweder ein oder zwei Mal verabreicht. Danach wurden die kurz zuvor entfernten Hornhautgewebestücke wieder in die Höhle positioniert, um die Haftung und erneute Befestigung, die durch den MAP-Klebstoff vermittelt wird, zu testen. Eine Bindung wurde zwischen den Stromafragmenten und der Wundhöhle in der Hornhaut nach 5 Minuten erreicht, wie es sehr vorsichtig mit Hilfe einer opthalmologischen Pinzette und eines Operationsmikroskops getestet wurde. Die MAP-Klebstoffkombination fügte keinerlei offensichtliche zusätzliche Intensität in Bezug auf die Entzündungsreaktionen während der ersten Tage hinzu. Die Hornhautwunde wurde mit Epithel innerhalb von zwei Tagen bedeckt, obwohl es scheinbar einige Unregelmässigkeiten in der epithelialen Zellschichtung gab. Es konnten keine nachteiligen Wirkungen durch Sichtinspektion oder durch Mikroskopie erkannt werden, die mit der MAP-Zusammensetzung in Verbindung stehen.
Die histologischen Untersuchungen der Hornhäute mit gebundenen stromalen Fragmenten nach 5 und für eine Ratte nach 7 Tagen zeigten, dass die MAP-Chondroitinsuifat-Kombination scheinbar die entzündliche Reaktion sowohl in der Hornhaut wie auch in dem Limbus und der Bindehaut im Vergleich zu solchen Spezies bei Tieren nicht verschlimmerten, die eine Wundhöhle in der Hornhaut für den gleichen Zeitraum hatten. Es gab kein deutliches Einwachsen von Epithelzellen in die Hornhautwunde.
Beispiel 4 (Vergleichend)
Aufgereinigtes MAP (0,81 mg/ml, BioPolymer Products AB) in entweder 1% Zitronen- oder 1% Milchsure wurde auf einen pH-Wert von üblicher Weise 7,5–8,5, aber in einigen Experimenten bis auf ungefähr 9,5 angepasst. Hyaluronan (wässrige Lösung, 10 mg/ml), Chitosan (wässrige Lösung, 10 mg/ml) und die Laborchemikalien waren von der höchsten verfügbaren Reinheit. Die Experimente wurden an betäubten Ratten gemäß den Richtlinien der ethischen Genehmigungen durchgeführt.
Die chirurgische Prozedur wurde wie in Beispiel 1 bis 3 durchgeführt. Eine recht gute Bindung wurde zwischen den stromalen Stücken und der umgebenden ursprünglichen Hornhaut erreicht. Die erreichten Ergebnisse stimmten mit denen überein, die in den Beispielen 1–3 berichtet werden. Jedoch zeigte die histologische Untersuchung, dass es etwas Einwachsen der epithelialen Zellen entlang der lateralen Grenzen des implantierten Stromas gab, jedoch nur in einem beschränkten Umfang.
Beispiel 5
Aufgereinigtes MAP (0,81 mg/ml, BioPolymer Products AB) in 1% Milchsäure wurde auf einen pH-Wert von üblicher Weise 7,5–8,5, aber in zusätzlichen Experimenten bis auf ungefähr 9,5 angepasst. Heparin und die Laborchemikalien waren von der höchsten verfügbaren Reinheit und wurden von Sigma und Merck käuflich erworben. Die Experimente wurden an betäubten Ratten gemäß den Richtlinien der ethischen Genehmigungen durchgeführt.
Die Hornhaut wurde deepithelialisiert. Die Hornhaut wurde vorsichtig in die Mitte mit der Hilfe eines Lochers mit einem Durchmesser von 3 mm gelocht. Der Gewebezylinder wurde langsam aus der ursprünglichen Hornhaut mit der Hilfe feiner Instrumente unter mikroskopischer Beobachtung bis zumindest der Hälfte seiner Dicke entfernt. Eine Lösung, die direkt vor der Verwendung aus 20 μl MAP, 10 μl 10 mg/ml wässriger Heparinlösung und 10 μl 6% (Gew./Vol.) wässrigem Wasserstoffperoxid hergestellt wurde, wurde entlang der Grenze zwischen dem Pfropfen und der verbleibenden Hornhaut aufgetragen. Der Hornhautpfropfen wurde dann wieder in Position gebracht und vorsichtig in der Position gehalten. Eine Haftung wurde zwischen dem zentralen Pfropfen und dem peripheren Teil der ursprünglichen Hornhaut nach 5 Minuten erreicht, wie es sehr vorsichtig mit Hilfe einer opthalmologischen Pinzette und eines Operationsmikroskops getestet wurde. Die Sichtinspektion und Mikroskopie wurde über 5 Tage und gelegentlich über 7 Tage durchgeführt. Es gab eine entzündliche Reaktion in der Bindehaut und die Blutgefäße tendierten dahin, zur Fläche der Chirurgie hin zu wachsen. Die zentrale Hornhaut blieb in ihrer Position an die umgebende Bindehaut befestigt. Die Bindehaut war innerhalb von zwei Tagen erneut epithelialisiert. Es gab ein Ödem und leichte bis moderate Trübungen in und um die Wundfläche. Die Histopathologie der Hornhaut zeigte eine leichte bis moderate Entzündung entlang der chirurgischen Zone. Epithelzellen bedeckten die vordere Oberfläche, konnten aber auch als Fäden entlang von Teilen der lateralen Grenzfläche des Hornhautpfropfens nachgewiesen werden. Leukozyten und Makrophagen hafteten an der Verletzungszone der vorderen Kammer zugewandt. Die erreichten Ergebnisse zeigen somit an, dass MAP in Verbindung mit Heparin und einem Oxidationsmittel verwendet werden könnte, um einen Hornhautpfropfen sicher zurück in seiner chirurgischen Entnahmeposition zu kleben.
Beispiel 6
Aufgereinigtes MAP (0,81 mg/ml, BioPolymer Products AB) in 1% Zitronensäure wurde auf einen pH-Wert von üblicher Weise 7,5–9,5 angepasst. Heparin und die Laborchemikalien waren von der höchsten verfügbaren Reinheit und wurden von Sigma und Merck käuflich erworben. Die Experimente wurden an betäubten Ratten gemäß den Richtlinien der ethischen Genehmigungen durchgeführt.
Die Hornhaut wurde deepithelialisiert. Die Chirurgie und Anwendung der Bindungsmischung wurde wie in Beispiel 5 durchgeführt. Die Haftung wurde zwischen dem mittigen Pfropfen und dem peripheren Teil der ursprünglichen Hornhaut nach 5 Minuten erreicht, wie es sehr vorsichtig mit Hilfe einer ophthalmologischen Pinzette und einem Operationsmikroskop getestet wurde.
Die erhaltenen Ergebnisse befanden sich in guter Übereinstimmung mit denen, die in Beispiel 5 gezeigt wurden; für in diesem Fall MAP in Zitronensäure und Heparin, beide Male in Bezug auf das klinische Ergebnis und die Histopathologie, wie sie nach 5 Tagen untersucht wurde.
Beispiel 7
Aufgereinigtes MAP (0,81 mg/ml, BioPolymer Products AB) in 1% Zitronensäure wurde auf einen pH-Wert von üblicher Weise 7,5–8,5 angepasst. Chondroitinsulfat (24 mg/ml wässrige Lösung) und die Laborchemikalien waren von der höchsten verfügbaren Reinheit und wurden von Sigma und Merck käuflich erworben. Die Experimente wurden an betäubten Ratten gemäß den Richtlinien der ethischen Genehmigungen durchgeführt.
Die Hornhaut wurde deepithelialisiert. Die Chirurgie und Anwendung der Bindungsmischung wurde wie in Beispiel 5 durchgeführt. Die Haftung wurde zwischen dem mittigen Pfropfen und dem peripheren Anteil der ursprünglichen Bindehaut nach 5 Minuten erreicht, wie es sehr vorsichtig mit Hilfe einer ophthalmologischen Pinzette und einem Operationsmikroskop getestet wurde.
Die Sichtinspektion und Mikroskopie wurde über 5 Tage und gelegentlich über 7 Tage durchgeführt. Es gab eine entzündliche Reaktion in der Bindehaut und die Blutgefäße tendierten dahin, zur Fläche der Chirurgie hin zu wachsen. Die zentrale Hornhauttransplantation blieb in ihrer Position an die umgebende Bindehaut befestigt. Die Bindehaut war innerhalb von zwei Tagen erneut epithelialisiert. Es gab ein Ödem und leichte bis moderate Trübungen in und um die Wundfläche. Die Histopathologie der Hornhaut zeigte eine leichte bis moderate Entzündung entlang der chirurgischen Zone. Epithelzellen bedeckten die vordere Oberfläche. Jedoch konnten entlang der lateralen Grenzfläche des Pfropfens und der Hornhaut nur kurze aber scheinbar breite Papillen von Epithelzellen erkannt werden. In keinem der untersuchten Abschnitte reichte das Epithel mehr als ungefähr ein Viertel oder ein Drittel in die Tiefe des Hornhautstromas. Leukozyten und Makrophagen hafteten an der Verletzungszone der vorderen Kammer zugewandt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen somit an, dass MAP (in Zitronensäure) in Verbindung mit Chondroitinsulfat und einem Oxidationsmittel verwendet werden könnten, um einen Hornhautgewebepfropfen an die Stelle seiner chirurgischen Entnahme zu befestigen.
Beispiel 8
Aufgereinigtes MAP (0,81 mg/ml, BioPolymer Products AB) in 1% Milchsäure wurde auf einen pH-Wert von 7,5–9,5 angepasst. Chondroitinsulfat (24 mg/ml wässrige Lösung) und die Laborchemikalien waren von der höchsten verfügbaren Reinheit und wurden von Sigma und Merck käuflich erworben. Die Experimente wurden an betäubten Ratten gemäß den Richtlinien der ethischen Genehmigungen durchgeführt.
Die Hornhaut wurde deepithelialisiert. Die Chirurgie und die Behandlung mit MAP, Chondroitinsulfat und Oxidationsmittel wurden wie in Beispiel 7 durchgeführt.
Die erhaltenen Ergebnisse stimmten mit denen von Beispiel 7 überein. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen somit an, dass MAP (in Milchsäure) in Verbindung mit Chondroitinsulfat und einem Oxidationsmittel verwendet werden könnten, um einen Hornhautgewebepfropfen erneut sicher an der Hornhaut zu befestigen.
Beispiel 9
Aufgereinigtes MAP (0,81 mg/ml, BioPolymer Products AB) in entweder 1% Milchsäure oder in 1% Zitronensäure wurde auf einen pH-Wert von 7,5–9,5 angepasst. Chitosan (10 mg/ml, wässrige Lösung), Hyaluronan (10 mg/ml, wässrige Lösung) und die Laborchemikalien wurden in der höchsten verfügbaren Reinheit käuflich erworben. Die Experimente wurden an betäubten Ratten gemäß den Richtlinien der ethischen Genehmigungen durchgeführt.
Die Hornhaut wurde deepithelialisiert. Die Chirurgie und die Behandlung mit MAP, Hyaluronan oder Chitosan und einem Oxidationsmittel wurden wie in Beispiel 7 durchgeführt. Die mit Chitosan erhalten Ergebnisse stimmten grob mit denen von Beispiel 7 überein, wobei Hyaluronan in der akuten Situation funktionierte, aber keine langfristigen Resultate erhalten wurden. Die Ergebnisse zeigen an, dass MAP in Verbindung mit zusätzlichen Polysacchariden und einem Oxidationsmittel verwendet werden könnte, um einen Hornhautgewebepfropfen erneut an der Hornhaut zu befestigen.
Beispiel 10
Aufgereinigtes MAP (0,9 mg/ml, BioPolymer Products AB) in 5% Essigsäure wurde so auf einen pH-Wert angepasst, dass es alkalisch wurde. Heparin und die Laborchemikalien waren von der höchsten verfügbaren Reinheit und wurden von Sigma und Merck käuflich erworben. Die Experimente wurden mit betäubten Ratten gemäß den Richtlinien der ethischen Genehmigungen durchgeführt.
Die Hornhaut wurde deepithelialisiert. Die Chirurgie und Anwendung der Bindungsmischung wurden wie in Beispiel 5 durchgeführt. Die Haftung wurde zwischen dem mittleren Pfropfen und dem peripheren Teil der ursprünglichen Hornhaut erreicht, wie es vorsichtig nach 10 Minuten mit der Hilfe einer opthalmologischen Pinzette und einem Operationsmikroskop getestet wurde.
Die erhalten Ergebnisse stimmten gut mit denen überein, die in Beispiel 5 gezeigt wurden, in diesen Fall für MAP in Essigsäure und Heparin, beide in Bezug auf das klinische Ergebnis und die Histopathologie, wie sie nach 5 Tagen untersucht wurde.
Beispiel 11
Aufgereinigtes MAP (0,81 mg/ml, BioPolymer Products AB) in 1% Milchsäure wurde auf einen pH auf 7,5 bis 9,5 angepasst. Heparin und die Laborchemikalien waren von der höchsten verfügbaren Reinheit und wurden von Sigma und Merck käuflich erworben. Ophthalmologische Nahtmaterialien (10–0) wurden von Ethicon käuflich erworben, in kleine Stücke mit einer Länge im Bereich 1–10 mm geschnitten und dann zu der MAP-Lösung hinzu gegeben. Die Experimente wurden mit betäubten Ratten gemäß den Richtlinien der ethischen Genehmigungen durchgeführt.
Die Hornhaut wurde deepithelialisiert. Die Hornhaut wurde vorsichtig in der Mitte mit der Hilfe eines Lochers mit einem Durchmesser von 3 mm gelocht. Der Gewebezylinder wurde langsam bis zu wenigstens der Hälfte seiner Dicke aus der ursprünglichen Hornhaut mit der Hilfe feiner Instrumente unter mikroskopischer Beobachtung entfernt. Es wurden zwei kleine Markierungen in der Peripherie des zentralen Gewebepfropfens durchgeführt. Eine Lösung, die direkt vor der Verwendung aus 20 μl MAP-Lösung, 10 μl wässriger Heparinlösung, opthalmologischen Nahtmaterialien (10 mg/ml in der fertigen Zusammensetzung) und 10 μl 6% (Gew./Vol.) wässriger Wasserstoffperoxidlösung hergestellt wurde, wurde mehrere Male entlang der Grenzfläche zwischen dem Pfropfen und der verbleibenden Hornhaut aufgetragen. Der Hornhautpfropfen wurde dann wieder eingesetzt und vorsichtig in Position gehalten. Die Haftung wurde zwischen dem zentralen Pfropfen und dem peripheren Anteil der ursprünglichen Hornhaut nach 5–10 Minuten erreicht, wie sehr vorsichtig mit Hilfe ophthalmologischer Mikrochirurgieinstrumente unter Verwendung eines Operationsmikroskops getestet wurde.
Die Inspektion durch Sichtung und Mikroskopie wurden während der folgenden 3 Stunden durchgeführt. Es gab eine gute Haftung zwischen dem zentralen Hornhautpfropfen und der umgebenden verbleibenden Hornhaut. Die kleinen Mängel in der Grenzfläche wurden mit dem Klebstoff mit seinen Filamenten aufgefüllt.
Die so erhaltenen Ergebnisse zeigen an, dass MAP in Verbindung mit Heparin, einem Oxidationsmittel und sehr feinen Filamenten verwendet werden könnten, um einen Hornhautpfropfen sicher zurück an der Stelle seiner chirurgischen Entnahme zu befestigen und Mängel in dem Gewebe aufzufüllen und zu überbrücken.
Beispiel 12
Aufgereinigtes MAP (0,81 mg/ml, BioPolymer Products AB) in entweder 1% Zitronen- oder 1% Milchsure wurde auf einen pH-Wert von üblicher Weise 7,5–8,5, aber in einigen Experimenten bis auf ungefähr 9,5 angepasst. Heparin und die Laborchemikalien waren von der höchsten verfügbaren Reinheit und wurden von Sigma und Merck käuflich erworben. Die Experimente wurden an betäubten Ratten gemäß den Richtlinien der ethischen Genehmigungen durchgeführt.
Die Hornhaut wurde deepithelialisiert. Eine Wunde wurde chirurgisch in der Mitte durch etwa die Hälfte der Hornhaut mit der Hilfe eines Bohrers mit einem Durchmesser von 3 mm hergestellt. Die Bowmans-Membran und Stroma wurden mit einem Messer und einer feinen Schere bis runter in die Nähe der Descements-Membran ausgeschnitten. Ein Block Hornhautgewebe wurde dadurch isoliert und von seiner ursprünglichen Position entfernt. Wenigstens 5 μl MAP, 3 μl 10 mg/ml wässrige Heparinlösung und 2 μl 2 mM Natriumperiodat wurden in die Wundhöhle entweder ein oder zwei Mal verabreicht. Danach wurden die kurz zuvor entfernten Hornhautgewebestücke wieder in die Höhle positioniert, um die Haftung und erneute Befestigung, die durch den MAP-Klebstoff vermittelt wird, zu testen. Eine Bindung wurde zwischen den Stromafragmenten und der Wundhöhle in der Hornhaut nach 5 Minuten erreicht, wie es sehr vorsichtig mit Hilfe einer opthalmologischen Pinzette und eines Operationsmikroskops getestet wurde. Die MAP-Klebstoffkombination fügte keinerlei offensichtliche zusätzliche Intensität in Bezug auf die Entzündungsreaktionen während der ersten Tage hinzu. Die Hornhautwunde wurde mit Epithel innerhalb von zwei Tagen bedeckt. Es konnten keine nachteiligen Wirkungen durch Sichtinspektion oder durch Mikroskopie erkannt werden, die mit der MAP-Zusammensetzung in Verbindung stehen könnten.
Beispiel 13
Aufgereinigtes MAP (0,81 mg/ml, BioPolymer Products AB) in entweder 1% Zitronen- oder 1% Milchsure wurde auf einen pH-Wert von üblicher Weise 7,5–8,5, aber in einigen Experimenten bis auf ungefähr 9,5 angepasst. Heparin und die Laborchemikalien waren von der höchsten verfügbaren Reinheit und wurden von Sigma und Merck käuflich erworben. Die Experimente wurden an betäubten Ratten gemäß den Richtlinien der ethischen Genehmigungen durchgeführt.
Die Hornhaut wurde deepithelialisiert. Eine Wunde wurde chirurgisch in der Mitte durch etwa die Hälfte der Hornhaut mit der Hilfe eines Bohrers mit einem Durchmesser von 3 mm hergestellt. Die Bowmans-Membran und Stroma wurden mit einem Messer und einer feinen Schere bis runter in die Nähe der Descements-Membran ausgeschnitten. Ein Block Hornhautgewebe wurde dadurch isoliert und von seiner ursprünglichen Position entfernt. Wenigstens 5 μl MAP, 3 μl 10 mg/ml wässrige Heparinlösung und 2 μl 2 mM Natriumprussid wurden in die Wundhöhle entweder ein oder zwei Mal verabreicht. Danach wurden die kurz zuvor entfernten Hornhautgewebestücke wieder in die Höhle positioniert, um die Haftung und erneute Befestigung, die durch den MAP-Klebstoff vermittelt wird, zu testen. Eine Bindung wurde zwischen den Stromafragmenten und der Wundhöhle in der Hornhaut nach 5 Minuten erreicht, wie es sehr vorsichtig mit Hilfe einer opthalmologischen Pinzette und eines Operationsmikroskops getestet wurde. Die MAP-Klebstoffkombination fügte keinerlei offensichtliche zusätzliche Intensität in Bezug auf die Entzündungsreaktionen während der ersten Tage hinzu. Die Hornhautwunde wurde mit Epithel innerhalb von zwei Tagen bedeckt. Es konnten keine nachteiligen Wirkungen durch Sichtinspektion oder durch Mikroskopie erkannt werden, die mit der MAP-Zusammensetzung in Verbindung stehen könnten.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend i) ein bioadhäsives, polyphenolisches Protein, das aus einer Byssus-bildenden Muschel abgeleitet ist, wobei das Protein 30–300 Aminosäuren umfasst und im Wesentlichen aus als Tandem gebundenen Peptidwiederholungen besteht, die 3–15 Aminosäurereste umfassen, wobei wenigstens 5% und vorzugsweise 6–25% der Aminosäurereste des bioadhäsiven, polyphenolischen Proteins DOPA sind; ii) ein Polymer, das Kohlenhydratgruppen wie Heparin, Chondroitinsulfat, Chitoson und Hyaluronan umfasst; und iii) ein nicht enzymatisches Oxidationsmittel wie Wasserstoffperoxid, Nitroprussid oder Periodationen; als eine kombinierte bioadhäsive Zubereitung zur gleichzeitigen medizinischen Verwendung, wobei die kombinierte bioadhäsive Zubereitung keinerlei enzymatisches Oxidationsmittel oder chemisches Vernetzungsmittel umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß Anspruch 1, die zusätzlich pharmazeutisch verträgliche feine Filamente umfassen, die dazu geeignet sind, als Fasern in ophthalmischen Nähten verwendet zu werden, wobei die Länge dieser Filamente 15 mm nicht überschreitet.
Verwendung von pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2 zur Herstellung einer kombinierten, ophthalmischen, bioadhäsiven Zubereitung, die verwendet werden kann, um Perforationen, Risse oder Einschnitte zu heilen, die Retina wieder auf der Rückseite des Auges zu befestigen, um Linsen zu reparieren oder zu befestigen und um korneale Komponentenanteile zu reparieren, zu konstruieren, zu rekonstruieren und/oder zu befestigen.
Verwendung von pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß einem der Ansprüche 1–2 zur Herstellung einer kombinierten bioadhäsiven Zubereitung, die zur Behandlung von Adnexkomplikationen des Auges wie der Gesichtshaut und der Schleimmembranen einschließlich der Augenlider und der Konjunktiva (Bindehaut), des Tränenkanalsystems und anderer periokutarer Strukturen und des Orbits verwendet werden kann.