SE516266C2 - En biovidhäftande komposition innehållande polyfenolisk protein och dess användning - Google Patents

Description

l5 20 25 30 516 266 2 Q u Q n n . | a - . o .n i Polyfenoliska proteiner, företrädesvis isolerade från musslor, är kända att fungera som vidhäfiare. Exempel på sådana proteiner kan hittas i t ex US 4,5 85,585. Deras vida användande som vidhäfiare har hindiats av problem relaterade till reningen och karakteriseringen av de vidhäftande proteinerna i tillräckliga mängder. Vidare har laavet på biokompatibla lämpliga tvärbindare och andra tillsatser begränsat deras i användande. Kemikalier, såsom bifimktionella konjugerande föreningar och enzy- mer, är vanligtvis associerade med toxiska reaktioner och andra biomedicinska sido- effekter. Dessutom är det svårt att i stor omfattning rena enzymer med bibehållen hög aktivitet undvikandes denaturering och skadliga effekter på celler, vävnader el- ler organ.

MAP bildas i en körtel i foten på byssusbildande musslor såsom den vanliga blå- musslan (Mytilus edulis). Molekylvikten hos MAP från Mytilus edulis är omkring 130 000 Dalton och det har visats bestå av 75-80 närbesläktade, repeterade pepfid- sekvenser. Proteinet karakteriseras vidare av sina många epidennal tillväxtfaktor- lika repetitioner. Det har en ovanligt hög proportion av hydroxiinnehållande amino- syror, såsom hydroxiprolin, serin, treonin, tyrosin och den ovanliga aminosyran 3,4- dihydroxi-L-fenylalanin (Dopa) lika väl som lysin. Det kan isoleras antingen fiån naturliga källor eller produceras bioteknologiskt. US 5,0l5,677 såväl som US 4,5 85,5 85 visar att MAP har mycket starka vidhäfiande egenskaper efter oxida- tion och polymerisation, t ex genom aktiviteten hos enzymet tyrosinas eller efter be- handling med bifunktionella reagenser. Det är mycket viktigt i biomedicinska appli- kationer av en vidhäftande och täckande komposition, att använda bioacceptabla och bionedbrytbara komponenter, vilka vidare inte skall, per se eller på grund av kontamiriation, inducera några inflamrnatoriska eller toxiska reaktioner. Fyllnads- material, inkluderande kollagener och polysackarider, har tillsatts för att förbättra de mekaniska egenskaperna i fall då MAP användes för att binda vävnader och struktu- rer tillsammans, därmed ökandes risken för immunologiska reaktioner. 10 15 20 25 30 516 266 3 nu »nu Det är också tidigare känt att det är möjligt att använda vidhäftande kompositioner baserade på MAP för optiska ändamål. Robin et al., Refractive and Comeal Surge- ry, vol. 5, sid. 302-306, och Robin et al., Arch. Ophthalmol., vol 106, sid. 973-977, visar båda MAP-baserade vidhäflare innefattande en enzympolymerisator.

US 5,015,677 beskriver också en MAP-baserad vidhäftare innehållande ett tvär- bindande medel och valfiitt ett fyllnadsmaterial och en tensid. Föredragna tvär- bindande medel enligt US 5,015,677 är enzymatiska oxideringsmedel, såsom kate- koloxidas och tyrosinas, men ibland också kemiska tvärbindande medel, såsom glutaraldehyd och formaldehyd. Exempel på fyllnadsmaterial är proteiner, såsom kollagen och albumin, och polyrnerer innefattande kolhydratgrupper, såsom kitosan och hyaluronan. US 5,030,230 skildrar också en biovidhäfiare bestående av MAP, svamptyrosinas (tvärbindare), SDS (natriumdodekylsulfat, en tensid) och kollagen (fyllnadsmaterial). Vidhäftaren används för att fästa en homhirmeprotes till ögon- väggen.

Ett betydande problem associerat med kända MAP-baserade biovidhäftande kompo- sitioner, trots de överlägsna egenskapema hos MAP per se, är att vissa beståndsde- lar, särskilt de för närvarande använda tväibindande medlen, kan skada och/eller ir- ritera levande vävnad och orsaka toxiska och irnmunologiska reaktioner. Kemiska tvärbindande medel, såsom glutaraldehyd och formaldehyd, är i allmänhet toxiska för människor och djur, och det är högst olämpligt att tillsätta sådana medel till känslig vävnad, såsom ögat. Enzymer, såsom katekoloxidas och tyrosinas, är protei- ner, och proteiner känns i allmänhet igen som potenta allergener, speciellt ifall de stammar från en art annan än patienten. På grund av deras oxiderande och hydroly- serande egenskaper kan de också skada känslig vävnad. Trots dessa allvarliga nack- delar förknippade med de för närvarande använda tvärbindarna har det betraktats som nödvändigt att inkludera dem för att få tillräcklig härdning av biovidhäftaren.

Följaktligen finns ett behov för MAP-baserade biovidhäftande kompositioner vilka övervinner dessa nackdelar och därför inte skadar eller irriterar känslig vävnad så- som ögat. 10 15 20 25 30 516 266 4 ..- n.

Sammanfattning av uppfinningen Nu har det överraskande furmits att en icke-irriterande, icke-allergen och icke-toxisk komposition kan erhållas genom att tillhandahålla en biovidhäfiande förening inne- fattande a) ett polyfenoliskt protein erhållet från byssus-bildande musslor b) en polymer innefattande kolhydratgrupper. Den biovidhäfiande föreningen inne- håller inte något enzym eller kemiskt tvärbindningsmedel. Valfritt kan föreningen innehålla ett oxiderande medel och/eller ett fyllnadsprotein. Företrädesvis tillhanda- hålles kompositionen som en sats omfattande åtminstone två delar, nämligen det polyfenoliska proteinet respektive polymeren innefattande kolhydratgrupper.

Definitioner Som beskrivits relaterar termen ”polyfenoliskt protein”, ”mussel adhesive pro- tein” (”vidhäftande musselprotein”) eller ”MAP” till ett biovidhåftande protein er- hållet från byssus-bildande musslor. Exempel på sådana musslor är musslor av ge- nus Mytilus, Geukensia, Aulacomya, Phiagmatopoma, Dreissenia och Brachiodon- tes. Lämpliga proteiner har beskrivits i en stor mängd publikationer, t ex US-A-5,0l5,677, US-A-5,242,808, US-A-4,585,585, US-A-5,202,236, US-A- 5 l49,657, US-A-5,4l0,023, WO 97/34016, och US-A-5,574,l34, Vreeland et al., J.

Physiol., 34: 1-8, och Yu et al., Macromolecules, 31: 4739-4745. De innefattar om- kring 30-300 arninosyrarester och består i huvudsak av tandemtörenade peptid- enheter, eventuellt separerade av en tvärtörbindelsesekvens på 0-10 aminosyror. Ett karakteristiskt särdrag hos sådana proteiner är en jämförelsevis stor mängd av posi- tivt laddade lysinrester, och i synnerhet den ovanliga arninosyran DOPA (L-3,4- dihydroxifenylalanin). Ett polyfenoliskt protein, lämpligt för användande i förelig- gande uppfmning, har en aminosyrasekvens, i vilken åtminstone 5 % och företrä- desvis 6-25 % av aminosyraresterna är DOPA. Några exempel på typiska peptiden- heter ges nedan. Emellertid är det viktigt att notera att aminosyrasekvensen hos des- 20 516 266 5 sa proteiner är variabel och att omfattningen av föreliggande uppfinning inte är be- gränsad till de exemplifierade subsekvenserna nedan eftersom fackmannen inser att biovidhäfiande polyfenoliska proteiner från olika källor kan anses som ekvivalenta: a) Val-Gly-Gly-DOPA-Gly-DOPA-Gly-Ala-Lys b) Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-diHyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys c) Thr-Gly-DOPA-Gly-Pro-Gly-DOPA-Lys d) Ala-Gly-DOPA-Gly-Gly-Leu-Lys e) Gly-Pro-DOPA-Val-Pro-Asp-Gly-Pro-Tyr-Asp-Lys f) Gly-Lys-Pro-Ser-Pro-DOPA-Asp-Pro-Gly-DOPA-Lys g) Gly-DOPA-Lys h) Thr-Gly-DOPA-Ser-Ala-Gly-DOPA-Lys i) Gln-Thr-Gly-DOPA-Val-Pro-Gly-DOPA-Lys j) Gln-Thr-Gly-DOPA-Asp-Pro-Gly-Tyr-Lys k) Gln-Thr-Gly-DOPA-Leu-Pro-Gly-DOPA-Lys Som beskrivits häri relaterar termen ”polymer innefattande kolhydratgrupper” en naturligt förekommande eller syntetisk polymer innefattande en stor mängd av kol- hydratgrupper. Polymererna kan utgöras av diskreta kolhydratgrupper förenade av kolvätekedjor, men företrädesvis är polymerema polysackarider, och ärmu mer fö- reträdesvis polysackarider innefattande laddade grupper. Exempel på lärnpliga po- lymerer är heparin, kondroitinsulfat, kitosan och hyaluronan.

Som beskrivits häri relaterar tennen ”farmaceutiskt godtagbara fina filament” till tunna fibrer vilka kan användas i suturer, företrädesvis oflalmiska suturer. För än- damålet hos föreliggande uppfinning bör inte längden på fibrema överstiga 15 mm, och är typiskt inom intervallet 1-10 mm. 10 15 20 25 30 516 266 6 »a .nu Som beskxivits-häri relaterar termen ”fyllnadsprotein” till ett protein som frivilligt är tillfórt den biovidhäftande kompositionen för att erhålla en biovidhäftande kompo- sition som är anpassad för speciella tillämpningar. Lämpliga fyllnads-proteiner en- ligt föreliggande uppfinning är kollagen, kasein, albumin, elastin, fibrin och fibro- nektin.

Med termen ”enzymatiskt oxiderande medel” avses ett enzym som har förmågan att oxidera MAP för att gynna full eller partiell tvärbindning av MAP och/eller polyme- rer och/eller fyllnadsproteiner. Exempel på sådana enzymer enligt aktuell teknisk nivå inkluderar katekoloxidas och tyrosinas. En komposition enligt före-liggande uppfinning inkluderar inte ett enzymatiskt oxiderande medel. Med tennen ”icke- enzymatiskt oxiderande medel” avses ett farmaceutiskt godtagbart oxiderande me- del vilket, vid de använda dosema, är icke-toxiskt och icke-irriterande. Exempel på sådana icke-enzymatiska oxiderande medel är väteperoxid och natriunniitro-prussid.

Med termen ”kemiskt tvärbindande medel” avses ett änme innefattande åtminstone två funktionella grupper som är förmögna att kovalent koppla till MAP och/eller polymerer och/eller fyllnadsproteiner. Exempel på sådana änmen enligt aktuell tek- nisk nivå inkluderar glutaraldehyd, formaldehyd, bis(sulfosuccinimidyl)suberat och 3,3'-ditiobis(sulfosuccinimidylpropionat). En komposition enligt föreliggande upp- finning inkluderar inte något kemiskt tvärbindande medel.

En komposition enligt föreliggande uppfinning innefattar två obligatoriska kompo- nenter, nämligen a) ett biovidlxäftande polyfenoliskt protein och b) en polymer inne- fattande kolhydratgiupper. Det är föredraget att kompositionen tillhandahålles som en undersökningssats i delar, vari de ovan nämnda obligatoriska komponentema är innefattade i separata prepamtioner. Dessa prepaiationer blandas omedelbart innan användning. I den fullständiga kompositionen har följande kon- centrationer funnits vara användbara: 10 15 20 25 30 516 266 7 Koncentration (mg/ml) 0,1 - 50, företrädesvis 0,3 - 10 0,1 - 50, företrädesvis 0,3 - 30 Komponent polyfenoliskt protein (komponent a) polymer med kolhydratgrupper Eventuellt kan ett icke-enzymatiskt oxiderande medel inkluderas. Ett sådant medel är väteperoxid, vilket typiskt kan inkluderas i en mängd av l-100 mg/rnl, företrä- desvis omkring 10 mg/rnl motsvarande 1 % (vikt/vol). Vidare kan farmaceutisk godtagbara fina filarnent inkluderas i en mängd av 0,5-40 mg/rnl, företrädesvis 1- 20 mg/ml av den slutliga kompositionen.

Om kompositionen tillhandahålles som en undersökningssats i delar tillhandahålles varje komponent i samma eller en högre koncentration, men de ovan nämnda kon- centrationsintervallen kommer att uppnås vid blandning av komponentpreparatio- nema med varandra för att förbereda den slutliga kompositionen.

Föreliggande uppfinning kommer nu att vidare beskrivas i de följande icke- begränsande exemplen.

Exempel 1 Utförligt renat MAP användes, tillhandahållet av BioPolymer Products AB, Floda, Sweden, i 5 % ättikssyra med en koncentration på 0,9 mg/ml och förvarad i mörker i kyla (~8°C). Heparin från tarmslemhinna från svin inköptes från Sigma Chemical Co., St. Louise, Mo, USA (H 3393). Ytterligare laboratoriekemikalier var av högsta tillgängliga renhet och inköptes från Sigma och Merck.

MAP-lösningens pH justerades till ett något alkalint pH, vanligtvis till 7,5 - 8,5, men i ytterligare experiment upp till runt 9,5. Experimenten utfördes på sövda råt- (Or. -10 15 20 25 516 266 s Hornhinnan deepitaliserades. Ett sår skapades kirurgiskt i mitten av homhinnan, med hjälp av en trepan med diameter 3 mm. Lamina limitans anterior och stroma skars bort med en kniv och fma saxar, ner till i närheten av Descemets membran. Ett block av homhinnevävnad var därmed isolerat och avlägsnat från sitt urspnmgliga ställe. Åtminstone 5 pl av MAP och 3 pl 10 mg/ml vattenhaltig heparinlösning ad- rninistrerades till sårkaviteten och därefter placerades den nyligen innan borttagna homhirmevävnadsbiten tillbaka i kaviteten för att pröva vidhäfining och återfástande förmedlat av MAP-lirnmet. Vidhäftande uppnåddes mellan stromafragrnenten och sårkaviteten i hornhinnan efter 5 minuter, när mycket försiktigt undersökt med hjälp av oftalmiska pincetter och ett operationsmikroskop. MAP-lirnsförerringen tillförde inte någon uppenbar extra intensitet avseende de inflarnrnatoriska reaktionema un- der de första dagarna. Homhirmesåret täcktes av epitel inom två dagar. Inga skadliga effekter kunde upptäckas vid visuell granskning eller vid mikroskopi, som kunde relateras till MAP-föreningen.

Histopatologisk undersökning av dessa hornhirmor, som fortfarande hade stromala fragment fästa, efter 5 och 7 dagar, visade att MAP-heparinföreningen till synes inte förvärrade det inflarnrnatoriska svaret i vare sig homhinnan eller i lirnbus och bind- hinnan, jämfört med den i prover från djur som hade hafi en sårkavitet i homhinnan under lika lång tid. Det fanns på ställen nedväxt av epitelceller in i homhinnesåret under de återfásta stromala fiagmenten, men inte i sådan grad att de släppte.

Exempel 2 Renat MAP (O,81 mg/rnl, BioPolymer Products AB), i antingen l % citron- eller I % mjölksyra, fick sitt pH justerat till vanligtvis 7,5-8,5, men i vissa experiment upp till nmt 9,5. Heparin och laboratoriekemikalier var av högsta tillgängliga renhet och inköptes från Sigma och Merck. Experimenten utfördes på sövda råttor enligt reglema specificerade av de etiska tillstånden. 10 15 20 25 30 516 266 9 Hornhinnan deepitaliserades. Ett sår skapades kirurgiskt i mitten genom ungefär halva homhinnan, med hjälp av en trepan med diameter 3 mm. Lamina limitans anterior och stroma skars bort med en kniv och fma saxar ned till i närheten av Descemets membran. Ett block av hornhinnevävnad var därmed isolerat och avlägs- nat från sitt ursprungliga ställe. Åtminstone 5 pl av MAP, 3 ul 10 mg/ml vattenhal- tig heparinlösning och 2 ul 6 % (vikt/vol) vattenhaltig väteperoxid administrerades in i sårkaviteten, antingen en eller två gånger. Därefier placerades den nyligen innan borttagna hornhinnevävnadsbiten tillbaka in i kaviteten för att pröva vidhäftande och återfástande förmedlat av MAP-limmet. Ihopbindning uppnåddes mellan de stromala fiagmenten och sårkaviteten i hornhinnan efter 5 minuter, när mycket för- siktigt undersökt med hjälp av ofialmiska pincetter och ett operationsmikroskop.

MAP-limföreningen tillförde ingen uppenbar extra intensitet avseende de inflam- matoriska reaktionema under de första dagarna. Homhinnesåret täcktes av epitel inom två dagar. Inga skadliga effekter kunde upptäckas vid visuell granskning eller vid mikroskopi, som ktmde sättas i samband med MAP-kompositionen.

Histopatologiska undersökningar av homhinnan med stromala fragment fästa, efier 5 och 7 dagar, visade att MAP-heparinföreningen synligen inte förvärrade den in- flarmnatoriska reaktionen i vare sig homhinnan eller i limbus och bindhinnan jäm- fört med den i prover från djur som hade haft sårkaviteter i hornhinnan under lika lång tid. Den fanns på ställen nedväxt av epitelceller in i homhinnesåret under de återfásta stromala fiagmenten, men inte i sådan utsträckning att de släppte på grund av förlust av kontakt med homhinnestroman.

Exempel 3 Renat MAP (0,8l mg/ml, BioPolymer Products AB) i antingen l % citron- eller l % mjölksyra fick sitt pH justerat till vanligtvis 7,5 - 8,5, i vissa experiment upp till nmt 9,5. Kondroitinsulfat och laboratoriekemikalier var av högsta tillgängliga ren- het och inköptes från Sigma och Merck. Experimenten 'utfördes på sövda råttor en- ligt reglema specificerade av de etiska tillstånden. 10 15 20 25 516 266 10 Hornhirman deepitaliserades. Ett sår skapades kirurgiskt i mitten genom ungefär halva hornhinnan, med hjälp av en trepan med diameter 3 mm. Larnina lirnitans an- terior och stroma skars ut med en kniv och fina saxar, ned till i närheten av Desce- mets membran. Ett block av homhinnevävnad var därmed isolerat och avlägsnat 'från sitt ursprimgliga ställe. Åtminstone 5 ul av MAP, 3 ul 24 mg/rnl vattenhaltig kondroitinsulfat och 2 ul 6 % (vikt/vol) vattenhaltig väteperoxid administrerades in i sårkaviteten, en eller två gånger. Därefler placerades den nyligen innan avlägsnade hornhinnesvävnadsbiten tillbaka in i kaviteten fór att pröva vidhäftande och åter- häfiande förmedlat av lVIAP-lirnmet. Ihopbindande uppnåddes mellan stroma- fragmenten och särkaviteten i homhinnan efter 5 min, när mycket försiktigt under- sökt med hjälp av oftalmiska pincetter och ett operationsmikroskop. MAP- limföreningen tillförde inte någon uppenbar extra intensitet avseende de in- flarnrnatoriska reaktionerna under de första dagarna. Hornhinnesåret täcktes av epi- tel inom två dagar, även om det såg ut att vara oregelbundenheter i epitelcellagret.

Inga skadliga effekter kunde upptäckas vid visuell granskning eller vid mikroskopi, som kunde relateras till MAP-föreningen.

Histopatologisk undersökning av homhinna med stromala 'fragment fästa, efter 5 och, för en råtta, 7 dagar visade att MAP-kondroitinsulfatföreningen synligen inte förvärrade den inflarrnnatoriska reaktionen i vari sig homhinnan eller i limbus och bindhinnan jämfört med den i prover från djur som hade haft en sårkavitet i hom- hinnan under lika lång tid. Det fanns ingen distinkt nedväxt av epitelceller in i hom- hinnesåret.

Erempel 4 Renat MAP (0,8l mg/rnl, BioPolymer Products AB) i antingen l % citron- eller 1 % mjölksyra fick sitt pH justerat till vanligtvis 7,5-8,5, i vissa experiment upp till runt 9,5. Hyaluronan (vattenhaltig lösning, 10 mg/ml), kitosan (vattenhaltig lösning, 10 10 15 20 25 516 266 ll un nov mg/ml) och laboratoriekerriikalier var av högsta tillgängliga renhet. Experimenten utfördes på sövda råttor enligt reglerna specificerade av de etiska tillstånden.

Den kirurgiska proceduren utfördes som i exempel 1-3. Tärnligcn god ihopbindning uppnåddes mellan de stromala bitarna och den omgivande ursprungliga -hom- hinnan. De uppnådda resultaten var i överensstämmelse med de rapporterade i ax- empel 1-3. Emellertid visade histopatologisk undersökning att det var viss nedväxt av epitelceller utefter den längsmedgående kanten av den implanterade stroman, men i en begränsad omfattning.

Exempel 5 Renat MAP (O,81 mg/ml, BioPolymer Products AB) i l % mjölksyra fick sitt pH justerat till omkring 7,5-8,5, i ytterligare experiment någon gång upp till runt 9,5.

Heparin och laboratoriekemikalier var av högsta tillgängliga renhet och inköptes från Sigma och Merck. Experimenten utfördes på sövda råttor enligt regler specifi- cerade av de etiska tillstånden.

Hornhinnan deepitaliserades. Homhinnan stansades försiktigt i mitten med hjälp av en trepan med diameter 3 mm. Vävnadscylindem trycktes långsamt ihop till åtmin- stone hälfien av dess tjocklek i den ursprungliga homhinnan med hjälp av fm- uddiga instrument under mikroskopobservation. En lösning, förberedd omedelbart före användande, av 20 ul MAP, 10 ul 10 mg/ml vattenhaltig lösning av heparin och 10 ul 6 % (vikt/vol) vattenhaltig väteperoxid applicerades längs med kanten mellan pluggen och den kvarvarande homhinnan. Hornhinnepluggen placerade sedan till- baka och hölls varsamt i position. Vidhäfiriing uppnåddes mellan den centrala plug- gen och periferala delen i den ursprungliga homhinnan efier 5 min, när mycket var- samt undersökt med hjälp av oñalrniska pincetter och ett operationsmikroskop. 10 15 20 25 516 266 12 noe u n o | | ø a n a « . » n» Visuell granskningoch mikroskopi utfördes under 5 dagar, och emellanåt 7 dagar.

Det uppstod en inflammatorisk reaktion i bindhinnan och blodkärl tenderade att växa i riktning mot operationsområdet. Den centrala hornhinnan stannade kvar i po- sition fixerad till den omgivande hornhinnan. Hornhinnan reepitaliserades inom 2 dagar. Det uppstod ödem och ringa till måttliga opaciteter i och intill det skadade området. Histopatologi av hornhinnan visade en ringa till måttlig inflammation - längs med operationsområdet. Epitelceller täckte den främre ytan, med kunde lika väl detekteras som trådar längs med delar av den laterala gränsytan av hornhinne- pluggen. Leukocyter och makrofager fäste till det skadade området, vända mot den främre kammaren. De uppnådda resultaten indikerar därför att MAP i förening med heparin och ett oxiderande medel kunde användas för att säkert limma en hornhin- neplugg tillbaka till dess operationsställe.

Exempel 6 Renat MAP (0,8l mg/ml, BioPolymer Products AB) i 1 % citronsyra fick sitt pH justerat till vanligtvis 7,5-9,5. Heparin och laboratoriekemikalier var av högsta till- gängliga renhet och köptes från Sigma och Merck. Experimenten utfördes på sövda råttor enligt reglema specificerade av de etiska tillstånden.

Hornhinnan deepitaliserades. Kinirgi och applikation av den ihophållande bland- ningen utfördes som i exempel 5. Vidhäfining uppnåddes mellan den centrala plugg- en och periferala delen av den ursprungliga hornhinnan efter 5 minuter, när mycket varsamt undersökt med hjälp av ofialmiska pincetter och ett operationsmikroskop.

De uppnådda resultaten vari god överensstämmelse med de presenterade i exempel 5 för i detta fall MAP i citronsyra och heparin, både avseende det kliniska resultatet och histopatologin när undersökt efter 5 dagar. - 10 15 20 25 516 266 13 Exempel 7 p Renat MAP (0,8l mg/ml, BioPolymer Products AB) i 1 % citronsyra fick sitt pH justerat till vanligtvis 7,5 - 8,5. Kondroitinsulfat (24 mg/ml vattenhaltig lösning) och laboratoriekemikalier var av högsta tillgängliga renhet och inköptes från Sigma och Merck. Experimenten utfördes på sövda råttor enligt reglerna specificerade av de etiska tillstånden.

Hornhinnan deepitaliserades. Kirurgi och applikation av den ihophållande bland- ningen utfördes som exempel 5. Vidhäfining uppnåddes mellan den centrala pluggen och periferala delen av den ursprungliga hornhinnan efler 5 minuter, när mycket varsamt undersökt med hjälp av oftalmiska pincetter och ett operationsmikroskop.

Visuell granskning och mikroskopi utfördes under 5 dagar, och emellanåt 7 dagar.

Det uppstod en inflamrnatorisk reaktion i bindhinnan och blodkärl tenderade att växa i riktning mot operationsområdet. Det centrala autologa homhinnetransplan- tatet stannade kvar i position fixerad till den omgivande hornhirman. Hornhirman reepitaliserades inom två dagar. Det uppstod ödem och ringa till måttlig opacitet i och i närheten av det skadade området. Histopatologi av hornhinnan visade ringa till måttlig inflamrnation i operationsområdet. Epitelceller täckte den främre ytan.

Emellertid kunde, längs med den laterala gränsytan mellan pluggen och homhinnan korta, men till synes breda, papilla av epitelceller upptäckas. I ingen av de under- sökta sektionerna nådde epitelet mer en fjärdedel eller en tredjedel av djupet i hom- hinnestroman. Leukocyter och makrofager fäste till det skadade området, vända mot den främre kammaren. De uppnådda resultaten indikerar därför att MAP (i citron- syra) i förening med kondroitinsulfat och ett oxiderande medel kunde användas för att säkert säkra en homhinneplugg till dess operationsställe. 10 15 20 25 516 266 23* - 'i u 14 Exempel 8 g Renat MAP (0,81 mg/rnl, BioPolymer Products AB) i l % mjölksyra fick sitt pH justerat till 7,5 - 9,5. Kondroitinsulfat (24 mg/ml, vattenhaltig lösning) och labora- toriekemikalier var av högsta tillgängliga renhet och inköptes från Sigma och Merck. Experimenten utfördes på sövda råttor enligt reglerna specificerade av de etiska tillstånden.

Hornhinnan deepitaliserades. Kirurgin och behandlingen med MAP, kondroitinsul- fat och oxiderande medel utfördes som i exempel 7.

De erhållna resultaten överensstämde med de i exempel 7. De uppnådda resultaten indikerar därför att MAP (i mjölksyra) i förening med kondroitinsulfat och ett oxi- derande medel kunde användas för att säkert återfästa en homhinnevävnadsplugg till homhinnan.

Exempel 9 Renat MAP (0,81 mg/ml, BioPolymer Products AB) i antingen 1 % mjölksyra eller i 1 % citronsyra fick sitt pH justerat till 7,5-9,5. Kitosan (10 mg/ml, vattenhaltig lös- ning), hyaluronan (10 mg/ml, vattenhaltig lösning) och laboratoriekemikalier in- köptes för att vara av högsta tillgängliga renhet. Experimenten utfördes på sövda råttor enligt reglema specificerade av de etiska tillstånden.

Hornhinnan deepitaliserades. Kirurgin och behandlingen med MAP, hyaluronan el- ler kitosan och oxiderande medel utfördes som i exempel 7. De erhållna resultaten med kitosan överensstämde i stora drag med de i exempel 7, medan hyaluronan fun- gerade i den akuta situationen men inga långsiktiga resultat uppnåddes. Resultaten indikerar att MAP i förening med ytterligare polysackarider och ett oxiderande me- del kimde användas för att återfästa en homhinnevävnadsplugg till homhinnan. u .nu nu 10 15 20 25 30 516 266 ÉÜ* '* »- n. 15 Exempel 10 _ Renat MAP (0,9 mg/ml, BioPolymer Products AB) i 5 % ättikssyra fick sitt pH ju- sterat för att bli alkalint. Heparin och laboratoriekeniikalier var av högsta tillgängli- ga renhet och inköptes från Sigma och Merck. Experimenten utfördes på sövda råt- tor enligt reglema specificerade av de etiska tillstånden.

Homhinnan deepitaliserades. Kirurgi och applikation av den ihophållande bland- ningen utfördes som i exempel 5. Vidhäftning uppnåddes mellan den centrala plugg- en och periferala delen av den ursprungliga hornhinnan när varsamt undersökt efter 10 minuter med hjälp av ofialmiska pincetter och ett operationsmikroskop.

De uppnådda resultaten vari god överensstämmelse med de presenterade i exempel 5 för i det här fallet MAP i ättikssyra och heparin, både avseende det kliniska resul- tatet och histopatologin när undersökt efter 5 dagar.

Exempel 11 _ Renat MAP (0,8l mg/ml, BioPolymer Products AB) i 1 % mjölksyra fick sitt pH justerat till 7,5-9,5. Heparin och laboratoriekemikalier var av högsta tillgängliga renhet och inköptes från Sigma och Merck. Oftalmiska suturer (10-0) inköptes från Ethicon, skars i små bitar sträckandes i längd från 1-10 mm och tillsattes slutligen till MAP-lösningen. Experimenten utfördes på sövda råttor enligt reglema specifice- rade av den etiska tillstånden.

Hornhinnan deepitaliserades. Homhinnan stansades försiktigt i mitten med hjälp av en trepan med diameter 3 mm. Vävnadscylindem trycktes långsamt ihop till hälfien av dess tjocklek i den ursprungliga hornhinnan med hjälp av fmuddiga instrument under mikroskopobservation. Två små märken gjordes i periferin av den centrala homhinnepluggen. En lösning, förberedd omedelbart innan användande, av 20 ul MAP-lösning, 10 ul vattenhaltig heparinlösning, oflalmiska suturer (10 mg/ml av den slutliga kompositionen) och 10 ul 6 % (vikt/vol) vattenhaltig väteperoxid- 10 15 516 2 66 ÉÜ* âfš - âïš 16 lösning, tillsattes flera gånger längs kanten mellan pluggen och den återstående homhinnan. Hornhinnepluggen placerades sedan åter och hölls varsamt i position.

Vidhäfining uppnåddes mellan den centrala pluggen och periferala delen av den ur- sprungliga hornhinnan efter 5-10 min, när mycket varsamt undersökt med hjälp av oftalmiska rnilcrokirurgiska instrument användandes ett operationsmikroskop.

Visuell granskning och mikroskopi utfördes under de följande tre timmarna. Det var god vidhäflning mellan den centrala hornhinnepluggen och den omgivande återstå- ende homhinnan. De små defektema i gränsytan var fyllda av lirnmet med dess fi- lament.

De uppnådda resultaten indikerar därför att MAP i förening med heparin, ett oxíde- rande medel och mycket fina filament kunde användas för att säkert limma en hom- hinneplugg tillbaka till sitt operationsställe och fylla och överbrygga defekter i väv- naden.

Claims (9)

10 15 20 25 30 516 266 §II= ,. . =IÉZ 17 Patentkrav

1. En biovidhäfiande komposition innefattande a) ett biovidhäftande polyfenoliskt protein erhållet från en byssus-bildande mussla, vars protein innefattar 30-300 aminosyror och består i huvudsak av i tandem tör- bundna peptidrepetitioner innefattande 3-15 aminosyrarester, vari åtminstone 5% och företrädesvis 6-25% av arninosyraresterna av nämnda biovidhäftande poly- fenoliska protein är DOPA; b) en polymer innefattande kolhydmtgrupper, såsom heparin, kondroitinsulfat, kito- san och hyaluronan; c) farmaceutiskt godtagbara fina filament; d) eventuellt ett icke-enzymatiskt oxiderande medel, såsom väteperoxid eller natri- umnitroprussid; och eventuellt e) en fyllnadsprotein, såsom kollagen, kasein, albumin, elastin, fibronektín och fib- fin; där kompositionen inte innefattar något enzymatiskt oxiderande medel eller kemiskt tvärbindande medel.

2. En biovidhäfiande komposition innefattande a) ett biovidhäftande polyfenoliskt protein erhållet från en byssus-bildande mussla, vars protein innefattar 30-3 00 aminosyror och består i huvudsak av i tandem för- enade peptidrepetitioner innefattande 3-15 aminosyrarester, vari åtminstone 5 % och företrädesvis 6-25 % av aininosyraresterna av nämnda biovidhäftande poly- fenoliska protein är DOPA; b) en polymer innefattande kolhydratgmpper, såsom heparin, kondroitinsulfat, kito- i san och hyaluronan; c) eventuellt ett icke-enzymatiskt oxiderande medel såsom väteperoxid eller natñ- umnitroprussid; och eventuellt d) ett fyllnadsprotein, såsom kollagen, kasein, albumin, elastin, fibronektín och fib- fin; 10 15' .20 25 30 515 265 §II= =I'= .a .nu 18 vars komposition inte innefattar något enzymatiskt oxideringsmedel eller kemiskt tvärbindningsmedel, för medicinsk användning.

3. En biovidhäftande komposition enligt kmv 2 vidare innefattande farmaceutiskt godtagbara fina filament, för medicinsk användning.

4. Användning av en komposition enligt krav 2 eller krav 3 för att 'framställa-en oftalmiskt vidhäftande komposition, vilken kan användas för att läka perforationer, lacerationer eller incisioner, för att återfásta näthinnan till den bakre delen av ögat, för att reparera eller fasta linser och för att reparera, konstruera, rekonstruera och/eller fästa hom-hinnekomponentdelar.

5. F armaceutiska kompositioner innehållande ett biovidliäftande polyfenoliskt protein enligt krav 1, komponent a), och en polymer enligt krav 1, komponent b), som ett kombinerat bioadhesivt preparat för samtidig medicinsk användning, vari nämnda kombinerade bioadhesiva preparat inte innefattar något enzymatiskt oxide- rande medel eller kemiskt tvärbindande medel.

6. Farmaceutiska kompositioner enligt krav 5 vidare innefattande ett icke- enzymatiskt oxiderande medel, såsom väteperoxid eller natiiurririitropnrssid.

7. Farmaceutiska kompositioner enligt krav 5 eller krav 6 vidare innefattande farmaceutisk godtagbara fina filament.

8. Användning av farmaceutiska kompositioner enligt vilket som helst av kraven l- 7, »för fiamställande av ett enkelt eller kombinerat oftalmiskt biovidhäftande prepa- rat, vilket kan användas för att läka ihop perforationer, lacerationer, eller incisioner, för att återfästa näthinnan till den bakre delen av ögat, för att reparera eller fästa lin- ser och föratt reparera, konstruera, rekonstruera och/eller fästa hornhinnekompo- nentdelar. 516 266 19

9. Användning av farmaceutiska kompositioner enligt vilket som helst av kraven l- 7, för framställande av ett enkelt eller kombinerat biovidhäfiande preparat, vilket kan användas fór att behandla komplikationer nära ögat, såsom ansiktshud och slemhinnor innefattande ögonlock och bindhinnan, tårkanalsystem och andra perio- kulära strukturer och ögonhålan.