DE60024629T2

DE60024629T2 - Genchiptechnologie zur bestimmung von gedächtnisgenen

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Publication number: DE60024629T2
Application number: DE60024629T
Authority: DE
Inventors: P. Timothy TULLY; I. Joshua DUBNAU; Michael Davis; Jan Mous; Ulrich Certa
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG; Cold Spring Harbor Laboratory; Emory University
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Cold Spring Harbor Laboratory; Emory University
Priority date: 1999-03-10
Filing date: 2000-03-10
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2020-03-11
Also published as: DE60024629D1; DK1571226T3; ATE507303T1; HK1081237A1; EP1196627B1; CA2364877C; ES2363142T3; AU782926B2; EP1196627A2; PT1571226E; DE60045900D1; CY1111554T1; EP1571226A2; WO2000053810A3; ATE312201T1; EP1571226A3; JP2002537859A; CA2364877A1; AU3622500A; EP1571226B1

Description

GRUNDLAGEN DER ERFINDUNG
Ein Merkmal, das viele Organismen, einschließlich Menschen, besitzen, ist die Erinnerung an zurückliegende Ereignisse. Dieses Merkmal ist viele Jahrzehnte mit großem Informationsgewinn untersucht worden, der jetzt verfügbar ist und viele seiner Verästelungen erklärt. Zum Beispiel sind zwei grundlegende Arten des Gedächtnisses identifiziert worden: das Transkriptions-unabhängige Gedächtnis, welches das Kurzzeitgedächtnis umfasst, und das Transkriptions-abhängige Gedächtnis, welches das Langzeitgedächtnis umfasst.
Ein bis heute relativ unbekannter Aspekt des Gedächtnisses ist die Identität von Genen, die zu seiner Manifestation beitragen. Die Identität von Genen, die zur Gedächtnisbildung beitragen, beginnt man erst heute zu erforschen. Die Identifizierung von Genen, die mit der Gedächtnisbildung in Verbindung stehen, würde liefern (a) eine genetische Epidemiologie von kognitiver Dysfunktion, (b) Diagnosemittel für Individuen, die verschiedene Allel-Formen dieser Gene tragen (die mit verschiedenen Leistungslevels für bestimmte kognitive Formen verbunden sind) und (c) neue Ziele für Medikamentenentdeckung, um schließlich verschiedene Formen kognitiver Dysfunktion zu verbessern (und bestimmte Medikamente könnten für bestimmte Formen von kognitiver Dysfunktion mit Hilfe diagnostischer Tests angepasst werden). Folglich wäre es zweckdienlich, über Techniken zu verfügen, die die Gene identifizieren würden, die mit der Gedächtnisbildung in Verbindung stehen.
Proceedings of the National Academy of Science USA, 1997, 94, 9669–9673 legt ein RNA-Fingerprinting offen, um Kandidaten für Gedächtnis-bezogene Gene (MRGs) zu identifizieren, die im Hippocampus von im Wasserlabyrinth trainierten Ratten aufreguliert sind, ein Gehirnbereich, der entscheidend am räumlichen Lernen involviert ist. Zwei von ursprünglich 10 Kandidaten-Genen, die mit dem RNA-Fingerprinting ermittelt wurden, das Ratten-Homolog des Ryanodinrezeptors Typ 2 und Glutamatdehydrogenase (EC 1.4.1.3) wurden mittels Northern-Blot-Analyse, reverse Transkriptions-PCR und in situ Hybridisierung weiter untersucht und als MRGs mit verschiedener zeitlicher und regionaler Expression identifiziert. Eine sukzessive RNA-Durchmusterung, wie hier veranschaulicht, kann helfen, ein Spektrum von MRGs aufzudecken, wie sie hier in unterschiedlichen Bereichen der Gedächtnisspeicherung vorkommen.
EP-A-0834576 legt Verfahren und Hilfsmittel zur Sequenzierung, Fingerprinting und Kartierung biologischer Polymere, insbesondere Polynukleotide, offen. Die Verfahren verwenden eine Vielzahl an spezifischen Erkennungsreagenzien für eine positionell unterschiedliche Sequenz, wie beispielsweise Polynukleotide. Das Hilfsmittel verwendet ein Substrat, das spezifische Erkennungsreagenzien für eine positionell unterschiedliche Sequenz, wie beispielsweise Polynukleotide, umfasst, die vorzugsweise in hohen Dichten lokalisiert sind. Die Verfahren und Hilfsmittel können zur Bestimmung der Sequenz von Polynukleotiden, zur Kartierung von Polynukleotiden und zur Entwicklung von Polynukleotid-Fingerprints verwendet sein. Polynukleotid-Fingerprints können zur Identifizierung von Individuen, Gewebeproben, pathologischen Zuständen, genetischen Erkrankungen, Infektionskrankheiten oder anderen Anwendungen verwendet sein. Polynukleotid-Fingerprints können ebenfalls zur Klassifizierung von biologischen Proben, einschließlich der Taxonomie und zur Charakterisierung ihres Ursprungs verwendet sein. Das Dokument stellt ebenfalls Polynukleotidkartierung, Fingerprinting und Sequenzierung als wertvolles Forschungswerkzeug bei biologischen Untersuchungen bereit.
WO-A-98/49342 legt ein Verfahren zur Präparation eines diagnostischen Gentranskript-Standardmusters, das für eine Erkrankung oder einen Zustand oder ein Stadium davon in einem prokaryotischen oder eukaryotischen Organismus charakteristisch ist, mit Hilfe der Verwendung von Transkripten, die bei der Erkrankung oder bei dem Zustand differentiell exprimiert sind, als Sonden für Nukleinsäureproben, Diagnoseverfahren unter Verwendung des Verfahrens und Kits zur Durchführung des Verfahrens offen.
Annual Review in Neurosiences, 1998, 21, 127–148 gibt einen Überblick über die Schlüsselmerkmale einer CREB-abhängigen Transkription wie auch über die Beteiligung von CREB bei der Gedächtnisbildung. Hinweise bei Aplysia, Drosophila, Mäusen und Ratten zeigen, dass eine CREB-abhängige Transkription für die zellulären Ereignisse erforderlich ist, die dem Langzeit- aber nicht dem Kurzzeitgedächtnis zugrunde liegen. Während die Arbeit bei Aplysia und Drosophila nur eine CREB-Funktion bei sehr einfachen Formen der Konditionierung involvierte, zeigen genetische und pharmazeutische Untersuchungen bei Mäusen und Ratten, dass CREB für eine Reihe an komplexen Gedächtnisformen, einschließlich räumliches und soziales Lernen erforderlich ist, was folglich darauf hindeutet, dass CREB ein universeller Modulator von Prozessen sein könnte, die für die Gedächtnisbildung erforderlich sind.
Society for Neuroscience Abstracts, 19, (1/3), 1066, Abstract Nr. 440.8 legt unabhängige Gedächtnisse bei Drosophila nach einer Pawlowschen Konditionierung offen.
WO-A-97/12976 legt ein neues in der cytologischen Region 37D des zweiten Chromosoms vorhandenes Gen offen, dass beim assoziativen Lernen und/oder Gedächtnis aktiv ist. Eine Unterbrechung des Gens, wie beispielsweise durch eine markierte Insertion des P-Element-Transposons, führt zu einem verminderten assoziativen Lernen und/oder Gedächtnis. Die Erfindung betrifft ebenfalls ein neuartiges Protein, das von einem Gen codiert ist, Antikörper, die an das codierte Protein binden, und Homologe des neuen Gens, die beim assoziativen Lernen aktiv sind und an die DNA-Sequenz des neuen Gens hybridisieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung eines Kandidatengens oder-gene, das/die am Transkriptions-abhängigen Gedächtnis beteiligt ist/sind, und zur Identifizierung, ob das Gen am assoziativen Lernen oder nicht-assoziativen Lernen beteiligt ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) Trainieren nicht-humaner Tiere unter Verwendung eines konditionierten Stimulus und eines nicht-konditionierten Stimulus, die zeitlich gepaart sind, um eine Transkriptions-abhängige assoziative Gedächtnisbildung einer spezifischen Versuchsaufgabe in besagten Tieren zu induzieren;
(b) Extrahieren von RNA aus Gehirngewebe von besagten in Schritt (a) trainierten Tieren;
(c) Synthetisieren von DNA-Sonden unter Verwendung der in Schritt (b) extrahierten RNA;
(d) Hybridisieren der in Schritt (c) synthetisierten DNA-Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen auf Microarray-Chips, die DNA-Sequenzen von Genen des Genoms besagter Tiere enthalten, wobei ein Signal nach Hybridisierung besagter Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen erzeugt wird;
(e) Detektieren des in Schritt (d) erzeugten Signals; und
(f) Durchführen eines statistischen Vergleichs zwischen dem in Schritt (e) detektierten Signal und dem in einer ersten untrainierten Kontrolle für jedes Gen und einer zweiten trainierten Kontrolle für jedes Gen detektierten Signal unter Anwendung eines Signal-Transformationsalgorithmus, wobei besagte erste untrainierte Kontrolle gemäß einem Verfahren erhalten ist, das die Schritte umfasst: (i) Extrahieren von RNA aus Gehirngewebe von nicht-humanen ersten untrainierten Kontrolltieren; (ii) Synthetisieren von DNA-Sonden unter Verwendung der in Schritt (f)(i) extrahierten RNA; und (iii) Hybridisieren der in Schritt (f)(ii) synthetisierten DNA-Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen auf Microarray-Chips, die DNA-Sequenzen von Genen des Genoms von ersten untrainierten Kontrolltieren enthalten, wobei ein Signal nach Hybridisierung besagter Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen erzeugt wird, und wobei besagte zweite trainierte Kontrolle gemäß einem Verfahren erhalten ist, das die Schritte umfasst: 1) Extrahieren von RNA aus Gehirngewebe von nicht-humanen Tieren, die trainiert sind, eine Transkriptions-unabhängige Gedächtnisbildung und nicht-assoziative Transkriptions-abhängige Gedächtnisbildung als Reaktion auf einen konditionierten Stimulus oder einen nicht-konditionierten Stimulus allein oder als Reaktion auf einen nicht-konditionierten Stimulus und einen konditionierten Stimulus, die zeitlich nicht gepaart sind, aber eine nicht-assoziative Transkriptions-abhängige Gedächtnisbildung in besagten zweiten trainierten Kontrolltieren vor Extraktion von RNA aus Gehirngewebe von besagten zweiten trainierten Kontrolltieren zu induzieren; 2) Synthetisieren von DNA-Sonden unter Verwendung der in Schritt (f) 1) extrahierten RNA; und 3) Hybridisieren der in Schritt (f) 2) synthetisierten DNA-Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen auf Microarray-Chips, die DNA-Sequenzen von Genen des Genoms von trainierten Kontrolltieren enthalten, wobei das Signal nach Hybridisierung besagter Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen erzeugt wird.

Bevorzugte Merkmale der Erfindung sind in den Ansprüchen 2 bis 4 definiert.
Die Anmelder haben entdeckt, dass die von bestimmten Versuchsprotokollen gebildeten unterschiedlichen Effekte auf die Gedächtnisbildung zur Identifizierung von Genen verwendet sein können, die an der Transkriptions-abhängigen Gedächtnisbildung, insbesondere Langzeitgedächtnisbildung, beteiligt sind. Der signifikante Unterschied zwischen irgendwelchen zwei Versuchsprotokollen besteht in der Induktion eines Transkriptions-abhängigen Gedächtnisses. Der signifikante Unterschied zwischen irgendwelchen bestimmten zwei Versuchsprotokollen, die verglichen werden sollen, ist die Induktion eines Transkriptions-abhängigen Gedächtnisses in der Versuchsgruppe und das Fehlen eines Transkriptions-abhängigen Gedächtnisses in der Kontrollgruppe.
Transkriptions-unabhängiges Gedächtnis umfasst verschiedene „Gedächtnis-Phasen", wie Kurzzeitgedächtnis, intermediäres (oder Mittel-)Zeitgedächtnis und (in Fliegen) Anästhesie-resistentes Gedächtnis. Gemeinsam ist diesen Formen, dass pharmakologische Inhibitoren der RNA-Transkription diese Gedächtnisse nicht unterbrechen. Transkriptionsabhängiges Gedächtnis bezieht sich normalerweise auf das Langzeitgedächtnis und Inhibitoren der RNA-Synthese blockieren sein Auftreten.
Folglich sind Verfahren zur Identifizierung eines Gens oder Gene offen gelegt, die am Transkriptions-abhängigen Gedächtnis (besonders Langzeitgedächtnis) beteiligt sind, umfassend (a) Trainieren nicht-humaner Tiere (insbesondere nicht-humaner Säuger, anderer Vertebraten und Invertebraten) unter hinreichenden Bedingungen, um eine Transkriptions-abhängige Gedächtnisbildung in den Tieren zu induzieren; (b) Extrahieren von RNA aus dem Gehirngewebe der in Schritt (a) trainierten Tiere; (c) Synthetisieren von DNA-Sonden unter Verwendung der in Schritt (b) extrahierten RNA; (d) Exponieren der in Schritt (c) synthetisierten DNA-Sonden an Microarray-Chips, die DNA-Sequenzen von Genen des Genoms der Tiere enthalten, unter Bedingungen, die für ein Hybridisieren der DNA-Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen auf den Microarray-Chips geeignet sind, wobei ein Signal nach Hybridisierung der Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen erzeugt wird; (e) Detektieren des in Schritt (d) erzeugten Signals; und (f) Durchführen eines statistischen Vergleichs zwischen dem in Schritt (e) detektierten Signal und dem in einer Kontrolle detektierten Signal.
Die Kontrolle kann gemäß einem Verfahren erhalten sein, umfassend (i) Trainieren nicht-humaner Tiere (insbesondere nicht-humaner Säuger, anderer Vertebraten und Invertebraten) unter geeigneten Bedingungen, wobei die Bedingungen nicht hinreichend sind, eine Transkriptions-abhängige Gedächtnisbildung in den Kontrolltieren zu induzieren; (ii) Extrahieren von RNA aus dem Gehirngewebe der in Schritt (i) trainierten Tiere; (iii) Synthetisieren von DNA-Sonden unter Verwendung der in Schritt (ii) extrahierten RNA; und (iv) Exponieren der in Schritt (iii) synthetisierten DNA-Sonden an Microarray-Chips, die DNA-Sequenzen von Genen des Genoms der Tiere enthalten, unter Bedingungen, die für ein Hybridisieren der DNA-Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen auf den Microarray-Chips geeignet sind, wobei ein Signal nach Hybridisierung der Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen erzeugt wird. Die Versuchsbedingungen von Schritt (a) und Schritt (i) bilden ein (experimentelles) Behandlungspaar. Der signifikante Unterschied zwischen den Versuchsbedingungen in Schritt (a) und Schritt (i) besteht in der Induktion eines Transkriptions-abhängigen Gedächtnisses.
Die Kontrolle kann gemäß einem Verfahren erhalten sein, umfassend, (i) Extrahieren von RNA aus dem Gehirngewebe nicht-humaner Kontrolltiere, (ii) Synthetisieren von DNA-Sonden unter Verwendung der in Schritt (i) extrahierten RNA; und (iii) Exponieren der in Schritt (ii) synthetisierten DNA-Sonden an Microarray-Chips, die DNA-Sequenzen von Genen des Genoms der Tiere enthalten, unter Bedingungen, die für ein Hybridisieren der DNA-Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen auf den Microarray-Chips geeignet sind, wobei ein Signal nach Hybridisierung der Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen erzeugt wird. In dieser Anwendungsform der Kontrolle sind die Kontrolltiere naive (untrainierte) Tiere.
Wie hier verwendet, ist ein Kontrolltier ein Tier derselben Spezies und im übrigen vergleichbar (z.B. ähnliches Alter, Geschlecht) mit dem Tier, das unter hinreichenden Bedingungen trainiert ist, um eine Transkriptions-abhängige Gedächtnisbildung in diesem Tier zu induzieren.
Die RNA kann aus der Amygdala trainierter Tiere oder Kontrolltiere extrahiert sein. Alternativ kann die RNA aus dem Hippocampus trainierter Tiere oder Kontrolltiere extrahiert sein. In einer noch anderen Anwendungsform ist das Signal von den hybridisierten Sonden vor der Detektion amplifiziert. In einer weiteren Anwendungsform ist ein statistischer Vergleich zwischen dem in Schritt (e) detektierten Signal und dem in einer Kontrolle detektierten Signal angestellt (durchgeführt, ausgeführt), das durch das Training von Kontrolltieren unter hinreichenden Bedingungen erhalten ist, um das Transkriptions-unabhängige Gedächtnis aber nicht das Transkriptions-abhängige Gedächtnis zu induzieren.
Das Transkriptions-abhängige Gedächtnis kann unter Anwendung spezifischer Versuchsbedingungen induziert werden. Transkriptions-abhängiges Gedächtnis kann in einem nicht-humanen Tier unter Anwendung eines spaced Trainingsprotokolls für die Angst-verstärkte Schockreaktion induziert sein. Transkriptions-abhängiges Gedächtnis kann in einem nicht-humanen Tier unter Anwendung eines Shuttle-Box-Ver meidungstrainingsprotokolls induziert sein. Transkriptions-abhängiges Gedächtnis kann in einem nicht-humanen Tier unter Anwendung eines kontextuellen Angstkonditionierungstrainingsprotokolls induziert sein.
Ein Verfahren zur Identifizierung eines Gens oder Gene, die am Transkriptionsabhängigen Gedächtnis bei Drosophila beteiligt sind, sind ebenfalls beschrieben, umfassend (a) Trainieren von Drosophila unter geeigneten Bedingungen, um eine Transkriptions-abhängige Gedächtnisbildung in Drosophila zu induzieren; (b) Extrahieren von RNA aus dem Kopfgewebe von in Schritt (a) trainierter Drosophila; (c) Synthetisieren von DNA-Sonden unter Verwendung der in Schritt (b) extrahierten RNA; (d) Exponieren der in Schritt (c) synthetisierten DNA-Sonden an Microarray-Chips, die DNA-Sequenzen von Genen des Drosophila-Genoms enthalten, unter Bedingungen, die für ein Hybridisieren der DNA-Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen auf den Microarray-Chips geeignet sind, wobei ein Signal nach Hybridisierung der Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen erzeugt wird; (e) Detektieren des in Schritt (d) erzeugten Signals; und (f) Durchführen eines statistischen Vergleichs zwischen dem in Schritt (e) detektierten Signal und dem in einer Kontrolle detektierten Signal.
Die Kontrolle kann gemäß einem Verfahren erhalten sein, umfassend (i) Trainieren von Drosophila unter geeigneten Bedingungen, wobei die Bedingungen hinreichend sind, um eine Transkriptions-abhängige Gedächtnisbildung in der Kontroll-Drosophila zu induzieren; (ii) Extrahieren von RNA aus dem Kopfgewebe der in Schritt (i) trainierten Kontroll-Drosophila; (iii) Synthetisieren von DNA-Sonden unter Verwendung der in Schritt (ii) extrahierten RNA; (iv) Exponieren der in Schritt (iii) synthetisierten DNA-Sonden an Microarray-Chips, die DNA-Sequenzen von Genen des Drosophila-Genoms enthalten, unter Bedingungen, die für ein Hybridisieren der DNA-Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen auf den Microarray-Chips geeignet sind, wobei ein Signal nach Hybridisierung der Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen erzeugt wird. Die Versuchsbedingungen von Schritt (a) und Schritt (i) bilden ein (experimentelles) Behandlungspaar. Der signifikante Unterschied zwischen den Versuchsbedingungen in Schritt (a) und Schritt(i) ist die Induktion eines Transkriptions-abhängigen Gedächtnisses.
Die Kontrolle kann gemäß einem Verfahren erhalten sein, umfassend (i) Extrahieren von RNA aus dem Kopfgewebe einer Kontroll-Drosophila; (ii) Synthetisieren von DNA-Sonden unter Verwendung der in Schritt (i) extrahierten RNA; (iii) Exponieren der in Schritt (ii) synthetisierten DNA-Sonden an Microarray-Chips, die DNA-Sequenzen von Genen des Drosophila-Genoms enthalten, unter Bedingungen, die für ein Hybridisieren der DNA-Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen auf den Microarray-Chips geeignet sind, wobei ein Signal nach Hybridisierung der Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen erzeugt wird. In diesem Fall der Kontrolle sind die Kontroll-Drosophila naive (untrainierte) Fliegen.
Wie hier verwendet, ist eine Kontroll-Drosophila eine Drosophila derselben Spezies und ist im übrigen vergleichbar (z.B. ähnliches Alter, Geschlecht) mit der Drosophila, die unter hinreichenden Bedingungen trainiert ist, um eine Transkriptions-abhängige Gedächtnisbildung in dieser Drosophila zu induzieren.
Das Verfahren zur Identifizierung eines Gens oder Gene, die am Transkriptionsabhängigen Gedächtnis in Drosophila beteiligt sind, kann DNA-Sonden umfassen, die mit einem fluoreszierenden Marker markiert sind, und das Signal ist mit Hilfe eines Fluoreszenz-Assays detektiert. In einer bestimmten Anwendungsform ist das Signal von hybridisierten Sonden vor der Detektion amplifiziert. Ein statistischer Vergleich kann zwischen dem in Schritt (e) detektierten Signal und dem in einer Kontrolle detektierten Signal durchgeführt werden, das von der trainierten Kontroll-Drosophila unter hinreichenden Bedingungen erhalten ist, um ein Transkriptions-unabhängiges Gedächtnis aber nicht Transkriptions-abhängiges Gedächtnis zu induzieren.
Ein Transkriptions-abhängiges Gedächtnis kann in Drosophila mit Hilfe eines spaced Trainingsprotokolls (z. B. ein spaced Training der Pawlowschen olfaktorischen Konditionierung) induziert sein. Ein Transkriptions-unabhängiges Gedächtnis kann in Drosophila mit Hilfe eines massed Trainingsprotokolls (z. B. massed Training der Pawlowschen olfaktorischen Konditionierung) induziert sein.
Eine statistisch signifikante Differenz im Transkriptionslevel für ein spezifisches Gen zwischen Tieren, die unter hinreichenden Bedingungen trainiert sind, um ein Transkriptions-abhängiges Gedächtnis zu induzieren, und Kontrolltieren, die unter geeigneten Bedingungen trainiert sind, die nicht hinreichend sind, ein Transkriptionsabhängiges Gedächtnis zu induzieren, identifiziert dieses Gen als einen Kandidaten-Gedächtnisgen (CMG). In einer besonderen Anwendung identifiziert eine statistisch signifikante Differenz im Transkriptionslevel zwischen spaced- und massed-trainierten Gruppen für ein spezifisches Gen dieses Gen als ein Kandidaten-Gedächtnisgen.
Eine statistisch signifikante Differenz im Transkriptionslevel für ein spezifisches Gen zwischen Tieren, die unter hinreichenden Bedingungen trainiert sind, um ein Transkriptions-abhängiges Gedächtnis zu induzieren, und naiven (untrainierten) Kontrolltieren identifiziert dieses Gen als ein Kandidaten-Plastizitätsgen (CPG). In einer besonderen Anwendung identifiziert eine statistisch signifikante Differenz im Transkriptionslevel für ein spezifisches Gen zwischen spaced-trainierten und untrainierten Gruppen dieses Gen als ein Kandidaten-Plastizitätsgen (CPG).
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein schematisches Diagramm eines in Tully et al., Cell, 79:35–47 (1994) beschriebenen Trainingsprotokolls, das ein Pawlowsches olfaktorisches Lernen in Fliegen bewirkt.
2 ist eine graphische Darstellung von Ergebnissen, die die Merkfähigkeit des Gedächtnisses nach spaced oder massed Training in normalen (Wildtyp)-Fliegen oder spaced Training in transgenen hs-CREB2-r Fliegen nach Induktion einer Expression von CREB-Repressor zeigt (siehe Yin et al., Cell, 79:49–58 (1994)). Das Lernen und frühes Gedächtnis (Cycloheximid-unempfindlich) ist in transgenen Fliegen normal. Das zusätzliche (Proteinsynthese-abhängige LTM) Gedächtnis, das normalerweise bei einem spaced Training ausgebildet wird, ist in transgenen Fliegen blockiert. Dieser Vergleich zeigt, dass der einzige Unterschied zwischen spaced und massed Training im Auftreten eines Transkriptions-abhängigen Gedächtnis nach dem ersteren liegt.
3 ist ein schematisches Diagramm, das die mittlere Differenz zwischen einem Signal, das für eine perfekt gepaarte (PM) spezifische DNA-Oligonukleotidsonde für einen spezifischen Abschnitt eines spezifischen Gens (komplementär) detektiert ist, und einem Signal, das für diese an diesem Abschnitt des Gens als Folge einer Einführung eines Fehlers der Nukleotidsequenz (Mutation) in diesem Genabschnitt fehlgepaarte (MM) Sonde detektiert ist. Die durchschnittliche Differenz zwischen PM und MM Paaren, und normalerweise für 20 Paare pro Gen, ist mit Hilfe der Affymetrix software analysis (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA) bestimmt. Die Quadrate stellen Mikrosequenzen auf einem Microarray-Chip dar.
4A ist ein Streudiagramm (spaced gegen massed) des mittleren Signals (transformierte normalisierte mittlere Differenz) von N = 10 Chips, jeweils mit DNA-Sonden hybridisiert, die aus RNA aus Köpfen normaler Drosophila hergestellt sind, die 24 Stunden entweder einem spaced oder massed Training unterzogen wurden. Jedes Quadrat stellt ein spezifisches Drosophila-Gen dar, 1542 davon sind auf jedem Chip enthalten. Die Kandidaten-Gedächtnisgene sind von den leicht schattierten Quadraten identifiziert. Der Ort des C/EB-Gens im Diagramm ist in der Figur angezeigt.
4B ist eine Streudiagramm (spaced gegen massed), das die statistisch signifikanten Werte von 4A zeigt. Jedes Quadrat stellt ein spezifisches Drosophila-Gen dar, 1542 davon sind auf jedem Chip enthalten. Die Stelle des C/EB-Gens im Diagramm ist in der Figur angezeigt.
5 ist ein Balkendiagramm, das die Ergebnisse eines Versuchs mit einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (QPRC) zeigt. Die Ergebnisse bestätigen den differentiellen Effekt von spaced versus massed Training auf das C/EBP-Gen.
6 ist ein Balkendiagramm, das den Effekt eines zwischenliegenden Intertrialintervalls (ITI) bei Angst-Konditionierungstrainingsexperimenten in Ratten auf das Langzeitgedächtnis zeigt. Die Ergebnisse definieren massed und spaced Trainingsprotokolle und zeigen, dass das Gedächtnis eines Angst-verstärkten Schocks nach einem spaced Training besser ist als nach einem massed Training.
7 ist ein Balkendiagramm, das den Effekt einer Überexpression von CREB-Aktivator in der Amygdala von Ratten auf das Langzeitgedächtnis zeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Überexpression von CREB-Aktivator in der Amygdala das Gedächtnis eines Angst-verstärkten Schocks in Ratten nach einem massed Training verbessert (erhöht).
8 stellt molekulare Karten der adf1 genomischen Region dar.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Um ein spezifisches „Langzeitgedächtnis" auszubilden, ist ein Tier einem spezifischen Trainingsprotokoll unter kontrollierten Versuchsbedingungen unterzogen. Bei den Pawlowschen Konditionierungsverfahren zum Beispiel sind zwei zeitlich eng beieinander liegende spezifische Stimuli präsentiert, um ein „assoziatives Lernen und Gedächtnis" auszubilden. Einer der beiden Stimuli ist als ein „konditionierter Stimulus" (CS) und der andere ist als ein „unkonditionierter Stimulus" (US) bezeichnet. Der US ist ein natürlicher Verstärker, der eine „unkonditionierte Reaktion" (UR) vor dem Training in einer „reflexiven" Weise hervorruft. Mit der CS-US Paarung beginnt eine „konditionierte Reaktion" (CR) als Reaktion auf den CS vor (oder bei Fehlen von) einer Präsentation des US zu erscheinen. Nachdem eine CR auf eine spezifische CS-US Paarung „gelernt" ist, beginnt danach die Gedächtnisbildung.
Eine Gedächtnisbildung dieser spezifischen experimentellen Erfahrung kann in zwei allgemeinen Formen geschehen: einer Transkriptions-unabhängigen Form und einer Transkriptions-abhängigen Form. Die erste Form umfasst verschiedene „Gedächtnisphasen", wie Kurzzeitgedächtnis, intermediäres oder (Mittel-) Zeitgedächtnis und (bei Fliegen) Anästhesie-resistentes Gedächtnis. Diesen Formen ist gemeinsam, dass pharmakologische Inhibitoren der RNA-Transkription diese Gedächtnisse nicht zerstören. Die letztere Form ist normalerweise als Langzeitgedächtnis bezeichnet und Inhibitoren der RNA-Synthese blockieren sein Auftreten.
In Tiermodellen können verschiedene experimentelle Behandlungen, wie Genmutation, pharmakologische Blockade, anatomische Verletzung oder spezifische Trainingsprotokolle, einen oder mehrere dieser Gedächtnistypen beeinflussen. Insbesondere führen manche experimentelle Behandlungen zu einem normalen Umfang des Transkriptions-unabhängigen Gedächtnisses, führen aber zu keinem Transkriptionsabhängigen Gedächtnis. Derartige Beobachtungen bilden die Basis informativer DNA-Chip-Vergleiche. Im Allgemeinen erfolgt ein Vergleich zwischen zwei experimentellen Protokollen; eines (experimentelle Gruppe), das hinreichend ist, sowohl ein Transkriptions-unabhängiges Gedächtnis als auch ein Transkriptions-abhängiges Gedächtnis zu induzieren, und eines das nur ein Transkriptions-unabhängiges Gedächtnis ergibt (Kontrollgruppe). Etwaige detektierbare Differenzen bei den Transkriptlevels zwischen diesen beiden Protokollen können dann spezifisch einem Transkriptionsabhängigen Gedächtnis des experimentell induzierten Lernens zugeschrieben werden. Diese Transkripte sind dann als „Kandidaten-Gedächtnisgene" (CMGs) bezeichnet.
Obwohl die experimentellen Bedingungen kontrolliert sind, um eine spezifische Art des Lernens zu induzieren, können weitere unkontrollierte Formen des Lernens ebenfalls stattfinden. Folglich kann es, obwohl eine Kontrollgruppe kein Transkriptions-abhängiges Gedächtnis der spezifischen Versuchsaufgabe hervorbringen kann, nichtsdestotrotz ein Transkriptions-abhängiges Gedächtnis einer unkontrollierten Lernerfahrung geben. Eine Art einer solchen Erfahrung sind die potenziellen „nichtassoziativen" Lernformen, die als Antwort auf nur den CS oder US (allein) oder als Antwort auf CS-US-Präsentationen erfolgen, die zeitlich nicht gepaart sind (was das Schlüsselerfordernis für ein „assoziatives Lernen" ist). Daher kann es in Kontrollgruppen Transkriptions-abhängige „unspezifische" Gedächtnisse geben, wie es oben definiert ist. Diese Beobachtung führt zu einer größeren Klasse von Transkripten, die am „unspezifischen" Lernen beteiligt sind, die wir als Kandidaten-Plastizitätsgene (CPGs) bezeichnen. DNA-Chip-Vergleiche zwischen einer wie oben definierten experimentellen Gruppe und naiven (untrainierten) Tieren wird zu CPGs zusammen mit CMGs führen.
Verhaltensgenetische Untersuchungen bei Drosophila haben ein Trainingsprotokollpaar mit unterschiedlichen Effekten auf die Gedächtnisbildung nach einem Pawlowschen Geruch-Schock-Lernparadigma etabliert. Zehn Trainingssitzungen „massed" (d.h. ohne Ruhezeit zwischen den Sitzungen) ergaben ein maximales Lernen (Erwerb) und Transkriptions-unabhängige Gedächtnisse (keine Abhängigkeit von Proteinsysnthese) (frühe Gedächtnisse, Kurzzeitgedächtnis). Im Gegensatz dazu ergaben zehn Trainingssitzungen „spaced" (d.h. mit einer 15 minütigen Ruhezeit zwischen den Sitzungen) äquivalente Lernlevels und Transkriptions-unabhängige Gedächtnisse (frühe Gedächtnisse) wie auch maximale Levels an Transkriptions-abhängigem Gedächtnis (einschließlich Proteinsynthese-abhängiges Langzeitgedächtnis (LTM)). LTM erfordert ein spaced Training, selbst 48 massed Trainingssitzungen induzieren kein LTM (Tully et al., Cell, 79:35–47 (1994)). Durch spaced Training induziertes Proteinsynthese-abhängiges LTM ist über eine Überexpression von CREB-Repressor vollständig blockiert (1) (Yin et al., Cell, 79:49–58 (1994)). Die resultierende Gedächtniskurve nach einem spaced Training, wo Proteinsynthese- und CREB-abhängiges LTM blockiert ist, ist derjenigen ähnlich, die von massed Training in normalen Fliegen gebildet ist. Im Gegensatz dazu induziert eine Überexpression des CREB-Aktivators LTM mit weniger Training (eine Trainingssitzung) oder mit massed Training (2) (Yin et al., Cell, 81:107–115 (1995)). Daher ist die LTM-Induktion sowohl Proteinsynthese- als auch CREB-abhängig. Diese Ergebnisse zeigen, dass der einzige funktionale Unterschied zwischen spaced und massed Trainingsprotokollen das Auftreten eines Transkriptions-abhängigen Gedächtnisses nach dem ersteren ist.
Diese Beobachtung bildet die Basis einer differentiellen Filterung, um zusätzliche „stromabwärts" liegende Gene zu identifizieren, die während der Transkriptionsabhängigen Gedächtnisbildung transkriptional reguliert sind. DNA-Sonden waren unter Verwendung von RNA synthetisiert, die aus den Köpfen von spaced- oder massedtrainierten Fliegen gemäß in der Technik allgemein bekannten Verfahren extrahiert war (siehe z.B. Sambrook et al., Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor University Press, New York (1989); und Ausubel et al., Eds., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1997)). RNA wurde aus Fliegenköpfen, wie bereits beschrieben, extrahiert (siehe z.B. Drain et al., Neuron, 6:71–82). Spaced oder massed Training von Fliegen wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (siehe z.B. Tully et al., Cell, 79:35–47 (1994); und Tully und Quinn, J. Comp. Physiol., 157:263–277 (1985). Komplementäre DNA (cDNA)-Sonde war aus der extrahierten RNA gemäß in der Technik allgemein bekannten Verfahren synthetisiert (siehe z.B. Sambrook et al., Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor University Press, New York (1989); und Ausubel et al., Eds., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1997)). Die komplexe cDNA-Sondenmischung wurde dann auf Microarray-Chips hybridisiert, die DNA-Sequenzen (Ziel-DNA-Sequenzen) von 1542 Drosophila-Genen enthielten (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA; siehe auch z.B. U.S. Patent Nr. 5.445.934 und Ramsay, Nature Biotechnology, 16:40–44 (1998). In einer besonderen Anwendungsform sind die DNA-Sonden mit einem detektierbaren Marker (z.B. fluoreszierenden Marker) markiert. Das Signal von den hybridisierten DNA-Sonden war gemäß in der Technik allgemein bekannten Verfahren amplifiziert und detektiert (siehe z.B. Sambrook et al., Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor University Press, New York (1989); und Ausubel et al., Eds., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1997)). In einer besonderen Anwendungsform war die Hybridisierung unter Anwendung eines Fluoreszenz-Assays detektiert. Ein statistischer Vergleich (DNA-Chip-Vergleich) wurde mittels eines Vergleichs des bei spaced- und massed-trainierten Gruppen detektierten Signals angestellt (durchgeführt).
Ein Probengröße und Signaltransformationsalgorithmus ist bestimmt worden, der die statistische Zuverlässigkeit verbessert, um kleine Differenzen bei Transkriptlevels zwischen spaced- und massed-trainierten Gruppen zu detektieren. Es ist in einer bevorzugten Anwendungsform bestimmt worden, dass eine Probengröße von 10 Chips pro Behandlungsgruppe für jedes Behandlungsprotokoll (d.h. 10 Chips für spaced-trainierte Gruppe 10 Chips für massed-trainierte Gruppe für jedes Gen) die statistische Zuverlässigkeit verbessert, um kleine Differenzen bei Transkriptlevels zwischen spaced und massed trainierten Gruppen zu detektieren. In einer bevorzugten Anwendungsform ist ein statistischer Vergleich (DNA-Chip-Vergleich) mit Hilfe des folgenden Signaltransformationsalgorithmus angestellt:

1. Bestimmen der „mittleren Differenz" zwischen dem für einen Satz an Primerpaaren für ein spezifisches Gen detektierten Signal. Die mittlere Differenz zwischen perfekt gepaarten (PM) und fehlgepaarten (MM) Signalen ist mit Hilfe der Affymetrix design software analysis (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA) bestimmt.
2. Box-Cox Transformation: Jeder mittlere Differenzwert unter 10 wird eliminiert. Die restlichen mittleren Differenzwerte für jedes Gen auf jedem Chip werden dann mit Hilfe der mittleren Gesamtdifferenz (über alle Gene) für den gesamten Chip normalisiert. Gew. Mittelwert = mittlere Gesamtdiff. für alle Chips und alle Gene/Chip
Norm (mittlere Diff.) = (Norm. Faktor für Chip X) × (Gen Y auf Chip X) Transformierte mittlere Diff. = {ln [norm(mittlere Diff.)]} × 2720,75
3. Bestimmen des mittleren Fehlers und Standardfehlers. Vergleich von Mittelwert für spaced- und massed-trainierte Fliegen für jedes Gen Y mit Hilfe des t-Standardtests (alpha = 0,05). Falls p ≤ 0,05, dann wird die durchschnittliche Signaltransformation für ein gegebenes Gen in zeitlich spaced-trainierten Fliegen als statistisch unterschiedlich von der durchschnittlichen Signaltransformation für dieses Gen in massed-trainierten Fliegen betrachtet.

Alternativ kann ein statistischer Vergleich (DNA-Chip-Vergleich) mit Hilfe des folgenden Signaltransformationsalgorithmus angestellt sein:

1. Bestimmen der „mittleren Differenz" zwischen dem für einen Satz an Primerpaaren für ein spezifisches Gen detektierten Signal. Die mittlere Differenz zwischen perfekt gepaarten (PM) und fehlgepaarten (MM) Signalen ist mit Hilfe der Affymetrix design software analysis (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA) bestimmt.
2. Box-Cox Transformation: Jeder negative mittlere Differenzwert für ein gegebenes Gen wird auf null gesetzt. Die „genullte mittlere Differenz" (mittl. Diff. 0) für jedes Gen auf jedem Chip wird dann mit Hilfe der „mittleren Gesamtdifferenz" für den gesamten Chip normalisiert. a) mittl. Diff. 0 = mittl. Diff., falls mittl. Diff. ≥ 0 = 0, falls mittl. Diff. < 0 b) Normalisierung Gew. Mittelwert = mittlere Gesamtdiff. für alle Chips und alle Gene/Chip
Norm (mittlere Diff. 0) = Normalisierungsfaktor (für Chip X) × (Gen Y auf Chip X) (für jedes Gen) c) Transformierte mittlere Diff. = {ln [norm(mittlere Diff. 0)]} × 2720,75136
3. Bestimmen des mittleren Fehlers und Standardfehlers. Vergleich von Mittelwert von spaced und massed mit einem t-Test-Vergleich. Falls p ≤ 0,05, dann wird die durchschnittliche Signaltransformation für ein gegebenes Gen in spaced-trainierten Fliegen als statistisch unterschiedlich von der durchschnittlichen Signaltransformation für dieses Gen in massed-trainierten Fliegen betrachtet.

Andere Algorithmen für eine Signaltransformation können bei Durchführung eines statistischen Vergleichs (DNA-Chip-Vergleich) eines zwischen spaced- und massedtrainierten Gruppen detektierten Signals verwendet sein.
Mit diesen Versuchsansätzen sind 1542 statistische Vergleiche (Student T-Tests) von spaced versus massed-trainierten für Drosophila bestimmt worden. Kandidaten-Gedächtnisgene (CMGs) (die nicht die transposablen Elemente oder mitochondrialen Gene einschließen), die während der Transkriptions-abhängigen Gedächtnisbildung transkriptional reguliert sind, wurden mit den DNA-Chip-Vergleichen (statistischen Vergleichen) zwischen spaced- und massed-trainierten Gruppen identifiziert. Transkripte, die differentiell reguliert sind, repräsentieren diejenigen, die an einem „assoziativen" LTM beteiligt sind, das von einem Pawlowschen Geruch-Schock-Lernparadigma induziert ist.
CMGs von Drosophila, die mit einer statistischen Analyse mit Hilfe des Signaltransformationsalgorithmus, in dem ein durchschnittlicher Differenzwert unter 10 für ein gegebenes Gen nicht berücksichtigt ist, von dem spaced-versus massed Vergleich (24 Stunden Gedächtnis) bestimmt sind, sind in Tabelle 1 angegeben. CMGs von Drosophila, die mit einer statistischen Analyse mit Hilfe des Signaltransformationsalgorithmus, in dem ein negativer durchschnittlicher Differenzwert für ein gegebenes Gen als null gewertet ist, von dem spaced versus massed Vergleich (24 Stunden Gedächtnis) bestimmt sind, sind in Tabelle 2 angegeben.
Die oben beschriebenen statistischen Verfahren lassen nur auf „statistische Kandidaten" schließen. Ein fundamentaler Aspekt der eingesetzten statistischen Verfahren (wie auch anderer derartiger Verfahren) ist, dass „falsch positive" und „falsch negative" Kandidaten mit den „richtig positiven" erhalten werden. Daher muss ein unabhängiges Verfahren für eine Detektion versuchssabhängiger Änderungen bei der Gentranskription für die „statistischen Kandidaten" angewandt werden. Derartige unabhängige Verfahren umfassen Northern Blot Analyse, quantitative Polymerase-Kettenreaktion (QPCR) und RNase-Schutzassays und können zur Bestätigung identifizierter statistischer Kandidaten verwendet sein. Die quantitativen Analysen dieser Daten sind ebenfalls Grund für falsch positive und falsch negative Ergebnisse.
Geringe Änderungen in den statistischen Verfahren können einen anderen Satz „statistischer Kandidaten" ergeben. Oftmals ist mehr als eine Art von Datentransformation hinreichend, um eine normalisierte Verteilung von Differenzbewertungen zu ergeben. Jede eingesetzte Datentransformation wird allerdings einen anderen Satz statistischer Kandidaten ergeben. Alle Signaldetektionsverfahren müssen ebenfalls „Grundlinienwerte" ausschließen, die für eine genaue Detektion zu niedrig sind. Die eine Möglichkeit mit diesem Problem umzugehen ist, derartige Werte auf null zu setzen. Eine andere Möglichkeit ist, derartige Werte aus dem Datensatz zu eliminieren (z.B. kleinere Werte als beispielsweise 10 zu eliminieren).
Chipdaten liefern eine bestätigende Information, Gen um Gen, dahingehend, welche Transkripte am Gedächtnis beteiligt sind. Chipdaten liefern ebenfalls eine genaue koordinierte transkriptionale Antwort auf verschiedene Stimuli über sämtliche Gentranskripte. Insbesondere liefern Chipdaten eine Information dahingehend, welcher koordinierte Effekt ein Gerntranskript auf das Gedächtnis hat.
Es ist von den meisten Genen in Drosophila gezeigt worden, dass sie Säuger-Homologe besitzen, und dies ist bei den meisten Drosophila-Genen der Fall, die an der Gedächtnisbildung beteiligt sind. (Dubnau und Tully, Ann. Rev. Neusosci., 21:407–444 (1998)). Mit dem zunehmenden Wissen, dass die Fliegen-Homologe durch die Säuger-Homologe in Drosophila funktionell ersetzt werden können, bezieht die vorliegende Entdeckung die entsprechenden Säuger-Homologe mit ein.
Die verschiedenen Effekte auf das Langzeitgedächtnis, die durch spaced versus massed Training gebildet sind, sind ein häufig beobachtetes Phänomen im Tierreich. Insbesondere ist ein spaced-massed differentieller Effekt für den konditionierten Angstverstärkten Schock-Effekt in Ratten (ein Säugermodellsystem) kürzlich etabliert worden. In dem Angst-verstärkten Schock-Paradigma ist das Gedächtnis von einer Erhöhung bei der Schock-Amplitude in Gegenwart eines konditionierten Stimulus (CS) gestört, der bereits mit einem Fußschock gepaart worden ist. Massed Training bei Ratten (4-CS gepaarte Schocks mit einem 10 Sekunden Intertrialintervall) bildet im Wesentlichen kein Transkriptions-abhängiges Gedächtnis aus, wohingegen ein spaced Training (4 Paarungen mit einem 8-Minuten Intertrialintervall) ein signifikant Transkriptions-abhängiges Gedächtnis ausbildet (6) (Josselyn et al., Society for Neurosci., 24:926, Abstract 365.10 (1998)). Darüber hinaus verstärkt eine Überexpression von CREB-Aktivator, an die Amygdala mit Hilfe viraler Vektortechnologie abgegeben, das Gedächtnis vom massed Training in einer wie auch bei der Drosophila beobachteten analogen Weise (7) (Josselyn et al., Society for Neurosci., 24:926, Abstract 365.10 (1998)). Diese Daten zeigen eine CREB-abhängige spaced-massed Unterscheidung, mit der die Säuger-CMGs zu identifizieren sind.
Daher wird von diesen Trainingsprotokollen erwartet, dass sie CMGs in Tieren, wie Säuger, ergeben, die den in Drosophila identifizierten CMGs ähnlich sind. Der Ausdruck „Tier", wie er hier verwendet ist, umfasst Säuger wie auch andere Tiere, Vertebraten und Invertebraten (z.B. Vögel, Fische, Reptilien, Insekten (z.B. Drosophila-Spezies), Aplysia). Die Ausdrücke „Säuger" oder „säugerartig", wie sie hier verwendet sind, beziehen sich auf beliebige Vertebraten, einschließlich Monotremata, Marsupialia und Placentalia, die ihre Jungen säugen und entweder lebendgebärend (Eutheria oder placentale Mammalia) oder eierlegend (Metatheria oder nichtplacentale Mammalia) sind. Beispiel für Säuger-Spezies umfassen nicht-humane Primaten (z.B. Affen, Schimpansen), Nager (z.B. Ratten, Mäuse, Meerschweinchen) und Wiederkäuer (z.B. Kühe, Schweine, Pferde).
Zur Identifizierung der CMGs bei nicht-humanen Tieren (besonders bei nicht-humanen Säugern, anderen Vertebraten und Invertebraten) sind DNA-Sonden unter Verwendung von RNA synthetisiert, die aus dem Gehirngewebe von spaced oder massed trainierten nicht-humanen Tieren gemäß in der Technik allgemein bekannten Verfahren extrahiert ist, (siehe z.B. Sambrook et al., Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor University Press, New York (1989); und Ausubel et al., Eds., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1997)). Diese Sonden können mit einem detektierbaren Marker markiert sein. In einer besonderen Anwendungsform sind DNA-Sonden unter Verwendung von RNA synthetisiert, die aus der Amygdala spaced- oder massed-trainierter Tiere extrahiert ist, und, falls erforderlich, mit einem detektierbaren Marker markiert sind. Eine Reihe an detektierbaren Marker und Markierungsverfahren sind in der Technik bekannt, einschließlich fluoreszierend, chemilumineszent, Biotin, radioaktiv, enzymatisch detektierter und immunologisch detektierter Marker (siehe z.B. Sambrook et al., Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor University Press, New York (1989); und Ausubel et al., Eds., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1997)). RNA ist aus Gehirngeweben, wie die Amygdala, gemäß in der Technik verfügbaren Verfahren extrahiert. Spaced oder massed Training von Tieren ist unter Anwendung in der Technik allgemein bekannten Verfahren durchgeführt (siehe z.B. Josselyn et al., Society for Neurosci., 24:926, Abstract 365.10 (1998); Casella und Davies, Physiol. Behav., 36:377–383 (1986); Guzowski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:2693–2698 (1997); Lamprecht et al., J. Neusoscience, 17(21):6443–6450 (1997); Bourtchuladze et al., Cell 79:59–68 (1994); und Kogan et al., Curr. Biol., 7:1–11 (1996). Dieses komplexe Sondengemisch wird dann auf Microarray-Chips hybridisert, die DNA-Sequenzen (Ziel-DNA-Sequenzen) von Genen des Genoms der Tiere enthalten (siehe z.B. U.S. Patent Nr. 5.445.934; und Ramsay, Nature Biotechnology, 16:40–44 (1998). Das Signal von hybridisierten DNA-Sonden wird gemäß in der Technik allgemein bekannten Verfahren amplifiziert und detektiert (siehe z.B. Sambrook et al., Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor University Press, New York (1989); und Ausubel et al., Eds., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1997)). Zum Beispiel kann eine Hybridisierung (das Signal von der hybridisierten Sonde) mit Hilfe von Fluoreszenz-Assays oder Massenspektroskopie detektiert sein. Verfahren unter Verwendung von Glasfasern, Diodenarray-Detektion, Chemilumineszenz/Lumineszenz, Agglutination von Latexkügelchen, direkte elektrische Ladungsänderung-Detektion (CCD) und piezoelektrisches Anzeige können ebenfalls angewandt sein. Der oben beschriebene Siganltransformationsalgorithmus ist zur Berechnung der Genexpressionslevels zwischen spaced- und massed-trainierten Gruppen angewandt.
Eine statistisch signifikante Differenz beim Transkriptlevel zwischen spaced und massedtrainierten Gruppen für ein spezifisches Gen identifiziert ein Kandidaten-Gedächtnisgen. Ein statistischer Vergleich (DNA-Chip-Vergleich) zwischen spaced- und massedtrainierten Gruppen kann mit Hilfe des Signaltransformationsalgorithmus angestellt sein.
Zusätzlich zu statistischen Vergleichen zwischen spaced- und massed-trainierten Gruppen können CMGs aus DNA-Chip-Vergleichen (statistischen Vergleichen) zwischen Tieren identifiziert sein, die unter Anwendung anderer Versuchsprotokollpaare trainiert sind. Die Versuchsgruppe ist unter Bedingungen trainiert, die hinreichend sind, ein Transkriptions-abhängiges Gedächtnis zu induzieren, und die Kontrollgruppe ist unter Bedingungen trainiert, die nicht hinreichend sind, ein Transkriptions-abhängiges Gedächtnis zu induzieren. Der signifikante Unterschied zwischen irgendwelchen zwei Versuchsprotokollen ist die Induktion eines Transkriptions-abhängigen Gedächtnisses. Der signifikante Unterschied zwischen irgendwelchen zwei Versuchsprotokollen, die verglichen werden sollen, ist die Induktion eines Transkriptions-abhängigen Gedächtnisses in der Versuchsgruppe und das Fehlen eines Transkriptions-abhängigen Gedächtnisses in der Kotrollgruppe.
Versuchsprotokollpaare, die primär bei der Induktion eines Transkriptionsabhängigen Gedächtnisses differieren, sind in der Technik bekannt. Zum Beispiel kann ein Versuchsprotokollpaar, das primär bei der Induktion eines Transkriptions-abhängigen Gedächtnisses differiert, aus einem spaced Trainingsprotokoll und einem massed Trainigsprotokoll bestehen. In dieser Anwendungsform ist das Training eines Tieres mit einem spaced Trainingsprotokoll hinreichend, um ein Transkriptions-abhängiges Gedächtnis in dem Tier zu induzieren. Das Training eines Tieres mit einem massed Trainingsprotokoll ist nicht hinreichend, ein Transkriptions-abhängiges Gedächtnis zu induzieren. Als ein weiteres Beispiel kann ein Versuchsprotokollpaar, das primär bei der Induktion eines Transkriptions-abhängigen Gedächtnisses differiert, aus einem Training normaler (Wildtyp)-Tiere mit einem Shuttle-Box-Vermeidungsprotokoll (besonders one Trial-Shuttle-Box-Vermeidungsprotokoll) und Training eines Tieres, bei dem der Fornix operativ verletzt ist, mit dem Shuttle-Box-Vermeidungsprotokoll bestehen (Taubenfeld et al., Nat. Neurosci., 2(4):309–310 (1999)). In dieser Anwendungsform ist das Transkriptions-abhängige Gedächtnis im normalen (Wildtyp)-Tier induziert. Das Transkriptions-abhängige Gedächtnis ist nicht in dem Tier induziert, dessen Fornix operativ verletzt ist. Als ein weiteres Beispiel kann ein Versuchsprotokollpaar, das primär bei der Induktion eines Transkriptions-abhängigen Gedächtnisses differiert, aus einem Training eines Tieres mit einem kontextuellen Angstkonditionierungsprotokoll (besonders one Trial kontextuelles Angstkonditionierungsprotokoll) und Training eines Tieres, das an die Trainingskammer vor der kontextuellen Angstkonditionierung gewöhnt ist, unter Anwendung des kontextuellen Angstkonditionierungsprotokolls bestehen (Imprey et al., Neurosci., 1(7):595–601 (1998)). In dieser Anwendungsform ist das Transkriptionsabhängige Gedächtnis in dem Tier induziert, das nicht an die Trainingskammer vor der kontextuellen Angstkonditionierung gewöhnt worden war. Das Transkriptions-abhängige Gedächtnis wird in dem Tier nicht induziert, das vor der kontextuellen Angstkonditionierung an die Trainingskammer gewöhnt ist. Andere Paare von Versuchsprotokollen können ohne weiteres vom Fachmann identifiziert werden.
DNA-Sonden sind unter Verwendung von RNA synthetisiert, die aus Gehirngeweben, wie Amygdala und Hippocampus, von Tieren extrahiert sind, die mit Versuchsprotokollpaaren trainiert sind, wie es hier beschrieben ist, und, falls erforderlich, mit einem detektierbaren Marker markiert sind. Das DNA-Sondengemisch wird dann auf Microarray-Chips hybridisiert, die DNA-Sequenzen (Ziel-DNA-Sequenzen) von Genen des Genoms des Tieres enthalten. Ein statistischer Vergleich wird durch einen Vergleich der DNA-Chipdaten zwischen zwei Versuchsprotokollen mit Hilfe des oben beschriebenen Signaltransformationsalgorithmus angestellt.
Die hier angeführten statistischen Verfahren können zur Detektion von Differenzen bei Transkriptlevels zwischen trainierten und untrainierten (naiven) Gruppen verwendet sein. Dementsprechend können Kandidaten-Plastizitätsgene (CPGs) aus Vergleichen von DNA-Chips (statistischen Vergleichen) zwischen trainierten versus untrainierten (naiven) Tieren identifiziert werden. Transkripte, die in dieser Klasse differentiell reguliert sind, werden CMGs zusammen mit beliebigen weiteren Genen umfassen, die auf eine „nicht assoziative" Weise auf die allgemeinen Trainingsbedingungen (z.B. Behandlung mit Geruch, Elektroschock oder beliebig anderen Versuchsaspekten des Trainingsprotokolls) transkriptional reagieren. Manche unspezifische transkriptionale Reaktionen erfolgen einfach, wenn ein Tier in einer neuen Umgebung verbracht wird oder wenn das Tier einem Stimulus allein oder einem zeitlich nicht gekoppelten Stimulus ausgesetzt ist. Diese Transkriptionsänderungen können aus allgemeinen (unspezifischen) Zunahmen der neuronalen Aktivität resultieren oder andere Formen des Lernens oder der Gedächtnisbildung widerspiegeln, die nicht mit den allgemeinen Trainingsbedingungen verbunden sind.
CPGs von Drosophila, die mit einer statistischen Analyse mit dem Signaltransformationsalgorithmus, bei dem ein durchschnittlicher Differenzwert von unter 10 für ein gegebenes Gen nicht berücksichtigt wird, aus dem spaced versus naiven Vergleich (24-Stunden Gedächtnis) bestimmt sind, sind in Tabelle 3 angeführt. CPGs von Drosophila, die mit einer statistischen Analyse mit dem Signaltransformationsalgorithmus, bei dem ein negativer durchschnittlicher Differenzwert für ein gegebenes Gen auf null gesetzt wird, aus dem spaced versus naiven Vergleich (24-Stunden Gedächtnis) bestimmt sind, sind in Tabelle 4 angeführt.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Identifizierung eines Gens oder Gene bereit, die am Transkriptions-abhängigen Gedächtnis (insbesondere Langzeitgedächtnis) beteiligt sind, umfassend (a) Trainieren nicht-humaner Tiere (insbesondere nicht-humaner Tiere, anderer Vertebraten und Invertebraten) unter Bedingungen, die hinreichend sind, ein Transkriptions-abhängiges Gedächtnis (insbesondere Langzeitgedächtnis) in den Tieren zu induzieren; (b) Extrahieren von RNA aus Gehirngewebe (wie aus Amygdala, Hippocampus) des in Schritt (a) trainierten Tieres; (c) Synthetisieren von DNA-Sonden unter Verwendung der in Schritt (b) extrahierten RNA; (d) Exponieren der in Schritt (c) synthetisierten DNA-Sonden an Microarray-Chips, die DNA-Sequenzen von Genen des Genoms der Tiere enthalten, unter Bedingungen, die für eine Hybridisierung der DNA-Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen auf den Microarray-Chips geeignet sind, wobei ein Signal nach Hybridisierung der Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen erzeugt ist; (e) Detektieren des in Schritt (d) erzeugten Signals; und (f) Durchführen eines statistischen Vergleichs zwischen dem in Schritt (e) detektierten Signal und dem in einer Kontrolle detektierten Signal.
In einer Anwendungsform ist die Kontrolle nach einem Verfahren erhalten, umfassend (i) Trainieren nicht-humaner Kontrolltiere (insbesondere nicht-humaner Säuger, anderer Vertebraten und Invertebraten) unter geeigneten Bedingungen, wobei die Bedingungen nicht hinreichend sind, ein Transkriptions-abhängiges Gedächtnis in den Kontrolltieren zu induzieren; (ii) Extrahieren von RNA aus Gehirngewebe der in Schritt (i) trainierten Kontrolltiere; (iii) Synthetisieren von DNA-Sonden unter Verwendung der in Schritt (ii) extrahierten RNA; (iv) Exponieren der in Schritt (iii) synthetisierten DNA-Sonden an Microarray-Chips, die DNA-Sequenzen von Genen des Genoms der Tiere enthalten, unter Bedingungen, die für eine Hybridisierung der DNA-Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen auf den Microarray-Chips geeignet sind, wobei ein Signal nach Hybridisierung der Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen erzeugt ist. Die Versuchsbedingungen von Schritt (a) und (i) bilden ein (experimentelles) Behandlungspaar. Der signifikante Unterschied zwischen den Versuchsbedingungen von Schritt (a) und Schritt (i) liegt in der Induktion eines Transkriptions-abhängigen Grdächtnisses.
In einer zweiten Anwendungsform ist die Kontrolle nach einem Verfahren erhalten, umfassend (i) Extrahieren von RNA aus Gehirngewebe von nicht-humanen Kontrolltieren; (ii) Synthetisieren von DNA-Sonden unter Verwendung der in Schritt (i) extrahierten RNA; (iii) Exponieren der in Schritt (ii) synthetisierten DNA-Sonden an Microarray-Chips, die DNA-Sequenzen von Genen des Genoms der Tiere enthalten, unter Bedingungen, die für eine Hybridisierung der DNA-Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen auf den Microarray-Chips geeignet sind, wobei ein Signal nach Hybridisierung der Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen erzeugt ist. In dieser Anwendungsform der Kontrolle sind die Kontrolltiere naive (untrainierte) Tiere.
Wie hier verwendet, ist ein Kontrolltier ein Tier derselben Spezies und im übrigen vergleichbar (z.B. ähnliches Alter, Geschlecht) mit dem Tier, das unter hinreichenden Bedingungen trainiert ist, um eine Transkriptions-abhängige Gedächtnisbildung in diesem Tier zu induzieren.
Ein Transkriptions-abhängiges Gedächtnis kann unter Anwendung spezifischer Versuchsbedingungen induziert sein. In einer Anwendungsform ist das Transkriptionsabhängige Gedächtnis in einem nicht-humanen Tier mit Hilfe eines spaced Trainingsprotokolls für die Angst-verstärkte Schockreaktion induziert. In einer zweiten Anwendungsform ist das Transkriptions-abhängige Gedächtnis in einem nicht-humanen Tier mit Hilfe eines Shuttle-Box-Vermeidungsprotokolls induziert. In einer dritten Anwendungsform ist das Transkriptions-abhängige Gedächtnis in einem nicht-humanen Tier mit Hilfe eines kontextuellen Angstkonditionierungsprotokolls induziert.
Die vorliegende Erfindung wird nun mit den folgenden Beispielen veranschaulicht, die in keiner Weise als Beschränkung betrachtet werden sollen.
BEISPIELE
BEISPIEL 1 nalyot^PI Isolierung.
Ein X-gekoppeltes PlacW-Transposon (Bier et al., Science, 240(4854):913–916 (1988)) wurde mobilisiert, um 2.182 Transposon-Stämme mit unabhängigen Insertionen auf dem zweiten und dritten Chromosom zu erzeugen (siehe Boynton und Tully, Genetics, 131:655–672 (1992); Dura et al., J. Neurogent., 9:1–14 (1993)). Das Das drei-Stunden-Gedächtnis wurde nach einer einzigen Trainingssitzung des Pawlowschen olfaktorischen Lernens mit einem Leistungsindex (PI) für jeden dier Transposon-Stämme quantifiziert. N = 4 PIs wurde dann für diese Stämme gebildet, die 70% oder weniger eines parentalen Wildtyp-Stammes [w¹¹¹⁸(CS10)] erzielten. Zu diesem Zeitpunkt der Durchmusterung erzielten 93 mutierte Stämme mittlere Drei-Stunden-Gedächtniss mit Bewertungen von 70% des Wildtyps oder weniger. Jeder dieser mutierten Kandidatenstämme wurde dann für fünf Generationen gegen den parentalen Stamm ausgekreuzt, um ihren (heterogenen) genetischen Hintergrund zu äquilibrieren. Wenn das Drei-Stunden-Gedächtnis wiederholt in diesen ausgekreuzten Stämmen quantifiziert wurde (N = 4 PIs), erzielten nur noch acht der 93 Kandidaten-Mutanten mittlere Bewertungen < 70% Wildtyp. Letztendlich wurden „Aufgaben-relevante" sensimotorische Aufgaben in diesen acht mutierten Stämmen untersucht. Alle acht zeigten eine normale Schockreaktion; vier, G_B335 und E_J51, E_J220 und E_S152 zeigten eine signifikant reduzierte olfaktorische Schärfe (Boynton und Tully, Genetics, 131:655–672 (1992); Dura et al., J. Neurogent., 9:1–14 (1993)). [G_B335, jetzt als dare bezeichnet, wurde bereits früher untersucht und zeigt eine bevorzugte Expression in den Antennen (Freeman et al., Development, 126:4591–4602 (1999)]. Die verbliebenen vier mutierten Stämme zeigten normale sensorimotorische Antworten und wurden als latheo (Boynton und Tully, Genetics, 131:655–672 (1992); Pinto et al., Neuron, 23:45–54 (1999); Rohrbough et al., Neuron, 23:55–70 (1999), linotte (Dura et al., J. Neurogent., 9:1–14 (1993); Bolwig et al., Neuron, 15:829–842 (1995); Simon et al., Mech. Dev., 76:42–55 (1998), golovan und nalyot bezeichnet.
BEISPIEL 2 Klonierung und Charakterisierung der nalyot genomischen Region.
Das PlacW-Transposon umfasst eine einzige SacII-Restriktionsschnittstelle, gefolgt vom bakteriellen Replikationsursprung und dem Ampicillin-Gen (8). Ein Verdau der genomischen nalyot (nal) DNA mit SacII, Ligation unter Verdünnungsbedingungen und eine bakterielle Transformation ermöglicht die Plasmid-Rettung eines 9,4 kb SacII-Restriktionsfragments gemeinsam mit flankierender DNA aus der genomischen Region. Chromosomen in situ- und Southern-Blotting-Experiment bestätigten, dass dieses Fragment mit der P-Insertionsstelle kartiert. Die radioaktiv markierten Rettungsfragmente wurden verwendet, um eine Million Plaques einer genomischen lambda-DashII Drosophila Can-S Bibliothek (Stratagene) zu durchmustern. Isolierung, Subklonierung und Restiktionsanalyse von 10 unabhängigen Klonen führten zu der Konstruktion einer 35 kb Karte, die sich über die genomische Region um die P-Element-Insertionsstelle erstreckt (8).
Intron/Exon-Karten der adf1 und cn20 Transkriptionseinheiten sind in 8 gezeigt. Das nal^PI-Element (Pfeil) ist innerhalb eines Introns der adf1 Transkriptionseinheit, 147 bp stromabwärts der Spleißdonorstelle inseriert. Das adf1-Gen codiert einen entfernt zu der myb-Familie verwandten Transkriptionsfaktor (England et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:683–687 (1992)) und ist alternativ in (mindestens) zwei mRNAs gespleißt. i1 und i2 entsprechen zwei potentiellen Translationsstartstellen. Zwei zusätzliche Introns mit ca. 3,5 kb und 59 bp scheinen konstitutiv gespleißt zu sein und trennen den Rest der adf1-Transkriptionseinheit in ein 274 bp und ein 1.013 bp Exon. Das cn20-Gen ist neuartig und erzeugt ein einziges, ungespleißtes Transkript, das ein 395 Aminosäuren langes Protein codieren kann. Der Umfang der genomischen Deletion in nal^le60 ist angegeben. Restriktionsschnittstellen: B, BamHI; E, EcoRI; H, HindIII; S, SacII.
BEISPIEL 3 Northern-Blot-Analyse von adf1 und cn20 in nal^PI-Mutanten und Wildtyp-Fliegen und cDNA-Isolierung.
Gesamt-RNA aus ganzen adulten Fliegen, adulten Köpfen oder adulten Körpern wurden mit dem TriZOL-Reagens (BRL) isoliert. Die poly(A)-Fraktion wurde anschließend mit oligo(dT)-Cellulose (Collaborative Research) oder magnetischen oligo(dT)-Kügelchen (Dynal) gereinigt. Die gereinigte poly(A)-RNA wurde mittels Formaldehyd-Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und in 10 X SSC auf eine ZetaProbe Nylon-Membran (BioRad) übertragen. Die RNA auf der getrockneten Membran wurde mittels UV-Vernetzung bei 2.500 μJoules (Stratalinker) fixiert. Für eine erste Identifizierung der Transkriptklassen wurden die Membranstreifen über Nacht mit radioaktiv markierten genomischen DNA-Fragmenten in hoch stringentem Church und Gilbert Puffer besondet, intensiv gewaschen und einem Kodak BioMax-Film exponiert.
Ausgewählte Sonden wurden mit zwei cDNA-Bibliotheken aus adulten Köpfen von Drosophila, einer lambda gt11 Bakteriophagen adulte Köpfe-Bibliothek (Salvaterra) und einer pJG4-5 Plasmid-Bibliothek (Roshbash) hybridisiert. Aus diesen zwei Bibliotheken wurden insgesamt elf Klone, die zwei unabhängigen Transkriptionseinheiten entsprechen, isoliert und mittels Restriktionsschnittstellenanalyse bewertet. Zehn Klone entsprachen der adf1-Transkriptionseinheit. Restriktionsstellenkartierung und Sequenzanalyse einer Untergruppe dieser Klone zeigte eine gemeinsame 3'-Ende Prozessierungsstelle und Heterogenität am 5'-Ende. Die 5'-Heterogenität spiegelte das partielle Spleißen des Introns 1 (114 bp) und vielleicht eine unvollständige Synthese des ersten Stranges wider. Ein Klon, cn20, entsprach einer unabhängigen benachbarten Transkriptionseinheit.
Um die Wirkung der P-Insertion auf adf1 und cn20 RNA-Levels zu quantifizieren, wurden von nal^PI und Wildtyp-Köpfen oder Körpern abstammende Northern-Blots, wie oben mit radioaktiv markierten Sonden, die adf1, cn20 und einer Kontroll-RNA rp49 entsprachen, analysiert.
Bezogen auf die Kontrolllevels der rp49-RNA waren die cn20-mRNA Expressionslevels sowohl in den Köpfen als auch in den Körpern in Wildtyp- und mutierten Fliegen ähnlich. Im Gegensatz dazu waren die adf1-mRNA Expressionslevels mindesten um das Zweifache in mutierten Köpfen und Körpern reduziert.
BEISPIEL 4 Antikörper Herstellung.
Der gesamte offene ADFl-Leserahmen von wurde in den pET30(a)-Expressionsvektor (Novagen) als eine C-terminale Fusion inseriert. Eine starke IPTG Induktion des ADF1-Fusionsproteins wurde in transformierten BL21-Bakterien erhalten. Der Großteil des induzierten Proteins war in der unlöslichen Einschlusskörperchenfraktion und diese Fraktion (3 Stunden nach der Induktion isoliert) wurde auf annähernd 85 % ADF1-Fusionsprotein angereichert. Diese Fraktion wurde intensiv mit PBS gewaschen und direkt als Antigen verwendet. Polyklonale und monoklonale Maus-Antikörper wurden mit Hilfe von Standardverfahren erhalten (Harlow und Lane, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY (1998)). Drei Mäuse wurden mit 50 μg Einschlusskörperchenfraktion (in komplettem Freunds Adjuvans) geimpft und dann alle zwei Wochen mit 50 μg der Einschlusskörperchenfraktion in inkomplettem Freunds Adjuvans wiederholt geimpft. Alle drei Mäuse zeigten starke Immunantworten; eine wurde für Hybridomfusionen getötet. Von 800 Kandidaten-Hybridomlinien zeigten 17 bei ADF1-Dot-Blot-Analysen eine Reaktion. Eine nachfolgende Bewertung der 17 Linien mittels Western-Blotting und immunchemischen Untersuchungen führte zu der Isolierung von zehn monoklonalen Linien, einschließlich mAk ADF1–8 und mAk ADF1–17.
BEISPIEL 5 Western-Blot-Analyse der ADF-1 Proteinlevels in mutierten nal^PI und Wildtyp-Fliegen.
Gefrorene Köpfe oder Körper wurden, wie zuvor beschrieben, isoliert (Yin et al., Cell, 79:49–58 (1994)), und die Extrakte wurden mittels Homogenisierung von 100 μl gefrorenen pulverisierten Köpfen in 500 μl RIPA-Puffer hergestellt. Die Proteinkonzentrationen wurden mit Hilfe des Bio-Rad Proteintests bestimmt. Die Proteinproben wurden in Standard-Gelbeladungsfarbstoff denaturiert, mittels SDS-PAGE aufgetrennt und elektrophoretisch mit 100 mA 2 Stunden auf eine Nitrocellulose-Membran (Bio-Rad) übertragen. Jede Membran wurde über Nacht bei 4°C in PBST + 5% Milch blockiert und dann 1–2 Stunden mit dem ersten Antikörper in PBST + Milch inkubiert. Die verwendeten ersten Antikörper waren polyklonale Maus-Sera gegen adf1 (1:1000), Maus monoklonaler Überstand (mAk Adf1–17) gegen adf1 (1:20), Maus monoklonaler Überstand gegen TBP (1:5) und Maus monoklonale Ascites gegen α-Tubulin (1:50.000) (Sigma). Die Membran wurde intensiv in PBST gewaschen und 1–2 Stunden mit dem zweiten HRP-konjugiertem anti-IgG Antikörper (Bio-Rad; 1:500) inkubiert. Nach intensivem Waschen in PBST wurden die konjugierten Produkte wurden mit Hilfe einer verstärkten Chemilumineszenz (Pierce SuperSignal ULTRA Substrate) und Autoradiographie sichtbar gemacht.
Bezogen auf die Kontrolllevels zweier anderer Proteine (TATA-Bindungsprotein und alpha-TUBULIN) war die ADF1-Expression um mindestens um das Zweifache in mutierten Fliegen reduziert.
BEISPIEL 6 Vergleich der DNA-Chipdatensätze zwischen Wildtyp-Fliegen und einer Einzelgen-Mutante, nalyot.
DNA-Chipdatensätze zwischen normalen (Wildtyp)-Fliegen und einer Einzelgen-Mutante, nalyot, wurden verglichen. Die nalyot Mutante zeigte, dass sie ein normales Gedächtnis nach einem massed Training besaß, aber das LTM wurde durch ein spaced Training nicht induziert. Überdies wurde die naylot Mutation als eine Transposon-Insertion in das Adf1-Gen identifiziert, und deren Wirkung ist, die Menge an Adf1-Transkript und Protein in den mutierten Fliegenköpfen zu mindern.
Wenn alle Grundwerte auf Null gesetzt und die Daten dann analysiert wurden, wurde kein signifikanter Unterschied für das Adf1-Gen zwischen Wildtyp-Fliegen und naylot Mutanten festgestellt. Wurden jedoch die Grundwerte von 10 oder weniger von der Analyse ausgeschlossen (eher als auf Null gesetzt) wurde eine signifikante Wirkung auf die Adf1-Transkripte festgestellt, welche die, wie in Beispiel 3 beschrieben, mittels Northern-Analyse erhaltenen Ergebnisse bestätigte. Dieses Ergebnis stellt eine signifikante Verifizierung des statistischen Versuchsansatzes dar, in dem die durchschnittlichen Differenzwerte unter 10 aus dem Datensatz entfernt sind.
BEISPIEL 7 Quantitative Polymerase-Kettenreaktion.
Eine gegebene Gruppe an Fliegen wird einem bestimmten Trainingsprotokoll unterzogen (spaced oder massed) und nach dem Training in normalen Futtergefäßen aufbewahrt. Vierundzwanzig Stunden nach dem Training werden Fliegen aus unterschiedlichen Gruppen eines gegebenen Trainingsprotokolls (spaced oder massed) in einem einzigen 50 ml Falcon-Röhrchen gesammelt und in Flüssigstickstoff schockgefroren. Die Köpfe der gefrorenen Fliegen werden durch heftiges mechanisches Schütteln von ihren Körpern getrennt. Die gefrorenen und abgetrennten Körperteile werden dann durch eine Reihe an Sieben gesiebt, um letztendlich eine homogene Population an Fliegenköpfen zu erhalten.
Die vereinigten Köpfe aus einer Trainingsgruppe (spaced oder massed) werden in acht Gruppen aufgeteilt. Jede Gruppe an Köpfen wird mit einem Mörser und Pistill zu einem Pulver zerrieben. Das Pulver wird in 5 ml Trizol-Lösung (Gibco) überführt und bei –70°C über Nacht aufbewahrt.
Die gefrorene Trizol/Fliegenpulver-Lösung wird dann aufgetaut. 2 ml Chloroform wird zugefügt. Die Mischung wird für 10 Minuten bei 4°C mit 3.500 UpM zentrifugiert. Die extrahierte RNA (in der wässrigen Schicht) wird in ein frisches Röhrchen dekantiert und 1,4 ml Isopropanpol zugefügt.
Für QPCR werden Aliquote der obigen Lösung 20 Minuten bei 4°C mit 8.000 UpM zentrifugiert. Das Isopropanol wird dekantiert und das Pellet wird 1 X in 70% Ethanol gewaschen. Das Pellet wird in 100 μl H₂O resuspendiert und ein gleiches Volumen an Phenol/Chloroform (Gibco) wird zugefügt. Die Lösung wird 5 Minuten bei 4°C mit 14.000 UpM zentrifugiert. Die obere wässrige Schicht wird in ein frisches Röhrchen dekantiert. 200 μl eiskaltes Ethanol wird zusammen mit 6 μl 3 M Natriumacetat zugefügt. Die Lösung wird mindestens 20 Minuten bei –20°C inkubiert.
Die Lösung wird dann 20 Minuten bei 4°C mit 14.000 UpM zentrifugiert. Das Pellet wird in 20 μl H₂O resuspendiert und einer RNase-freien RQ1-DNase (Promega) Behandlung unterworfen. Die RNA-Konzentration wird bestimmt.
Erststrang-cDNAs werden dann von 1 μg der DNase-freien RNA-Proben synthetisiert und der QPCR-Assay wird gemäß den Perkin Elmer Biosystems Protokollen unter Verwendung des 7700 ABI Prism mit „CYBR" cybergreen Fluoreszenz-Detektion durchgeführt.
BEISPIEL 8 Statistisches Kandidaten- Gedächtnisgen, C/EBP.
Die folgenden C/EBP Primer, konstruiert von Quantagene (Paris, Frankreich), wurden in QPCR-Experimenten verwendet: 5'-AGACTACCGATGCGAACAAC-3' (SEQ ID NR:1) und 3'-GTCCCTGAACTGGTCGTCTA-5' (SEQ ID NR:2) und ergaben ein erwartetes Fragment mit einer Größe von 221 bp.
Für C/EBP Daten wurden 8 wiederholte RNA Extraktionen verwendet, die aus annähernd 10.000 Fliegenköpfen gewonnen wurden, 24 Stunden nachdem sie einem spaced oder massed Training unterzogen waren. QPCR-Reaktionen für jede RNA-Extraktion wurden dreifach gemäß dem in Beispiel 7 dargestellten Verfahren durchgeführt.
Die Ergebnisse für jede C/EBP-Reaktion wurden für RNA-Mengen gegen eine gekoppelte QPCR-Reaktion für TBP-ββ normalisiert, einem Kontrollgen, das keine transkriptionellen Veränderungen in diesem Zusammenhang zeigt.
Auf diese Art und Weise analysiert, war die mittlere Anzahl an Cyclen 21,86 ± 0,56 für die spaced Gruppe und 23,78 ± 0,56 für die massed Gruppe, um den für eine C/EBP-Amplifikation benötigten kritischen Wert zu erreichen. Es wurden weniger Cyclen für die spaced Gruppe benötigt, um den kritischen Wert zu erreichen, was auf eine höhere Konzentration an C/EBP zu Beginn der PCR-Amplifizierung hinweist.
Diese Daten zeigen, dass die C/EBP-Levels um das 3,78-fache höher in der spaced Trainingsgruppe als in der massed Trainingsgruppe waren (5). Die Versuchsergebnisse bestätigen, dass es einen signifikanten Unterschied für isolierte C/EBP-Transkripte (sogenannte slow border cells, slobo bei Drosophila) aus spaced versus massed trainierten Fliegen gibt. Die genetische Manipulierung von C/EBP in Mäusen verstärkt das Langzeitgedächtnis (Sterneck et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(18):10908–10913 (1998)) und eine molekulare Manipulierung von C/EBP in Aplysia blockiert die Langzeit-Förderung (ein zelluläres Substrat für die Langzeitgedächtnis-Sensibilisierung) (Alberini et al., Cell, 76:1099–1114 (1994)). Deshalb stellt die Bestätigung von C/EBP als ein CMG hier eine signifikante Verifizierung dar, dass dieser DNA-Chip-Versuchsansatz für eine Identifizierung am Gedächtnis beteiligter Transkripte verwendet werden kann.
BEISPIEL 9 Trainingsapparatur.
Experimentell naive männliche Sprague-Dawley Ratten (300–350 g) wurden in fünf identischen Plexiglas- und Maschendrahtkäfigen (8 × 15 × 15 cm), die in einer schallgedämpften Kammer untergebracht waren, trainiert und getestet (Cassella und Davis, Physio. Behav., 36:377–383 (1986)). Der schockauslösende Stimulus war ein 105 dB, 50 ms Knall weißen Rauschens (Anstieg-Abfall-Zeit 5 ms) gegen ein weißes Hintergrundrauschen von 55dB. Ein 3,7-s Licht CS wurde mittels einer 8 W Fluoreszenz-Glühbirne (Anstieg/Abfall-Zeit, 100 μs; BCO Footlambertsintensität) gebildet. Der Boden von jedem Käfig bestand aus vier Edelstahl-Streifen durch die ein 0,5 s 0,6 oder 0,3 mA Fußschock abgegeben werden konnte.
BEISPIEL 10 Verhaltenstrainingsverfahren.
Zwei Tagen vor jeglichem Training wurden die Ratten einmal täglich in die Schockkammern verbracht und 15 Minuten später 15 Schockstimuli ausgesetzt. An dem einzigen Trainingstag für Exp. 1 wurden die Tiere in der Schockkammer verbracht und erhielten 5 Minuten später 4 gekoppelte Lichtschocks mit einem der folgenden Intertrial-Intervalle (ITIs) (3 Sekunden, 5 Sekunden, 10 Sekunden, 15 Sekunden, 2 Minuten oder 8 Minuten) Fünf Minuten nach dem letzten gekoppelten Lichtschock wurden die Tiere in ihre Aufenthaltskäfige zurückgebracht. Das gekoppelte massed und spaced Training wurde ähnlich durchgeführt, außer dass die ITI zwischen den 4 gekoppelten Lichtschocks 10 Sekunden beziehungsweise 8 Minuten betrugen. Ausdrücklich nicht-gekoppelte massed Trainingsversuche bestanden aus massed Lichtpräsentationen (4, ITI von 10 Sekunden) gefolgt von massed Schockpräsentationen (4, ITI von 10 Sekunden) 4 Minuten später.
BEISPIEL 11 Langzeitgedächtnis-Test.
Achtundvierzig Stunden nach dem Training wurden die Ratten in die Schockapparatur verbracht und erhielten ausschließlich 30 schockauslösende Stimuli, gefolgt von 60 schockauslösenden Stimuli, von denen eine Hälfte 3,2 Sekunden nach der 3,7 Sekunden Lichtattacke (Licht-Geräusch-Versuch) erfolgten und eine Hälfte davon in Dunkelheit präsentiert wurden (nur Geräusch-Versuch). Die Reihenfolge der zwei Versuchstypen war unregelmäßig. Alle Schockstimuli wurden mit einem Interstimulusintervall von 30 Sekunden präsentiert. Angst-verstärkte Schock-Differenzbewertungen, die als LTM-Index verwendet wurden, wurden durch Subtraktion der durchschnittlichen Schockamplituden, die von den 30 ausschließlich Geräusch-Versuchen gebildet wurden, von den durchschnittlichen Schockamplituden, die von den 30 Licht-Geräusch-Versuchen gebildet wurden, berechnet.
BEISPIEL 12 Kurzzeitgedächtnis-Test
Der Kurzzeitgedächtnis-(STM)-Test war dem LTM-Test ähnlich, außer dass er 15 oder 40 Minuten nach dem Training stattfand. Den zwanzig Nur-Geräusch-Stimuli folgten 15 Licht-Geräusch-Stimuli und 15 Nur-Geräusch-Stimuli wurden beigemischt. Angstverstärkte Schockbewertungen wurden durch Subtraktion der mittleren Nur-Geräusch-Bewertung von der mittleren Licht-Geräusch-Bewertung berechnet und als ein STM-Index verwendet.
BEISPIEL 13 Operation.
Die Ratten wurden mit Atropinsulfat (0,4 mg/Kg, ip) vorbehandelt, mit Natriumpentobarbital (60 mg/Kg, ip) narkotisiert und in ein stereotaktisches Standardinstrument verbracht. Eine an einer Infusionspumpe befestigte Hamilton Mikrospritze (10 μl), wurde für Infusionen verwendet. Bilaterale Mikroinjektionen (2 μl) wurden über 10 Minuten über eine 30er Kanüle gegeben, die auf den lateralen Nukleus der Amygdala (Koordinaten AP = –2,8, L = ±5,2, DV = –8,5 unter der Oberfläche des Schädeldaches) oder Nucleus caudatus (Koordinaten AP = +0,2, L = ±3,0, DV = –6,0) gerichtet war, nach Painos und Watson, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, Academic, Sydney, Australia (1986). Die Infusionskanüle wurde 10 zusätzliche Minuten an Ort und Stelle gelassen, um eine Diffusion sicherzustellen.
BEISPIEL 14 Virus-Herstellung.
CREB und mCREB cDNAs (erhalten von M.E. Greenberg, Harvard University) und LacZ wurden in das HSV-Amplicon HSV-PrpUC inseriert und mit Hilfe des Helferstammes 5dl 1.2 (Lim et al., Biotechniques, 20:460–469 (1996); Keve et al., Neuroscience, 79:435–447 (1997)) verpackt. Das Virus wurde über einen Sucrose-Gradienten gereinigt, pelletiert und in 10 % Sucrose resuspendiert. Der durchschnittliche Titer der rekombinanten Virus-Stocks betrug 4,0 × 10⁷ infektiöse Einheiten/ml und war für HSV-CREB und HSV-mCREB ähnlich. Die transgene Expression wurde von dem konstitutiven Promotor für das frühe intermediäre HSV-Gen IE 4/5 reguliert.
BEISPIEL 15 Immunchemie.
Ratten wurden mit Chloralhydrat überdosiert und mit 50 ml PBS und anschließend mit 250 ml 4 % Paraformaldehyd in PBS perfundiert. Die Gehirne wurden kältegeschützt auf einem Mikrotom (40 μm Schnitte) geschnitten und die Immuncytochemie wurde auf freischwimmenden Schnitten durchgeführt. Mit HSV-LacZ infizierte Gehirne wurden auf β-Galactosidase getestet und mit Neutralrot gegengefärbt (nach Lim et al., Biotechniques, 20:460–469 (1996); Keve et al., Neuroscience, 79:435–447 (1997)). Zusammengefasst, es konnten die Gehirnschnitte 2 Stunden in einer Lösung aus 3,1 mM Kaliumferrocyanid, 3,1 mM Kaliumferricyanid, 20 mM MgCl₂, 0,1 M PBS und 0,2 mg/ml X-Gal (Boehringer-Mannheim) reagieren, um die β-Galactosidase Aktivität zu detektieren.
Die Analyse der transgenen Expression in mit HSV-CREB infizierten Gehirnen wurde durchgeführt. Zusammengefasst, es wurden die Schnitte wurden mit 1% H₂O₂ und 0,3% Triton-X für 20 Minuten inkubiert, mit 1% Rinderserumalbumin, 2% normalen Ziegeserum und 0,3% Triton 30 Minuten blockiert und mit dem ersten Antikörper CREB (1:1000; Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) über Nacht bei 4°C mit konstantem Schütteln inkubiert. Die Schnitte wurden mit dem zweiten biotinylierten Ziege-anti-Kaninchen IgG-Antiserum (1:200 Verdünnung; Vector Laboratories, Burlingame, CA) 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Schnitte wurden gewaschen und mit Avidin-Biotin Peroxidase-Komplex (ABC) Reagenz (Vector Laboratories) inkubiert. Die Immunreaktivität wurde mit Hilfe der Diaminobenzidin-(DAB)-Reaktion visualisiert.
BEISPIEL 16 Wirkung des Intertrial-Intervalls zwischen Angstkonditionierungsversuchen auf nachfolgende Langzeitgedächtnis-Levels.
Das mittlere LTM (± SEM; als Angst-verstärkte Schock-Differenzbewertungen abgeschätzt) wurde 48 Stunden nach dem Training abgeschätzt, das aus 4 gekoppelten Lichtschocks mit ITIs von 3 Sekunden, 5 Sekunden, 10 Sekunden, 15 Sekunden, 2 Minuten und 8 Minuten (n = 10, 10, 5, 5 beziehungsweise 15), variiert mit unterschiedlichen ITIs (F_1,49 = 3,04, p < 0,05), bestand. Der LTM-Level ist eine lineare Funktion des ITI mit längeren ITIs, die ein stärkeres LTM produzieren, wie durch den signifikanten linearen Trend (F_14,9 = 7,99, p < 0,05) gezeigt wird. Massed Training (3 Sekunden, 5 Sekunden, 10 Sekunden) produziert ein sehr schwaches LTM (ca. 50 Einheiten). Eine Steigerung des restlichen Intervalls von 10 Sekunden auf 8 Minuten führt zu einem Anstieg des LTM, wie Duncan post-hoc Vergleiche zeigen, dass 8 min. ITI (spaced) ein signifikant größeres LTM produzierte als 10 Sekunden, 5 Sekunden und 3 Sekunden (massed). Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt.
BEISPIEL 17 Wirkung von HSV-Vektor-Infusionen in die basolaterale Amygdala und Nebenbereiche der Amygdala.
Mit HSV-CREB in die basolaterale Amygdala infundierte Ratten (n = 17) zeigten ein signifikant größeres LTM als Ratten, denen ähnlich PBS (n = 7), HSV-LacZ (n = 10) oder HSV-mCREB (n = 11) infundiert wurde oder Ratten (n = 8), denen HSV-CREB in die den basolateralen Komplex der Amygdala umgebenden Gerhirnregionen oder in eine Kontrollregion (Caudatus; n = 5) (F_5,52 = 4,99, p < 0,001) infundiert wurde. Post-hoc Analysen zeigten, dass der LTM-Level in Ratten, die eine HSV-CREB-Infusion in die basolaterale Amygdala erhalten hatten, signifikant höher war als in allen anderen Gruppen.
Die Reaktivität auf Fußschocks unterschied sich nicht von Tieren, die eine HSV-CREB (n = 17), HSV-mCREB (n = 11), HSV-LacZ (n = 10) oder PBS (n = 7) Infusion in die basolaterale Amygdala vor dem massed Training (F_3,41 = 1,41, p > 0,05) verabreicht bekamen. Die mittlere Schockreaktivität wurde mittels Käfigverlagerung für den 200 ms Zeitraum nach jedem der 4 Fußschocks bestimmt.
Ausdrücklich nicht gekoppelte Konditionierung (in der CS (konditionierter Stimulus) und US (unkonditionierter Stimulus) nicht verbunden sind) versagten, ein LTM für die Assoziation in Kontrollratten (n = 10) zu bilden und eine Infusion in die Amygdala mit PBS (n = 5) oder HXV-CREB (n = 5) änderte diesen Sachverhalt nicht (F_2,17 = 0,44, p > 0,05).
Tiere, die HSV-CREB 3 Tage vor dem massed Training (3 d HSV-CREB, n = 10) erhielten, zeigten ein größeres LTM, wenn sie 14 Tage nach der Infusion erneut getestet wurden, als Tiere, die ähnlich mit HVS-LacZ (3 d HSV-LacZ, n = 3) behandelt wurden, oder Tiere, die HSV-CREB 14 Tage vor dem massed Training bekamen und 48 Stunden später (14 d HSV-CREB, n = 4) (F_2,14 = 6,05, p < 0,05) getestet wurden.

Claims

Ein Verfahren zur Identifizierung eines Kandidatengens oder von Kandidatengenen, das/die am Transkriptions-abhängigen Gedächtnis beteiligt ist/sind, und zur Identifizierung, ob das Gen am assoziativen Lernen oder nicht-assoziativen Lernen beteiligt ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Trainieren nicht-humaner Tiere unter Verwendung eines konditionierten Stimulus und eines nicht-konditionierten Stimulus, die zeitlich gepaart sind, um eine Transkriptions-abhängige assoziative Gedächtnisbildung einer spezifischen Versuchsaufgabe in besagten Tieren zu induzieren; (b) Extrahieren von RNA aus Gehirngewebe von besagten in Schritt (a) trainierten Tieren; (c) Synthetisieren von DNA-Sonden unter Verwendung der in Schritt (b) extrahierten RNA; (d) Hybridisieren der in Schritt (c) synthetisierten DNA-Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen auf Microarray-Chips, die DNA-Sequenzen von Genen des Genoms besagter Tiere enthalten, wobei ein Signal nach Hybridisierung besagter Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen erzeugt wird; (e) Detektieren des in Schritt (d) erzeugten Signals; und (f) Durchführen eines statistischen Vergleichs zwischen dem in Schritt (e) detektierten Signal und dem in einer ersten untrainierten Kontrolle für jedes Gen und einer zweiten trainierten Kontrolle für jedes Gen detektierten Signal unter Anwendung eines Signal-Transformationsalgorithmus, wobei besagte erste untrainierte Kontrolle gemäß einem Verfahren erhalten ist, das die Schritte umfasst: (i) Extrahieren von RNA aus Gehirngewebe von nicht-humanen ersten untrainierten Kontrolltieren; (ii) Synthetisieren von DNA-Sonden unter Verwendung der in Schritt (f)(i) extrahierten RNA; und (iii) Hybridisieren der in Schritt (f)(ii) synthetisierten DNA-Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen auf Microarray-Chips, die DNA-Sequenzen von Genen des Genoms von ersten untrainierten Kontrolltieren enthalten, wobei ein Signal nach Hybridisierung besagter Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen erzeugt wird, und wobei besagte zweite trainierte Kontrolle gemäß einem Verfahren erhalten ist, das die Schritte umfasst: 1) Extrahieren von RNA aus Gehirngewebe von nicht-humanen Tieren, die trainiert sind, eine Transkriptions-unabhängige Gedächtnisbildung und nicht-assoziative Transkriptions-abhängige Gedächtnisbildung als Reaktion auf einen konditionierten Stimulus oder einen nicht-konditionierten Stimulus allein oder als Reaktion auf einen nicht-konditionierten Stimulus und einen konditionierten Stimulus, die zeitlich nicht gepaart sind, aber eine nicht-assoziative Transkriptions-abhängige Gedächtnisbildung in besagten zweiten trainierten Kontrolltieren vor Extraktion von RNA aus Gehirngewebe von besagten zweiten trainierten Kontrolltieren zu induzieren; 2) Synthetisieren von DNA-Sonden unter Verwendung der in Schritt (f) 1) extrahierten RNA; und 3) Hybridisieren der in Schritt (f) 2) synthetisierten DNA-Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen auf Microarray-Chips, die DNA-Sequenzen von Genen des Genoms von trainierten Kontrolltieren enthalten, wobei das Signal nach Hybridisierung besagter Sonden an komplementäre DNA-Sequenzen erzeugt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 1, worin besagte nicht-humane Tiere nicht-humane Säuger sind und RNA aus Gehirngewebe (z.B. Amygdala, Hippocampus) besagter Säuger extrahiert ist.
Das Verfahren nach Anspruch 2, worin (a) eine Transkriptions-abhängige assoziative Gedächtnisbildung unter Anwendung eines Shuttle-Box-Vermeidungstrainingsprotokolls induziert ist; oder (b) eine Transkriptions-abhängige assoziative Gedächtnisbildung unter Anwendung eines kontextuellen Angstkonditionierungstrainingsprotokolls induziert ist.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin besagte nicht-humane Tiere Drosophila sind und RNA aus dem Kopfgewebe besagter Drosophila extrahiert ist.