JP4594532B2 - 記憶遺伝子を決定するための遺伝子チップ技術 - Google Patents
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Description
【０００１】
背景技術
ヒトを含む多くの生物が持っている１つの特性は、過去の出来事の記憶である。この特性は、その枝分かれ（ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の多くを説明する現在手に入る多くの情報を用いて、数十年間にわたり研究されてきた。例えば、短期記憶を含む転写非依存性記憶（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｍｏｒｙ）および長期記憶を含む転写依存性記憶（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｍｏｒｙ）という２つの基本的な記憶タイプが同定されている。
【０００２】
これまで比較的知られていなかった記憶の１つの態様は、記憶の発現に貢献する遺伝子の正体である。記憶形成に貢献する遺伝子の正体についての調査はまだ始まったばかりである。記憶形成に関係する遺伝子の同定は、（ａ）認知機能障害の遺伝的疫学、（ｂ）これらの遺伝子の異なる対立遺伝子形態（特定の形態の認識に対する異なるパフォーマンスレベルに関係している）を保持する個体の診断手段および（ｃ）様々な形態の認識機能障害を最終的に改善するための薬物を発見するための新しい標的（および特定の薬物は診断テストによって特定の形態の認識機能障害にマッチし得る）を提供する。このように、記憶形成に関係する遺伝子を同定するために利用できる技術があれば有益であろう。
【０００３】
発明の概要
本発明は、所定の実験プロトコルによって生じさせた記憶形成に対する差次的な影響を用いて、転写依存性記憶形成（特に長期記憶形成）に関与する遺伝子を同定することができるという出願人の知見に関する。任意の２つの実験的プロトコル間の有意差は、転写依存性記憶の誘導にある。比較しようとする任意の具体的な２つのプロトコル間の有意差は、その実験グループにおける転写依存性記憶の誘導および対照グループにおける転写依存性記憶の不在である。
【０００４】
転写非依存性記憶には、短期記憶、中間（中）期記憶および（ハエにおいては）感覚消失抵抗性記憶（ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｅｍｏｒｙ）などの様々な「記憶相」が含まれる。これらの形態に共通していることは、ＲＮＡ転写の薬理学的インヒビターがこれらの記憶を妨げない、ということである。転写依存性記憶は通常は長期記憶と呼ばれ、ＲＮＡ合成のインヒビターはその出現を遮断する。
【０００５】
よって、本発明は、転写依存性記憶（特に長期記憶）に関与する遺伝子を同定する方法であって、（ａ）非ヒト動物（特に非ヒト哺乳動物、他の脊椎動物および無脊椎動物）を、その動物において転写依存性記憶形成を誘導するのに充分な条件下で訓練する工程；（ｂ）工程（ａ）で訓練した動物の脳組織からＲＮＡを抽出する工程；（ｃ）工程（ｂ）で抽出したＲＮＡを用いてＤＮＡプローブを合成する工程；（ｄ）工程（ｃ）で合成したＤＮＡプローブを、その動物のゲノム遺伝子に由来するＤＮＡ配列を含むマイクロアレイチップ上の相補的なＤＮＡ配列に該ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせるのに適した条件下で、該マイクロアレイチップに曝露する工程であって、該プローブが相補的なＤＮＡ配列にハイブリダイズするとシグナルが生成される工程；（ｅ）工程（ｄ）で生成されたシグナルを検出する工程；ならびに（ｆ）工程（ｅ）で検出されたシグナルと対照において検出されたシグナルとの統計的比較を実施する工程を含む方法に関する。
【０００６】
１つの態様において、対照は、（ｉ）適切な条件下において非ヒト対照動物（特に非ヒト哺乳動物、他の脊椎動物および無脊椎動物）を訓練する工程であって、該適切な条件とはその対照動物内で転写依存性記憶形成を誘導するのに不充分な条件である工程；（ｉｉ）工程（ｉ）で訓練した対照動物の脳組織からＲＮＡを抽出する工程；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で抽出したＲＮＡを用いてＤＮＡプローブを合成する工程；および（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で合成したＤＮＡプローブを、その動物のゲノム遺伝子に由来するＤＮＡ配列を含むマイクロアレイチップ上の相補的なＤＮＡ配列に該ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせるのに適した条件下で該マイクロアレイチップに曝露する工程であって、該プローブが相補的なＤＮＡ配列にハイブリダイズするとシグナルが生成される工程を含む方法により得られる。工程（ａ）および工程（ｉ）の実験条件は、（実験）処理ペアを構成する。実験条件における工程（ａ）と工程（ｉ）との有意差は、転写依存性記憶の誘導にある。
【０００７】
第２の態様において、対照は、（ｉ）非ヒト対照動物の脳組織からＲＮＡを抽出する工程；（ｉｉ）工程（ｉ）で抽出したＲＮＡを用いてＤＮＡプローブを合成する工程；および（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で合成したＤＮＡプローブを、その動物のゲノム遺伝子に由来するＤＮＡ配列を含むマイクロアレイチップ上の相補的なＤＮＡ配列に該ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせるのに適した条件下で該マイクロアレイチップに曝露する工程であって、該プローブが相補的なＤＮＡ配列にハイブリダイズするとシグナルが生成される工程を含む方法により得られる。この対照の態様において、対照動物は未処理の（訓練されていない）動物である。
【０００８】
本明細書中で使用される対照動物とは、その動物において転写依存性記憶形成を誘導するのに充分な条件下で訓練される動物と同じ種であって且つ他の全ての点でその動物と同等な（例えば同じ年齢および性別の）動物である。
【０００９】
特定の態様において、ＲＮＡは、訓練された動物または対照動物の扁桃から抽出する。他の態様において、ＲＮＡは、訓練された動物または対照動物の海馬から抽出する。更に他の態様において、ハイブリダイズしたプローブからのシグナルは、検出前に増幅される。他の態様では、工程（ｅ）で検出されたシグナルと、転写依存性記憶ではなく転写非依存性記憶を誘導するのに充分な条件下で対照動物を訓練することによって得られる対照において検出されたシグナルとの統計的比較を実施する。
【００１０】
転写依存性記憶は、特定の実験条件を用いて誘導することができる。１つの態様において、転写依存性記憶は、恐怖増強驚愕応答（ｆｅａｒ−ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｄ ｓｔａｒｔｌｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の間隔訓練プロトコル（ｓｐａｃｅｄ ｔｒａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を用いて、非ヒト動物において誘導される。第２の態様において、転写依存性記憶は、シャトル−ボックス回避プロトコル（ｓｈｕｔｔｌｅ−ｂｏｘ ａｖｏｉｄａｎｃｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を用いて非ヒト動物において誘導される。第３の態様において、転写依存性記憶は、恐怖条件付け文脈プロトコル（ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ ｆｅａｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を用いて非ヒト動物において誘導される。
【００１１】
また本発明は、ショウジョウバエ属において転写依存性記憶に関与する１つまたは複数の遺伝子を同定する方法であって、（ａ）ショウジョウバエを、該ショウジョウバエにおいて転写依存性記憶形成を誘導するのに適した条件下で訓練する工程；（ｂ）工程（ａ）で訓練したショウジョウバエの頭部組織からＲＮＡを抽出する工程；（ｃ）工程（ｂ）で抽出したＲＮＡを用いてＤＮＡプローブを合成する工程；（ｄ）工程（ｃ）で合成したＤＮＡプローブを、該ショウジョウバエのゲノム遺伝子に由来するＤＮＡ配列を含む該マイクロアレイチップ上の相補的なＤＮＡ配列に該ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせるのに適した条件下でマイクロアレイチップに曝露する工程であって、該プローブが相補的なＤＮＡ配列にハイブリダイズするとシグナルが生成される工程；（ｅ）工程（ｄ）で生成されたシグナルを検出する工程；ならびに（ｆ）工程（ｅ）で検出されたシグナルと対照において検出されたシグナルとの統計的比較を実施する工程を含む方法にも関する。
【００１２】
特定の態様において、対照は、（ｉ）適切な条件下において対照ショウジョウバエを訓練する工程であって、該適切な条件とはその対照ショウジョウバエにおいて転写依存性記憶形成を誘導するのに不充分な条件である工程；（ｉｉ）工程（ｉ）で訓練した対照ショウジョウバエの頭部組織からＲＮＡを抽出する工程；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で抽出したＲＮＡを用いてＤＮＡプローブを合成する工程；および（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で合成したＤＮＡプローブを、その対照ショウジョウバエのゲノム遺伝子に由来するＤＮＡ配列を含むマイクロアレイチップ上の相補的なＤＮＡ配列に該ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせるのに適した条件下で該マイクロアレイチップに曝露する工程であって、該プローブが相補的なＤＮＡ配列にハイブリダイズするとシグナルが生成される工程を含む方法に従って得られる。工程（ａ）および工程（ｉ）の実験条件は、（実験）処理ペアを構成する。実験条件における工程（ａ）と工程（ｉ）との有意差は、転写依存性記憶の誘導にある。
【００１３】
第２の態様において、対照は、（ｉ）対照ショウジョウバエの頭部組織からＲＮＡを抽出する工程；（ｉｉ）工程（ｉ）で抽出したＲＮＡを用いてＤＮＡプローブを合成する工程；および（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で合成したＤＮＡプローブを、そのショウジョウバエのゲノム遺伝子に由来するＤＮＡ配列を含むマイクロアレイチップ上の相補的なＤＮＡ配列に該ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせるのに適した条件下で該マイクロアレイチップに曝露する工程であって、該プローブが相補的なＤＮＡ配列にハイブリダイズするとシグナルが生成される工程を含む方法に従って得られる。対照のこの態様において、対照ショウジョウバエは未処理の（訓練されていない）ハエである。
【００１４】
本明細書中に使用される「対照ショウジョウバエ」とは、そのショウジョウバエにおいて転写依存性記憶を誘導するのに充分な条件下で訓練されるショウジョウバエと同じ種であって且つ他の全ての点でそれと同等なショウジョウバエである。
【００１５】
ショウジョウバエにおける転写依存性記憶に関与する１つまたは複数の遺伝子の同定方法の１つの態様では、ＤＮＡプローブを蛍光マーカーで標識し、蛍光アッセイを用いてシグナルを検出する。特定の態様では、ハイブリダイズしたプローブからのシグナルを検出前に増幅する。他の態様では、工程（ｅ）で検出されたシグナルと、転写依存性記憶ではなく転写非依存性記憶を誘導するのに充分な条件下で対照ショウジョウバエを訓練することによって得られた対照において検出されたシグナルとの統計的比較を行う。
【００１６】
転写依存性記憶は、間隔訓練プロトコル（例えば嗅覚的パヴロフの条件付けの一定間隔訓練）を用いてショウジョウバエにおいて誘導することができる。転写非依存性記憶は、集中訓練プロトコル（ｍａｓｓｅｄ ｔｒａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌ（嗅覚的パヴロフの条件付けの集中的訓練）を用いてショウジョウバエにおいて誘導することができる。
【００１７】
転写依存性記憶を誘導するのに充分な条件下で訓練した動物と、転写依存性記憶を誘導するのに不充分な適切な条件下で訓練した対照動物とで、特定の遺伝子の転写レベルにおいて統計的に有意な差があれば、その遺伝子を候補記憶遺伝子（ＣＭＧ）として同定する。特定の態様において、一定間隔で訓練されたグループと集中的に訓練されたグループとの間で、特定の遺伝子の転写レベルにおいて統計的に有意な差があれば、その遺伝子を候補記憶遺伝子として同定する。
【００１８】
転写依存性記憶を誘導するのに充分な条件下で訓練した動物と未処理の（訓練されていない）対照動物との間で、特定の遺伝子の転写レベルに統計的に有意な差があれば、その遺伝子を候補可塑性（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）遺伝子（ＣＰＧ）として同定する。特定の態様において、一定間隔で訓練されたグループと訓練されていないグループとの間で、特定の遺伝子の転写レベルに統計的に有意な差があれば、その遺伝子を候補可塑性遺伝子として同定する。
【００１９】
発明の詳細な説明
特定の「長期記憶」を生じさせるために、動物を、制御された実験条件下で特定の訓練プロトコルに付す。たとえばパヴロフの条件付け手順では、２つの特定の刺激を時間的に連続して提示して、「連想的学習および記憶」を生じさせる。２つの刺激の一方は「条件刺激」（ＣＳ）と呼ばれ、他方は「非条件刺激」（ＵＳ）と呼ばれる。ＵＳは通常、「反射的な」様式による訓練を行う前に「非条件付け応答」（ＵＲ）を惹起する自然強化因子である。ＣＳとＵＳが対になると、ＵＳが提示される前に（またはＵＳの非存在下で）、ＣＳに対して「条件付け応答」（ＣＲ）が出現し始める。特定のＣＳ−ＵＳ対合に対するＣＲが「学習」された後で、記憶形成が始まる。
【００２０】
この特定の実験的経験の記憶形成は２つの一般的形態で存在しうる。すなわち、転写非依存性と転写依存性である。前者としては、短期記憶、中（または中間）期記憶、および（ハエにおける）感覚晶質抵抗性記憶（ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｅｍｏｒｙ）など様々な「記憶相」が挙げられる。これらの型に共通するのは、ＲＮＡ転写を薬理学的に阻害する物質がこれらの記憶を破壊しないということである。後者の型は通常、長期記憶と呼ばれ、ＲＮＡ合成の阻害物質はその出現を遮断する。
【００２１】
動物モデルにおいては、遺伝子突然変異、薬理学的遮断、解剖学的病変、または特定の訓練プロトコルなど様々な実験処理がこれらのタイプの記憶の１つ以上に対して影響を及ぼしうる。とくに、一部の実験処理は、正常量の転写非依存性記憶を引き起こすが、転写依存性記憶は引き起こさない。このような知見は、有益なＤＮＡチップ比較の根拠を成すものである。一般に、２つの実験プロトコルの比較を行う。すなわち、転写非依存性記憶と転写依存性記憶の両者を誘発するのに十分なプロトコル（実験群）と、転写非依存性記憶のみを引き起こすプロトコル（対照群）である。次いで、これらの２つのプロトコルの転写物レベル差が検出可能であれば、実験的に誘発させた学習の転写依存性記憶に特異的に起因するものであると考えられうる。本明細書中では、これらの転写物を「候補記憶遺伝子」（ＣＭＧ）と呼ぶ。
【００２２】
実験条件を制御して特定タイプの学習を誘発させるのであるが、他の実験的非制御型の学習も起こりうる。すなわち、対照群は特定の実験課題の転写依存性記憶を示さない場合もあるが、それにもかかわらず非制御型学習経験の転写依存性記憶を示すことがある。このような経験の１つのタイプとして、ＣＳまたはＵＳ（単独）のみに対して、または時間的に対合されない（これは「連想学習」のカギとなる重要要件である）ＣＳ−ＵＳ提示に対して起こる潜在的「非連想」型の学習がある。すなわち、転写依存性の「非特異的」記憶が上記定義の対照群中に存在しうる。この知見は、「非特異的」学習に関与するより広範なクラスの転写物を生じさせるが、これを我々は候補可塑性遺伝子（ＣＰＧ）と呼ぶ。上記定義の実験群とナイーブ（未訓練）動物のＤＮＡチップ比較を行うと、ＣＰＧがＣＭＧとともに得られる。
【００２３】
ショウジョウバエにおける行動−遺伝学的研究により、パヴロフの臭気（ｏｄｏｒ）−刺激（ｓｈｏｃｋ）学習パラダイム後の記憶形成に様々な影響を及ぼす１対の訓練プロトコルが確立されている。つないで「集中させた」（すなわち、セッション間に休憩間隔を設けない）１０個の訓練セッションは、最大の学習（獲得）と転写非依存性記憶（タンパク質合成に依存しない）（早期記憶、短期記憶）を引き起こす。一方、「間を置いた」（すなわち、セッション間に１５分間の休憩間隔を設ける）１０個の訓練セッションは、同等レベルの学習と転写非依存性記憶（早期記憶）、ならびに最大レベルの転写依存性記憶（タンパク質合成依存型長期記憶（ＬＴＭ）を含む）を引き起こす。ＬＴＭは間隔訓練を必要とする。すなわち、４８個の訓練セッションを集中させたものでもＬＴＭを誘発することができない［テュリーら（Tully et al.）、Cell, 79:35-47 (1994) ］。間隔訓練によって誘発されるタンパク質合成依存型ＬＴＭは、ＣＲＥＢリプレッサーの過剰発現により完全に遮断される（図１）［ユィンら（Yin et al.）、Cell, 79:49-58 (1994) ］。タンパク質合成依存型かつＣＲＥＢ依存型のＬＴＭが遮断される間隔訓練の後に生じる記憶曲線は、正常なハエにおける集中訓練によって生じるものと同様である。一方、ＣＲＥＢアクチベーターが過剰発現されると、より少ない訓練（１つの訓練セッション）または集中訓練でＬＴＭが誘発される（図２）［ユィンら（Yin et al.）、Cell, 81:107-115 (1995) ］。すなわち、ＬＴＭの誘発はタンパク質合成とＣＲＥＢの両者に依存する。これらの結果から、間隔訓練プロトコルと集中訓練プロトコルの間に見られる機能差は、前者の後に転写依存性記憶が出現することだけであることがわかる。
【００２４】
この知見は、転写依存性記憶形成の際に転写的に調節される付加的な「下流」遺伝子を同定するための識別スクリーニングの根拠を成すものである。当該分野において公知の方法［たとえばサムブルークら（Sambrook et al. ）編、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor University Press, New York (1989) ；およびアウスベルら（Ausubel et al.）編、Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1997)参照］に従い、間隔訓練または集中訓練を受けたハエの頭部から抽出したＲＮＡを用いて、ＤＮＡプローブを合成した。ＲＮＡは、既報［たとえばドラインら（Drain et al.）、Neuron. 6:71-82 (1991)参照；この文献の開示内容は引用により本明細書に取り込まれる］に従い、ハエの頭部から抽出した。ハエに対する間隔訓練および集中訓練は、既報［たとえばトゥリーら（Tully et al.）、Cell, 79:35-47 (1994) ；およびトゥリーとクイン（Tully and Quinn ）、J. Comp. Physiol., 157:263-277 (1985) 参照；これらの文献の開示内容は引用により本明細書に取り込まれる］に従い行った。当該分野において公知の方法［たとえばサムブルークら（Sambrook et al. ）編、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor University Press, New York (1989) ；およびアウスベルら（Ausubel et al.）編、Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1997)参照］に従い、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）プローブを抽出ＲＮＡから合成した。次いで、複合ｃＤＮＡプローブ混合物を、１５４２ショウジョウバエ遺伝子のＤＮＡ配列（標的ＤＮＡ配列）を含むマイクロアレイチップ（Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA ；たとえば米国特許第５，４４５，９３４号；およびラムセイ（Ramsay）、Nature Biotechnology, 16:40-44 (1998) も参照されたい；これらの文献の開示内容は引用により本明細書に取り込まれる）にハイブリダイズさせた。特定の態様においては、ＤＮＡプローブを検出可能マーカー（たとえば蛍光マーカー）で標識する。ハイブリダイズしたＤＮＡプローブからのシグナルを、当該分野において公知の方法［たとえばサムブルークら（Sambrook et al. ）編、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor University Press, New York (1989) ；およびアウスベルら（Ausubel et al.）編、Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1997)参照］に従い、増幅および検出した。特定の態様においては、蛍光アッセイを用いてハイブリダイゼーションを検出した。間隔訓練群と集中訓練群の間で検出されたシグナルを比較することによって、統計的比較（ＤＮＡチップ比較）を行った。
【００２５】
間隔訓練群と集中訓練群の転写物レベルのわずかな差を検出する統計的信頼性を向上させる標本数とシグナル変換アルゴリズムが決定されている。好ましい態様においては、各処理プロトコルについて、処理群１つあたり１０個のチップという標本数（各遺伝子について、間隔訓練群では１０個のチップ、集中訓練群でも１０個のチップ）が、間隔訓練群と集中訓練群の転写物レベルのわずかな差を検出する統計的信頼性を向上させる。好ましい態様においては、下記のシグナル変換アルゴリズムを用いて、統計的比較（ＤＮＡチップ比較）を行う。
【００２６】
１．特定の遺伝子に対して１組のプライマー対について検出されるシグナル間の「平均差」を求める。完全にマッチした（ＰＭ）シグナルとミスマッチ（ＭＭ）のシグナルの平均差を、アフィメトリックス社デザイン・ソフトウエア解析法 （Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA ）によって求める。
【００２７】
２．ボックス・コックス変換：
１０未満（ｂｅｌｏｗ）の平均差値があれば排除する。次いで、各チップ上の各遺伝子についての残余平均差値を、当該チップ全体の全体平均差（全ての遺伝子に対する）によって正規化する。
【００２８】
総平均＝全てのチップおよび全ての遺伝子／チップについての全体平均差（Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．）
正規化係数（チップＸの場合）＝チップＸの全体平均差／総平均
正規化（平均差）＝（チップＸの正規化係数）×（チップＸ上の遺伝子Ｙ）
変換後平均差＝｛ｌｎ［正規化（平均差）］｝×２７２０．７５
【００２９】
３．平均と標準誤差を求める。標準ｔ検定（アルファ＝０．０５）を用いて、各遺伝子Ｙについて、間隔訓練を受けたハエと集中訓練を受けたハエの平均を比較する。ｐ≦０．０５の場合には、間隔訓練を受けたハエにおける特定の遺伝子の平均シグナル変換値は、集中訓練を受けたハエにおける当該遺伝子の平均シグナル変換値と統計的に差があるものとみなされる。
【００３０】
あるいは、下記のシグナル変換アルゴリズムを用いて、統計的比較（ＤＮＡチップ比較）を行うこともできる：
【００３１】
１．特定の遺伝子に対して１組のプライマー対で検出されるシグナル間の「平均差」を求める。完全にマッチした（ＰＭ）シグナルとミスマッチ（ＭＭ）のシグナルの平均差を、アフィメトリックス社デザイン・ソフトウエア解析法（Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA ）によって求める。
【００３２】
２．ボックス・コックス変換
特定の遺伝子について負の平均差があればゼロ化する。各チップ上の各遺伝子について「ゼロ化された平均差」（Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．０）を、当該チップ全体の全体「平均差」によって正規化する。
【００３３】
ａ）Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．≧０の場合には、Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．０＝Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．となり、Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．＜０の場合には、Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．０＝０となる。
【００３４】
ｂ）正規化：
総平均＝全てのチップおよび全ての遺伝子／チップについての全体Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．
正規化係数（チップＸの場合）＝チップＸの全体Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．／総平均
正規化（Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．０）＝正規化係数（チップＸの場合）×（チップＸ上の遺伝子Ｙ）（各遺伝子について）
【００３５】
ｃ）変換後Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．＝｛ｌｎ［正規化（Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．０）］｝×２７２０．７５１３６
【００３６】
３．平均と標準誤差を求める。ｔ検定比較により、間隔訓練群の平均と集中訓練群の平均を比較する。ｐ≦０．０５の場合には、間隔訓練を受けたハエにおける特定の遺伝子についての平均シグナル変換値は、集中訓練を受けたハエにおける当該遺伝子についての平均シグナル変換値と統計的に差があるものとみなされる。
【００３７】
間隔訓練群で検出されるシグナルと集中訓練群で検出されるシグナルとの統計的比較（ＤＮＡチップ比較）を行う際、他のシグナル変換アルゴリズムを用いることができる。
【００３８】
これらの専用的な方法を用いて、キイロショウジョウバエについて、１５４２の統計的な間隔訓練対集中的訓練の比較（Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−検定）を決定した。転写依存型記憶形成中にその転写が調節される候補記憶遺伝子（ＣＭＧ）（転位成分やミトコンドリア遺伝子を含まない）を、間隔訓練群と集中訓練群との間のＤＮＡチップ比較（統計的比較）から同定した。別々に調節される転写産物は、パヴロフの臭気−刺激学習パラダイムによって誘導される「連想的」ＬＴＭに特異的に関与するものを表す。
【００３９】
所定の遺伝子に対して１０未満の平均差を間隔対集中比較（２４時間記憶）から削除した、シグナル変換アルゴリズムを用いて統計的分析から決定されたキイロショウジョウバエに由来するＣＭＧを、表１に示す。所定の遺伝子に対する負の平均差を間隔対集中比較（２４時間記憶）からゼロにしたシグナル変換アルゴリズムを用いて統計的分析から決定したキイロショウジョウバエに由来するＣＭＧを、表２に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】
【表２】
【００４２】
上記の統計手法は「統計的候補」を示唆するに過ぎない。使用される統計的方法（および他の同様の方法）の基本的特徴は「真の陽性」と共に「偽陽性」および「偽陰性」候補が得られることである。したがって「統計的候補」には経験依存的な遺伝子転写の変化を検出する独立した方法を適用しなければならない。そのような独立した方法には例えばノーザンブロット解析、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）およびＲＮアーゼ保護アッセイなどが含まれ、同定された統計的候補を裏付けるために使用できる。これらのデータの定量的解析も、偽陽性および偽陰性結果に供される。
【００４３】
本明細書において統計的方法のわずかな変更が「統計的候補」の異なる集合を生じる可能性がある。正規化された差スコアの分布を得るには、多くの場合、1 種類以上の型のデータ変換を行なえば十分である。しかし使用される各データ変換は統計的候補の異なる集合を与えるだろう。またどのシグナル検出法でも、正確に検出するには低すぎる「ベースライン値」を解明しなければならない。そのような値を「ゼロ」に設定するというのがこの問題点に対処する一つの方法である。もう一つの方法はそのような値をデータセットから排除する（例えば１０未満の値を排除する）ことである。
【００４４】
チップデータはどの転写物が記憶に関与するかに関して遺伝子ごとに確証的な情報を与える。チップデータは全遺伝子転写物にわたって様々な刺激に対する正確な協調的転写応答も与える。特にチップデータは遺伝子転写物が記憶に対して持つ協調的効果に関する情報を与える。
【００４５】
ショウジョウバエのほとんどの遺伝子は哺乳類ホモログを持つことが明らかになっており、このことは記憶形成に関与するショウジョウバエ遺伝子の大部分にあてはまる（ＤｕｂｎａｕおよびＴｕｌｌｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２１：４０７−４４４（１９９８））。ショウジョウバエでは哺乳類ホモログによってそのハエホモログを機能的に置換できるという知見が増えつつあるので、この発見は対応する哺乳類ホモログに直結する。
【００４６】
長期記憶に対して間隔訓練と集中訓練がもたらす効果に差があることは、動物界に広く観察される現象である。特に、長期記憶に対する間隔−集中間の効果の差は、最近、条件付け恐怖増強驚愕効果(conditioned fear-potentiated startle effect) に関してラット（哺乳類モデル系）で確立されている。この恐怖増強驚愕パラダイムでは、予めフットショックと組み合わせておいた条件刺激（ＣＳ）の存在下での驚愕の大きさの増大から記憶が推論される。ラットの集中訓練 （１０秒の試行間間隔で４回のＣＳ−ショックの組み合わせ）は転写依存性の記憶を本質的に生成しないが、間隔訓練（８分の試行間隔で４回の組み合わせ）は有意な転写依存性記憶を生じる（図６）（Ｊｏｓｓｅｌｙｎら，Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２４，９２６，Ａｂｓｔｒａｃｔ ３６５．１０（１９９８））。さらに、ウイルスベクター技術によって扁桃（amygdala）に送達されたＣＲＥＢ活性化因子の過剰発現は、ショウジョウバエで観察されたものとまさに類似する形で、集中訓練による記憶を強化する（図７）（Ｊｏｓｓｅｌｙｎら，Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２４：９２６，Ａｂｓｔｒａｃｔ ３６５．１０（１９９８））。これらのデータは、哺乳類ＣＭＧの同定に利用されるＣＲＥＢ依存性の間隔−集中間の差を実証している。
【００４７】
したがってこれらの特定の訓練プロトコルにより、ショウジョウバエで同定されたＣＭＧと類似するＣＭＧが哺乳動物などの動物で得られると予想される。本明細書で使用する「動物」という用語には哺乳動物ならびに他の動物、脊椎動物および無脊椎動物（例えば鳥類、魚類、爬虫類、昆虫（例えばショウジョウバエ属）、アメフラシなど）が包含される。本明細書で使用する「哺乳動物」および「哺乳類」という用語は、子供に授乳し、かつ生児を出産する（真獣類または有胎盤哺乳類）か、産卵する（後獣類または非胎盤哺乳類）、任意の脊椎動物（単孔類、有袋類および有胎盤類を含む）を指す。哺乳類種の例にはヒトおよび他の霊長類（例えばサル、チンパンジーなど）、げっ歯類（例えばラット、マウス、モルモット）および反芻動物（例えばウシ、ブタ、ウマ）などが挙げられる。
【００４８】
非ヒト動物（特に非ヒト哺乳類、他の脊椎動物および無脊椎動物）でのＣＭＧを同定するには、当技術分野で一般に知られている方法に従って間隔訓練または集中訓練を受けた非ヒト動物の脳組織から抽出したＲＮＡを使ってＤＮＡプローブを合成する（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら編，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ ｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９８９）や、Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９９７）を参照されたい）。これらのプローブは検出可能なマーカーで標識することができる。ある態様では、間隔訓練または集中訓練を受けた動物の扁桃から抽出したＲＮＡを使ってＤＮＡプローブを合成し、必要であれば検出可能なマーカーで標識する。当技術分野では蛍光マーカー、化学発光マーカー、ビオチンマーカー、放射性マーカー、酵素的に検出されるマーカーおよび免疫学的に検出されるマーカーなどを含む種々の検出可能なマーカーと標識方法が知られている（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら編，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９８９）や、Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９９７）を参照されたい）。ＲＮＡは当技術分野で利用できる方法によって扁桃などの脳組織から抽出される。動物の間隔訓練と集中訓練は当技術分野で広く知られている方法を使って行なわれる（例えばＪｏｓｓｅｌｙｎら，Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２４：９２６，Ａｂｓｔｒａｃｔ ３６５．１０（１９９８）、ＣａｓｓｅｌｌａおよびＤａｖｉｓ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｅｈａｖ．，３６：３７７−３８３（１９８６）、Ｇｕｚｏｗｓｋｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：２６９３−２６９８（１９９７）、Ｌａｍｐｒｅｃｈｔら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１７（２１）：６４４３−６４５０（１９９７）、Ｂｏｕｒｔｃｈｕｌａｄｚｅら，Ｃｅｌｌ，７９：５９−６８（１９９４）、およびＫｏｇａｎら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，７：１−１１（１９９６）を参照されたい、これらは参照によって本明細書に組み込まれる）。次にこの複合プローブ混合物を、その動物のゲノムの遺伝子のＤＮＡ配列（標的ＤＮＡ配列）を含有するマイクロアレイチップにハイブリダイズさせる（例えば米国特許第５，４４５，９３４号や、Ｒａｍｓａｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：４０−４４（１９９８）を参照されたい、これらは参照によって本明細書に組み込まれる）。ハイブリダイズしたＤＮＡプローブからのシグナルは当技術分野で広く知られている方法によって増幅され、検出される（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら編，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９８９）や、Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９９７）を参照されたい）。例えばハイブリダイゼーション（ハイブリダイズしたプローブからのシグナル）は蛍光アッセイまたは質量分析法を使って検出することができる。光ファイバー、ダイオードアレイ検出、化学発光／発光、ラテックスビーズ凝集、直接電荷変化検出（ＣＣＤ）および圧電読出し装置を使った方法も使用できる。上記のシグナル変換アルゴリズムを使って、間隔訓練群および集中訓練群間の遺伝子発現レベルを計算する。特定の遺伝子に関する間隔訓練群と集中訓練群の間の転写レベルの統計的な有意差によって候補記憶遺伝子が同定される。間隔訓練群と集中訓練群の間の統計的比較（ＤＮＡチップ比較）は、上記のシグナル変換アルゴリズムを使って行なうことができる。
【００４９】
間隔訓練群と集中訓練群の間の統計的比較の他に、他の実験プロトコル対を使って訓練を施した動物間のＤＮＡチップ比較（統計的比較）からＣＭＧを同定することができる。実験群は転写依存性記憶を誘導するのに充分な条件で訓練し、対照群は転写依存性記憶を誘導するには不充分な条件で訓練する。任意の２実験プロトコル間の有意な相違は転写依存性記憶の誘導にある。比較対象の任意の２実験プロトコル間の有意な相違は、実験群での転写依存性記憶の誘導と、対照群での転写依存性記憶の欠如である。
【００５０】
当技術分野では、転写依存性記憶の誘導を主な相違点とする実験プロトコルの対が知られている。例えば転写依存性記憶の誘導を主な相違点とする一対の実験プロトコルは間隔訓練プロトコルと集中訓練プロトコルとからなることができる。この態様では、間隔訓練プロトコルを使った動物の訓練は、その動物に転写依存性記憶を誘導するのに十分である。集中訓練プロトコルを使った動物の訓練は、転写依存性記憶を誘導するには不十分である。もう一つの例として、転写依存性記憶の誘導を主な相違点とする一対の実験プロトコルは、シャトル−ボックス回避プロトコル（特に一試行シャトル−ボックス回避プロトコル）を使った正常（野生型）動物の訓練と、脳弓を外科的に損傷させた動物のシャトル−ボックス回避プロトコルを使った訓練とからなることができる（Ｔａｕｂｅｎｆｅｌｄら，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２（４）：３０９−３１０（１９９９））。この態様では、正常（野生型）動物に転写依存性記憶が誘導される。脳弓が外科的に損傷された動物では転写依存性記憶は誘導されない。さらなる一例として、転写依存性記憶の誘導を主な相違点とする一対の実験プロトコルは、状況判断的恐怖条件付けプロトコル（特に一試行状況判断的恐怖条件付けプロトコル）を使った動物の訓練と、状況判断的恐怖条件付けプロトコルを使った状況判断的恐怖条件付けする前に訓練チャンバーに慣らせた動物の訓練とからなることができる（Ｉｍｐｒｅｙら，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１（７）：５９５−６０１（１９９８））。この態様では、状況判断的恐怖条件付けに先立って訓練チャンバーに慣らせていない動物に転写依存性記憶が誘導される。状況判断的恐怖条件付け前に訓練チャンバーに慣らせた動物では転写依存性記憶が誘導されない。当業者は他の実験プロトコル対を容易に見極めることができる。
【００５１】
ＤＮＡプローブは、本明細書に記載するような実験プロトコル対を使って訓練した動物の扁桃や海馬などといった脳組織から抽出したＲＮＡを使って合成され、必要であれば検出可能なマーカーで標識される。次にそのＤＮＡプローブ混合物を、その動物のゲノムの遺伝子のＤＮＡ配列（標的ＤＮＡ配列）を含有するマイクロアレイチップ上にハイブリダイズさせる。上述したシグナル変換アルゴリズムを使って上記２つの実験プロトコル間でＤＮＡチップデータを比較することにより、統計的比較を行なう。
【００５２】
本明細書中の統計的手法は、訓練群と非訓練（未処置）群の間の転写レベルの差を検出するために使用できる。したがって訓練を受けた動物と訓練を受けていない（未処置）動物との間のＤＮＡチップ比較（統計的比較）から候補可塑性（plasticity）遺伝子（ＣＰＧ）を同定することができる。区別的に調節されるこのクラスの転写物にはＣＭＧと、一般的訓練条件（例えば臭気、電気ショックまたは訓練プロトコルの他の任意の経験的性状（aspects ）の呈示）に対して「非連想的（nonassociative）」な様式で転写的に応答する他の任意の遺伝子とが包含される。単に動物を新しい環境に置くか、動物を刺激のみまたは時間的に対呈示されない刺激にさらすだけで、多少の非特異的転写応答が起こる。これらの転写変化はニューロン活性の一般的（非特異的）増加によって生じるか、一般的訓練条件に関係しない他の形態の学習／記憶形成を反映するのだろう。
【００５３】
所定の遺伝子に関して１０未満の平均差値を削除するシグナル変換アルゴリズムを使った統計的解析によって間隔訓練群と未処置（naive ）群との比較（２４時間記憶）から決定されたショウジョウバエのＣＰＧを表３に示す。所定の遺伝子に関して負の平均差値をゼロとするシグナル変換アルゴリズムを使った統計的解析によって間隔訓練群と未処置群との比較（２４時間記憶）から決定されたショウジョウバエのＣＰＧを表４に示す。
【００５４】
【表３】
【００５５】
【表４】
【００５６】
本発明は、転写依存性記憶（特に長期記憶）に関与する１つまたは複数の遺伝子を同定する方法であって、（ａ）非ヒト動物（特に非ヒト哺乳動物、他の脊椎動物および無脊椎動物）を、その動物に転写依存性記憶（特に長期記憶）を誘導するのに充分な条件で訓練し；（ｂ）工程（ａ）で訓練した動物の脳組織（例えば扁桃、海馬など）からＲＮＡを抽出し；（ｃ）工程（ｂ）で抽出したＲＮＡを使ってＤＮＡプローブを合成し；（ｄ）工程（ｃ）で合成したＤＮＡプローブを、そのＤＮＡプローブがマイクロアレイチップ上の相補的ＤＮＡ配列にハイブリダイズするのに適する条件で上記動物のゲノムの遺伝子に由来するＤＮＡ配列を含有するマイクロアレイチップにばく露し、ここで、プローブが相補的ＤＮＡ配列にハイブリダイズするとシグナルが生成する；（ｅ）工程（ｄ）で生成したシグナルを検出し；ならびに（ｆ）工程（ｅ）で検出したシグナルと、対照で検出されるシグナルとの統計的比較を行なうことからなる方法を提供する。
【００５７】
一態様として、対照は、（ｉ）非ヒト対照動物（特に非ヒト哺乳動物、他の脊椎動物および無脊椎動物）を、その対照動物に転写依存性記憶を誘導するには不十分である適当な条件で訓練し；（ｉｉ）工程（ｉ）で訓練した対照動物の脳組織からＲＮＡを抽出し；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で抽出したＲＮＡを使ってＤＮＡプローブを合成し；ならびに（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で合成したＤＮＡプローブを、そのＤＮＡプローブがマイクロアレイチップ上の相補的ＤＮＡ配列にハイブリダイズするのに適する条件で上記動物のゲノムの遺伝子に由来するＤＮＡ配列を含有するマイクロアレイチップにばく露する、ここで、プローブが相補的ＤＮＡ配列にハイブリダイズするとシグナルが生成する、ことからなる方法によって得られる。工程（ａ）と工程（ｉ）の実験条件は一対の（実験的）処置を構成する。工程（ａ）と工程（ｉ）の実験条件間の有意な相違は転写依存性記憶の誘導にある。
【００５８】
第２の態様として、対照は、（ｉ）非ヒト対照動物の脳組織からＲＮＡを抽出し；（ｉｉ）工程（ｉ）で抽出したＲＮＡを使ってＤＮＡを合成し；ならびに（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で合成したＤＮＡプローブを、そのＤＮＡプローブがマイクロアレイチップ上の相補的ＤＮＡ配列にハイブリダイズするのに適する条件で上記動物のゲノムの遺伝子に由来するＤＮＡ配列を含有するマイクロアレイチップにばく露する、ここで、プローブが相補的ＤＮＡ配列にハイブリダイズするとシグナルが生成する、ことからなる方法によって得られる。この対照の態様では、対照動物は未処置（訓練されていない）動物である。
【００５９】
本明細書にいう対照動物とは、その動物に転写依存性記憶形成を誘導するのに充分な条件で訓練を受ける動物と同じ種に属し他の点では同等な（例えば年齢、性別などが同等な）動物である。
【００６０】
転写依存性記憶は特定の実験条件を使って誘導することができる。ある態様では恐怖増強驚愕応答の間隔訓練プロトコルを使って非ヒト動物に転写依存性記憶が誘導される。第２の態様ではシャトル−ボックス回避プロトコルを使って非ヒト動物に転写依存性記憶が誘導される。第３の態様では状況判断的恐怖条件付けプロトコルを使って非ヒト動物に転写依存性記憶が誘導される。
【００６１】
本発明を以下の実施例によって説明するが、本発明が以下の実施例により何らかの形で限定されるとみなしてはならない。
【００６２】
実施例
実施例１ ｎａｌｙｏｔ P1 の単離
Ｘ連鎖ＰｌａｃＷトランスポゾン（Ｂｉｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０（４８５４）：９１３−９１６（１９８８））を可動化して、第２および第３染色体に個別の挿入物を持つ２，１８２株のトランスポザント（ｔｒａｎｓｐｏｓａｎｔ）株を生成した（ＢｏｙｎｔｏｎおよびＴｕｌｌｙ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３１：６５５−６７２（１９９２）；Ｄｕｒａら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｇｅｎｔ．，９：１−１４（１９９３）参照）。１回のパヴロフ嗅覚学習セッション訓練後の３時間記憶を、これらのトランスポザント株のそれぞれについて１パフォーマンスインデックス（ＰＩ）で定量した。次にスコアが野生型親株［ｗ1118（ＣＳ１０）］の７０％以下だった株についてＮ＝４ ＰＩを作製した。スクリーニングのこの段階で９３株の突然変異株が野生型親株の７０％以下の平均３時間記憶スコアを与えた。次にこれらの候補突然変異体株のそれぞれを５世代にわたって親株に異系交配してそれらの（不均質な）遺伝的背景を平衡化した。これらの異系交配株で再び３時間記憶を定量（Ｎ＝４ ＰＩ）したところ、９３株の候補突然変異体のうち８株だけがなお野生型の７０％未満の平均スコアを与えた。最後にこれらの８つの突然変異体株で「課題関連（task relevant ）」感覚運動課題をアッセイした。８株全てが正常なショック反応性を示し、ＧB ３３５とＥJ ５１、ＥJ ２２０とＥS １５２の４株は嗅覚の鋭さの有意な低下を示した（ＢｏｙｎｔｏｎおよびＴｕｌｌｙ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３１：６５５−６７２（１９９２）、Ｄｕｒａら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｇｅｎｔ．，９：１−１４（１９９３）［ＧB ３３５は現在ｄａｒｅと呼ばれており、さらなる研究が行なわれた。これは触角での選択的発現を示す（Ｆｒｅｅｍａｎら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２６：４５９１−４６０２（１９９９））］）。残り４株の突然変異株は正常な感覚運動応答を示し、ｌａｔｈｅｏ（ＢｏｙｎｔｏｎおよびＴｕｌｌｙ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３１：６５５−６７２（１９９２）、Ｐｉｎｔｏら，Ｎｅｕｒｏｎ，２３：４５−５４（１９９９）、Ｒｏｈｒｂｏｕｇｈら，Ｎｅｕｒｏｎ，２３：５５−７０（１９９９））、ｌｉｎｏｔｔｅ（Ｄｕｒａら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｇｅｎｔ．，９：１−１４（１９９３）、Ｂｏｌｗｉｇら，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：８２９−８４２（１９９５）、Ｓｉｍｏｎら，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．，７６：４２−５５ （１９９８））、ｇｏｌｏｖａｎおよびｎａｌｙｏｔと名付けられた。
【００６３】
実施例２ ｎａｌｙｏｔゲノム領域のクローニングと特徴づけ
ＰｌａｃＷトランスポゾンはユニークなＳａｃＩＩ制限部位を含み、その後ろに細菌の複製起点とアンピシリン耐性遺伝子が続いている（図８）。ＳａｃＩＩによるｎａｌｙｏｔ（ｎａｌ）ゲノムＤＮＡの消化、希薄条件でのライゲーションおよび細菌形質転換により、ゲノム領域に由来する隣接ＤＮＡを伴なった９．４ｋｂのＳａｃＩＩ制限断片のプラスミドレスキューを行なうことができた。染色体インサイチューおよびサザンブロッティング実験により、この断片がＰ−挿入部位と同位置にマッピングされることを確認した。放射標識したレスキュー断片を使って１００万プラークのラムダ−ＤａｓｈＩＩショウジョウバエＣａｎ−Ｓゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をスクリーニングした。１０個の独立したゲノムクローンを単離し、サブクリーニングし、制限酵素解析することにより、Ｐ−エレメント挿入部位付近のゲノム領域をまたぐ３５ｋｂの地図を構築した（図８）。
【００６４】
ａｄｆ１およびｃｎ２０転写単位のイントロン／エキソン地図を図８に示す。ｎａｌ P1 因子（矢印）はａｄｆ１転写単位のイントロン内、スプライス供与部位の１４７ｂｐ下流に挿入される。ａｄｆ１遺伝子はｍｙｂファミリーと遠い類縁関係にある転写因子をコードし（Ｅｎｇｌａｎｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６８３−６８７（１９９２））、（少なくとも）２種類のｍＲＮＡに択一的にスプライスされる。ｉ１とｉ２は２つの潜在的翻訳開始部位に相当する。さらに２つの約３．５ｋｂと５９ｂｐのイントロンが構成的にスプライスされ、ａｄｆ１転写単位の残りの部分を２７４ｂｐと１０１３ｂｐのエキソンに分離しているようである。ｃｎ２０遺伝子は新規であり、３９５アミノ酸タンパク質コードできる一本のスプライスされない転写物を産生する。ｎａｌ ie60 中のゲノム欠失の程度を示す。制限部位：Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｈ、ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｓ、ＳａｃＩＩ。
【００６５】
実施例３ 突然変異体ｎａｌ P1 と野生型のハエにおけるａｄｆ１およびｃｎ２０のノーザンブロット解析ならびにｃＤＮＡ単離
ハエ成虫全身、成虫頭部または成虫胴体（ｂｏｄｙ）の全ＲＮＡをＴｒｉＺＯＬ試薬（ＢＲＬ）を使って単離した。次にオリゴ（ｄＴ）セルロース（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）または磁化オリゴ（ｄＴ）ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を使ってポリ（Ａ）画分を精製した。精製ポリ（Ａ）ＲＮＡをホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動で分画し、１０×ＳＳＣ中でＺｅｔａＰｒｏｂｅナイロン膜（ＢｉｏＲａｄ）に転写した。乾燥した膜上のＲＮＡを２，５００マイクロジュール（ujoules ）でＵＶ架橋することによって固定した（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）。転写物クラスの一次同定のために、ＣｈｕｒｃｈとＧｉｌｂｅｒｔの高ストリンジェンシー緩衝液中で膜ストリップを放射標識ゲノムＤＮＡ断片で終夜プローブし、Ｋｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘフィルムに露光した。
【００６６】
選択したプローブを２つのショウジョウバエ成虫頭部ｃＤＮＡライブラリー、すなわちラムダｇｔ１１バクテリオファージ成虫頭部ライブラリー（Ｓａｌｖａｔｅｒｒａ）とｐＪＧ４−５プラスミドライブラリー（Ｒｏｓｈｂａｓｈ）にハイブリダイズさせた。これらの２つのライブラリーから２つの独立した転写単位に対応する合計１１個のクローンを単離し、制限酵素解析によって評価した。１０個のクローンがａｄｆ１転写単位に対応した。これらのサブセットを制限酵素マッピングし配列解析することにより、共通する３’末端プロセシング部位と５’末端の不均一性が明らかになった。５’不均一性はイントロン１（１１４ｂｐ）の部分的スプライシングと、おそらくは不完全な第１鎖合成とを反映したものである。１つのクローン（ｃｎ２０）は独立した隣接する転写単位に対応した。
【００６７】
ａｄｆ１およびｃｎ２０ ＲＮＡレベルに対するＰ−挿入の影響を定量するために、ａｄｆ１、ｃｎ２０および対照ＲＮＡ ｒｐ４９に対応する放射標識プローブを使って、ｎａｌ P1 および野生型の頭部または胴体から得たノーザンブロットを上述のように解析した。
【００６８】
ｒｐ４９ ＲＮＡの対照レベルと比較して、ｃｎ２０ ｍＲＮＡ発現レベルは頭部でも胴体でも野生型のハエと突然変異型のハエでほぼ同等だった。これに対し、ａｄｆ１ ｍＲＮＡ発現レベルは突然変異体の頭部および胴体では少なくとも２倍減少していた。
【００６９】
実施例４ 抗体産生
全ＡＤＦ１オープンリーディングフレームをｐＥＴ３０（ａ）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にＣ末端融合物として挿入した。ＡＤＦ１融合タンパク質の強いＩＰＴＧ誘導を形質転換したＢＬ２１細菌で得た。誘導タンパク質の大部分は不溶性の封入体画分にあり、この画分（誘導の３時間後に単離）はＡＤＦ１融合タンパク質が８５％近くに濃縮されていた。この画分をＰＢＳで十分に洗浄し、抗原として直接使用した。マウスのポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を標準的方法で得た（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州プレーンビュー（１９９８））。３匹のマウスに５０μｇの封入体画分を（完全フロイントアジュバントと混合して）接種した後、２週間毎に５０μｇの封入体画分を不完全フロイントアジュバントと混合して追加免疫した。３匹のマウスはすべて強い免疫応答を示し、１匹をハイブリドーマ融合のために屠殺した。８００個の候補ハイブリドーマ株のうち、１７株がＡＤＦ１ドットブロット検定で応答を示した。次にその１７株をウェスタンブロットおよび免疫化学アッセイで評価することにより、ＭＡｂ ＡＤＦ１−８とＭＡｂ ＡＤＦ１−１７を含む１０株のモノクローナル株を単離した。
【００７０】
実施例５ 変異体ｎａｌP1および野生型ハエにおけるＡＤＦ−１タンパク質レベルのウェスタンブロット解析
上記のように（Ｙｉｎら、Ｃｅｌｌ、７９、４９〜５８、（１９９４））凍結頭部または胴部を単離し、５００μｌのＲＩＰＡ緩衝液中での１００μｌの凍結頭部粉末のホモゲナイズによって抽出物を調製した。タンパク質濃縮物を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイによって測定した。タンパク質サンプルを、標準的なローディング色素中で変性させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、１００ｍＡで２時間電気泳動によってニトロセルロースメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。各メンブレンを、ＰＢＳＴ＋５％ミルク中で４℃で一晩ブロックし、ＰＢＳＴ＋５％ミルク中で１〜２時間一次抗体とインキュベートした。使用した一次抗体は、ａｄｆ１に対するマウスポリクローナル血清（１：１０００）、ａｄｆ１に対するマウスモノクローナル上清（Ｍａｂ Ａｄｆ１−１７）（１：２０）、ＴＢＰに対するマウスモノクローナル上清（１：５）、およびａ−チューブリンに対するマウスモノクローナル腹水（１：５０，０００）（Ｓｉｇｍａ）であった。メンブレンをＰＢＳＴ中で充分に洗浄し、ＨＲＰ結合抗ＩｇＧ二次抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１：５００）と１〜２時間インキュベートした。ＰＢＳＴ中での充分な洗浄後、結合産物を、強化化学発光（Ｐｉｅｒｃｅ ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＵＬＴＲＡ基質）およびオートラジオグラフィーによって視覚化した。
【００７１】
他の２つのタンパク質（ＴＡＴＡ結合タンパク質およびα−ＴＵＢＵＬＩＮ）の対照レベルと比較して、ＡＤＦ１発現は、変異体ハエにおいて少なくとも２倍減少した。
【００７２】
実施例６ 野生型ハエと１遺伝子変異体ｎａｌｙｏｔとの間のＤＮＡチップデータセットの比較
正常な（野生型）ハエと１遺伝子変異体ｎａｌｙｏｔとの間のＤＮＡデータセットを比較した。ｎａｌｙｏｔ変異体は、集中訓練後に正常な記憶を有することが認められるが、間隔をおいた訓練によってＬＴＭは誘導されなかった。さらに、ｎａｌｙｏｔ変異は、Ａｄｆ１遺伝子中のトランスポゾン挿入物として同定され、その効果は、変異体ハエ頭部中のＡｄｆ１転写物およびタンパク質の量の減少である。
【００７３】
全てのベースライン値を０に設定し、次いでデータを解析した場合、Ａｄｆ１遺伝子についての野生型ハエとｎａｌｙｏｔ変異体との間に有意な相違は検出されなかった。しかし、（０に設定した場合より）１０以下のベースライン値を分析から削除した場合、Ａｄｆ１転写に対する有意な効果が検出され、これは、実施例３に記載のノーザン分析によって得られた結果を確証するものである。この結果は、データセットから１０未満の平均差を削除する統計学的アプローチの有意な証拠である。
【００７４】
実施例７ 定量的ポリメラーゼ連鎖反応
所与のハエ群を、特定の訓練プロトコル（間隔をあけるまたは集中）に供し、訓練後通常の食品バイアルに保存する。訓練から２４時間後、所与の訓練プロトコル（間隔をあけるまたは集中）の異なる群由来のハエを１つの５０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブに回収し、液体窒素中で急速冷凍する。凍結ハエの頭部を、強い機械的震盪によって胴部から分離する。次いで、凍結して分離した胴部を、一連のふるいにかけて最終的にハエ頭部の均一な集団を得る。
【００７５】
訓練群（間隔または集中）由来の頭部を合わせ、８つの群に分ける。各頭部群を、次いで乳鉢および乳棒で粉末に磨砕する。粉末を５ｍｌのＴｒｉｚｏｌ溶液（Ｇｉｂｃｏ）に移し、−７０℃で一晩保存する。
【００７６】
ついで、凍結Ｔｒｉｚｏｌ／ハエ粉末溶液を解凍する。２ｍｌのクロロホルムを添加する。混合物を、４℃、３，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。抽出ＲＮＡ（水層中）を、新しいチューブにデキャントし、１．４ｍｌのイソプロパノールを添加する。
【００７７】
ＱＰＣＲのために、上記溶液のアリコートを、４℃、８０００ｒｐｍで２０分間スピンする。イソプロパノールをデキャントし、ペレットを７０％エタノールで１回洗浄する。ペレットを、１００μｌのＨ2 Ｏ中に再懸濁し、同体積のフェノール／クロロホルム（Ｇｉｂｃｏ）を添加する。溶液を、４℃、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上部の水層を新しいチューブにデキャントする。６μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと共に２００μｌの氷冷エタノールを添加する。溶液を、−２０℃で少なくとも２０分間インキュベートする。
【００７８】
次いで、溶液を、４℃、１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。ペレットを、２０μｌのＨ2 Ｏ中に再懸濁し、ＲＱＩ Ｒｎａｓｅ無含有ＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に供する。ＲＮＡ濃度を測定する。
【００７９】
ついで、１μｇの無ＤＮＡｓｅ ＲＮＡサンプルから第１鎖ｃＤＮＡを合成し、「ＣＹＢＲ」サイバーグリーン蛍光検出器を具備した７７００ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍを用いてＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓプロトコルにしたがって、ＱＰＣＲアッセイを行う。
【００８０】
実施例８ 統計学的候補記憶遺伝子Ｃ／ＥＢＰ
２２１ｂｐの予想フラグメントが得られる、Ｑｕａｎｔａｇｅｎｅ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）によって設計された以下のＣ／ＥＢＰプライマーを、ＱＰＣＲ実験に使用し、２２１ｂｐの大きさの予想した断片を得た：５’−ＡＧＡＣＴＡＣＣＧＡＴＧＣＧＡＡＣＡＡＣ−３’（配列番号：１）および３’−ＧＴＣＣＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＣＧＴＣＴＡ−５’（配列番号：２）。
【００８１】
Ｃ／ＥＢＰデータのために、ハエを間隔訓練または集中訓練に供した２４時間後に約１０，０００個のハエの頭部から８つの複製ＲＮＡ抽出物を得た。各ＲＮＡ抽出部についてのＱＰＣＲ反応を、実施例７に概説の方法にしたがって三連で行った。
【００８２】
各Ｃ／ＥＢＰ反応の結果を、ＴＢＰββ（これらの状況で転写の変化が認められない対照遺伝子）についての一対のＱＰＣＲ反応に対するＲＮＡ量について規準化した。
【００８３】
この方法で分析して、臨界値に達するのに必要な平均Ｃ／ＥＢＰ増幅サイクル数は、間隔をあけた群では２１．８６±０．５６であり、集中群では２３．７８±０．５６であった。間隔をあけた群のほうが臨界値に達するための増幅サイクル数が少ないことから、これは、ＰＣＲ増幅の初期段階でＣ／ＥＢＰ濃度がより高いことを示す。
【００８４】
これらのデータは、Ｃ／ＥＢＰレベルが集中訓練群より間隔をあけた訓練群の方が３．７８倍高いことを示す（図５）。実験結果により、間隔をあけた訓練ハエと集中訓練ハエから単離したＣ／ＥＢＰ（緩徐境界（slow border ）細胞と呼ばれる、ショウジョウバエにおけるｓｌｏｂｏ）転写物が有意に異なることが確認された。マウスにおけるＣ／ＥＢＰの遺伝子操作により、長期記憶が促進され（Ｓｔｅｒｎｅｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５（１８）、１０９０８〜１０９１３、（１９９８））、ＡｐｌｙｓｉａにおけるＣ／ＥＢＰの分子操作によって長期促進（facilitation）（感作の長期記憶用の細胞基質）がブロックされる（Ａｌｂｅｒｉｎｉら、Ｃｅｌｌ、７６、１０９９〜１１１４、（１９９４））。したがって、本明細書中でＣＭＧとしてのＣ／ＥＢＰの確認は、記憶に関する転写物の同定にこのＤＮＡチップアプローチを使用することができる有意な確認法である。
【００８５】
実施例９ 訓練装置
実験を経験していないの雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（３００〜３５０ｇ）を、減音チャンバー中に設置した５つの同一のプレキシガラスおよびワイヤーメッシュケージ（８×１５×１５ｃｍ）中で訓練および試験した（ＣａｓｓｅｌｌａとＤａｖｉｓ、Ｐｈｙｓｉｏ．Ｂｅｈａｖ．、３６、３７７〜３８３、（１９８６））。驚愕惹起刺激は、５５ｄＢの背景ホワイトノイズに対して１０５ｄＢであった（５０ｍｓのホワイトノイズの群発（上昇−減衰時間は５ｍｓ））。８Ｗの蛍光電球によって、３．７秒の光ＣＳを得た（上昇−減衰時間１００μｓ、ＢＣＯフットランベルト（footlamberts）強度）。各ケージの床は、０．５ｓで０．６ｓまたは０．３ｍＡの周波数帯変換（scrambled ）フットショックを供給することができる４つのステンレススチールバーからなった。
【００８６】
実施例１０ 行動訓練法
全ての訓練の２日前の各日に、ラットを、驚愕チャンバー中に入れ、１５分後に１５回の驚愕刺激を与えた。Ｅｘｐ．１の単回訓練日に、動物を驚愕チャンバーに入れ、５分後に以下の試行間隔（ＩＴＩ）の１つで４回の光−ショック対を与えた：３秒間、５秒間、１０秒間、１５秒間、２分間、または８分間。最後の光−ショック対から５分後、動物を元のケージに戻した。４回のショック対間のＩＴＩがそれぞれ１０秒間および８分間である以外は対の集中訓練および間隔をあけた訓練を同様に行った。明らかに対ではない集中訓練試験は、光の集中投与（４回、１０秒間のＩＴＩ）およびその４分後のショックの集中投与（４回、１０秒間のＩＴＩ）とした。
【００８７】
実施例１１ 長期記憶試験
訓練から４８時間後、ラットを驚愕装置に置き、３０回の驚愕惹起刺激のみおよびその後に６０回の驚愕惹起刺激（半分は３．７秒の発光後３．２秒間行い（光−ノイズ試験）、半分は暗所に置いた（ノイズのみの試験））を与えた。２つの試験型の順番は不規則であった。３０秒の刺激間隔ですべての驚愕刺激を与えた。ＬＴＮの指標として使用する恐怖増強驚愕の差スコアを、３０回の光−ノイズ試験で得られた平均驚愕振幅（amplitudes）から３０回のノイズのみの試験から得られた平均驚愕振幅を引くことによって計算した。
【００８８】
実施例１２ 短期記憶試験
短期記憶（ＳＴＭ）試験は、訓練後１５〜４０分間で行われる以外はＬＴＭ試験と類似していた。２０回のノイズのみの刺激後、１５回の光−ノイズ刺激および１５回のノイズみの刺激を混合して与えた。恐怖増強驚愕の差スコアを、平均光−ノイズスコアからノイズのみのスコアを引くことによって計算し、これをＳＴＭの指標として使用した。
【００８９】
実施例１３ 手術
ラットを硫酸アトロピン（０．４ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で前処理し、ペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔し、標準的な定位固定装置に置いた。薬物注入ポンプに取り付けたハミルトンマイクロシリンジ（１０μｌ）を、注入に使用した。ＰａｘｉｎｏｓとＷａｔｓｏｎ（「定位調整でのラット脳（The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ、Ｓｙｎｄｎｅｙ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ、１９８６）にしたがって、扁桃の外側核（頭蓋骨表面下でＡＰ＝−２．８、Ｌ＝±５．２、ＤＶ＝−８．５に調整（coordinates ））または尾状核（ＡＰ＝＋０．２、Ｌ＝±３．０、ＤＶ＝−６．０に調整）を対象として、３０ゲージのカニューレを介した両側微量注入（２μｌ）により１０分間送達させた。拡散を確実にするために、注入カニューレをさらに１０分間放置した。
【００９０】
実施例１４ ウイルスの調製
ＣＲＥＢおよびｍＣＲＥＢ ｃＤＮＡ（Ｍ．Ｅ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから得た）およびＬａｃＺを、ＨＳＶアンプリコンＨＳＶ−ＰｒｐＵＣに挿入し、ヘルパー５ｄｌ １．２を用いて封入した（Ｌｉｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０、４６０〜４６９（１９９６）、Ｋｅｖｅら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、７９、４３５〜４４７（１９９７））。ウイルスを、スクロース勾配で精製し、ペレット化し、１０％スクロース中に再懸濁した。組換えウイルスストックの平均力価は、４．０×１０7 感染単位／ｍｌであり、ＨＳＶ−ＣＲＥＢおよびＨＳＶ−ｍＣＲＥＢと類似した。導入遺伝子発現を、ＨＳＶ即時型遺伝子ＩＥ−４／５の構成プロモーターによって制御した。
【００９１】
実施例１５ 免疫化学
ラットに抱水クロラールを過剰投与し、５０ｍｌのＰＢＳおよび２５０ｍｌの４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液で灌流した。脳を凍結防止して、ミクロトーム上で切断し（４０μｍ切片）、浮動性切片に免疫細胞化学法を行った。ＨＳＶ−ＬａｃＺを感染させた脳は、β−ガラクトシダーゼに反応し、ニュートラルレッドで対比染色した（Ｌｉｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０、４６０〜４６９（１９９６）、Ｋｅｖｅら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、７９、４３５〜４４７（１９９７）に従う）。簡単に述べれば、β−ガラクトシダーゼ活性を検出するために、脳のスライスを３．１ｍＭフェロシアン化カリウム、３．１ｍＭフェリシアン化カリウム、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１Ｍ ＰＢＳ、および０．２ｍｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌから構成される溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中で２時間反応させた。
【００９２】
ＨＳＶ−ＣＲＥＢ感染脳における導入遺伝子発現の分析を行った。簡単に述べれば、切片を、１％Ｈ2 Ｏ2 および０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘと２０分間インキュベートし、１％ウシ血清アルブミン、２％ヤギ正常血清、および０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで３０分間ブロックし、一次抗体ＣＲＥＢ（１：１０００、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）と４℃で一定で撹拌しながら一晩インキュベートした。切片を、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗血清（１：２００希釈、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）と室温で２時間インキュベートした。切片をリンスし、アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ）試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とインキュベートした。免疫反応性を、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）反応を用いて視覚化した。
【００９３】
実施例１６ その後の長期記憶レベルに対する恐怖条件付け試行間の試行間隔の影響
３秒間、５秒間、１０秒間、１５秒間、２分間、および８分間（それぞれｎ＝１０、１０、１０、５、５、１５）のＩＴＩでの４回の光−ショック対からなる訓練から４８時間後に評価した平均ＬＴＭ（±ＳＥＭ、恐怖増強驚愕差スコアとして評価）は、ＩＴＩによって変化した（Ｆ1.49＝３．０４、ｐ＜０．０５）。有意な線形トレンド（Ｆ1.49＝７．９９、ｐ＜０．０５）によって示されるように、ＬＴＭレベルは、ＩＴＩとより強いＬＴＭが得られるより長いＩＴＩとの一次関数である。集中訓練（３秒間、５秒間、１０秒間）により、非常に弱いＬＴＭ（約５０ユニット）が得られた。その後のダンカン比較によって８分間のＩＴＩ（間隔をあけた群）は、１０秒間、５秒間、および３秒間（集中群）よりも有意に強いＬＴＭが得られることが明らかとなったことから、１０秒間から８分間に休憩時間が増加するとＬＴＭは増加する。結果を、図６に示す。
【００９４】
実施例１７ 基底外側扁桃および扁桃外領域へのＨＳＶベクターの注入効果
基底外側扁桃にＨＳＶ−ＣＲＥＢを注入したラット（ｎ＝１７）は、ＰＢＳ（ｎ＝７）、ＨＳＶ−ＬａｃＺ（ｎ＝１０）、もしくはＨＳＶ−ｍＣＲＥＢ（ｎ＝１１）を同様に注入したラット、または扁桃の基底外側複合体周囲の脳領域（ｎ＝８）もしくは対照領域（尾状核、ｎ＝５）にＨＳＶ−ＣＲＥＢを注入したラットよりも有意に高いＬＴＭを示した（Ｆ5.52＝４，９９、ｐ＜０．００１）。分析後、基底外側扁桃にＨＳＶ−ＣＲＥＢ注入を受けたラットのＬＴＭレベルは、全ての他の群よりも有意に高いことが明らかとなった。
【００９５】
フットショックに対する反応性は、集中訓練前に基底外側扁桃にＨＳＶ−ＣＲＥＢ（ｎ＝１７）、ＨＳＶ−ｍＣＲＥＢ（ｎ＝１１）、ＨＳＶ−ＬａｃＺ（ｎ＝１０）、またはＰＢＳ（ｎ＝７）を注入した動物で異ならなかった（Ｆ3.41＝１．４１、ｐ＞０．０５）。平均刺激反応性を、それぞれ４回のフットショック後２００ｍｓの間、ケージを置換することによって評価した。
【００９６】
明らかに対ではない条件付け（ＣＳ（条件刺激）およびＵＳ（無条件刺激）が関連しない）では対照ラット（ｎ＝１０）に関連するＬＴＭは得られず、ＰＢＳ（ｎ＝５）またはＨＳＶ−ＣＲＥＢ（ｎ＝５）の扁桃内注入によってＬＴＭは変化しなかった（Ｆ2.17＝０．４４、ｐ＞０．０５）。
【００９７】
注入から１４日後に再試験した場合、集中訓練の３日前にＨＳＶ−ＣＲＥＢを投与した動物（３ｄ ＨＳＶ−ＣＲＥＢ、ｎ＝１０）は、ＨＳＶ−ＬａｃＺで同様に処理した動物（３ｄ ＨＳＶ−ＬａｃＺ、ｎ＝３）または集中訓練の１４日前にＨＳＶ−ＣＲＥＢを投与して４８時間後に試験した動物（１４ｄ ＨＳＶ−ＣＲＥＢ、ｎ＝４）より高いＬＴＭを示した（Ｆ2.14＝６．０５、ｐ＜０．０５）。
【００９８】
本明細書中で引用した全ての論文、特許、および特許出願の教示は、その全体が参考として援用される。
【００９９】
本発明は、好ましい態様について特に表示および記載しているが、添付の特許請求の範囲に定義の本発明の精神および範囲を逸脱することなく形態および内容について種々の変更を行うことができることが当業者に理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ハエにおいてパヴロフの嗅覚学習を行う、Ｔｕｌｌｙら，Ｃｅｌｌ，７９：３５−４７（１９９４）に記載された訓練プロトコルの模式図である。
【図２】 図２は、ＣＲＥＢリプレッサーの発現を誘導した後に、正常な（野生型）ハエにおいて一定間隔でまたは集中的に訓練を行った後、またはトランスジェニックｈｓ−ＣＲＥＢ２−ｒハエにおいて一定間隔訓練を行った後の、記憶保持を示す結果のグラフ図である（Ｙｉｎら，Ｃｅｌｌ，７９；４９−５８（１９９４）を参照されたい）。学習および早期記憶（シクロヘキシミド非感受性）は、トランスジェニックハエにおいては正常である。一定間隔訓練によって通常生じる追加的な（タンパク質合成依存性ＬＴＭ）記憶は、トランスジェニックハエにおいてブロックされる。この比較により、一定間隔訓練と集中訓練との唯一の差は、前者の後の転写依存性記憶の出現であることが明らかになる。
【図３】 図３は、特定の遺伝子の特定のセクションに完全にマッチする（ＰＭ）（相補的な）特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブについて検出されたシグナルと、その遺伝子のそのセクションにヌクレオチド配列エラー（変異）が導入された結果、その遺伝子のそのセクションにミスマッチする（ＭＭ）該プローブについて検出されたシグナルとの平均差を示す模式図である。ＰＭペアとＭＭペアと間の平均差（および遺伝子１つにつき通常は２０対）は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘデザイン・ソフトウェア解析（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）によって測定する。四角はマイクロアレイチップ上のミクロ配列を表す。
【図４】 図４Ａは、各々が一定間隔もしくは集中訓練の２４時間前に曝露した正常ショウジョウバエの頭部から抽出したＲＮＡから作製したＤＮＡプローブとハイブリダイズしているＮ＝１０チップから得た平均シグナル（変換され平均化された平均差）の散布図（間隔対集中）である。四角はそれぞれ特定のショウジョウバエ遺伝子を表し、そのうち１５４２個が各チップ上に含まれる。候補記憶遺伝子は、薄い影を付した四角によって同定される。そのプロット中のＣ／ＥＢＰ遺伝子の位置を図中に示す。
図４Ｂは、図４Ａから得た統計的に有意な値を示す散布図表示（間隔対集中）である。四角はそれぞれ特定のショウジョウバエ遺伝子を表し、そのうち１５４２個が各チップ上に含まれる。そのプロット中のＣ／ＥＢＰ遺伝子の位置を図中に示す。
【図５】 図５は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）実験から得た結果を表す棒グラフを示す。これらの結果は、Ｃ／ＥＢＰ遺伝子に対して間隔訓練および集中訓練が及ぼす影響の差を確認するものである。
【図６】 図６は、ラットにおける恐怖条件付け訓練試行間の試行間隔（ＩＴＩ）が後の長期記憶に対して及ぼす影響を表す棒グラフを示す。これらの結果は、集中的および一定間隔で訓練されたプロトコルの違いを明らかにし、恐怖増強驚愕の記憶が集中訓練よりも間隔訓練後の方が良いことを示す。
【図７】 図７は、ラットの扁桃におけるＣＲＥＢアクチベーターの過剰発現が長期記憶に対して及ぼす影響を表す棒グラフを示す。これらの結果は、扁桃におけるＣＲＥＢアクチベーターの過剰発現が、集中訓練後のラットにおいて恐怖増強驚愕の記憶を強化（増強）することを示す。
【図８】 図８は、ａｄｆ１ゲノム領域の分子マップを示す。
背景技術
ヒトを含む多くの生物が持っている１つの特性は、過去の出来事の記憶である。この特性は、その枝分かれ（ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の多くを説明する現在手に入る多くの情報を用いて、数十年間にわたり研究されてきた。例えば、短期記憶を含む転写非依存性記憶（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｍｏｒｙ）および長期記憶を含む転写依存性記憶（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｍｏｒｙ）という２つの基本的な記憶タイプが同定されている。
【０００２】
これまで比較的知られていなかった記憶の１つの態様は、記憶の発現に貢献する遺伝子の正体である。記憶形成に貢献する遺伝子の正体についての調査はまだ始まったばかりである。記憶形成に関係する遺伝子の同定は、（ａ）認知機能障害の遺伝的疫学、（ｂ）これらの遺伝子の異なる対立遺伝子形態（特定の形態の認識に対する異なるパフォーマンスレベルに関係している）を保持する個体の診断手段および（ｃ）様々な形態の認識機能障害を最終的に改善するための薬物を発見するための新しい標的（および特定の薬物は診断テストによって特定の形態の認識機能障害にマッチし得る）を提供する。このように、記憶形成に関係する遺伝子を同定するために利用できる技術があれば有益であろう。
【０００３】
発明の概要
本発明は、所定の実験プロトコルによって生じさせた記憶形成に対する差次的な影響を用いて、転写依存性記憶形成（特に長期記憶形成）に関与する遺伝子を同定することができるという出願人の知見に関する。任意の２つの実験的プロトコル間の有意差は、転写依存性記憶の誘導にある。比較しようとする任意の具体的な２つのプロトコル間の有意差は、その実験グループにおける転写依存性記憶の誘導および対照グループにおける転写依存性記憶の不在である。
【０００４】
転写非依存性記憶には、短期記憶、中間（中）期記憶および（ハエにおいては）感覚消失抵抗性記憶（ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｅｍｏｒｙ）などの様々な「記憶相」が含まれる。これらの形態に共通していることは、ＲＮＡ転写の薬理学的インヒビターがこれらの記憶を妨げない、ということである。転写依存性記憶は通常は長期記憶と呼ばれ、ＲＮＡ合成のインヒビターはその出現を遮断する。
【０００５】
よって、本発明は、転写依存性記憶（特に長期記憶）に関与する遺伝子を同定する方法であって、（ａ）非ヒト動物（特に非ヒト哺乳動物、他の脊椎動物および無脊椎動物）を、その動物において転写依存性記憶形成を誘導するのに充分な条件下で訓練する工程；（ｂ）工程（ａ）で訓練した動物の脳組織からＲＮＡを抽出する工程；（ｃ）工程（ｂ）で抽出したＲＮＡを用いてＤＮＡプローブを合成する工程；（ｄ）工程（ｃ）で合成したＤＮＡプローブを、その動物のゲノム遺伝子に由来するＤＮＡ配列を含むマイクロアレイチップ上の相補的なＤＮＡ配列に該ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせるのに適した条件下で、該マイクロアレイチップに曝露する工程であって、該プローブが相補的なＤＮＡ配列にハイブリダイズするとシグナルが生成される工程；（ｅ）工程（ｄ）で生成されたシグナルを検出する工程；ならびに（ｆ）工程（ｅ）で検出されたシグナルと対照において検出されたシグナルとの統計的比較を実施する工程を含む方法に関する。
【０００６】
１つの態様において、対照は、（ｉ）適切な条件下において非ヒト対照動物（特に非ヒト哺乳動物、他の脊椎動物および無脊椎動物）を訓練する工程であって、該適切な条件とはその対照動物内で転写依存性記憶形成を誘導するのに不充分な条件である工程；（ｉｉ）工程（ｉ）で訓練した対照動物の脳組織からＲＮＡを抽出する工程；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で抽出したＲＮＡを用いてＤＮＡプローブを合成する工程；および（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で合成したＤＮＡプローブを、その動物のゲノム遺伝子に由来するＤＮＡ配列を含むマイクロアレイチップ上の相補的なＤＮＡ配列に該ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせるのに適した条件下で該マイクロアレイチップに曝露する工程であって、該プローブが相補的なＤＮＡ配列にハイブリダイズするとシグナルが生成される工程を含む方法により得られる。工程（ａ）および工程（ｉ）の実験条件は、（実験）処理ペアを構成する。実験条件における工程（ａ）と工程（ｉ）との有意差は、転写依存性記憶の誘導にある。
【０００７】
第２の態様において、対照は、（ｉ）非ヒト対照動物の脳組織からＲＮＡを抽出する工程；（ｉｉ）工程（ｉ）で抽出したＲＮＡを用いてＤＮＡプローブを合成する工程；および（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で合成したＤＮＡプローブを、その動物のゲノム遺伝子に由来するＤＮＡ配列を含むマイクロアレイチップ上の相補的なＤＮＡ配列に該ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせるのに適した条件下で該マイクロアレイチップに曝露する工程であって、該プローブが相補的なＤＮＡ配列にハイブリダイズするとシグナルが生成される工程を含む方法により得られる。この対照の態様において、対照動物は未処理の（訓練されていない）動物である。
【０００８】
本明細書中で使用される対照動物とは、その動物において転写依存性記憶形成を誘導するのに充分な条件下で訓練される動物と同じ種であって且つ他の全ての点でその動物と同等な（例えば同じ年齢および性別の）動物である。
【０００９】
特定の態様において、ＲＮＡは、訓練された動物または対照動物の扁桃から抽出する。他の態様において、ＲＮＡは、訓練された動物または対照動物の海馬から抽出する。更に他の態様において、ハイブリダイズしたプローブからのシグナルは、検出前に増幅される。他の態様では、工程（ｅ）で検出されたシグナルと、転写依存性記憶ではなく転写非依存性記憶を誘導するのに充分な条件下で対照動物を訓練することによって得られる対照において検出されたシグナルとの統計的比較を実施する。
【００１０】
転写依存性記憶は、特定の実験条件を用いて誘導することができる。１つの態様において、転写依存性記憶は、恐怖増強驚愕応答（ｆｅａｒ−ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｄ ｓｔａｒｔｌｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の間隔訓練プロトコル（ｓｐａｃｅｄ ｔｒａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を用いて、非ヒト動物において誘導される。第２の態様において、転写依存性記憶は、シャトル−ボックス回避プロトコル（ｓｈｕｔｔｌｅ−ｂｏｘ ａｖｏｉｄａｎｃｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を用いて非ヒト動物において誘導される。第３の態様において、転写依存性記憶は、恐怖条件付け文脈プロトコル（ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ ｆｅａｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を用いて非ヒト動物において誘導される。
【００１１】
また本発明は、ショウジョウバエ属において転写依存性記憶に関与する１つまたは複数の遺伝子を同定する方法であって、（ａ）ショウジョウバエを、該ショウジョウバエにおいて転写依存性記憶形成を誘導するのに適した条件下で訓練する工程；（ｂ）工程（ａ）で訓練したショウジョウバエの頭部組織からＲＮＡを抽出する工程；（ｃ）工程（ｂ）で抽出したＲＮＡを用いてＤＮＡプローブを合成する工程；（ｄ）工程（ｃ）で合成したＤＮＡプローブを、該ショウジョウバエのゲノム遺伝子に由来するＤＮＡ配列を含む該マイクロアレイチップ上の相補的なＤＮＡ配列に該ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせるのに適した条件下でマイクロアレイチップに曝露する工程であって、該プローブが相補的なＤＮＡ配列にハイブリダイズするとシグナルが生成される工程；（ｅ）工程（ｄ）で生成されたシグナルを検出する工程；ならびに（ｆ）工程（ｅ）で検出されたシグナルと対照において検出されたシグナルとの統計的比較を実施する工程を含む方法にも関する。
【００１２】
特定の態様において、対照は、（ｉ）適切な条件下において対照ショウジョウバエを訓練する工程であって、該適切な条件とはその対照ショウジョウバエにおいて転写依存性記憶形成を誘導するのに不充分な条件である工程；（ｉｉ）工程（ｉ）で訓練した対照ショウジョウバエの頭部組織からＲＮＡを抽出する工程；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で抽出したＲＮＡを用いてＤＮＡプローブを合成する工程；および（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で合成したＤＮＡプローブを、その対照ショウジョウバエのゲノム遺伝子に由来するＤＮＡ配列を含むマイクロアレイチップ上の相補的なＤＮＡ配列に該ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせるのに適した条件下で該マイクロアレイチップに曝露する工程であって、該プローブが相補的なＤＮＡ配列にハイブリダイズするとシグナルが生成される工程を含む方法に従って得られる。工程（ａ）および工程（ｉ）の実験条件は、（実験）処理ペアを構成する。実験条件における工程（ａ）と工程（ｉ）との有意差は、転写依存性記憶の誘導にある。
【００１３】
第２の態様において、対照は、（ｉ）対照ショウジョウバエの頭部組織からＲＮＡを抽出する工程；（ｉｉ）工程（ｉ）で抽出したＲＮＡを用いてＤＮＡプローブを合成する工程；および（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で合成したＤＮＡプローブを、そのショウジョウバエのゲノム遺伝子に由来するＤＮＡ配列を含むマイクロアレイチップ上の相補的なＤＮＡ配列に該ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせるのに適した条件下で該マイクロアレイチップに曝露する工程であって、該プローブが相補的なＤＮＡ配列にハイブリダイズするとシグナルが生成される工程を含む方法に従って得られる。対照のこの態様において、対照ショウジョウバエは未処理の（訓練されていない）ハエである。
【００１４】
本明細書中に使用される「対照ショウジョウバエ」とは、そのショウジョウバエにおいて転写依存性記憶を誘導するのに充分な条件下で訓練されるショウジョウバエと同じ種であって且つ他の全ての点でそれと同等なショウジョウバエである。
【００１５】
ショウジョウバエにおける転写依存性記憶に関与する１つまたは複数の遺伝子の同定方法の１つの態様では、ＤＮＡプローブを蛍光マーカーで標識し、蛍光アッセイを用いてシグナルを検出する。特定の態様では、ハイブリダイズしたプローブからのシグナルを検出前に増幅する。他の態様では、工程（ｅ）で検出されたシグナルと、転写依存性記憶ではなく転写非依存性記憶を誘導するのに充分な条件下で対照ショウジョウバエを訓練することによって得られた対照において検出されたシグナルとの統計的比較を行う。
【００１６】
転写依存性記憶は、間隔訓練プロトコル（例えば嗅覚的パヴロフの条件付けの一定間隔訓練）を用いてショウジョウバエにおいて誘導することができる。転写非依存性記憶は、集中訓練プロトコル（ｍａｓｓｅｄ ｔｒａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌ（嗅覚的パヴロフの条件付けの集中的訓練）を用いてショウジョウバエにおいて誘導することができる。
【００１７】
転写依存性記憶を誘導するのに充分な条件下で訓練した動物と、転写依存性記憶を誘導するのに不充分な適切な条件下で訓練した対照動物とで、特定の遺伝子の転写レベルにおいて統計的に有意な差があれば、その遺伝子を候補記憶遺伝子（ＣＭＧ）として同定する。特定の態様において、一定間隔で訓練されたグループと集中的に訓練されたグループとの間で、特定の遺伝子の転写レベルにおいて統計的に有意な差があれば、その遺伝子を候補記憶遺伝子として同定する。
【００１８】
転写依存性記憶を誘導するのに充分な条件下で訓練した動物と未処理の（訓練されていない）対照動物との間で、特定の遺伝子の転写レベルに統計的に有意な差があれば、その遺伝子を候補可塑性（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）遺伝子（ＣＰＧ）として同定する。特定の態様において、一定間隔で訓練されたグループと訓練されていないグループとの間で、特定の遺伝子の転写レベルに統計的に有意な差があれば、その遺伝子を候補可塑性遺伝子として同定する。
【００１９】
発明の詳細な説明
特定の「長期記憶」を生じさせるために、動物を、制御された実験条件下で特定の訓練プロトコルに付す。たとえばパヴロフの条件付け手順では、２つの特定の刺激を時間的に連続して提示して、「連想的学習および記憶」を生じさせる。２つの刺激の一方は「条件刺激」（ＣＳ）と呼ばれ、他方は「非条件刺激」（ＵＳ）と呼ばれる。ＵＳは通常、「反射的な」様式による訓練を行う前に「非条件付け応答」（ＵＲ）を惹起する自然強化因子である。ＣＳとＵＳが対になると、ＵＳが提示される前に（またはＵＳの非存在下で）、ＣＳに対して「条件付け応答」（ＣＲ）が出現し始める。特定のＣＳ−ＵＳ対合に対するＣＲが「学習」された後で、記憶形成が始まる。
【００２０】
この特定の実験的経験の記憶形成は２つの一般的形態で存在しうる。すなわち、転写非依存性と転写依存性である。前者としては、短期記憶、中（または中間）期記憶、および（ハエにおける）感覚晶質抵抗性記憶（ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｅｍｏｒｙ）など様々な「記憶相」が挙げられる。これらの型に共通するのは、ＲＮＡ転写を薬理学的に阻害する物質がこれらの記憶を破壊しないということである。後者の型は通常、長期記憶と呼ばれ、ＲＮＡ合成の阻害物質はその出現を遮断する。
【００２１】
動物モデルにおいては、遺伝子突然変異、薬理学的遮断、解剖学的病変、または特定の訓練プロトコルなど様々な実験処理がこれらのタイプの記憶の１つ以上に対して影響を及ぼしうる。とくに、一部の実験処理は、正常量の転写非依存性記憶を引き起こすが、転写依存性記憶は引き起こさない。このような知見は、有益なＤＮＡチップ比較の根拠を成すものである。一般に、２つの実験プロトコルの比較を行う。すなわち、転写非依存性記憶と転写依存性記憶の両者を誘発するのに十分なプロトコル（実験群）と、転写非依存性記憶のみを引き起こすプロトコル（対照群）である。次いで、これらの２つのプロトコルの転写物レベル差が検出可能であれば、実験的に誘発させた学習の転写依存性記憶に特異的に起因するものであると考えられうる。本明細書中では、これらの転写物を「候補記憶遺伝子」（ＣＭＧ）と呼ぶ。
【００２２】
実験条件を制御して特定タイプの学習を誘発させるのであるが、他の実験的非制御型の学習も起こりうる。すなわち、対照群は特定の実験課題の転写依存性記憶を示さない場合もあるが、それにもかかわらず非制御型学習経験の転写依存性記憶を示すことがある。このような経験の１つのタイプとして、ＣＳまたはＵＳ（単独）のみに対して、または時間的に対合されない（これは「連想学習」のカギとなる重要要件である）ＣＳ−ＵＳ提示に対して起こる潜在的「非連想」型の学習がある。すなわち、転写依存性の「非特異的」記憶が上記定義の対照群中に存在しうる。この知見は、「非特異的」学習に関与するより広範なクラスの転写物を生じさせるが、これを我々は候補可塑性遺伝子（ＣＰＧ）と呼ぶ。上記定義の実験群とナイーブ（未訓練）動物のＤＮＡチップ比較を行うと、ＣＰＧがＣＭＧとともに得られる。
【００２３】
ショウジョウバエにおける行動−遺伝学的研究により、パヴロフの臭気（ｏｄｏｒ）−刺激（ｓｈｏｃｋ）学習パラダイム後の記憶形成に様々な影響を及ぼす１対の訓練プロトコルが確立されている。つないで「集中させた」（すなわち、セッション間に休憩間隔を設けない）１０個の訓練セッションは、最大の学習（獲得）と転写非依存性記憶（タンパク質合成に依存しない）（早期記憶、短期記憶）を引き起こす。一方、「間を置いた」（すなわち、セッション間に１５分間の休憩間隔を設ける）１０個の訓練セッションは、同等レベルの学習と転写非依存性記憶（早期記憶）、ならびに最大レベルの転写依存性記憶（タンパク質合成依存型長期記憶（ＬＴＭ）を含む）を引き起こす。ＬＴＭは間隔訓練を必要とする。すなわち、４８個の訓練セッションを集中させたものでもＬＴＭを誘発することができない［テュリーら（Tully et al.）、Cell, 79:35-47 (1994) ］。間隔訓練によって誘発されるタンパク質合成依存型ＬＴＭは、ＣＲＥＢリプレッサーの過剰発現により完全に遮断される（図１）［ユィンら（Yin et al.）、Cell, 79:49-58 (1994) ］。タンパク質合成依存型かつＣＲＥＢ依存型のＬＴＭが遮断される間隔訓練の後に生じる記憶曲線は、正常なハエにおける集中訓練によって生じるものと同様である。一方、ＣＲＥＢアクチベーターが過剰発現されると、より少ない訓練（１つの訓練セッション）または集中訓練でＬＴＭが誘発される（図２）［ユィンら（Yin et al.）、Cell, 81:107-115 (1995) ］。すなわち、ＬＴＭの誘発はタンパク質合成とＣＲＥＢの両者に依存する。これらの結果から、間隔訓練プロトコルと集中訓練プロトコルの間に見られる機能差は、前者の後に転写依存性記憶が出現することだけであることがわかる。
【００２４】
この知見は、転写依存性記憶形成の際に転写的に調節される付加的な「下流」遺伝子を同定するための識別スクリーニングの根拠を成すものである。当該分野において公知の方法［たとえばサムブルークら（Sambrook et al. ）編、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor University Press, New York (1989) ；およびアウスベルら（Ausubel et al.）編、Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1997)参照］に従い、間隔訓練または集中訓練を受けたハエの頭部から抽出したＲＮＡを用いて、ＤＮＡプローブを合成した。ＲＮＡは、既報［たとえばドラインら（Drain et al.）、Neuron. 6:71-82 (1991)参照；この文献の開示内容は引用により本明細書に取り込まれる］に従い、ハエの頭部から抽出した。ハエに対する間隔訓練および集中訓練は、既報［たとえばトゥリーら（Tully et al.）、Cell, 79:35-47 (1994) ；およびトゥリーとクイン（Tully and Quinn ）、J. Comp. Physiol., 157:263-277 (1985) 参照；これらの文献の開示内容は引用により本明細書に取り込まれる］に従い行った。当該分野において公知の方法［たとえばサムブルークら（Sambrook et al. ）編、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor University Press, New York (1989) ；およびアウスベルら（Ausubel et al.）編、Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1997)参照］に従い、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）プローブを抽出ＲＮＡから合成した。次いで、複合ｃＤＮＡプローブ混合物を、１５４２ショウジョウバエ遺伝子のＤＮＡ配列（標的ＤＮＡ配列）を含むマイクロアレイチップ（Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA ；たとえば米国特許第５，４４５，９３４号；およびラムセイ（Ramsay）、Nature Biotechnology, 16:40-44 (1998) も参照されたい；これらの文献の開示内容は引用により本明細書に取り込まれる）にハイブリダイズさせた。特定の態様においては、ＤＮＡプローブを検出可能マーカー（たとえば蛍光マーカー）で標識する。ハイブリダイズしたＤＮＡプローブからのシグナルを、当該分野において公知の方法［たとえばサムブルークら（Sambrook et al. ）編、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor University Press, New York (1989) ；およびアウスベルら（Ausubel et al.）編、Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1997)参照］に従い、増幅および検出した。特定の態様においては、蛍光アッセイを用いてハイブリダイゼーションを検出した。間隔訓練群と集中訓練群の間で検出されたシグナルを比較することによって、統計的比較（ＤＮＡチップ比較）を行った。
【００２５】
間隔訓練群と集中訓練群の転写物レベルのわずかな差を検出する統計的信頼性を向上させる標本数とシグナル変換アルゴリズムが決定されている。好ましい態様においては、各処理プロトコルについて、処理群１つあたり１０個のチップという標本数（各遺伝子について、間隔訓練群では１０個のチップ、集中訓練群でも１０個のチップ）が、間隔訓練群と集中訓練群の転写物レベルのわずかな差を検出する統計的信頼性を向上させる。好ましい態様においては、下記のシグナル変換アルゴリズムを用いて、統計的比較（ＤＮＡチップ比較）を行う。
【００２６】
１．特定の遺伝子に対して１組のプライマー対について検出されるシグナル間の「平均差」を求める。完全にマッチした（ＰＭ）シグナルとミスマッチ（ＭＭ）のシグナルの平均差を、アフィメトリックス社デザイン・ソフトウエア解析法 （Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA ）によって求める。
【００２７】
２．ボックス・コックス変換：
１０未満（ｂｅｌｏｗ）の平均差値があれば排除する。次いで、各チップ上の各遺伝子についての残余平均差値を、当該チップ全体の全体平均差（全ての遺伝子に対する）によって正規化する。
【００２８】
総平均＝全てのチップおよび全ての遺伝子／チップについての全体平均差（Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．）
正規化係数（チップＸの場合）＝チップＸの全体平均差／総平均
正規化（平均差）＝（チップＸの正規化係数）×（チップＸ上の遺伝子Ｙ）
変換後平均差＝｛ｌｎ［正規化（平均差）］｝×２７２０．７５
【００２９】
３．平均と標準誤差を求める。標準ｔ検定（アルファ＝０．０５）を用いて、各遺伝子Ｙについて、間隔訓練を受けたハエと集中訓練を受けたハエの平均を比較する。ｐ≦０．０５の場合には、間隔訓練を受けたハエにおける特定の遺伝子の平均シグナル変換値は、集中訓練を受けたハエにおける当該遺伝子の平均シグナル変換値と統計的に差があるものとみなされる。
【００３０】
あるいは、下記のシグナル変換アルゴリズムを用いて、統計的比較（ＤＮＡチップ比較）を行うこともできる：
【００３１】
１．特定の遺伝子に対して１組のプライマー対で検出されるシグナル間の「平均差」を求める。完全にマッチした（ＰＭ）シグナルとミスマッチ（ＭＭ）のシグナルの平均差を、アフィメトリックス社デザイン・ソフトウエア解析法（Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA ）によって求める。
【００３２】
２．ボックス・コックス変換
特定の遺伝子について負の平均差があればゼロ化する。各チップ上の各遺伝子について「ゼロ化された平均差」（Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．０）を、当該チップ全体の全体「平均差」によって正規化する。
【００３３】
ａ）Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．≧０の場合には、Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．０＝Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．となり、Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．＜０の場合には、Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．０＝０となる。
【００３４】
ｂ）正規化：
総平均＝全てのチップおよび全ての遺伝子／チップについての全体Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．
正規化係数（チップＸの場合）＝チップＸの全体Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．／総平均
正規化（Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．０）＝正規化係数（チップＸの場合）×（チップＸ上の遺伝子Ｙ）（各遺伝子について）
【００３５】
ｃ）変換後Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．＝｛ｌｎ［正規化（Ａｖｇ．Ｄｉｆｆ．０）］｝×２７２０．７５１３６
【００３６】
３．平均と標準誤差を求める。ｔ検定比較により、間隔訓練群の平均と集中訓練群の平均を比較する。ｐ≦０．０５の場合には、間隔訓練を受けたハエにおける特定の遺伝子についての平均シグナル変換値は、集中訓練を受けたハエにおける当該遺伝子についての平均シグナル変換値と統計的に差があるものとみなされる。
【００３７】
間隔訓練群で検出されるシグナルと集中訓練群で検出されるシグナルとの統計的比較（ＤＮＡチップ比較）を行う際、他のシグナル変換アルゴリズムを用いることができる。
【００３８】
これらの専用的な方法を用いて、キイロショウジョウバエについて、１５４２の統計的な間隔訓練対集中的訓練の比較（Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−検定）を決定した。転写依存型記憶形成中にその転写が調節される候補記憶遺伝子（ＣＭＧ）（転位成分やミトコンドリア遺伝子を含まない）を、間隔訓練群と集中訓練群との間のＤＮＡチップ比較（統計的比較）から同定した。別々に調節される転写産物は、パヴロフの臭気−刺激学習パラダイムによって誘導される「連想的」ＬＴＭに特異的に関与するものを表す。
【００３９】
所定の遺伝子に対して１０未満の平均差を間隔対集中比較（２４時間記憶）から削除した、シグナル変換アルゴリズムを用いて統計的分析から決定されたキイロショウジョウバエに由来するＣＭＧを、表１に示す。所定の遺伝子に対する負の平均差を間隔対集中比較（２４時間記憶）からゼロにしたシグナル変換アルゴリズムを用いて統計的分析から決定したキイロショウジョウバエに由来するＣＭＧを、表２に示す。
【００４０】
【表１】
【表２】
上記の統計手法は「統計的候補」を示唆するに過ぎない。使用される統計的方法（および他の同様の方法）の基本的特徴は「真の陽性」と共に「偽陽性」および「偽陰性」候補が得られることである。したがって「統計的候補」には経験依存的な遺伝子転写の変化を検出する独立した方法を適用しなければならない。そのような独立した方法には例えばノーザンブロット解析、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）およびＲＮアーゼ保護アッセイなどが含まれ、同定された統計的候補を裏付けるために使用できる。これらのデータの定量的解析も、偽陽性および偽陰性結果に供される。
【００４３】
本明細書において統計的方法のわずかな変更が「統計的候補」の異なる集合を生じる可能性がある。正規化された差スコアの分布を得るには、多くの場合、1 種類以上の型のデータ変換を行なえば十分である。しかし使用される各データ変換は統計的候補の異なる集合を与えるだろう。またどのシグナル検出法でも、正確に検出するには低すぎる「ベースライン値」を解明しなければならない。そのような値を「ゼロ」に設定するというのがこの問題点に対処する一つの方法である。もう一つの方法はそのような値をデータセットから排除する（例えば１０未満の値を排除する）ことである。
【００４４】
チップデータはどの転写物が記憶に関与するかに関して遺伝子ごとに確証的な情報を与える。チップデータは全遺伝子転写物にわたって様々な刺激に対する正確な協調的転写応答も与える。特にチップデータは遺伝子転写物が記憶に対して持つ協調的効果に関する情報を与える。
【００４５】
ショウジョウバエのほとんどの遺伝子は哺乳類ホモログを持つことが明らかになっており、このことは記憶形成に関与するショウジョウバエ遺伝子の大部分にあてはまる（ＤｕｂｎａｕおよびＴｕｌｌｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２１：４０７−４４４（１９９８））。ショウジョウバエでは哺乳類ホモログによってそのハエホモログを機能的に置換できるという知見が増えつつあるので、この発見は対応する哺乳類ホモログに直結する。
【００４６】
長期記憶に対して間隔訓練と集中訓練がもたらす効果に差があることは、動物界に広く観察される現象である。特に、長期記憶に対する間隔−集中間の効果の差は、最近、条件付け恐怖増強驚愕効果(conditioned fear-potentiated startle effect) に関してラット（哺乳類モデル系）で確立されている。この恐怖増強驚愕パラダイムでは、予めフットショックと組み合わせておいた条件刺激（ＣＳ）の存在下での驚愕の大きさの増大から記憶が推論される。ラットの集中訓練 （１０秒の試行間間隔で４回のＣＳ−ショックの組み合わせ）は転写依存性の記憶を本質的に生成しないが、間隔訓練（８分の試行間隔で４回の組み合わせ）は有意な転写依存性記憶を生じる（図６）（Ｊｏｓｓｅｌｙｎら，Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２４，９２６，Ａｂｓｔｒａｃｔ ３６５．１０（１９９８））。さらに、ウイルスベクター技術によって扁桃（amygdala）に送達されたＣＲＥＢ活性化因子の過剰発現は、ショウジョウバエで観察されたものとまさに類似する形で、集中訓練による記憶を強化する（図７）（Ｊｏｓｓｅｌｙｎら，Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２４：９２６，Ａｂｓｔｒａｃｔ ３６５．１０（１９９８））。これらのデータは、哺乳類ＣＭＧの同定に利用されるＣＲＥＢ依存性の間隔−集中間の差を実証している。
【００４７】
したがってこれらの特定の訓練プロトコルにより、ショウジョウバエで同定されたＣＭＧと類似するＣＭＧが哺乳動物などの動物で得られると予想される。本明細書で使用する「動物」という用語には哺乳動物ならびに他の動物、脊椎動物および無脊椎動物（例えば鳥類、魚類、爬虫類、昆虫（例えばショウジョウバエ属）、アメフラシなど）が包含される。本明細書で使用する「哺乳動物」および「哺乳類」という用語は、子供に授乳し、かつ生児を出産する（真獣類または有胎盤哺乳類）か、産卵する（後獣類または非胎盤哺乳類）、任意の脊椎動物（単孔類、有袋類および有胎盤類を含む）を指す。哺乳類種の例にはヒトおよび他の霊長類（例えばサル、チンパンジーなど）、げっ歯類（例えばラット、マウス、モルモット）および反芻動物（例えばウシ、ブタ、ウマ）などが挙げられる。
【００４８】
非ヒト動物（特に非ヒト哺乳類、他の脊椎動物および無脊椎動物）でのＣＭＧを同定するには、当技術分野で一般に知られている方法に従って間隔訓練または集中訓練を受けた非ヒト動物の脳組織から抽出したＲＮＡを使ってＤＮＡプローブを合成する（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら編，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ ｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９８９）や、Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９９７）を参照されたい）。これらのプローブは検出可能なマーカーで標識することができる。ある態様では、間隔訓練または集中訓練を受けた動物の扁桃から抽出したＲＮＡを使ってＤＮＡプローブを合成し、必要であれば検出可能なマーカーで標識する。当技術分野では蛍光マーカー、化学発光マーカー、ビオチンマーカー、放射性マーカー、酵素的に検出されるマーカーおよび免疫学的に検出されるマーカーなどを含む種々の検出可能なマーカーと標識方法が知られている（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら編，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９８９）や、Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９９７）を参照されたい）。ＲＮＡは当技術分野で利用できる方法によって扁桃などの脳組織から抽出される。動物の間隔訓練と集中訓練は当技術分野で広く知られている方法を使って行なわれる（例えばＪｏｓｓｅｌｙｎら，Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２４：９２６，Ａｂｓｔｒａｃｔ ３６５．１０（１９９８）、ＣａｓｓｅｌｌａおよびＤａｖｉｓ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｅｈａｖ．，３６：３７７−３８３（１９８６）、Ｇｕｚｏｗｓｋｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：２６９３−２６９８（１９９７）、Ｌａｍｐｒｅｃｈｔら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１７（２１）：６４４３−６４５０（１９９７）、Ｂｏｕｒｔｃｈｕｌａｄｚｅら，Ｃｅｌｌ，７９：５９−６８（１９９４）、およびＫｏｇａｎら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，７：１−１１（１９９６）を参照されたい、これらは参照によって本明細書に組み込まれる）。次にこの複合プローブ混合物を、その動物のゲノムの遺伝子のＤＮＡ配列（標的ＤＮＡ配列）を含有するマイクロアレイチップにハイブリダイズさせる（例えば米国特許第５，４４５，９３４号や、Ｒａｍｓａｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：４０−４４（１９９８）を参照されたい、これらは参照によって本明細書に組み込まれる）。ハイブリダイズしたＤＮＡプローブからのシグナルは当技術分野で広く知られている方法によって増幅され、検出される（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら編，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９８９）や、Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９９７）を参照されたい）。例えばハイブリダイゼーション（ハイブリダイズしたプローブからのシグナル）は蛍光アッセイまたは質量分析法を使って検出することができる。光ファイバー、ダイオードアレイ検出、化学発光／発光、ラテックスビーズ凝集、直接電荷変化検出（ＣＣＤ）および圧電読出し装置を使った方法も使用できる。上記のシグナル変換アルゴリズムを使って、間隔訓練群および集中訓練群間の遺伝子発現レベルを計算する。特定の遺伝子に関する間隔訓練群と集中訓練群の間の転写レベルの統計的な有意差によって候補記憶遺伝子が同定される。間隔訓練群と集中訓練群の間の統計的比較（ＤＮＡチップ比較）は、上記のシグナル変換アルゴリズムを使って行なうことができる。
【００４９】
間隔訓練群と集中訓練群の間の統計的比較の他に、他の実験プロトコル対を使って訓練を施した動物間のＤＮＡチップ比較（統計的比較）からＣＭＧを同定することができる。実験群は転写依存性記憶を誘導するのに充分な条件で訓練し、対照群は転写依存性記憶を誘導するには不充分な条件で訓練する。任意の２実験プロトコル間の有意な相違は転写依存性記憶の誘導にある。比較対象の任意の２実験プロトコル間の有意な相違は、実験群での転写依存性記憶の誘導と、対照群での転写依存性記憶の欠如である。
【００５０】
当技術分野では、転写依存性記憶の誘導を主な相違点とする実験プロトコルの対が知られている。例えば転写依存性記憶の誘導を主な相違点とする一対の実験プロトコルは間隔訓練プロトコルと集中訓練プロトコルとからなることができる。この態様では、間隔訓練プロトコルを使った動物の訓練は、その動物に転写依存性記憶を誘導するのに十分である。集中訓練プロトコルを使った動物の訓練は、転写依存性記憶を誘導するには不十分である。もう一つの例として、転写依存性記憶の誘導を主な相違点とする一対の実験プロトコルは、シャトル−ボックス回避プロトコル（特に一試行シャトル−ボックス回避プロトコル）を使った正常（野生型）動物の訓練と、脳弓を外科的に損傷させた動物のシャトル−ボックス回避プロトコルを使った訓練とからなることができる（Ｔａｕｂｅｎｆｅｌｄら，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２（４）：３０９−３１０（１９９９））。この態様では、正常（野生型）動物に転写依存性記憶が誘導される。脳弓が外科的に損傷された動物では転写依存性記憶は誘導されない。さらなる一例として、転写依存性記憶の誘導を主な相違点とする一対の実験プロトコルは、状況判断的恐怖条件付けプロトコル（特に一試行状況判断的恐怖条件付けプロトコル）を使った動物の訓練と、状況判断的恐怖条件付けプロトコルを使った状況判断的恐怖条件付けする前に訓練チャンバーに慣らせた動物の訓練とからなることができる（Ｉｍｐｒｅｙら，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１（７）：５９５−６０１（１９９８））。この態様では、状況判断的恐怖条件付けに先立って訓練チャンバーに慣らせていない動物に転写依存性記憶が誘導される。状況判断的恐怖条件付け前に訓練チャンバーに慣らせた動物では転写依存性記憶が誘導されない。当業者は他の実験プロトコル対を容易に見極めることができる。
【００５１】
ＤＮＡプローブは、本明細書に記載するような実験プロトコル対を使って訓練した動物の扁桃や海馬などといった脳組織から抽出したＲＮＡを使って合成され、必要であれば検出可能なマーカーで標識される。次にそのＤＮＡプローブ混合物を、その動物のゲノムの遺伝子のＤＮＡ配列（標的ＤＮＡ配列）を含有するマイクロアレイチップ上にハイブリダイズさせる。上述したシグナル変換アルゴリズムを使って上記２つの実験プロトコル間でＤＮＡチップデータを比較することにより、統計的比較を行なう。
【００５２】
本明細書中の統計的手法は、訓練群と非訓練（未処置）群の間の転写レベルの差を検出するために使用できる。したがって訓練を受けた動物と訓練を受けていない（未処置）動物との間のＤＮＡチップ比較（統計的比較）から候補可塑性（plasticity）遺伝子（ＣＰＧ）を同定することができる。区別的に調節されるこのクラスの転写物にはＣＭＧと、一般的訓練条件（例えば臭気、電気ショックまたは訓練プロトコルの他の任意の経験的性状（aspects ）の呈示）に対して「非連想的（nonassociative）」な様式で転写的に応答する他の任意の遺伝子とが包含される。単に動物を新しい環境に置くか、動物を刺激のみまたは時間的に対呈示されない刺激にさらすだけで、多少の非特異的転写応答が起こる。これらの転写変化はニューロン活性の一般的（非特異的）増加によって生じるか、一般的訓練条件に関係しない他の形態の学習／記憶形成を反映するのだろう。
【００５３】
所定の遺伝子に関して１０未満の平均差値を削除するシグナル変換アルゴリズムを使った統計的解析によって間隔訓練群と未処置（naive ）群との比較（２４時間記憶）から決定されたショウジョウバエのＣＰＧを表３に示す。所定の遺伝子に関して負の平均差値をゼロとするシグナル変換アルゴリズムを使った統計的解析によって間隔訓練群と未処置群との比較（２４時間記憶）から決定されたショウジョウバエのＣＰＧを表４に示す。
【００５４】
【表３】
【表４】
本発明は、転写依存性記憶（特に長期記憶）に関与する１つまたは複数の遺伝子を同定する方法であって、（ａ）非ヒト動物（特に非ヒト哺乳動物、他の脊椎動物および無脊椎動物）を、その動物に転写依存性記憶（特に長期記憶）を誘導するのに充分な条件で訓練し；（ｂ）工程（ａ）で訓練した動物の脳組織（例えば扁桃、海馬など）からＲＮＡを抽出し；（ｃ）工程（ｂ）で抽出したＲＮＡを使ってＤＮＡプローブを合成し；（ｄ）工程（ｃ）で合成したＤＮＡプローブを、そのＤＮＡプローブがマイクロアレイチップ上の相補的ＤＮＡ配列にハイブリダイズするのに適する条件で上記動物のゲノムの遺伝子に由来するＤＮＡ配列を含有するマイクロアレイチップにばく露し、ここで、プローブが相補的ＤＮＡ配列にハイブリダイズするとシグナルが生成する；（ｅ）工程（ｄ）で生成したシグナルを検出し；ならびに（ｆ）工程（ｅ）で検出したシグナルと、対照で検出されるシグナルとの統計的比較を行なうことからなる方法を提供する。
【００５７】
一態様として、対照は、（ｉ）非ヒト対照動物（特に非ヒト哺乳動物、他の脊椎動物および無脊椎動物）を、その対照動物に転写依存性記憶を誘導するには不十分である適当な条件で訓練し；（ｉｉ）工程（ｉ）で訓練した対照動物の脳組織からＲＮＡを抽出し；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で抽出したＲＮＡを使ってＤＮＡプローブを合成し；ならびに（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で合成したＤＮＡプローブを、そのＤＮＡプローブがマイクロアレイチップ上の相補的ＤＮＡ配列にハイブリダイズするのに適する条件で上記動物のゲノムの遺伝子に由来するＤＮＡ配列を含有するマイクロアレイチップにばく露する、ここで、プローブが相補的ＤＮＡ配列にハイブリダイズするとシグナルが生成する、ことからなる方法によって得られる。工程（ａ）と工程（ｉ）の実験条件は一対の（実験的）処置を構成する。工程（ａ）と工程（ｉ）の実験条件間の有意な相違は転写依存性記憶の誘導にある。
【００５８】
第２の態様として、対照は、（ｉ）非ヒト対照動物の脳組織からＲＮＡを抽出し；（ｉｉ）工程（ｉ）で抽出したＲＮＡを使ってＤＮＡを合成し；ならびに（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で合成したＤＮＡプローブを、そのＤＮＡプローブがマイクロアレイチップ上の相補的ＤＮＡ配列にハイブリダイズするのに適する条件で上記動物のゲノムの遺伝子に由来するＤＮＡ配列を含有するマイクロアレイチップにばく露する、ここで、プローブが相補的ＤＮＡ配列にハイブリダイズするとシグナルが生成する、ことからなる方法によって得られる。この対照の態様では、対照動物は未処置（訓練されていない）動物である。
【００５９】
本明細書にいう対照動物とは、その動物に転写依存性記憶形成を誘導するのに充分な条件で訓練を受ける動物と同じ種に属し他の点では同等な（例えば年齢、性別などが同等な）動物である。
【００６０】
転写依存性記憶は特定の実験条件を使って誘導することができる。ある態様では恐怖増強驚愕応答の間隔訓練プロトコルを使って非ヒト動物に転写依存性記憶が誘導される。第２の態様ではシャトル−ボックス回避プロトコルを使って非ヒト動物に転写依存性記憶が誘導される。第３の態様では状況判断的恐怖条件付けプロトコルを使って非ヒト動物に転写依存性記憶が誘導される。
【００６１】
本発明を以下の実施例によって説明するが、本発明が以下の実施例により何らかの形で限定されるとみなしてはならない。
【００６２】
実施例
実施例１ ｎａｌｙｏｔ P1 の単離
Ｘ連鎖ＰｌａｃＷトランスポゾン（Ｂｉｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０（４８５４）：９１３−９１６（１９８８））を可動化して、第２および第３染色体に個別の挿入物を持つ２，１８２株のトランスポザント（ｔｒａｎｓｐｏｓａｎｔ）株を生成した（ＢｏｙｎｔｏｎおよびＴｕｌｌｙ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３１：６５５−６７２（１９９２）；Ｄｕｒａら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｇｅｎｔ．，９：１−１４（１９９３）参照）。１回のパヴロフ嗅覚学習セッション訓練後の３時間記憶を、これらのトランスポザント株のそれぞれについて１パフォーマンスインデックス（ＰＩ）で定量した。次にスコアが野生型親株［ｗ1118（ＣＳ１０）］の７０％以下だった株についてＮ＝４ ＰＩを作製した。スクリーニングのこの段階で９３株の突然変異株が野生型親株の７０％以下の平均３時間記憶スコアを与えた。次にこれらの候補突然変異体株のそれぞれを５世代にわたって親株に異系交配してそれらの（不均質な）遺伝的背景を平衡化した。これらの異系交配株で再び３時間記憶を定量（Ｎ＝４ ＰＩ）したところ、９３株の候補突然変異体のうち８株だけがなお野生型の７０％未満の平均スコアを与えた。最後にこれらの８つの突然変異体株で「課題関連（task relevant ）」感覚運動課題をアッセイした。８株全てが正常なショック反応性を示し、ＧB ３３５とＥJ ５１、ＥJ ２２０とＥS １５２の４株は嗅覚の鋭さの有意な低下を示した（ＢｏｙｎｔｏｎおよびＴｕｌｌｙ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３１：６５５−６７２（１９９２）、Ｄｕｒａら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｇｅｎｔ．，９：１−１４（１９９３）［ＧB ３３５は現在ｄａｒｅと呼ばれており、さらなる研究が行なわれた。これは触角での選択的発現を示す（Ｆｒｅｅｍａｎら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２６：４５９１−４６０２（１９９９））］）。残り４株の突然変異株は正常な感覚運動応答を示し、ｌａｔｈｅｏ（ＢｏｙｎｔｏｎおよびＴｕｌｌｙ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３１：６５５−６７２（１９９２）、Ｐｉｎｔｏら，Ｎｅｕｒｏｎ，２３：４５−５４（１９９９）、Ｒｏｈｒｂｏｕｇｈら，Ｎｅｕｒｏｎ，２３：５５−７０（１９９９））、ｌｉｎｏｔｔｅ（Ｄｕｒａら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｇｅｎｔ．，９：１−１４（１９９３）、Ｂｏｌｗｉｇら，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：８２９−８４２（１９９５）、Ｓｉｍｏｎら，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．，７６：４２−５５ （１９９８））、ｇｏｌｏｖａｎおよびｎａｌｙｏｔと名付けられた。
【００６３】
実施例２ ｎａｌｙｏｔゲノム領域のクローニングと特徴づけ
ＰｌａｃＷトランスポゾンはユニークなＳａｃＩＩ制限部位を含み、その後ろに細菌の複製起点とアンピシリン耐性遺伝子が続いている（図８）。ＳａｃＩＩによるｎａｌｙｏｔ（ｎａｌ）ゲノムＤＮＡの消化、希薄条件でのライゲーションおよび細菌形質転換により、ゲノム領域に由来する隣接ＤＮＡを伴なった９．４ｋｂのＳａｃＩＩ制限断片のプラスミドレスキューを行なうことができた。染色体インサイチューおよびサザンブロッティング実験により、この断片がＰ−挿入部位と同位置にマッピングされることを確認した。放射標識したレスキュー断片を使って１００万プラークのラムダ−ＤａｓｈＩＩショウジョウバエＣａｎ−Ｓゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をスクリーニングした。１０個の独立したゲノムクローンを単離し、サブクリーニングし、制限酵素解析することにより、Ｐ−エレメント挿入部位付近のゲノム領域をまたぐ３５ｋｂの地図を構築した（図８）。
【００６４】
ａｄｆ１およびｃｎ２０転写単位のイントロン／エキソン地図を図８に示す。ｎａｌ P1 因子（矢印）はａｄｆ１転写単位のイントロン内、スプライス供与部位の１４７ｂｐ下流に挿入される。ａｄｆ１遺伝子はｍｙｂファミリーと遠い類縁関係にある転写因子をコードし（Ｅｎｇｌａｎｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６８３−６８７（１９９２））、（少なくとも）２種類のｍＲＮＡに択一的にスプライスされる。ｉ１とｉ２は２つの潜在的翻訳開始部位に相当する。さらに２つの約３．５ｋｂと５９ｂｐのイントロンが構成的にスプライスされ、ａｄｆ１転写単位の残りの部分を２７４ｂｐと１０１３ｂｐのエキソンに分離しているようである。ｃｎ２０遺伝子は新規であり、３９５アミノ酸タンパク質コードできる一本のスプライスされない転写物を産生する。ｎａｌ ie60 中のゲノム欠失の程度を示す。制限部位：Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｈ、ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｓ、ＳａｃＩＩ。
【００６５】
実施例３ 突然変異体ｎａｌ P1 と野生型のハエにおけるａｄｆ１およびｃｎ２０のノーザンブロット解析ならびにｃＤＮＡ単離
ハエ成虫全身、成虫頭部または成虫胴体（ｂｏｄｙ）の全ＲＮＡをＴｒｉＺＯＬ試薬（ＢＲＬ）を使って単離した。次にオリゴ（ｄＴ）セルロース（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）または磁化オリゴ（ｄＴ）ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を使ってポリ（Ａ）画分を精製した。精製ポリ（Ａ）ＲＮＡをホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動で分画し、１０×ＳＳＣ中でＺｅｔａＰｒｏｂｅナイロン膜（ＢｉｏＲａｄ）に転写した。乾燥した膜上のＲＮＡを２，５００マイクロジュール（ujoules ）でＵＶ架橋することによって固定した（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）。転写物クラスの一次同定のために、ＣｈｕｒｃｈとＧｉｌｂｅｒｔの高ストリンジェンシー緩衝液中で膜ストリップを放射標識ゲノムＤＮＡ断片で終夜プローブし、Ｋｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘフィルムに露光した。
【００６６】
選択したプローブを２つのショウジョウバエ成虫頭部ｃＤＮＡライブラリー、すなわちラムダｇｔ１１バクテリオファージ成虫頭部ライブラリー（Ｓａｌｖａｔｅｒｒａ）とｐＪＧ４−５プラスミドライブラリー（Ｒｏｓｈｂａｓｈ）にハイブリダイズさせた。これらの２つのライブラリーから２つの独立した転写単位に対応する合計１１個のクローンを単離し、制限酵素解析によって評価した。１０個のクローンがａｄｆ１転写単位に対応した。これらのサブセットを制限酵素マッピングし配列解析することにより、共通する３’末端プロセシング部位と５’末端の不均一性が明らかになった。５’不均一性はイントロン１（１１４ｂｐ）の部分的スプライシングと、おそらくは不完全な第１鎖合成とを反映したものである。１つのクローン（ｃｎ２０）は独立した隣接する転写単位に対応した。
【００６７】
ａｄｆ１およびｃｎ２０ ＲＮＡレベルに対するＰ−挿入の影響を定量するために、ａｄｆ１、ｃｎ２０および対照ＲＮＡ ｒｐ４９に対応する放射標識プローブを使って、ｎａｌ P1 および野生型の頭部または胴体から得たノーザンブロットを上述のように解析した。
【００６８】
ｒｐ４９ ＲＮＡの対照レベルと比較して、ｃｎ２０ ｍＲＮＡ発現レベルは頭部でも胴体でも野生型のハエと突然変異型のハエでほぼ同等だった。これに対し、ａｄｆ１ ｍＲＮＡ発現レベルは突然変異体の頭部および胴体では少なくとも２倍減少していた。
【００６９】
実施例４ 抗体産生
全ＡＤＦ１オープンリーディングフレームをｐＥＴ３０（ａ）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にＣ末端融合物として挿入した。ＡＤＦ１融合タンパク質の強いＩＰＴＧ誘導を形質転換したＢＬ２１細菌で得た。誘導タンパク質の大部分は不溶性の封入体画分にあり、この画分（誘導の３時間後に単離）はＡＤＦ１融合タンパク質が８５％近くに濃縮されていた。この画分をＰＢＳで十分に洗浄し、抗原として直接使用した。マウスのポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を標準的方法で得た（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州プレーンビュー（１９９８））。３匹のマウスに５０μｇの封入体画分を（完全フロイントアジュバントと混合して）接種した後、２週間毎に５０μｇの封入体画分を不完全フロイントアジュバントと混合して追加免疫した。３匹のマウスはすべて強い免疫応答を示し、１匹をハイブリドーマ融合のために屠殺した。８００個の候補ハイブリドーマ株のうち、１７株がＡＤＦ１ドットブロット検定で応答を示した。次にその１７株をウェスタンブロットおよび免疫化学アッセイで評価することにより、ＭＡｂ ＡＤＦ１−８とＭＡｂ ＡＤＦ１−１７を含む１０株のモノクローナル株を単離した。
【００７０】
実施例５ 変異体ｎａｌP1および野生型ハエにおけるＡＤＦ−１タンパク質レベルのウェスタンブロット解析
上記のように（Ｙｉｎら、Ｃｅｌｌ、７９、４９〜５８、（１９９４））凍結頭部または胴部を単離し、５００μｌのＲＩＰＡ緩衝液中での１００μｌの凍結頭部粉末のホモゲナイズによって抽出物を調製した。タンパク質濃縮物を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイによって測定した。タンパク質サンプルを、標準的なローディング色素中で変性させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、１００ｍＡで２時間電気泳動によってニトロセルロースメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。各メンブレンを、ＰＢＳＴ＋５％ミルク中で４℃で一晩ブロックし、ＰＢＳＴ＋５％ミルク中で１〜２時間一次抗体とインキュベートした。使用した一次抗体は、ａｄｆ１に対するマウスポリクローナル血清（１：１０００）、ａｄｆ１に対するマウスモノクローナル上清（Ｍａｂ Ａｄｆ１−１７）（１：２０）、ＴＢＰに対するマウスモノクローナル上清（１：５）、およびａ−チューブリンに対するマウスモノクローナル腹水（１：５０，０００）（Ｓｉｇｍａ）であった。メンブレンをＰＢＳＴ中で充分に洗浄し、ＨＲＰ結合抗ＩｇＧ二次抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１：５００）と１〜２時間インキュベートした。ＰＢＳＴ中での充分な洗浄後、結合産物を、強化化学発光（Ｐｉｅｒｃｅ ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＵＬＴＲＡ基質）およびオートラジオグラフィーによって視覚化した。
【００７１】
他の２つのタンパク質（ＴＡＴＡ結合タンパク質およびα−ＴＵＢＵＬＩＮ）の対照レベルと比較して、ＡＤＦ１発現は、変異体ハエにおいて少なくとも２倍減少した。
【００７２】
実施例６ 野生型ハエと１遺伝子変異体ｎａｌｙｏｔとの間のＤＮＡチップデータセットの比較
正常な（野生型）ハエと１遺伝子変異体ｎａｌｙｏｔとの間のＤＮＡデータセットを比較した。ｎａｌｙｏｔ変異体は、集中訓練後に正常な記憶を有することが認められるが、間隔をおいた訓練によってＬＴＭは誘導されなかった。さらに、ｎａｌｙｏｔ変異は、Ａｄｆ１遺伝子中のトランスポゾン挿入物として同定され、その効果は、変異体ハエ頭部中のＡｄｆ１転写物およびタンパク質の量の減少である。
【００７３】
全てのベースライン値を０に設定し、次いでデータを解析した場合、Ａｄｆ１遺伝子についての野生型ハエとｎａｌｙｏｔ変異体との間に有意な相違は検出されなかった。しかし、（０に設定した場合より）１０以下のベースライン値を分析から削除した場合、Ａｄｆ１転写に対する有意な効果が検出され、これは、実施例３に記載のノーザン分析によって得られた結果を確証するものである。この結果は、データセットから１０未満の平均差を削除する統計学的アプローチの有意な証拠である。
【００７４】
実施例７ 定量的ポリメラーゼ連鎖反応
所与のハエ群を、特定の訓練プロトコル（間隔をあけるまたは集中）に供し、訓練後通常の食品バイアルに保存する。訓練から２４時間後、所与の訓練プロトコル（間隔をあけるまたは集中）の異なる群由来のハエを１つの５０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブに回収し、液体窒素中で急速冷凍する。凍結ハエの頭部を、強い機械的震盪によって胴部から分離する。次いで、凍結して分離した胴部を、一連のふるいにかけて最終的にハエ頭部の均一な集団を得る。
【００７５】
訓練群（間隔または集中）由来の頭部を合わせ、８つの群に分ける。各頭部群を、次いで乳鉢および乳棒で粉末に磨砕する。粉末を５ｍｌのＴｒｉｚｏｌ溶液（Ｇｉｂｃｏ）に移し、−７０℃で一晩保存する。
【００７６】
ついで、凍結Ｔｒｉｚｏｌ／ハエ粉末溶液を解凍する。２ｍｌのクロロホルムを添加する。混合物を、４℃、３，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。抽出ＲＮＡ（水層中）を、新しいチューブにデキャントし、１．４ｍｌのイソプロパノールを添加する。
【００７７】
ＱＰＣＲのために、上記溶液のアリコートを、４℃、８０００ｒｐｍで２０分間スピンする。イソプロパノールをデキャントし、ペレットを７０％エタノールで１回洗浄する。ペレットを、１００μｌのＨ2 Ｏ中に再懸濁し、同体積のフェノール／クロロホルム（Ｇｉｂｃｏ）を添加する。溶液を、４℃、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上部の水層を新しいチューブにデキャントする。６μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと共に２００μｌの氷冷エタノールを添加する。溶液を、−２０℃で少なくとも２０分間インキュベートする。
【００７８】
次いで、溶液を、４℃、１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。ペレットを、２０μｌのＨ2 Ｏ中に再懸濁し、ＲＱＩ Ｒｎａｓｅ無含有ＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に供する。ＲＮＡ濃度を測定する。
【００７９】
ついで、１μｇの無ＤＮＡｓｅ ＲＮＡサンプルから第１鎖ｃＤＮＡを合成し、「ＣＹＢＲ」サイバーグリーン蛍光検出器を具備した７７００ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍを用いてＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓプロトコルにしたがって、ＱＰＣＲアッセイを行う。
【００８０】
実施例８ 統計学的候補記憶遺伝子Ｃ／ＥＢＰ
２２１ｂｐの予想フラグメントが得られる、Ｑｕａｎｔａｇｅｎｅ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）によって設計された以下のＣ／ＥＢＰプライマーを、ＱＰＣＲ実験に使用し、２２１ｂｐの大きさの予想した断片を得た：５’−ＡＧＡＣＴＡＣＣＧＡＴＧＣＧＡＡＣＡＡＣ−３’（配列番号：１）および３’−ＧＴＣＣＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＣＧＴＣＴＡ−５’（配列番号：２）。
【００８１】
Ｃ／ＥＢＰデータのために、ハエを間隔訓練または集中訓練に供した２４時間後に約１０，０００個のハエの頭部から８つの複製ＲＮＡ抽出物を得た。各ＲＮＡ抽出部についてのＱＰＣＲ反応を、実施例７に概説の方法にしたがって三連で行った。
【００８２】
各Ｃ／ＥＢＰ反応の結果を、ＴＢＰββ（これらの状況で転写の変化が認められない対照遺伝子）についての一対のＱＰＣＲ反応に対するＲＮＡ量について規準化した。
【００８３】
この方法で分析して、臨界値に達するのに必要な平均Ｃ／ＥＢＰ増幅サイクル数は、間隔をあけた群では２１．８６±０．５６であり、集中群では２３．７８±０．５６であった。間隔をあけた群のほうが臨界値に達するための増幅サイクル数が少ないことから、これは、ＰＣＲ増幅の初期段階でＣ／ＥＢＰ濃度がより高いことを示す。
【００８４】
これらのデータは、Ｃ／ＥＢＰレベルが集中訓練群より間隔をあけた訓練群の方が３．７８倍高いことを示す（図５）。実験結果により、間隔をあけた訓練ハエと集中訓練ハエから単離したＣ／ＥＢＰ（緩徐境界（slow border ）細胞と呼ばれる、ショウジョウバエにおけるｓｌｏｂｏ）転写物が有意に異なることが確認された。マウスにおけるＣ／ＥＢＰの遺伝子操作により、長期記憶が促進され（Ｓｔｅｒｎｅｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５（１８）、１０９０８〜１０９１３、（１９９８））、ＡｐｌｙｓｉａにおけるＣ／ＥＢＰの分子操作によって長期促進（facilitation）（感作の長期記憶用の細胞基質）がブロックされる（Ａｌｂｅｒｉｎｉら、Ｃｅｌｌ、７６、１０９９〜１１１４、（１９９４））。したがって、本明細書中でＣＭＧとしてのＣ／ＥＢＰの確認は、記憶に関する転写物の同定にこのＤＮＡチップアプローチを使用することができる有意な確認法である。
【００８５】
実施例９ 訓練装置
実験を経験していないの雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（３００〜３５０ｇ）を、減音チャンバー中に設置した５つの同一のプレキシガラスおよびワイヤーメッシュケージ（８×１５×１５ｃｍ）中で訓練および試験した（ＣａｓｓｅｌｌａとＤａｖｉｓ、Ｐｈｙｓｉｏ．Ｂｅｈａｖ．、３６、３７７〜３８３、（１９８６））。驚愕惹起刺激は、５５ｄＢの背景ホワイトノイズに対して１０５ｄＢであった（５０ｍｓのホワイトノイズの群発（上昇−減衰時間は５ｍｓ））。８Ｗの蛍光電球によって、３．７秒の光ＣＳを得た（上昇−減衰時間１００μｓ、ＢＣＯフットランベルト（footlamberts）強度）。各ケージの床は、０．５ｓで０．６ｓまたは０．３ｍＡの周波数帯変換（scrambled ）フットショックを供給することができる４つのステンレススチールバーからなった。
【００８６】
実施例１０ 行動訓練法
全ての訓練の２日前の各日に、ラットを、驚愕チャンバー中に入れ、１５分後に１５回の驚愕刺激を与えた。Ｅｘｐ．１の単回訓練日に、動物を驚愕チャンバーに入れ、５分後に以下の試行間隔（ＩＴＩ）の１つで４回の光−ショック対を与えた：３秒間、５秒間、１０秒間、１５秒間、２分間、または８分間。最後の光−ショック対から５分後、動物を元のケージに戻した。４回のショック対間のＩＴＩがそれぞれ１０秒間および８分間である以外は対の集中訓練および間隔をあけた訓練を同様に行った。明らかに対ではない集中訓練試験は、光の集中投与（４回、１０秒間のＩＴＩ）およびその４分後のショックの集中投与（４回、１０秒間のＩＴＩ）とした。
【００８７】
実施例１１ 長期記憶試験
訓練から４８時間後、ラットを驚愕装置に置き、３０回の驚愕惹起刺激のみおよびその後に６０回の驚愕惹起刺激（半分は３．７秒の発光後３．２秒間行い（光−ノイズ試験）、半分は暗所に置いた（ノイズのみの試験））を与えた。２つの試験型の順番は不規則であった。３０秒の刺激間隔ですべての驚愕刺激を与えた。ＬＴＮの指標として使用する恐怖増強驚愕の差スコアを、３０回の光−ノイズ試験で得られた平均驚愕振幅（amplitudes）から３０回のノイズのみの試験から得られた平均驚愕振幅を引くことによって計算した。
【００８８】
実施例１２ 短期記憶試験
短期記憶（ＳＴＭ）試験は、訓練後１５〜４０分間で行われる以外はＬＴＭ試験と類似していた。２０回のノイズのみの刺激後、１５回の光−ノイズ刺激および１５回のノイズみの刺激を混合して与えた。恐怖増強驚愕の差スコアを、平均光−ノイズスコアからノイズのみのスコアを引くことによって計算し、これをＳＴＭの指標として使用した。
【００８９】
実施例１３ 手術
ラットを硫酸アトロピン（０．４ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で前処理し、ペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔し、標準的な定位固定装置に置いた。薬物注入ポンプに取り付けたハミルトンマイクロシリンジ（１０μｌ）を、注入に使用した。ＰａｘｉｎｏｓとＷａｔｓｏｎ（「定位調整でのラット脳（The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ、Ｓｙｎｄｎｅｙ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ、１９８６）にしたがって、扁桃の外側核（頭蓋骨表面下でＡＰ＝−２．８、Ｌ＝±５．２、ＤＶ＝−８．５に調整（coordinates ））または尾状核（ＡＰ＝＋０．２、Ｌ＝±３．０、ＤＶ＝−６．０に調整）を対象として、３０ゲージのカニューレを介した両側微量注入（２μｌ）により１０分間送達させた。拡散を確実にするために、注入カニューレをさらに１０分間放置した。
【００９０】
実施例１４ ウイルスの調製
ＣＲＥＢおよびｍＣＲＥＢ ｃＤＮＡ（Ｍ．Ｅ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから得た）およびＬａｃＺを、ＨＳＶアンプリコンＨＳＶ−ＰｒｐＵＣに挿入し、ヘルパー５ｄｌ １．２を用いて封入した（Ｌｉｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０、４６０〜４６９（１９９６）、Ｋｅｖｅら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、７９、４３５〜４４７（１９９７））。ウイルスを、スクロース勾配で精製し、ペレット化し、１０％スクロース中に再懸濁した。組換えウイルスストックの平均力価は、４．０×１０7 感染単位／ｍｌであり、ＨＳＶ−ＣＲＥＢおよびＨＳＶ−ｍＣＲＥＢと類似した。導入遺伝子発現を、ＨＳＶ即時型遺伝子ＩＥ−４／５の構成プロモーターによって制御した。
【００９１】
実施例１５ 免疫化学
ラットに抱水クロラールを過剰投与し、５０ｍｌのＰＢＳおよび２５０ｍｌの４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液で灌流した。脳を凍結防止して、ミクロトーム上で切断し（４０μｍ切片）、浮動性切片に免疫細胞化学法を行った。ＨＳＶ−ＬａｃＺを感染させた脳は、β−ガラクトシダーゼに反応し、ニュートラルレッドで対比染色した（Ｌｉｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０、４６０〜４６９（１９９６）、Ｋｅｖｅら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、７９、４３５〜４４７（１９９７）に従う）。簡単に述べれば、β−ガラクトシダーゼ活性を検出するために、脳のスライスを３．１ｍＭフェロシアン化カリウム、３．１ｍＭフェリシアン化カリウム、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１Ｍ ＰＢＳ、および０．２ｍｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌから構成される溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中で２時間反応させた。
【００９２】
ＨＳＶ−ＣＲＥＢ感染脳における導入遺伝子発現の分析を行った。簡単に述べれば、切片を、１％Ｈ2 Ｏ2 および０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘと２０分間インキュベートし、１％ウシ血清アルブミン、２％ヤギ正常血清、および０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで３０分間ブロックし、一次抗体ＣＲＥＢ（１：１０００、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）と４℃で一定で撹拌しながら一晩インキュベートした。切片を、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗血清（１：２００希釈、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）と室温で２時間インキュベートした。切片をリンスし、アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ）試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とインキュベートした。免疫反応性を、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）反応を用いて視覚化した。
【００９３】
実施例１６ その後の長期記憶レベルに対する恐怖条件付け試行間の試行間隔の影響
３秒間、５秒間、１０秒間、１５秒間、２分間、および８分間（それぞれｎ＝１０、１０、１０、５、５、１５）のＩＴＩでの４回の光−ショック対からなる訓練から４８時間後に評価した平均ＬＴＭ（±ＳＥＭ、恐怖増強驚愕差スコアとして評価）は、ＩＴＩによって変化した（Ｆ1.49＝３．０４、ｐ＜０．０５）。有意な線形トレンド（Ｆ1.49＝７．９９、ｐ＜０．０５）によって示されるように、ＬＴＭレベルは、ＩＴＩとより強いＬＴＭが得られるより長いＩＴＩとの一次関数である。集中訓練（３秒間、５秒間、１０秒間）により、非常に弱いＬＴＭ（約５０ユニット）が得られた。その後のダンカン比較によって８分間のＩＴＩ（間隔をあけた群）は、１０秒間、５秒間、および３秒間（集中群）よりも有意に強いＬＴＭが得られることが明らかとなったことから、１０秒間から８分間に休憩時間が増加するとＬＴＭは増加する。結果を、図６に示す。
【００９４】
実施例１７ 基底外側扁桃および扁桃外領域へのＨＳＶベクターの注入効果
基底外側扁桃にＨＳＶ−ＣＲＥＢを注入したラット（ｎ＝１７）は、ＰＢＳ（ｎ＝７）、ＨＳＶ−ＬａｃＺ（ｎ＝１０）、もしくはＨＳＶ−ｍＣＲＥＢ（ｎ＝１１）を同様に注入したラット、または扁桃の基底外側複合体周囲の脳領域（ｎ＝８）もしくは対照領域（尾状核、ｎ＝５）にＨＳＶ−ＣＲＥＢを注入したラットよりも有意に高いＬＴＭを示した（Ｆ5.52＝４，９９、ｐ＜０．００１）。分析後、基底外側扁桃にＨＳＶ−ＣＲＥＢ注入を受けたラットのＬＴＭレベルは、全ての他の群よりも有意に高いことが明らかとなった。
【００９５】
フットショックに対する反応性は、集中訓練前に基底外側扁桃にＨＳＶ−ＣＲＥＢ（ｎ＝１７）、ＨＳＶ−ｍＣＲＥＢ（ｎ＝１１）、ＨＳＶ−ＬａｃＺ（ｎ＝１０）、またはＰＢＳ（ｎ＝７）を注入した動物で異ならなかった（Ｆ3.41＝１．４１、ｐ＞０．０５）。平均刺激反応性を、それぞれ４回のフットショック後２００ｍｓの間、ケージを置換することによって評価した。
【００９６】
明らかに対ではない条件付け（ＣＳ（条件刺激）およびＵＳ（無条件刺激）が関連しない）では対照ラット（ｎ＝１０）に関連するＬＴＭは得られず、ＰＢＳ（ｎ＝５）またはＨＳＶ−ＣＲＥＢ（ｎ＝５）の扁桃内注入によってＬＴＭは変化しなかった（Ｆ2.17＝０．４４、ｐ＞０．０５）。
【００９７】
注入から１４日後に再試験した場合、集中訓練の３日前にＨＳＶ−ＣＲＥＢを投与した動物（３ｄ ＨＳＶ−ＣＲＥＢ、ｎ＝１０）は、ＨＳＶ−ＬａｃＺで同様に処理した動物（３ｄ ＨＳＶ−ＬａｃＺ、ｎ＝３）または集中訓練の１４日前にＨＳＶ−ＣＲＥＢを投与して４８時間後に試験した動物（１４ｄ ＨＳＶ−ＣＲＥＢ、ｎ＝４）より高いＬＴＭを示した（Ｆ2.14＝６．０５、ｐ＜０．０５）。
【００９８】
本明細書中で引用した全ての論文、特許、および特許出願の教示は、その全体が参考として援用される。
【００９９】
本発明は、好ましい態様について特に表示および記載しているが、添付の特許請求の範囲に定義の本発明の精神および範囲を逸脱することなく形態および内容について種々の変更を行うことができることが当業者に理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ハエにおいてパヴロフの嗅覚学習を行う、Ｔｕｌｌｙら，Ｃｅｌｌ，７９：３５−４７（１９９４）に記載された訓練プロトコルの模式図である。
【図２】 図２は、ＣＲＥＢリプレッサーの発現を誘導した後に、正常な（野生型）ハエにおいて一定間隔でまたは集中的に訓練を行った後、またはトランスジェニックｈｓ−ＣＲＥＢ２−ｒハエにおいて一定間隔訓練を行った後の、記憶保持を示す結果のグラフ図である（Ｙｉｎら，Ｃｅｌｌ，７９；４９−５８（１９９４）を参照されたい）。学習および早期記憶（シクロヘキシミド非感受性）は、トランスジェニックハエにおいては正常である。一定間隔訓練によって通常生じる追加的な（タンパク質合成依存性ＬＴＭ）記憶は、トランスジェニックハエにおいてブロックされる。この比較により、一定間隔訓練と集中訓練との唯一の差は、前者の後の転写依存性記憶の出現であることが明らかになる。
【図３】 図３は、特定の遺伝子の特定のセクションに完全にマッチする（ＰＭ）（相補的な）特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブについて検出されたシグナルと、その遺伝子のそのセクションにヌクレオチド配列エラー（変異）が導入された結果、その遺伝子のそのセクションにミスマッチする（ＭＭ）該プローブについて検出されたシグナルとの平均差を示す模式図である。ＰＭペアとＭＭペアと間の平均差（および遺伝子１つにつき通常は２０対）は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘデザイン・ソフトウェア解析（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）によって測定する。四角はマイクロアレイチップ上のミクロ配列を表す。
【図４】 図４Ａは、各々が一定間隔もしくは集中訓練の２４時間前に曝露した正常ショウジョウバエの頭部から抽出したＲＮＡから作製したＤＮＡプローブとハイブリダイズしているＮ＝１０チップから得た平均シグナル（変換され平均化された平均差）の散布図（間隔対集中）である。四角はそれぞれ特定のショウジョウバエ遺伝子を表し、そのうち１５４２個が各チップ上に含まれる。候補記憶遺伝子は、薄い影を付した四角によって同定される。そのプロット中のＣ／ＥＢＰ遺伝子の位置を図中に示す。
図４Ｂは、図４Ａから得た統計的に有意な値を示す散布図表示（間隔対集中）である。四角はそれぞれ特定のショウジョウバエ遺伝子を表し、そのうち１５４２個が各チップ上に含まれる。そのプロット中のＣ／ＥＢＰ遺伝子の位置を図中に示す。
【図５】 図５は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）実験から得た結果を表す棒グラフを示す。これらの結果は、Ｃ／ＥＢＰ遺伝子に対して間隔訓練および集中訓練が及ぼす影響の差を確認するものである。
【図６】 図６は、ラットにおける恐怖条件付け訓練試行間の試行間隔（ＩＴＩ）が後の長期記憶に対して及ぼす影響を表す棒グラフを示す。これらの結果は、集中的および一定間隔で訓練されたプロトコルの違いを明らかにし、恐怖増強驚愕の記憶が集中訓練よりも間隔訓練後の方が良いことを示す。
【図７】 図７は、ラットの扁桃におけるＣＲＥＢアクチベーターの過剰発現が長期記憶に対して及ぼす影響を表す棒グラフを示す。これらの結果は、扁桃におけるＣＲＥＢアクチベーターの過剰発現が、集中訓練後のラットにおいて恐怖増強驚愕の記憶を強化（増強）することを示す。
【図８】 図８は、ａｄｆ１ゲノム領域の分子マップを示す。
Claims (4)
- （ａ）非ヒト動物において転写依存性記憶形成を誘導するために非ヒト動物を訓練する工程；
（ｂ）工程（ａ）で訓練された前記非ヒト動物の脳組織からＲＮＡを抽出する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で抽出されたＲＮＡを用いてＤＮＡプローブを合成する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で合成されたＤＮＡプローブを、前記動物のゲノムの遺伝子由来のＤＮＡ配列を含むマイクロアレイチップに対し、マイクロアレイチップ上の相補的ＤＮＡ配列への前記ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションに適する条件下で曝露する工程、ここで、相補的ＤＮＡ配列への前記プローブのハイブリダイゼーションの際にシグナルが生ずる；
（ｅ）工程（ｄ）で生じたシグナルを検出する工程；ならびに
（ｆ）工程（ｅ）で検出されたシグナルと対照において検出されたシグナルとの間で、各遺伝子についてシグナル変換アルゴリズムを用いて統計的比較を実施する工程、ここで、前記対照は以下の工程：
（ｉ）記憶形成を誘導するための訓練を受けていない非ヒト対照動物の脳組織からＲＮＡを抽出する工程；
（ii）工程（ｆ）（ｉ）で抽出されたＲＮＡを用いてＤＮＡプローブを合成する工程；および
（iii）工程（ｆ）（ii）で合成されたＤＮＡプローブを、対照動物のゲノムの遺伝子由来のＤＮＡ配列を含むマイクロアレイチップに対し、マイクロアレイチップ上の相補的ＤＮＡ配列への前記ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションに適する条件下で曝露する工程、ここで、相補的ＤＮＡ配列への前記プローブのハイブリダイゼーションの際にシグナルが生ずる、
を含む方法により得られる、
を含む、転写依存性記憶に係わる１つまたは複数の遺伝子の同定方法であって、前記工程（ａ）の訓練が、間隔訓練プロトコル、シャトル−ボックス回避訓練プロトコル、または恐怖条件付け文脈訓練プロトコルである、方法。 - 前記転写依存性記憶形成が長期記憶形成である請求項１記載の方法。
- （ａ）ショウジョウバエにおいて転写依存性記憶形成を誘導するためにショウジョウバエを訓練する工程；
（ｂ）工程（ａ）で訓練されたショウジョウバエの頭部組織から全ＲＮＡを抽出する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で抽出されたＲＮＡを用いてＤＮＡプローブを合成する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で合成されたＤＮＡプローブを、ショウジョウバエゲノムの遺伝子由来のＤＮＡ配列を含むマイクロアレイチップに対し、マイクロアレイチップ上の相補的ＤＮＡ配列への前記ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションに適する条件下で曝露する工程、ここで、相補的ＤＮＡ配列への前記プローブのハイブリダイゼーションの際にシグナルが生ずる；
（ｅ）工程（ｄ）で生じたシグナルを検出する工程；ならびに
（ｆ）工程（ｅ）で検出されたシグナルと対照において検出されたシグナルとの間で、各遺伝子についてシグナル変換アルゴリズムを用いて統計的比較を実施する工程、ここで、前記対照は以下の工程：
（ｉ）記憶形成を誘導するための訓練を受けていない対照ショウジョウバエの頭部組織からＲＮＡを抽出する工程；
（ii）工程（ｆ）（ｉ）で抽出されたＲＮＡを用いてＤＮＡプローブを合成する工程；および
（iii）工程（ｆ）（ii）で合成されたＤＮＡプローブを、ショウジョウバエゲノムの遺伝子由来のＤＮＡ配列を含むマイクロアレイチップに対し、マイクロアレイチップ上の相補的ＤＮＡ配列への前記ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションに適する条件下で曝露する工程、ここで、相補的ＤＮＡ配列への前記プローブのハイブリダイゼーションの際にシグナルが生ずる、
を含む方法により得られる、
を含む、転写依存性記憶に係わる１つまたは複数の遺伝子の同定方法であって、前記工程（ａ）の訓練が、間隔訓練プロトコルである、方法。 - 前記転写依存性記憶形成が長期記憶形成である請求項３記載の方法。
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