DE60020239T2 - Verwendung von orthoestern zur synthese von chirale säuren in biokatalytischen irreversiblen veresterungsverfahren - Google Patents

Description

• Enantiomerenreine chirale Verbindungen werden in letzter Zeit verstärkt benötigt, da diese Verbindungen in einer Vielzahl verschiedener Gebiete (biomedizinische, agroalimentäre, spezielle Materialien und ähnliches) eingesetzt werden können. Racemische chirale Säuren können mit Hilfe einer Veresterung in einem organischen Lösungsmittel, welche durch eine Hydrolase (Lipase, Esterase, Protease) katalysiert wird, getrennt werden, wie es zum Beispiel in IT 1 274 482 und IT 1 275 458 dargestellt ist.
• Wenn eine racemische Säure RCOOH mit einem Alkohol R'OH in der Gegenwart einer Hydrolase mit R-Stereopräferenz umgesetzt wird, wird dieses Enantiomer dasjenige sein, welches schnell reagiert und bei dem die Veresterung viel schneller erfolgt, so das die unreagierte Säure mit dem S-Enantiomer gemäß des folgenden Schemas angereichert wird:
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• Offensichtlich scheint es möglich zu sein, das optisch reine S-Isomer einfach durch Ausdehnung der Umsetzung auf einen ausreichend hohen Wert zu erhalten. Die Reversibilität dieser Reaktion macht die Situation jedoch kompliziert, denn das R-Enantiomer, welches dasjenige ist, welches schneller gebildet wird, ist auch dasjenige, bei welchem zum Nachteil der optischen Reinheiten sowohl des R-Esters und als auch des Rückstandes der S-Säure einfacher die Hydrolyse erfolgt (Chen, C. S.; Wu, S. H.; Girdaukas, G. und SiH, C. J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 2812 -2817).
• Die oben genannten Einschränkungen werden auch bei der Entsymmetrisierung der meso-Formen von Polycarbonsäuren gefunden, wenn deren enantiotoposelektive Veresterung in der Gegenwart einer Hydrolase durchgeführt wird.
• Viele Herangehensweisen wurden vorgeschlagen, um die Probleme, die mit der Reversibilität der Veresterung verbunden sind, zu überwinden:
• a) Entfernen des Wassers aus dem Reaktionsgleichgewicht durch Zugabe von dehydratisierenden Salzen (Kvittingen, L.; Sjursnes, B. und Anthonsen, T. Tetrahedron 1992, 48, 2793 – 2802). Der Nachteil dieses Verfahrens ist, dass Wechselwirkungen zwischen den Salzpartikeln und denen der Enzyme auftreten, die die Enzyme schädigen und so deren Lebenszeit reduzieren und deren Rückgewinnung schwierig machen.
• b) Entfernen des Wassers aus dem Gleichgewicht durch Zugabe von Molekularsieben (Fonteyn, F.; Blecker, C.; Lognay, G.; Marlier, M. und Severin, M. Biotechnol. Lett. 1994, 16, 693 – 696). Zusätzlich zu den obigen Nachteilen kann der Alkohol, insbesondere im Fall von niedermolekularen Alkoholen, ebenfalls entfernt werden.
• c) Entfernen des Wassers durch Destillation. Dieses Verfahren kann nur eingesetzt werden, wenn das Wasser die niedriger siedende Verbindung in der Mischung ist. Aus diesem Grund kann es nicht zusammen mit niedrig siedenden Alkoholen oder Lösungsmitteln eingesetzt werden.
• d) Rückführung der Reaktionsprodukte, um deren optische Reinheit zu erhöhen (Morrone, R.; Nicolosi, G.; Patti, A. und Piattelli, M. Tetrahedron: Asymetry 1995, 6, 1773 – 1778). Dieses Verfahren erhöht deutlich die Aufarbeitungskosten.
• EP 051071 2 A und EP 0407033 A offenbaren biokatalysierte Veresterungsverfahren zur Synthese chiraler Säuren. Die Verwendung von Orthoestern wird in diesen Dokumenten nicht beschrieben.
• US 4,1 07,439 offenbart die Herstellung von Estern unter Verwendung eines Orthoesters, um Wasser aus der Reaktionsmischung zu entfernen.
• Es wurde nun gefunden, und das ist der Gegenstand der Erfindung, dass, wenn die Reaktion in Gegenwart von Orthoestern durchgeführt wird, letztere mit dem Wasser, welches sich während der Reaktion bildet, reagieren und dadurch das Verfahren irreversibel machen,
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• OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
• Die vorliegende Erfindung stellt deshalb ein Verfahren zur Trennung von enantiomeren Mischungen einer chiralen Carbonsäure der Formel R-COOH, bereit, worin R ein Kohlenwasserstoff-Rest ist, der gegebenenfalls ein oder mehr Heteroatome aufweist und gegebenenfalls mono- oder polysubstituiert ist, umfassend eine Veresterungsreaktion der Carbonsäure in einem organischen Lösungsmittel in der Gegenwart einer stereoselektiven Hydrolase, wobei ein Orthoester der Formel R¹-C(OR²)₃, worin R¹ aus H und C₁-C₄-Alkyl ausgewählt ist und R² C₁-C₈-Alkyl oder - CH₂-C_6-10-Aryl ist, als Veresterungsreagenz verwendet wird.
• R ist vorzugsweise der Rest einer entzündungshemmenden Arylpropionsäure wie (±)-(R,S)-2-(2-Fluor-4-biphenyl)propionsäure, (±)-(R,S)-2-(3-Benzoylphenyl)propionsäure, (±)-(R,S)-2-(4-iso-Butylphenyl)propionsäure, (±)-(R,S)-2-[4-(1-Oxo-2-isoindolinyl)phenyl]propionsäure, (±)-(R,S)-2-[4-(2-Thenoyl)phenyl]propionsäure und (±)-(R,S)-2-(6-Methoxy-2-naphthyl)propiosäure.
• R¹ ist vorzugsweise ausgewählt aus H, Methyl, Ethyl und n-Propyl und n-Butyl.
• Die stereoselektive Hydrolase ist vorzugsweise eine Lipase aus Candida antarctica, Candida cylindracea, Pseudomonas cepacia, Mucor miehei, Mucor javanicus, Aspergillus niger, Schweinepankreas oder eine Protease aus Aspergillus subtilis.
• Die Veresterungsreaktion wird im Allgemeinen bei einer Temperatur von 0 – 50°C, vorzugsweise bei 45°C durchgeführt. In gleicher Weise kann ein überkritisches Gas, wie zum Beispiel CO₂, als das Reaktionslösungsmittel eingesetzt werden.
• Die meso-Form einer Dicarbonsäure kann in der Veresterungsreaktion eingesetzt werden.
• Geeigneterweise umfasst das Verfahren gemäß der Erfindung den Schritt der Zugabe von einer Menge an Wasser oder an einem Alkohol mit 1 – 8 Kohlenstoffatomen, die 1 – 5 Mol-%, verglichen mit den Molen an chiraler Carbonsäure, entspricht, zu der Reaktionsmischung, bestehend aus Carbonsäure, der Hydrolase und dem organischen Lösungsmittel. Die Reaktion wird dadurch aktiviert und verläuft dann dank des aus der Reaktion des Orthoesters mit dem Wasser, welches während der Veresterungsreaktion gebildet wird, gebildeten Alkohols weiter.
• Die erhaltene Suspension wird unter Rühren bei der optimalen Temperatur für das eingesetzte Enzym gehalten. Der Fortgang der Reaktion kann mit Hilfe der üblichen analytischen Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, verfolgt werden. Wenn der gewünschte Umsatzwert, von dem der gewünschte Enantiomerenüberschuss des Produkts abhängt, erreicht wurde, wird die Reaktion durch Abfiltrieren der Enzyme gestoppt. Die Reaktionsprodukte werden dann durch Abtrennung mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren isoliert.
• Alternativ zur Verwendung der Orthoester können auch Carbonate im Verfahren der Erfindung eingesetzt werden.
• Die Irreversibilität der Veresterung, die gemäß dem Verfahren der Erfindung durchgeführt wird, ermöglicht die Herstellung chiraler Säuren in enantioreiner Form (insbesondere des Enantiomeren, welches nicht vom Enzym bevorzugt wird) durch Ausdehnung der Reaktionszeit bis zu Umsatzwerten größer als 50%.
• 1a zeigt die Änderung der optischen Reinheit des unreagierten Substrats in der Veresterungsreaktion von rac-Flurbiprofen in Abhängigkeit von der Reaktionszeit, wenn Methanol, Ethanol, Propanol und Butanol als Alkohol, Acetonitril als Lösungsmittel und eine Lipase aus Candida antarctica (mit R-Stereopräferenz) eingesetzt werden. In 1b ist der Fortgang der Reaktion unter denselben operativen Bedingungen unter Verwendung von Orthoformiaten (jeweils Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl) als Alkoholquelle dargestellt.
• Beim Vergleich des Fortgangs der Reaktion mit Alkoholen (1a) mit dem mit Orthoformiaten (1b) wird leicht deutlich, dass in der normalen Veresterung von Flurbiprofen der ee des unveränderten Substrats einen maximalen Wert von 80 – 85 erreicht und dann anfängt zu fallen.
• Im offenkundigen Gegensatz steigt der ee-Wert, wenn Orthoformiate verwendet werden, weiter an, wenn die Inkubationszeit und dadurch der Umsetzungswert ausgedehnt werden. Bei allen getesteten Orthoformiaten erreicht der ee-Wert der unreagierten Säure 95–98%.
• In 2 ist der Trend für die Veresterung von 2-Methylvaleriansäure in Hexan in Gegenwart der Candida cylindracea- Lipase (Stereopräferenz S) gezeigt. Die Veresterung mit Alkohol (2a) zeigt den üblichen Verlauf der reversiblen Reaktionen und der ee der verbleibenden Säure sinkt, wenn der Umsatz auf weit über 50% ausgedehnt wird. Die Veresterung unter Verwendung von Orthoformiaten verläuft als eine irreversible Reaktion (2b). Mit Tributylorthoformiat, dem besten der vier getesteten, werden Werte für den ee des verbleibenden Substrats von > 98 erhalten.
• Offensichtlich kann das vorgeschlagene Verfahren nicht nur zur Trennung von chiralen Säuren, sondern auch bei der Veresterung achiraler Säuren, insbesondere wenn diese sehr teuer sind, eingesetzt werden, um die Ausbeute durch Verschiebung des Gleichgewichts in Richtung Komplettierung zu erhöhen.
• Die folgenden Beispiele offenbaren die Erfindung im größeren Detail.
• Beispiel 1
• Herstellung von enantioreinem S-Flurbiprofen
• Novozym 435^® (Lipase aus Candida antartica) (100 g) wurde zu einer Lösung von racemischem Flurbiprofen (41 mmol, 10 g) in CH₃CN (1 L), enthaltend Tripropylorthoformiat (123 mmol, 26,5 ml) und 0.1 ml n-Propanol, gegeben. Die Mischung wurde bei 45°C unter Schütteln (300 rpm) inkubiert. Der Umsatz und der ee des unreagierten Flurbiprofen wurden mittels HPLC unter Verwendung einer Säule Chirex R-NGLY & DNB (250 × 4.0 mm) verfolgt. Nach 6 Tagen hatte der Umsatz 60% erreicht und die Reaktion wurde durch Abfiltrieren des Enzyms gestoppt.
• Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum ergab einen Rückstand, der zwischen Hexan und wässriger NaHCO₃ (3 g in 200 ml Wasser) verteilt wurde. Die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und das Lösungsmittel wurde entfernt, um 6.8 g des Propylesters von (-)-R-Flurbiprofen zu liefern (Ausbeute 58%, ee 64%). ¹H-NMR (CDCl₃): δ 0.89 (t, 3H, J = 7Hz), 1.54 (d, 3H, J = 7Hz), 1.65 (m, 2H), 3.78 (q, 1H, J = 7Hz), 4.06 (t, 2H, J = 6Hz), 7.1 – 7.6 (m, 8H).
• Analyse berechnet für C₁₈H₁₉FO₂; C, 75.70; H, 6.69. gefunden: C, 75.62; H, 6.89.
• Ansäuern der wässrigen Phase mit H₂SO₄ ergab einen Niederschlag von (+)-S-Flurbiprofen (3.9 g, Ausbeute 39%, ee > 98%). Analyse berechnet für C₁₅H₁₃FO₂; C, 73.76; H, 5.36. gefunden: C, 73.90; H, 5.52.
• Beispiel 2
• Herstellung von enantioreiner (R)-2-Methylvaleriansäure
• Candida cylindracea-Lipase (50 g) wurde zu einer Lösung von racemischer 2-Methylvaleriansäure (86.2 mmol, 10 g) in Hexan (500 ml), enthaltend Tributylorthoformiat (86.2 mmol, 23 ml) und 0.1 ml n-Butanol, gegeben. Die Mischung wurde bei 45°C unter Schütteln (300 rpm) inkubiert. Der Umsatz und der ee des Butylesters wurden mittels GC unter Verwendung einer β-Cyclodextrin-Säule (Dimethylpenthylbetacdx/OV1701 3:7) verfolgt. Nach 48 Stunden hatte der Umsatz 65% erreicht und die Reaktion wurde durch Abfiltrieren des Enzyms gestoppt. Nach Verteilung mit wässriger NaHCO₃ (3 g in 200 ml Wasser) wurde die Hexan-Phase über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum verdampft, um 9.6 g des Butylesters von (S)-2-Methylvaleriansäure zu ergeben (Ausbeute 65%, ee 53%). Die MS-Daten stimmten mit denen, die in der Literatur angegeben sind, überein (Kim Ha, J.; Lindsay, R.C.; J. Food Compos. Anal. 1989, 2, 118 -131).
• Analyse berechnet für C₁₀H₂₀O₂; C, 69.72; H, 11.70. gefunden: C, 69.98; H, 11.84.
• Die wässrige Phase wurde mit H₂SO₄ angesäuert, dreimal mit Hexan extrahiert und die organischen Phasen wurden gesammelt. Entfernen des Hexans unter Vakuum ergab 3.5 g (R)-2-Methylvaleriansäure (Ausbeute 35 %, ee > 97%). [a]_D ²⁰ = 18.2 (Substanz); (Lit. [a]_D ²⁰ = 18.4 (Substanz); Levene, P. A.; Marker, R. E. J. Biol. Chem. 1932, 98, 1) Analyse berechnet für C₆H₁₂O₂; C, 62.04; H, 10.41. gefunden: C, 62.31; H, 10.52.

Claims (9)

1. Ein Verfahren zur Trennung von enantiomeren Mischungen einer chiralen Carbonsäure der Formel R-COOH, worin R ein Kohlenwasserstoff-Rest ist, der optional ein oder mehr Heteroatome aufweist und optional mono- oder polysubstituiert ist, umfassend eine Veresterungsreaktion der Carbonsäure in einem organischen Lösungsmittel in der Gegenwart einer stereoselektiven Hydrolase, dadurch gekennzeichnet, dass ein Orthoester der Formel R¹-C(OR²)₃, worin R¹ aus H und C₁-C₄-Alkyl ausgewählt ist und R² C₁-C₈-Alkyl oder - CH₂-C_6-10-Aryl ist, als Veresterungsreagenz verwendet wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin R¹ aus H, Methyl, Ethyl, n-Propyl und n-Butyl ausgewählt ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die stereoselektive Hydrolase eine Lipase ausgewählt aus Candida antarctica, Candida cylindracea, Pseudomonas cepacia, Mucor miehei, Mucor javanicus, Aspergillus niger, Schweinepankreas oder eine Protease aus Aspergillus subtilis ist.
4. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, worin die Veresterungsreaktion bei einer Temperatur von 0 – 50°C, vorzugsweise bei 45°C, durchgeführt wird.
5. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, umfassend den Schritt der Zugabe der Reaktionsmischung in einer Menge an Wasser oder an einem Alkohol mit 1 – 8 Kohlenstoffatomen, die 1 – 5 Mol-%, verglichen mit den Molen der chiralen Carbonsäure, entspricht.
6. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, worin in der Veresterungsreaktion die meso-Form einer Dicarbonsäure als Substrat eingesetzt wird.
7. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche 1 – 6, worin die Carbonsäure ausgewählt ist aus (±)-(R,S)-2-(2-Fluor-4-biphenyl)propansäure, (±)-(R,S)-2-(3-Benzoylphenyl)propansäure, (±)-(R,S)-2-(4-iso-Butylphenyl)propansäure, (±)-(R,S)-2-[4-(1-Oxo-2-isoindolinyl)phenyl]propansäure, (±)-(R,S)-2-[4-(2-Thenoyl)phenyl]propansäure und (±)-(R,S)-2-(6-Methoxy-2-naphthyl)propansäure.
8. Verwendung eines Orthoesters der Formel R¹-C(OR²)₃, worin R¹ aus H und C₁-C₄-Alkyl ausgewählt ist und R² C₁-C₈-Alkyl oder - CH₂-C_6-10-Aryl ist, in Kombination mit einer stereoselektiven Hydrolase zur Trennung von enantiomeren Mischungen an chiralen Carbonsäuren.
9. Verwendung gemäß Anspruch 8, worin die Hydrolase eine Lipase ausgewählt aus Candida antarctica, Candida cylindracea, Pseudomonas cepacia, Mucor miehei, Mucor javanicus, Aspergillus niger, Schweinepankreas oder eine Protease aus Aspergillus subtilis ist.