CN112048527B

CN112048527B - 一种双酶联用拆分手性物质的方法

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Publication number: CN112048527B
Application number: CN202010838999.2A
Authority: CN
Inventors: 杨博; 李志刚; 方颖琳; 王永华; 陈华勇
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2020-08-19
Filing date: 2020-08-19
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2040-08-19
Also published as: CN112048527A

Abstract

本发明公开了一种双酶联用拆分手性物质的方法，包括以下步骤：(1)向外消旋手性酸溶液中添加固定化脂肪酶以及酰基受体，将该体系于搅拌条件下进行反应；将反应后的溶液加入碱溶液进行除酸和萃取，分离得到上相和下相；下相pH调节至酸性，回收未反应的手性酸后，加入可溶性盐，生成盐溶液；(2)在盐溶液中加入脂肪酶MAS1 H108A、亲水性溶剂和步骤(1)的上相，形成三液相；将三液相体系进行水解反应，静置或离心至分为三层，水解后的单一旋光手性产物主要富集于中液层，上液层产物为另一含单一旋光手性产物的酯类或酰胺类产品。该方法原料利用率高，条件温和，解决了现有酶法拆分效率低、手性选择性差、回收率低等问题。

Description

一种双酶联用拆分手性物质的方法

技术领域

本发明属于生物工程与食品技术领域，涉及到酶的分离与应用技术，特别涉及到利用酶法拆分手性物质的方法。

背景技术

随着药物手性和药效关系的深入研究,人们发现手性因素的药物对映体在人体内的药理活性、代谢过程及毒性存在显著差异,多数情况下只有一种药物对映体有显著的药理活性,而另一种对映体活性较低、或没有活性、或活性相反甚至导致毒副作用。手性药物的合成研究愈发受各国的关注与重视。

然而工业上采用的不对称合成或者非对映体盐结晶法等物化方法拆分手性药物存在着拆分剂选择困难、价格昂贵、有毒性，污染环境等缺点(Patel RN.Biocatalysis forsynthesis of pharmaceuticals.Bioorganic&Medicinal Chemistry.2018；26(7):1252-74)。近年来，以脂肪酶为代表的界面酶拆分手性酸药物由于具有较高的选择性，反应条件温和，污染小等优势，已成为行业寄予厚望的热点Rocha

Teixeira R,

NMT,Afonso CAM.Enzymatic Kinetic Resolution of Secondary Alcohols Using an IonicAnhydride Generated In Situ[J].ChemSusChem.2017；10(1):296-302.。但是，一方面脂肪酶的催化属于界面催化，即使在双相体系中产物也会对反应有较大的抑制，难以用现有体系提高催化效率；另一方面手性拆分对光学纯度要求极高，通常情况下，光学纯度要大于99％，即只有那些高选择性的酶才有工业化潜力。使用单酶进行选择性催化的效果根据底物有不同的效果，单酶催化手性拆分的光学纯度达不到要求。另外，传统的酶法拆分往往存在着控制困难，产物分离和酶的回用难以兼容等问题加大研发难度，严重制约发展。因此亟需开发一种高效、可控的催化及分离体系，以适用其发展。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供一种具有分离效果好，拆分效率高，绿色环保，操作简便，便于放大，能耗低可实现自动化连续化生产的手性物质拆分方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种双酶联用拆分手性物质的方法，包括以下步骤：

(1)用疏水性溶剂配置外消旋手性酸溶液，向溶液中添加固定化脂肪酶以及酰基受体，所述酰基受体以脂肪醇为主；将该体系于搅拌条件下进行酶催化反应；所述外消旋手性酸与酰基受体的摩尔比为1:1-1:12；将反应后的溶液通过加入碱溶液进行除酸和萃取，分层后经分离得到上相和下相；在下相中加入酸溶液将pH调节至酸性，加入疏水性溶剂萃取回收未反应的手性酸，之后加入可溶性盐，生成盐溶液；所述的脂肪酶为诺维信435；

(2)在盐溶液中加入脂肪酶MAS1 H108A、亲水性溶剂和步骤(1)的上相，形成三液相体系，上相即步骤(1)生成上相，以手性酸酯为主；中相即为加入的亲水性溶剂，下相即步骤(1)生成的盐溶液；将三液相体系于搅拌条件下进行水解反应，反应结束后，静置或离心至分为三层(从上自下依次为上液层、中液层和下液层)，水解后的单一旋光手性产物主要富集于中液层，上液层产物为另一含单一旋光手性产物的酯类或酰胺类产品。

优选地，步骤(1)所述的疏水性试剂为正己烷，异丙醇，异丙醚和异辛烷中的一种；所述脂肪醇为伯醇。

优选地，步骤(1)所述的脂肪醇包括甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇的一种；所述的碱溶液为氢氧化钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸氢钾和氨水中的一种；所述的酸溶液为硫酸、盐酸、硝酸和磷酸中的一种，浓度为0.05～10mol/L。

优选地，步骤(2)所述的可溶性盐是柠檬酸钠、氯化钠、硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的一种或两种。

优选地，步骤(2)所述的述亲水性溶剂为聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、乙二醇和丙酮中的一种或两种以上；或者所述亲水性溶剂为[BMIM]Br、[BMIM]BF4、[EMIM]ETSO4和[OMIM]Cl中的一种或两种以上。

优选地，步骤(1)的反应条件为：温度30～45℃，反应时间为4h～6h；步骤(2)的反应条件为：温度10～45℃，反应时间20min～4h。

优选地，步骤(1)所述的外消旋手性酸选自扁桃酸、萘普生和布洛芬的一种。

优选地，步骤(1)所述的外消旋手性酸占疏水性溶剂质量的0.1％-10％，优选1％-5％。

优选地，步骤(3)所述的可溶性盐、亲水性溶剂、上相和酶液的质量比为0.2-0.8，0.2-0.8，0.2-0.4。

优选地，步骤(1)所述脂肪酶的浓度为1-10000U/g，步骤(2)所述脂肪酶的浓度为1-1000U/mL；步骤(3)所述的三液相体系pH值为5-9。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明克服了目前酶法拆分手性物质的存在的拆分效率低，成本高，连续化生产困难，反应抑制等问题，提供了一种高效，绿色，经济的拆分方法。首先通过酯化，得到后续反应需要的底物，酯化过程中的底物以及产物分离消耗的盐均可回收，用于后续构建三液相体系进行反应，脂肪酶分配在富盐相，水解后的单一旋光手性产物富集于另一相，经简单离心或静置即可将产物回收利用。两步过程，既提高了拆分效率，也利于酶的回收与利用，降低酶的损耗。该方法反应条件温和，拆分效率高，原料利用率高，解决了酶法拆分手性物质难以工业化的技术难题。本发明双酶联用对产物进行多次选择性拆分，还提高产物的对映体过量值(ee值)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步具体描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

本实施例中使用的固定化酶为Novozym 435，购于诺维信(中国)生物有限公司。脂肪酶MAS1 H108A为来源Streptomyces sp.strain W007(基因编号:AY260764)的突变体，其氨基酸序列如SEQ NO.1所示。

实施例1

称取200mg的Novozym 435酶，加入10mL的20g/L的扁桃酸异丙醚溶液中进行反应，加入与扁桃酸摩尔比为4:1的甲醇，反应温度为30℃，反应时间为6h。向反应混合物中加入与未反应的扁桃酸等摩尔的1mol/L的氢氧化钠溶液，目的使扁桃酸盐溶于水相。静置分层，上相为富含扁桃酸甲酯的异丙醚，R-扁桃酸甲酯的e.e值达到68％。下相加入硫酸调节pH至酸性，然后再加入异丙醚萃取分离回收未反应的手性酸，再加入硫酸钠，获得下相含盐溶液。将上述所得的含盐溶液加入脂肪酶MAS1 H108A、聚乙二醇400，形成双水相体系，其中，硫酸钠为15％，酶液为65％，聚乙二醇400为20％，百分比均为质量百分比；再向双水相体系中加入富含扁桃酸甲酯的异丙醚溶液，为双水相体系质量的20％，形成三液相体系。扁桃酸甲酯在三液相体系中水解，反应温度为37℃，反应时间为1h。三液相体系中，酶在中下相的分配系数K为6.3，R-扁桃酸e.e.值达到98.06％，转化率达到84.27％。

实施例2

称取200mg的Novozym 435酶，加入10mL的10g/L的扁桃酸异丙醚溶液中进行反应，加入与扁桃酸摩尔比为4:1的正戊醇，反应温度为30℃，反应时间为6h。向反应混合物中加入与未反应的扁桃酸等摩尔的0.5mol/L的氢氧化钾溶液，目的使扁桃酸盐溶于水相。静置分层，上相为富含扁桃酸戊酯的异丙醚，R-扁桃酸甲酯的e.e值达到65％。下相加入硫酸调节pH至酸性，然后再加入异丙醚萃取分离，再加入硫酸钾，获得下相含盐溶液。将上述所得的含盐溶液加入脂肪酶MAS1 H108A、聚乙二醇600，形成双水相体系，其中，硫酸钾为22％，酶液为60％，聚乙二醇600为18％，加入双水相体系的20％的富含扁桃酸戊酯的异丙醚溶液，形成三液相体系，百分比均为质量百分比。扁桃酸戊酯在三液相体系中水解，反应温度为37℃，反应时间为2h。三液相体系中，酶在中下相的分配系数K为5.7，R-扁桃酸e.e.值达到96.24％，转化率达到79.49％。

实施例3

称取200mg的Novozym 435酶，加入10mL的20g/L的扁桃酸的正己烷溶液中进行反应，加入与扁桃酸摩尔比为3:1的乙醇，反应温度为30℃，反应时间为6h。向反应混合物中加入与未反应的扁桃酸等摩尔的1mol/L的氨水溶液，目的使扁桃酸盐溶于水相。静置分层，上相为富含扁桃酸乙酯的正己烷，R-扁桃酸乙酯的e.e值达到67％。下相加入硫酸调节pH至酸性，然后再加入异辛烷萃取分离，再加入硫酸铵，获得下相含盐溶液。将上述所得的含盐溶液加入脂肪酶MAS1 H108A、[BMIM]Br，形成双水相体系，其中，硫酸铵为20％，酶液为60％，[BMIM]Br为20％，百分比均为质量百分比。向双水相体系加入富含扁桃酸乙酯的正己烷溶液，为双水相体系质量的20％，形成三液相体系。扁桃酸乙酯在三液相体系中水解，反应温度为37℃，反应时间为2h。三液相体系中，R-扁桃酸e.e.值达到94.65％，转化率达到78.45％。值得注意，氨水碱性较弱，除酸过程中仍有剩余的扁桃酸未除去，影响后续水解的产物的e.e.值，因此需除尽未反应的扁桃酸。

实施例4

称取200mg的Novozym 435酶，加入10mL的15g/L的扁桃酸异丙醚溶液中进行反应，加入与扁桃酸摩尔比为6:1的正丁醇，反应温度为30℃，反应时间为6h。向反应混合物中加入与未反应的扁桃酸等摩尔的1mol/L的氢氧化钾溶液，目的使扁桃酸盐溶于水相。静置分层，上相为富含扁桃酸正丁酯的异丙醚，R-扁桃酸正丁酯的e.e值达到67％。下相加入磷酸调节pH至酸性，然后再加入异丙醚萃取，再加入磷酸氢二钾，获得下相含盐溶液。将上述所得的含盐溶液加入脂肪酶MAS1 H108A、异丙醇，形成双水相体系，其中，磷酸氢二钾为19％，酶液为64％，异丙醇为17％，百分比均为质量百分比。向双水相体系加入上述所得的富含扁桃酸正丁酯的异丙醚溶液，为双水相体系质量的20％，形成三液相体系。扁桃酸正丁酯在三液相体系中水解，反应温度为37℃，反应时间为2h。三液相体系中，酶在中下相的分配系数K为9.8，R-扁桃酸e.e.值达到96.92％，转化率达到80.68％。

实施例5

称取200mg的Novozym 435酶，加入10mL的15g/L的外消旋萘普生异辛烷溶液中进行反应，加入与萘普生摩尔比为1:1的甲醇，反应温度为30℃，反应时间为6h。向反应混合物中加入与未反应的萘普生等摩尔的1mol/L的氢氧化钠溶液，目的使萘普生盐溶于水相。静置分层，上相为富含萘普生甲酯的异辛烷溶液，R-萘普生甲酯的e.e值达到72％。下相加入硫酸调节pH至酸性，然后再加入异辛烷萃取分离，再加入硫酸钠，获得下相含盐溶液。将上述所得的含盐溶液加入脂肪酶MAS1 H108A、PEG400，形成双水相体系，其中，硫酸钠为15％，酶液为65％，PEG400为20％，百分比均为质量百分比。向双水相体系加入上述得到的富含萘普生甲酯的异辛烷溶液，为双水相体系质量的20％，形成三液相体系。萘普生甲酯在三液相体系中水解，反应温度为37℃，反应时间为4h。三液相体系中，酶在中下相的分配系数K为13，R-萘普生e.e.值达到96.81％，转化率达到75.48％。

实施例6

称取200mg的Novozym 435酶，加入10mL的10g/L的外消旋萘普生异辛烷溶液中进行反应，加入与萘普生摩尔比为1:1的甲醇，反应温度为30℃，反应时间为6h。向反应混合物中加入与未反应的萘普生等摩尔的10mol/L的氢氧化钠溶液。静置分层，上相为富含萘普生甲酯的异辛烷溶液，R-萘普生甲酯的e.e值达到70％。下相加入硫酸调节pH至酸性，然后再加入异辛烷萃取分离，再加入硫酸钠，获得下相含盐溶液。将上述所得的含盐溶液加入脂肪酶MAS1H108A、PEG600，形成双水相体系，其中，硫酸钠为15％，酶液为65％，PEG600为20％，百分比均为质量百分比。向双水相体系加入富含萘普生甲酯的异辛烷溶液，为双水相体系质量的20％，形成三液相体系。萘普生甲酯在三液相体系中水解，反应温度为37℃，反应时间为4h。三液相体系中，R-萘普生e.e.值达到96.43％，转化率达到76.64％。由于萃取时加入碱溶液浓度过大，导致部分萘普生甲酯水解，使得酯化过程中萘普生甲酯回收率下降，反应的总转化率下降。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种双酶联用拆分手性物质的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 265

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Thr Ala Thr Ala Ala Thr Pro Ala Ala Glu Ala Thr Ser Arg Gly

1 5 10 15

Trp Asn Asp Tyr Ser Cys Lys Pro Ser Ala Ala His Pro Arg Pro Val

20 25 30

Val Leu Val His Gly Thr Phe Gly Asn Ser Ile Asp Asn Trp Leu Val

35 40 45

Leu Ala Pro Tyr Leu Val Asn Arg Gly Tyr Cys Val Phe Ser Leu Asp

50 55 60

Tyr Gly Gln Leu Pro Gly Val Pro Phe Phe His Gly Leu Gly Pro Ile

65 70 75 80

Asp Lys Ser Ala Glu Gln Leu Asp Val Phe Val Asp Lys Val Leu Asp

85 90 95

Ala Thr Gly Ala Pro Lys Ala Asp Leu Val Gly Ala Ser Gln Gly Gly

100 105 110

Met Met Pro Asn Tyr Tyr Leu Lys Phe Leu Gly Gly Ala Asp Lys Val

115 120 125

Asn Ala Leu Val Gly Ile Ala Pro Asp Asn His Gly Thr Thr Leu Leu

130 135 140

Gly Leu Thr Lys Leu Leu Pro Phe Phe Pro Gly Val Glu Lys Phe Ile

145 150 155 160

Ser Asp Asn Thr Pro Gly Leu Ala Asp Gln Val Ala Gly Ser Pro Phe

165 170 175

Ile Thr Lys Leu Thr Ala Gly Gly Asp Thr Val Pro Gly Val Arg Tyr

180 185 190

Thr Val Ile Ala Thr Lys Tyr Asp Gln Val Val Thr Pro Tyr Arg Thr

195 200 205

Gln Tyr Leu Asp Gly Pro Asn Val Arg Asn Val Leu Leu Gln Asp Leu

210 215 220

Cys Pro Val Asp Leu Ser Glu His Val Ala Ile Gly Thr Ile Asp Arg

225 230 235 240

Ile Ala Phe His Glu Val Ala Asn Ala Leu Asp Pro Ala Arg Ala Thr

245 250 255

Pro Thr Thr Cys Ala Ser Val Ile Gly

260 265

Claims

1.一种双酶联用拆分手性物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）用疏水性溶剂配置外消旋手性酸溶液，向溶液中添加固定化脂肪酶以及酰基受体，将该体系于搅拌条件下进行酶催化反应；所述外消旋手性酸与酰基受体的摩尔比为1:1-1:12；将反应后的溶液通过加入碱溶液进行除酸和萃取，分层后经分离得到上相和下相；在下相中加入酸溶液将pH调节至酸性，加入疏水性溶剂萃取回收未反应的手性酸，之后加入可溶性盐，生成盐溶液；所述的脂肪酶为诺维信435；所述酰基受体为甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇中的一种，所述疏水性试剂为正己烷、异丙醇、异丙醚和异辛烷中的一种；

（2）在盐溶液中加入脂肪酶MAS1 H108A、亲水性溶剂和步骤（1）的上相，形成三液相体系；将三液相体系于搅拌条件下进行水解反应，反应结束后，静置或离心至分为三层，水解后的单一旋光手性产物主要富集于中液层，上液层产物为另一含单一旋光手性产物的酯类或酰胺类产品；所述亲水性溶剂为聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、乙二醇和丙酮中的一种或两种以上；或者所述亲水性溶剂为[BMIM]Br、[BMIM]BF₄、[EMIM]ETSO₄和[OMIM]Cl中的一种或两种以上。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的碱溶液为氢氧化钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸氢钾和氨水中的一种；所述的酸溶液为硫酸、盐酸、硝酸和磷酸中的一种，浓度为0.05-10mol/L。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的可溶性盐是柠檬酸钠、氯化钠、硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的一种或两种。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步骤(1)的反应条件为：温度30～45℃，反应时间为4h～6h；步骤(2)的反应条件为：温度10～45℃，反应时间20min~4h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的外消旋手性酸选自扁桃酸、萘普生和布洛芬的一种。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的外消旋手性酸占疏水性溶剂质量的0.1%-10%。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的外消旋手性酸占疏水性溶剂质量的1%-5%。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述可溶性盐与脂肪酶MAS1H108A的质量比为0.2-0.8，步骤（2）所述亲水性溶剂和上相与脂肪酶MAS1 H108A的质量比分别为0.2-0.8、0.2-0.4。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述脂肪酶的浓度为1-10000U/g，步骤（2）所述脂肪酶MAS1 H108A的浓度为1-1000 U/mL。