CN113355369B

CN113355369B - 一种采用流加方式的固定化脂肪酶催化制备共轭亚油酸的方法及应用

Info

Publication number: CN113355369B
Application number: CN202010135636.2A
Authority: CN
Inventors: 牛坤; 洪永德; 姜书华; 吴文忠
Original assignee: Innobio Corp ltd
Current assignee: Innobio Corp ltd
Priority date: 2020-03-02
Filing date: 2020-03-02
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2040-03-02
Also published as: CN113355369A

Abstract

本发明公开了一种采用流加方式的固定化脂肪酶催化制备共轭亚油酸的方法，其步骤包括，制备酯化共轭化料后，将固定化酶装入用筛网制成的口袋中；总用酶量为酯化共轭化料量1‑10％。将共轭化料使用酸调节至pH5‑7.5，与水按质量比1:0.5‑10混合均匀，配制成反应液，预热，减压，蒸出水和醇，同时流加水，使得加入水量和流出的水的质量比为1:0.5‑2，反应至酸值≥185；后进行固定化酶回收；分离出的油水混合物静置分水，油层脱水后进分子蒸馏。终产品过氧化值、水解率、茴香胺值等方面显著优于现有技术。同时反应较快，成本较低，缩短优化整个工艺流程，产能增加，后处理简易化，利于后续实现生产。

Description

一种采用流加方式的固定化脂肪酶催化制备共轭亚油酸的方法及应用

技术领域

本发明涉及固定化脂肪酶催化技术领域，特别涉及一种采用流加方式的固定化脂肪酶催化制备共轭亚油酸的方法及应用。

背景技术

共轭亚油酸(简称CLA)是亚油酸分子的几种立体和位置异构体的通称，是含有共轭双键的十八碳二烯酸。CLA系列中，c9，t11-CLA和t10，c12-CLA是含量最多且已经被证实具有生理活性的两种主要异构体。天然的CLA主要存在于瘤胃动物中，并且含量较低，因此人类基本无法从自然界中获得。共轭亚油酸有诸多作用，例如抗动脉硬化、降低血脂、调节血压并对部分癌症有抑制作用。同时其抗氧化性、抗疲劳、调节免疫减肥增肌的活性正被越来越多的开发出来。

其制备上多数厂家会选择皂化酸化来进行亚油酸的制备，或者采用酶法，但是会选择增加乳化剂(CN200810110995.1)、固定化酶柱状反应(CN 103849660 A)、旋转填料床(CN201610647385.x)等方式，从而带来了诸如增加分离成本、增加初期设备成本以及反应慢等特点。例如：CN 103849660 A医诺生物(大连)股份有限公司申请的，以有机酸共轭化甲酯或乙酯料为反应原料，进入固定化酶的填料柱，反应后油水分离得到产品；该工艺存在的缺点如下：采用固定化酶柱式反应，使用酶量较大，初始设备成本较高。CN200810110995.1为领先科技公司申请的，利用脂肪酶在乳化剂存在下进行水解反应，水解率为90％以上，但其缺点是采用乳化剂进行反应，后续分离繁琐，同时反应时间长。专利CN201711436720.2是丰益(上海)生物技术研发中心有限公司申请的，将水、油脂和脂肪酶、糖化酶混合反应，补加糖化酶，反应后进行相分离，干燥得到油相，该工艺存在的缺点如下：反应同时使用脂肪酶和糖化酶，成本增加，同时反应时间长。专利CN201610647385.x主要描述一种改进的酶催化用旋转填料床反应器及其在酶催化油脂水解制备脂肪酸中的应用，无溶剂体系中，反应时间减少，产率提高。但存在旋转填料床装置的操作复杂，设备成本和运行成本高的缺点；专利CN20138001797提供一种用于在均质混合物中酶促水解油脂的有效方法。本发明特别提供用于由脂肪生产脂肪酸、sn-区域单酰基甘油(MAG)、sn-区域二酰基甘油(DAG)和甘油的方法，其中超过98％的脂肪可转化为期望产物，但其使用了叔丁醇等有机溶剂来提高转化率，同时还采用了离子交换树脂，方式复杂，提纯困难。

总之，现有技术中亟需一种能解决解决上述问题的新工艺。

发明内容

针对现有技术中的合成方法复杂、成本高等问题，本发明采用的方案是釜式搅拌反应，同时创新性的采用了抽真空流加水的方式，将醇水共沸出去，同时补加新水继续快速反应，使得成本降低，反应时间减少，产能增加，后处理简易化，利于后续实现生产，获得的产品酸值大于等于185，共轭化料的水解率高达90-99％的产品，同时，所述产品中共轭亚油酸的含量78-85％；过氧化值为0-1.0，茴香胺值为0-5。是现有技术中其他工艺无法达到的。

本发明一方面为采用流加方式的固定化脂肪酶催化制备共轭亚油酸的方法，其步骤包括：

1.将红花籽油与C_1-4短链醇按照摩尔比为1：0.5-5混合，加入红花籽油质量的1-5％称取碱性化合物一起投入到反应釜，氮气置换后在60-90℃条件下搅拌反应3-5h；所述C_1-4短链醇为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇；

2.反应产物酸化至pH为5-7搅拌，静置，分离出油相产物，得到红花籽油脂肪酸酯化产物酯化物；将产物降膜脱汽后得到的物料与酯化物质量的1-5％的醇钾或醇钠投入反应釜中，氮气置换后在110-160℃条件下搅拌反应1-5h，得到最终产物，即酯化共轭化料。

3.将固定化酶装入用60-200目筛网制成的口袋中。总用酶量为酯化共轭化料量1-10％，密封后投入釜中。将共轭化料使用酸调节至pH5-7.5，与水按质量比1:0.5-10混合均匀，配制成反应液，预热至40-80℃，减压，蒸出水和醇，同时流加水，使得加入水量和流出的水的质量比为1:0.5-2，反应至酸值≥185。

4、固定化酶回收

反应结束后直接沉淀固定化酶包，油水混合物从釜底放出，固定化酶包由于不能通过釜底放料口，所以留在釜中，直接用于下一釜反应。

5、油的后处理

分离出的油水混合物静置分水，油层脱水后进分子蒸馏。

进一步地，所述红花籽油与C_1-4短链醇按照摩尔比为1：1-3.5混合。进一步优选的C_1-4短链醇为C_1-2短链醇，即甲醇或乙醇。

进一步地，所述的碱性化合物加入量为红花籽油质量的2-3％。

进一步地，所述的碱性化合物常见的有氢氧化钠，氢氧化钾，醇钠或醇钾等中一种或几种；

进一步地，所述的步骤(2)中，醇钾或醇钠添加量为酯化物质量的3-5％；

进一步地，所述的步骤(3)中固定化酶选自黑曲霉(Aspergillus niger)、米黑根毛霉菌(Rhizomucor miehei)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)等，酶活性为≥4000u/g；优选的酶活性为4000-150000u/g；最优选的酶活性为4000-20000u/g。

进一步地，所述的步骤(3)中固定化酶，可以根据不同釜体大小进行适当的调整，一般装入每个口袋的量为20-100g。

进一步地，所述的步骤(3)中，总用酶量为酯化共轭化料量的4-8％；

进一步地，所述的步骤(3)中，调节共轭化料pH所使用的酸选自柠檬酸、冰醋酸、盐酸、磷酸或硫酸中的至少一种；优选的共轭化料pH值调至6-7；优选的，将共轭化料与水按质量比1：2-6混合均匀，配制成反应液。

进一步地，所述的步骤(3)中，加入水量和流出的水的质量比为1:0.5-2。

进一步地，所述的步骤(3)中，反应至酸值≥185，优选≥196。

本发明另一方面为所述的方法在制备共轭亚油酸中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、最优酶量4-8％该酶量下，终产品的酸值大于等于185；共轭化料的水解率高达90-99％；制备得到的产品中共轭亚油酸的含量78-85％；过氧化值为0-1.0；茴香胺值为0-5，即产品品质较好，包括过氧化值、水解率、茴香胺值等方面显著优于现有技术。油脂的指标包括缩水甘油酯等污染物大大降低，同时反应较快，成本较低，搅拌效果好。

2、抽真空流加水的工艺，创新性的提出该工艺，其优点在于初始投加水较少，利用短链醇沸点低，与水共沸去除短链醇，再补加水，保证反应正向进行，酸解过程加快。

3、采用流加水并抽真空的方式，缩短优化整个工艺流程，使得成本降低，反应时间减少，产能增加，后处理简易化，利于后续实现生产。

4、不需要加入乳化剂，就能很好的进行水解反应，减少后处理的流程。减少酸水的产生，对环境友好。

5、利用水和短链醇在较低温度下可以沸腾的特点，使酶反应和醇去除同时进行，简化了工序。

6、固定化酶填充于筛网制成的口袋中，能够最大限度的减少酶的破损，可以最大限度的保留酶的完整性，酶可以进行循环利用，同时方便后期分离。

7、酶直接回收在反应釜中，避免了酶在过滤、离心过程中的损失，可以最大限度的保留酶的完整性，酶可以进行循环利用，使用100次以上，仍然能达到要求。本发明所涉及方法简单，所得产品领域有良好的应用前景。

具体实施方式

下面结合本发明的具体实施方式进行详细地描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

本申请下述实施例中使用的试剂有以下几种：红花油(中粮集团)，乙醇(科密欧试剂级)，氢氧化钠(试剂级)，测定方法，分别为GB 5009.168-2016食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定、GB 5009.227-2016食品安全国家标准食品中过氧化值的测定、GB5009.229-2016食品安全国家标准食品中酸价的测定、GB/T 24304-2009动植物油脂茴香胺值的测定；

下述实施例中的固定化酶为黑曲霉Aspergillus niger，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种，采购于安徽绿维康生物科技有限公司，商品名称为LVK100，酶活10000u/g。

实施例1

——抽真空流加水的工艺

将红花籽油与乙醇按照摩尔比为1:3.5，加入红花籽油质量的3％的氢氧化钠一起投入到反应釜，氮气置换后在80℃条件下搅拌反应3h。

反应产物酸化至pH为7搅拌，静置，分离出油相产物，得到红花籽油脂肪酸乙酯产物；将产物降膜脱汽后得到的物料与乙酯质量的3％的醇钾投入反应釜中，氮气置换后在130℃条件下搅拌反应3h，得到最终产物，即乙酯共轭化料。

将固定化酶装入用200目筛网制成的口袋中。每个口袋装入20g固定化酶，总用酶量为乙酯共轭化料总质量的4％，密封后投入釜中。将共轭化料使用有机酸调节至pH6，与水按质量比1:4混合均匀，配制成反应液，预热至60℃搅拌，减压蒸出水和醇，同时流加水，使得加入水量和流出的质量相同，反应5小时至酸值198.0。

反应结束后直接沉淀固定化酶包，油水混合物从釜底放出，固定化酶包由于不能通过釜底放料口，所以留在釜中，直接用于下一釜反应，分离出的油水混合物静置分水，油层脱水后进分子蒸馏，产品质量好：

通过GB 5009.229-2016食品安全国家标准食品中酸价的测定实验测得：酸值198，

通过GB 5009.168-2016食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定实验测得：气相组成共轭亚油酸81.5％，

通过GB 5009.168-2016食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定实验测得：反式脂肪酸0.3％；

通过GB 5009.227-2016食品安全国家标准食品中过氧化值的测定实验测得：过氧化值为0.5；

通过GB/T 24304-2009动植物油脂茴香胺值实验测得：茴香胺值为3.0。

通过实验测得：水解率96.5％。

实施例2

1.将红花籽油与甲醇按照摩尔比为1：3加入红花籽油质量的2.5％的氢氧化钠一起投入到反应釜，氮气置换后在75℃条件下搅拌反应4h；

2.共轭化

反应产物酸化至pH为7搅拌，静置，分离出油相产物，得到红花籽油脂肪酸甲酯；将产物降膜脱汽后得到的物料与质量的3％的醇钾投入反应釜中，氮气置换后在140℃条件下搅拌反应4h，得到最终产物，即甲酯共轭化料。

3.酶法水解

将固定化酶装入用200目筛网制成的口袋中。每个口袋装入25g固定化酶，总用酶量为甲酯共轭化料量的4.5％，密封后投入釜中。将共轭化料使用有机酸调节至pH6，与水按质量比1:2混合均匀，配制成反应液，预热至55℃，减压，蒸出水和醇，同时流加水，使得加入水量和流出的质量相同，反应6小时至酸值197.0。

4、固定化酶回收

5、油的后处理

分离出的油水混合物静置分水，油层脱水后进分子蒸馏。

6、产品性质检测结果：

通过GB 5009.229-2016食品安全国家标准食品中酸价的测定实验测得：酸值197；

通过实验测得：水解率96.1％；

通过GB 5009.168-2016食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定实验测得：制备得到的产品中共轭亚油酸的含量81％；

通过GB 5009.227-2016食品安全国家标准食品中过氧化值的测定实验测得：过氧化值为0.8；

通过GB/T 24304-2009动植物油脂茴香胺值实验测得：茴香胺值为4；

通过GB 5009.168-2016食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定测得：反式脂肪酸0.5％。

实施例3

1.将红花籽油与丙醇按照摩尔比为1：4加入红花籽油质量的2.5％的氢氧化钠一起投入到反应釜，氮气置换后在70℃条件下搅拌反应5h；

2.共轭化

反应产物酸化至pH为6搅拌，静置，分离出油相产物，得到丙酯；将产物降膜脱汽后得到的物料与质量的4％的醇钾投入反应釜中，氮气置换后在160℃条件下搅拌反应4h，得到最终产物，即共轭化料。

3.酶法水解

将固定化酶装入用100目筛网制成的口袋中。每个口袋装入35g固定化酶，总用酶量为乙酯共轭化料总质量的7％，密封后投入釜中。将共轭化料使用有机酸调节至pH6，与水按质量比1:5混合均匀，配制成反应液，预热至60℃，减压，蒸出水和醇，同时流加水，使得加入水量和流出的质量1:1.5，反应6.5小时至酸值196。

4、固定化酶回收

5、油的后处理

分离出的油水混合物静置分水，油层脱水后进分子蒸馏。

6、产品性质检测结果：

通过GB 5009.229-2016食品安全国家标准食品中酸价的测定实验测得：酸值196；

通过实验测得：水解率95.6％

通过GB 5009.168-2016食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定实验测得：制备得到的产品中共轭亚油酸的含量80.5％；

通过GB 5009.227-2016食品安全国家标准食品中过氧化值的测定实验测得：过氧化值为0.7；

通过GB/T 24304-2009动植物油脂茴香胺值实验测得：茴香胺值为4.2。

通过GB 5009.168-2016食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定测得：反式脂肪酸0.4％。

实施例4

1.将红花籽油与丁醇按照摩尔比为1：5加入红花籽油质量的2.5％的氢氧化钠一起投入到反应釜，氮气置换后在70℃条件下搅拌反应5h；

2.共轭化

反应产物酸化至pH为7搅拌，静置，分离出油相产物，得到红花籽油脂肪酸甲酯；将产物降膜脱汽后得到的物料与质量的5％的醇钾投入反应釜中，氮气置换后在150℃条件下搅拌反应4h，得到最终产物，即共轭化料。

3.酶法水解

将固定化酶装入用100目筛网制成的口袋中。每个口袋装入45g固定化酶，总用酶量为乙酯共轭化料总质量的8％，密封后投入釜中。将共轭化料使用有机酸调节至pH6.5，与水按质量比1:6混合均匀，配制成反应液，预热至70℃，减压，蒸出水和醇，同时流加水，使得加入水量和流出的质量1:0.5，反应8小时至酸值197.5。

4、固定化酶回收

5、油的后处理

分离出的油水混合物静置分水，油层脱水后进分子蒸馏。

6、产品性质检测结果：

通过GB 5009.229-2016食品安全国家标准食品中酸价的测定实验测得：酸值197.5；

通过实验测得：水解率96.3％

通过GB 5009.168-2016食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定实验测得：制备得到的产品中共轭亚油酸的含量79％；

通过GB/T 24304-2009动植物油脂茴香胺值实验测得：茴香胺值为3.2。

通过GB 5009.168-2016食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定测得：反式脂肪酸0.7％。

实施例5

回用100次

将回用100次的固定化酶包，总用酶量为油量4％，投入釜中。将共轭化料使用有机酸调节至pH6，与水按质量比1:4混合均匀，配制成反应液，预热至60℃搅拌，减压蒸出水和醇，同时流加水，使得加入水量和流出的质量相同，反应5小时至酸值196.0。

反应结束后直接沉淀固定化酶包，油水混合物从釜底放出，固定化酶包由于不能通过釜底放料口，所以留在釜中，直接用于下一釜反应，分离出的油水混合物静置分水，油层脱水后进分子蒸馏。

产品性质检测结果：

通过GB 5009.229-2016食品安全国家标准食品中酸价的测定实验测得，酸值196；

通过实验测得：共轭化料的水解率高达95.6％；

对比例1

按照专利CN 103849660 A的方法实施

(1)取100g的甲酯共轭化料在50℃下加入适量的50％的硫酸/水中和至pH为8后继续酸化1h，得酸化甲酯共轭化料，所述甲酯共轭化料中共轭亚油酸甲酯含量为80wt％；

(2)将5g固定化脂肪酶填充在酶反应柱中，酶反应柱的温度保持在45℃；

(3)将步骤(1)的得到的酸化甲酯共轭化料与水按质量比1:0.5配成反应液，反应液搅拌均匀，得到乳化体系，并预热至40℃，通过恒流泵泵入步骤(2)准备的酶反应柱中，搅拌速度为100rpm/min流速为0.5mL/min，连续反应4h，得到反应产物，在80℃的条件下，继续利用50％的硫酸/水溶液酸化至pH7.0左右，然后离心得到油相，即为最终产物。酸值为182，水解率为88.8％，反式脂肪酸为0.6％，过氧化值为3.2，茴香胺值为10.1。

对比例2

(1)向100g的甲酯共轭化料中加入50％的柠檬酸水溶液，中和至pH为8后继续酸化1h，得酸化甲酯共轭化料，所述甲酯共轭化料中共轭亚油酸甲酯含量为80wt％；

(2)将5g固定化脂肪酶填充在酶反应柱中，酶反应柱的温度保持在40℃；

(3)将步骤(1)的得到的酸化甲酯共轭化料与水按质量比1:0.5配成反应液，反应液搅拌均匀，并预热至40℃，通过恒流泵泵入步骤(2)准备的酶反应柱中，搅拌速度为100rpm/min流速为0.5mL/min，连续反应4h，得到反应产物在80℃的条件下，继续利用50％的柠檬酸/水溶液酸化至pH7.0左右，然后离心得到油相，即为最终产物，酸值为194，水解率为94.6％，反式脂肪酸为0.5％，过氧化值为4，茴香胺值为9.1。

该实施例采用的是固定化酶—酶反应柱，初始成本较高，同时较难脱出副反应物甲醇，同时产品品质，尤其因为中和温度较高，过氧化值，茴香胺值相对比较差，因此该工艺在产业化应用时，存在初始成本较高、产品过氧化较差的缺点。

对比例3

——减压回流

反应产物酸化至pH为7搅拌，静置，分离出油相产物，得到红花籽油脂肪酸乙酯产物；将产物降膜脱汽后得到的物料与乙酯质量的3％的醇钾投入反应釜中，氮气置换后在140℃条件下搅拌反应3h，得到最终产物，即乙酯共轭化料。

将固定化酶装入用200目筛网制成的口袋中。每个口袋装入20g固定化酶，总用酶量为油量4.5％，密封后投入釜中。将共轭化料使用有机酸调节至pH7，与水按质量比1:3混合均匀，配制成反应液，预热至60℃，减压冷凝回流，反应8小时至酸值184。

反应结束后直接沉淀固定化酶包，油水混合物从釜底放出，固定化酶包由于不能通过釜底放料口，所以留在釜中，直接用于下一釜反应，油层脱水后进分子蒸馏。

产品质量较差，酸值184，水解率89.8％，气相组成共轭亚油酸80.1％，反式脂肪酸0.6％。过氧化值为1.0，茴香胺值为4.9。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims

1.一种采用流加方式的固定化脂肪酶催化制备共轭亚油酸的方法，其特征在于：所述方法的步骤包括，

（1）将红花籽油与 C_1-4短链醇按照摩尔比为1：0.5-5混合，加入红花籽油质量的1-5%称取碱性化合物一起投入到反应釜，氮气置换后在60-90℃条件下搅拌反应 3-5h；其中，所述C_1-4短链醇为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇；

（2）反应产物酸化至 pH 为 5-7 搅拌，静置，分离出油相产物，得到红花籽油脂肪酸酯化产物酯化物；将产物降膜脱汽后得到的物料与酯化物质量的1-5%的醇钾或醇钠投入反应釜中，氮气置换后在110-160℃条件下搅拌反应 1-5h，得到最终产物，即酯化共轭化料；

（3）将固定化酶装入用60-200目筛网制成的口袋中；总用酶量为酯化共轭化料量的4-8%，酶活性为4000-150000u/g；密封后投入釜中；将共轭化料使用酸调节至pH5-7.5，与水按质量比 1:0.5-10混合均匀，配制成反应液，预热至 40-80℃，减压，蒸出水和醇，同时流加水，使得加入水量和流出的水的质量比为1:0.5-2，反应至酸值≥196；

（4）固定化酶回收

反应结束后直接沉淀固定化酶包，油水混合物从釜底放出，固定化酶包由于不能通过釜底放料口，所以留在釜中，直接用于下一釜反应；分离出的油水混合物静置分水，油层脱水后进分子蒸馏。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述红花籽油与 C_1-4短链醇按照摩尔比为1：3-5混合。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述碱性化合物加入量为红花籽油质量的2-3%。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述碱性化合物选自氢氧化钠，氢氧化钾，醇钠或醇钾的一种或几种。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤（2）中，醇钾或醇钠添加量为酯化物质量的3-5%。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤（3）中，固定化酶选自黑曲霉(Aspergillus niger)、米黑根毛霉菌(Rhizomucor miehei)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤（3）中，调节共轭化料pH所使用的酸选自柠檬酸、冰醋酸、盐酸、磷酸或硫酸中的至少一种。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤（3）中，共轭化料pH值调至6-7。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述的步骤（3）中，将共轭化料与水按质量比1：2-6混合均匀，配制成反应液。

10.如权利要求1所述的方法在制备共轭亚油酸中的应用。