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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine nahrhafte oder therapeutische
Zusammensetzung zur oralen Verabreichung, welche eine natürlich vorkommende
Vorstufe umfasst, die zu einer Verbindung mit Anandamidaktivität verstoffwechselt
wird, zur Verwendung als Medikament oder Nahrungsprodukt, ein Verfahren
zur Herstellung der Zusammensetzung, die Verwendung der Zusammensetzung
bei der Herstellung einer nahrhaften oder therapeutischen Zusammensetzung
zur Behandlung oder Verhinderung einer Verhaltensstörung, und
ein Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung einer Verhaltensstörung, das
Verabreichen einer wirksamen Menge der Zusammensetzung umfasst.
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In
dieser Beschreibung soll der Ausdruck "umfassen" verstanden werden als "enthält unter
anderen Dingen".
Es ist nicht beabsichtigt, diesen als "enthält
lediglich" verstanden
zu wissen. Die Standardnomenklatur für Fettsäureverbindungen wird verwendet.
So wird beispielsweise die Anzahl der Kohlenstoffatome und die Anzahl
und Position von Doppelbindungen für Arachidonsäure mit "20:4(5,8,11,14)" bezeichnet: die
Zahl vor dem Doppelpunkt stellt die gesamte Anzahl der Kohlenstoffatome
dar, die Zahl unmittelbar nach dem Doppelpunkt die Anzahl der Doppelbindungen,
und die Zahlen in Klammern beschreiben die Position der Doppelbindungen,
beginnend mit dem die Carboxylsäuregruppe
tragenden Kettenende. In dieser Art und Weise wird sich bei allen
Verbindungen bezogen, ausgenommen an Stellen, an denen anderweitig
angezeigt ist, dass alle Doppelbindungen in cis vorliegen.
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Die
verwendete Standardnomenklatur für
Klassen von Fettsäureverbindungen
zeigt die Stellung der Doppelbindung an, die der Methylgruppe, gekennzeichnet
durch "n-3" oder "n-6", am nächsten gelegen
ist: die Zahl die dem Bindestrich folgt, bezeichnet die Position
der Doppelbindung, die dem Methylende des Moleküls, gezählt von dem Methylende, am
nächsten
gelegen ist. Arachidonsäure
gehört
daher wie Linolsäure (18:2(9,12))
in die n-6 Klasse, wohingegen Eicosapentaenonsäure (20:5(5,8,11,14,17)) in
die n-3 Klasse gehört.
Diese Nomenklatur ist äquivalent
zu der "Omega oder ω" Nomenklatur in der
Literatur, wobei "ω" und "n" austauschbar sind.
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Anandamid
(auch als N-Arachidonylethanolamin bezeichnet) ist ein Beispiel
für N-Acylethanolamin (nachstehend
als NAE bezeichnet). Sowohl NAEs als auch N-Acylamine (nachstehend
als NAAs bezeichnet), wobei ein Beispiel für das Letztgenannte Oleamid
ist, kommen im menschlichen Körper
natürlich
vor. Sie wurden im Hippocampus, im Striatum, im Cerebellum, der
Niere, dem Herz, im Plasma und in Zerebrospinalflüssigkeit
als auch in menschlicher Milch aufgefunden.
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Der
Ausdruck "Anandamidaktivität" wird in dieser Beschreibung
verwendet, um eine Aktivität
zu bezeichnen, die ausgewählt
ist aus der Gruppe, die eine Aktivität umfasst, die dem Arzneimittel
9-Tetrahydrocannabinol (THC) zugeschrieben wird, als auch Auswirkungen spezifisch
für Anandamid
und 1- und 2-Monoarachidonylglycerolisomeren (nachstehend als AG
bezeichnet) und von THC verschieden. Es wurde vorgeschlagen, dass
die Anandamid- und AG-Aktivitäten normalerweise,
jedoch nicht notwendigerweise, durch Bindung an die als CB1 und
CB2 bekannte Rezeptorklasse vermittelt werden. Diese Anandamidaktivitäten umfassen, ohne
darauf beschränkt
zu sein: Antinociception, Katalepsie und Hemmung der Bewegungsaktivität in vivo
und Ersetzung von 9-Tetrahydrocannabinol (THC), Hemmung der Adenylatcyclase,
Hemmung von Calciumkanälen,
Aktivierung der Phospholipase A2, Freisetzung
intrazellulären
Calciums in vitro und Hemmung eines Zuckreflexes ex vivo.
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Der
Ausdruck Anandamid, wie er in dieser Beschreibung verwendet wird,
bezeichnet ein NAE, NAA oder MAG mit einer Anandamidaktivität (wie vorstehend
definiert). Die akzeptierte wissenschaftliche Nomenklatur wird in
dieser Beschreibung verwendet werden, wenn eine Bezugnahme auf spezifische
Acylkomponenten eines NAE, NAA oder MAG genommen wird.
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Es
ist wohlbekannt, dass pharmazeutische Verbindungen eine breite Anwendung
für ihre
beruhigenden Wirkungen aufweisen und dass sie bei der Behandlung
von Patienten verwendet werden können,
die an Zuständen,
wie beispielsweise Hypertonie, Glaukom, Insomnie, Schmerz, Entzündung, Migräne-Kopfschmerzen,
Konvulsionen, Appetitlosigkeit, Übelkeit,
Krämpfe,
Durchfall, Asthma, Nervosität,
Aggressivität, übermäßige Schüchternheit,
Unvermögen
zu Schlafen, Katalepsie, gedrückte
Stimmung, Depression, Darmstörungen oder
Spasmen, schlechter motorische Kontrolle, Tics, übermäßigen Stress, Spastizität oder Multiple
Sklerose leiden. Mehrere dieser Verbindungen kommen jedoch in der
Natur nicht natürlich
vor und in dieser Hinsicht könnten
Patienten widerwillig sein, diese verabreicht zu bekommen. Im Hinblick
darauf besteht ein Bedarf, neue Produkte bereitzustellen, die natürlich vorkommende
Vorstufen von Verbindungen mit einer nahrhaften und therapeutischen
Wirkung umfassen, wenn sie endogen zu aktiven Verbindungen mit Anandamidaktivität verstoffwechselt
werden.
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Darüber hinaus
besteht ein Problem mit den meisten im Handel erhältlichen
Arzneimitteln darin, dass sie Nebenwirkungen hervorrufen, wie beispielsweise Übelkeit,
Aufquellen, Krämpfe,
etc. Somit besteht klar ein Bedarf nach einer Zusammensetzung, die
keine dieser Nebenwirkungen hervorruft.
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Das
Verfahren einer Verabreichung einer nahrhaften oder therapeutischen
Verbindung ist eine wichtige Betrachtung. Intravenöse oder
subkutane Verabreichung von Arzneimitteln erfordert Expertise und
verglichen mit einer oralen Verabreichung ist sie nicht so sicher,
bequem oder für
den Patienten annehmbar. Im Lichte dieser Punkte ist klar, dass
ein Bedarf besteht nach neuen, nahrhaften oder therapeutischen Produkte,
die oral verabreicht werden können.
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Zusätzlich zu
den vorstehend erwähnten
Problemen, sind Kindernahrungen gewöhnlich so aufgebaut, dass sie
menschlicher Milch so stark wie möglich ähneln, wobei jedoch mehrere
Bestandteile in der menschlichen Milch biologisch aktiv sind so
dass aufgrund von Synergien unter den Bestandteilen der Einschluss
bzw. die Aufnahme von lediglich einem oder einigen von diesen die
biologische Aktivität
der menschliche Milch nicht reproduzieren könnte. Im Hinblick darauf besteht
ein Problem, dem Wissenschaftler gegenwärtig gegenüberstehen, in der Formulierung
von Kindernahrungen oder Entwöhnungsnahrungen,
die Bestandteile aufweisen, die in der Milch vorkommen und die eine äquivalente
Aktivität
zu menschlicher Milch aufweisen. Das Problem leitet sich von der
Tatsache ab, dass nicht alle Bestandteile in menschlicher Milch
identifiziert wurden und die Konzentration von vorhandenen Bestandteilen,
die möglicherweise
aufgrund von Variationen bei der Ernährung der Mutter vorkommen
variiert Ein weiteres Problem, dem Ernährungswissenschaftler gegenüberstehen, besteht
auf dem Gebiet der Haustiernahrung. Einige Haustiere sind aggressiv
wohingegen andere furchtsam oder schüchtern sind. Maulkörbe wurden
bereitgestellt, die über
die Köpfe
aggressiver Tiere passen und deren Mäuler umhüllen. Dies kann hinsichtlich
der Tatsache, dass ein Maulkorb dazu dienen kann, das Tier zu ärgern, keine
gute Lösung
sein. Im Lichte dieses Umstands besteht ein Bedarf nach alternativen
Lösungen,
um übermäßig aggressive
oder furchtsame Haustiere zu beruhigen.
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Die
US-5,874,459 offenbart, dass Anandamid als ein Ligand wirken kann,
der mit Cannabinoidrezeptoren in dem Zentralnervensystem und dem
Darm (CB1 Rezeptoren) und/oder Immunzellen und Geweben wie beispielsweise
der Niere, dem Thymus und Lymphozyten (CB2 Rezeptoren) interagiert.
Weiterhin zeigt dieses Dokument, das Interaktionen zwischen Anandamid
und diesen zwei Typen von Cannabinoidrezeptoren physiologische Wirkungen
hervorrufen. Es wird beschrieben, dass gezeigt werden konnte, dass
Nicht-Arachidonyl NAEs und NAAs Anandamid inaktivierende Enzyme
hemmen. Diese Hemmung weist die schlussendliche Wirkung auf, dass
die Wirkung von Anandamid potenziert wird.
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Die
WO-96/40106 beschreibt ein Verfahren zur Behandlung einer neurologischen
Erkrankung, das die Verabreichung eines mikrobiellen Öls, dass
Arachidonsäure
und/oder Dokosahexaenonsäure
(DHA) umfasst.
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Es
wurde vorgeschlagen, dass eine Familie von NAEs und NAAs als auch
sn-1 und sn-2 Monoarachidonylglyceriden Agonisten von Anandamidrezeptoren
(hier bezieht sich Anandamidrezeptor auf einen Rezeptor, an den
Anandamid binden könnte,
einschließlich
CB1, CB2, Nicht-CB-Rezeptoren)
darstellen und Antworten analog zu denen durch Anandamid hervorgerufenen,
bewirken. Die chemischen Strukturen von NAEs und NAAs basieren auf
Fettsäuren
und abhängig
von den spezifisch veresterten Fettsäuren wurde gezeigt, dass sie
unterschiedliche Aktivitäten
zeigen. So kann beispielsweise Palmitoylethanolamid mit dem CB2
Rezeptor, aber nicht dem CB1 Rezeptor interagieren und weist eine
anti-entzündliche
Wirkung, aber keine bekannte neurologische Wirkung auf, wohingegen
Anandamid sowohl mit dem CB1 Rezeptor des Zentralnervensystems als auch
dem CB2 Rezeptor des Immunsystems wechselwirkt.
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In
Nature, Vol. 396, Seite 636, (1998) werden die Ergebnisse einer
Analyse offenbart, in der NAEs und 2-Arachidonoylglycerol (2-AG)
in Nahrungsmitteln einschließlich
menschlicher, Rinder- und Ziegenmilch und in verschiedenen Bearbeitungsstufen
von Kakao identifiziert wurden. Das Dokument legt nahe, dass Anandamid
(300 mgkg Körpergewicht–1)
und 2-Arachidonylglycerol (400 mgkg Körpergewicht–1)
eine biologische Aktivität
aufweisen, wenn sie von Mäusen
oral aufgenommen werden, wobei jedoch die Verbindungen im Verhältnis zu
den normalerweise vorhandenen Konzentrationen in Lebensmitteln,
lediglich bei sehr hohen Konzentrationen aktiv waren und die erhaltenen
Ergebnisse zeigen, dass die Mengen von Anandamid, 2-AG und Oleamid
in Lebensmitteln, einschließlich
Milch und Kakao, einige Größenordnungen
unter denen liegen, die erforderlich sind, wenn sie durch den Mund
verabreicht werden, um das Blut zu erreichen und beobachtbare "zentrale Wirkungen" zu erzielen. Das
Dokument zeigt jedoch, das reine Dosen von Anandamid, 2-AG und Oleamid beruhigende
Wirkungen und Wirkungen auf das Immunsystem aufweisen, wenn sie
in Tiere injiziert werden. Beruhigende Wirkungen sind durch verringerte
Aktivität,
verminderte Nociception und erhöhte
Schlafneigung gekennzeichnet.
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Die
US-568,955 offenbart, dass synthetisch hergestellte, mehrfach ungesättigte Fettsäureamide
und deren Derivate die Wirkung von natürlich vorkommenden Anandamiden
im Hirn nachahmen können
und an den Cannabinoidrezeptor binden. Die beschriebenen Verbindungen
zeigen physiologische Aktivität
und werden als nützliche
aktive Bestandteile pharmazeutischer Zusammensetzungen zur Behandlung
von Entzündung,
Migränen,
Spastizität,
Glaukom und Multipler Sklerose dargestellt.
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Bemerkenswerterweise
wurde nun festgestellt, dass eine Zusammensetzung zur oralen Verabreichung
bereitgestellt werden kann, die eine Vorstufe umfasst, die endogen
verstoffwechselt wird, um eine Verbindung mit Anandamidaktivität zu bilden.
Insbesondere ist es überraschend,
dass eine Nahrungs- bzw. Lebensmittelvorstufe selektiv vom ZNS aufgenommen
wird und selektiv in den NAE-Pool eingebaut wird, um als ein CB
Rezeptor bindender Ligand zu dienen. Außerdem ist bemerkenswert, dass
ein Lebensmittelvorläufer lediglich
eine kleine Veränderung
in der Phospholipidacylzusammensetzung, jedoch eine große Änderung
in der Zusammensetzung von NAE hervorruft.
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Die
Erfindung betrifft die vorstehend aufgeführten Probleme.
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Demgemäß stellt
eine erste erfindungsgemäße Ausführungsform
eine nahrhafte oder therapeutische Zusammensetzung zur oralen Verabreichung
zur Verwendung als ein Medikament oder Nahrungsprodukt bereit, die
einen natürlich
vorkommenden Vorläufer,
wie in Anspruch 1 definiert, umfasst, der zu einer Verbindung mit
Anandamidaktivität
verstoffwechselt wird.
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In
einer zweiten Ausführungsform
stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer nahrhaften oder
therapeutischen Zusammensetzung zur oralen Verabreichung bereit,
das die Schritte umfasst, Identifizieren, Reinigen oder Synthetisieren
eines natürlich
vorkommenden Vorläufers,
wie in Anspruch 1 definiert, der zu einer Verbindung mit Anandamidaktivität verstoffwechselt
wird.
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In
einer dritten Ausführungsform
stellt die Erfindung die Verwendung eines Vorläufers, wie in Anspruch 1 definiert,
bereit, der zu einer Verbindung mit Anandamidaktivität verstoffwechselt
wird, für
die Herstellung einer nahrhaften oder therapeutischen Zusammensetzung
zur Behandlung oder Verhinderung einer Anandamid vermittelten Unpässlichkeit,
die ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Hypertonie, Glaukom, Insomnie, Schmerz,
Entzündung,
Migräne-Kopfschmerzen,
Appetitlosigkeit, Übelkeit,
Krämpfe,
Durchfall, Darmstörungen,
intestinale Bewegungsstörungen,
Asthma, Nervosität,
Aggressivität, übermäßige Schüchternheit,
Unvermögen
zu Schlafen, Katalepsie, gedrückte
Stimmung, Depression, Spasmen, schlechte motorische Kontrolle, Tics, übermäßigen Stress,
Spastizität,
Multiple Sklerose und Vokalisation, schwacher Spracherwerb, Hautentzündung und übermäßige Nociception.
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Vokalisation
soll Störungen
in der Lautgebung bedeuten und Vokalisation bezieht sich auf ein
Bindungsverhalten, beispielsweise zwischen einem Kind und der Mutter.
Derartige Vokalisationen sind wichtig bei der Viehzucht und bei
der erfolgreichen Aufzucht der Nachkommen durch die Mutter bei im
Haus gehaltenen Haustieren. Weiterhin können Verhaltensweisen, wie
chronisch anhaltendes Schreien bei Menschenkindern durch orale Verabreichung
einer Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
behandelt werden.
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Eine
orale Verabreichung einer Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
kann ebenfalls dazu verwendet werden, eine Entzündung in oberflächigem Säugergewebe
(bspw. Haut) zu behandeln oder zu verhindern, in dem in diesen Geweben
die Mengen an Verbindungen mit Anandamid ähnlicher Aktivität moduliert
werden.
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Der
Vorläufer,
der zu einer Verbindung mit Anandamidaktivität verstoffwechselt wird, ist
eine mehrfach ungesättigte
Fettsäure
von 16–28
Kohlenstoffatomen mit 2–6
Doppelbindungen, die methylierte, verzweigte, cyclische, konjugierte,
nicht von Methylen unterbrochene, Epoxy-, Furanoid-, Hydroxyl-,
Allyl-, trans- und Selen-Komponenten aufweisen, oder ein Derivat
einer langkettigen mehrfach ungesättigten Fettsäure (LCPUFA) der
allgemeinen Formel X:
worin R die Alkenylgruppe
einer LCPUFA einer Gesamtkettenlänge
von 16–28
Kohlenstoffatomen mit 2–6 Doppelbindungen
ist, wobei sich die erste Doppelbindung an der c-1, c-3, c-6, c-7, c-9 c-12 Position
befindet, gezählt
von dem nicht-Carboxyl-(Methyl)Anteil des Moleküls, und worin R" ausgewählt ist
unter -H, niedrigerem Alkyl, NH
3 und NHCH
2CH
2OH oder einem
Säure-Additionssalz
Komplex davon.
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Der
Vorläufer
umfasst mehr bevorzugt mehrere der Formel X. Vorzugsweise sind 1–3 X Moleküle an ein
Glycerolrückgrat
in den folgenden stereochemischen Konfigurationen: sn-1,2,3; sn-1,2;
sn-1,3; sn-2,3; sn-2; sn-3 verestert.
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Die
Fettsäure
ist mehr bevorzugt ausgewählt
aus der Gruppe umfassend Arachidonat (20:4n- 6 AA), Linoleat (18:3n-6), Gamma-Linoleat
(18:3n-6), Dihomogamma-Linoleat (20:3n-6 DGLA), Adrenic-Säure (22:4n-3),
Linolenat (18:3n-3), Stearat (18:4n-3), Eicosatetraenoat (20:4n-3),
Eicosapentaenoat (20:5n-3), Dokosahexaenoat (22:6n-3 DHA), Dokosapentaenoat
(22:5n-3) oder 22:5n-6), Tetracosapentaenoat (24:5n-3) oder 24:5n-6),
Tetracosahexaenoat (24:6n-3) oder Mead-Säure (20:3n-9) umfasst.
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Vorzugsweise
umfasst eine Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
einen Hemmstoff eines Anandamid inaktivierenden Enzyms (auch als
Amidase bekannt). Der Hemmstoff wird vorzugsweise ausgewählt aus
der Gruppe umfassend Oleat und Oleamid, Palmitat, Palmitoylethanolamid,
Linoleylethanolamid, 2-Palmitoylglycerol, 2-Linoleylglycereol.
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Vorzugsweise
umfasst eine Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
ein Gemisch eines gesättigten
Moleküls
in Kombination mit einem ungesättigten
Vorläufer,
der zu einer Verbindung mit Anandamidaktivität verstoffwechselt wird. Vorzugsweise
ist das gesättigte
Molekül
Palmitat oder Palmitoylethanolamid. Dies liefert bzw. bringt den
Vorteil, dass die Anandamidaktivität des endogen gebildeten Metaboliten,
sowohl durch die Hemmung des Abbaus eines Metaboliten mit Anandamidaktivität als auch
durch Binden der gesättigten
NAE Verbindung an den CB2 Rezeptor potenziert wird.
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Vorzugsweise
umfasst eine Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
ein Gemisch einer Verbindung, die in Kombination mit einem Vorläufer, der
zu einer Verbindung mit Anandamidaktivität verstoffwechselt wird, mit
einem CB Rezeptor reagiert und einen Hemmstoff der Amidase. Dies
bringt den Vorteil einer Synergie zwischen den aktiven Molekülen und
eine Potenzierung ihrer Wirkung durch Hemmen des Abbaus eines Metaboliten
mit Anandamid ähnlicher
Aktivität.
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Vorzugsweise
ist der Vorläufer,
der zu einer Verbindung mit Anandamidaktivität verstoffwechselt wird, eine
freie Fettsäure,
ein Fettsäureester
eines Alkohols oder ein Triacylglycerol. Mehr bevorzugt ist er ein
Triacylglycerol mit einer aktiven Fettsäure an der sn-1 und sn-2 Position.
Dies liefert den Vorteil, dass es zu einem besonders wirksamen CB
Rezeptoragonismus führt.
Am meisten bevorzugt umfasst das Triacylglycerol sowohl die aktiven
Vorläuferverbindungen,
als auch die Potenzierverbindungen (bspw. Palmitat). Dies bringt
den Vorteil eines besonders wirksamen Gemisches.
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Vorzugsweise
umfasst eine Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
ein strukturiertes Triacylglycerol, das durch die Zwischenveresterung
von Triacylglycerolen mit Fettsäuren
hergestellt wird, so dass eine biologisch aktive Fettsäure in der
sn-2 Position des Triacylglycerols aufgefunden wird. Dies bringt
den Vorteil einer optimierten Zuführung der aktiven Fettsäure an Körpergewebe,
insbesondere das Gehirn.
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Vorzugsweise
umfasst eine Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
einen physiologisch verträglichen
Träger,
ein physiologisch verträgliches
Verdünnungsmittel
oder Adjuvanz.
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Vorzugsweise
umfasst eine Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
eine Kombination eines natürlich
vorkommenden Vorläufers,
der zu einer Verbindung mit Anandamidaktivität verstoffwechselt wird, zusammen
mit einem gewöhnlichen
steroidalen oder nicht-steroidalen anti-entzündlichen Arzneimittel (NSAID).
Dies bringt den Vorteil, dass, da die Kombination die Fähigkeit
aufweist, die Entzündung über verschiede
Wege zu vermindern, eine Synergie auftritt.
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Vorzugsweise
umfasst eine Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
einen Vorläufer
eines CB1 Rezeptoragonisten (bspw. Anandamid) in Kombination mit
einem Vorläufer
eines CB2 Rezeptoragonisten (bspw. Palmitoylethanolamid). Dies bringt
den Vorteil, dass die schmerzlindernde Wirkung der Metaboliten ungefähr 100-fach
stärker
ist als die Wirkung, die durch die Metaboliten des jeweils einzelnen
Vorläufers
bereitgestellt wird.
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Nachstehend
werden Beispiele (nicht gemäß der Erfindung)
unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen
beschrieben, in denen:
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1 die
chemische Struktur von N-Arachidonylethanolamin (Anandamid), 2-AG
und Oleamid zeigt;
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2 die
Wirkung von oral verabreichten cannabimimetischen Lipiden auf eine
ambulante Behandlung bzw. Ambulation, Tierzucht, Immobilität und Analgesie
zeigt;
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3 die
Wirkung einer Verabreichung von Olivenöl, Anandamid, 2-AG, THC und
Oleamid auf die Ambulation, Tierzucht, Immobilität und Analgesie zeigt. Die
Ambulations-, Tierzucht- und Immobilitätsparameter waren zwischen
den Behandlungsgruppen und der Kontrollgruppe statistisch signifikant
unterschiedlich, p<0,01–0,05, ANOVA,
Newman-Keuls; lediglich THC erhöhte
die Analgesie statistisch signifikant;
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4 die
Wirkung von Olivenöl,
Anandamid, 2-AG, THC und Oleamid auf die Körpertemperatur zeigt. Alle
Gruppen waren von der Kontrollgruppe statistisch signifikant verschieden,
p<0,01–0,05, ANOVA,
Newman-Keuls;
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5 die
Wirkung von Olivenöl,
Anandamid, 2-AG, THC und Oleamid auf die Fäkalabgabe zeigt. Lediglich
die THC-Gruppe war von der Kontrolle signifikant verschieden.
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6 die Änderungen
in N-Acylethanolaminen im Ferkelhirn nach Nahrungsfettsäuremodifikation zeigt,
wobei eine Skala von 0 bis 250 auf der Achse durch pmol/mg Ferkelgehirnlipidextrakt
markiert ist. Balken innerhalb einer Dreiergruppe, die nicht mit
einem gemeinsamen Buchstaben gekennzeichnet sind, sind von einander
statistisch signifikant verschieden (p<0,01–0,05, ANOVA, Newman-Keuls).
Adeq., adäquat.
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7 die Änderungen
in N-Acylethanolaminen im Ferkelgehirn nach einer Nahrungsfettsäuremodifikation
zeigt, wobei eine Skala von 0 bis 70 auf der Achse durch pmol/mg
Ferkelgehirnlipidextrakt gekennzeichnet ist. Die Balken innerhalb
einer Dreiergruppe, die nicht mit einem gemeinsamen Buchstaben bezeichnet sind,
sind von einander statistisch verschieden (p<0,01–0,05, ANOVA, Newman-Keuls).
Adeq., adäquat.
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Die
Ferkel wurden unter Verwendung zweier verschieden angepasster Sorten
von Kinder-formulierungen,
die mit niedrigen Mengen von Arachidonat und Dokosahexaenoat (ungefähr die gleichen
Mengen wie sie in menschlicher Brustmilch aufgefunden werden) angereichert
wurden und von verschiedenen Quellen erhalten wurden (siehe Tabelle
1), gefüttert.
Die Mengen an NAEs, MAG (Monoacylglycerol) und primären Amiden wurden
in ihren Gehirnen bewertet.
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In
dieser Untersuchung wurden die Ferkel von Geburt an bis 18 Tage
danach mit Nahrungsmitteln gefüttert,
die Ausführungsformen
einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
mit oder ohne 0,5% 20:4n-6 von Einzelzellölen und 0,4% 22:6n-3 in der
Rezeptur bzw. Formulierung, mit entweder niedrigem (unzureichend) 18:2n-6
(1,6%) und 18:3n-3 (0,1%) oder mit adäquaten 18:2(n-6)(15,6%) und
18:3n-3 (1,5%) umfassten.
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Die
Nahrungszusammensetzungen werden in Tabelle 1 gezeigt.
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Tabelle
1: Rezepturen mit variierenden n-3 und n-6 Fettsäuregehalt
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Die Änderungen
der den einzelnen Phospholipidklassen im Gehirn nach Fütterung
wurden analysiert.
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Die
Ergebnisse zeigten, dass die Zugabe von 20:4n-6 und 22:6n-3 zu Nahrungsmitteln,
die adäquate Mengen
an essentiellen Fettsäuren
(18:2n-6 und 18:3n-3) enthielten, zu einem Anstieg in 22:6n-3 von
Phosphatidylcholin, einer Abnahme in 22:5n-6 von Phosphatidylethanolamin
und zu keiner Änderung
in Arachidonat (20:4n-6) in irgendeiner der Phospholipidklassen
führte.
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Somit
stimmt der kleine, unwesentliche Anstieg in 22:6n-3 von Phosphatidylcholin,
mit der Tatsache überein,
dass der relevanten Nahrung 22:6n-3 zugegeben wurde, wobei das Fehlen
ei nes signifikanten Anstiegs an Arachidonat in irgendeiner der untersuchten
Phospholipidklassen jedoch zeigt, dass zugegebenes Arachidonat nicht
in diese Phospholipidklassen eingebaut, sondern eher verstoffwechselt
oder nicht ausreichend zum Gehirn transportiert wird.
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Die
primären
Amide, Oleamid und Arachidonamid und 18:3 NAE wurden nicht nachgewiesen
und sind aus der Tabelle 2, die die Änderungen in den Mengen von
MAG und NAE als pmol/mg Lipid, das nach Fütterung der Nahrung auftritt,
darstellt, weggelassen.
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Tabelle
2: Monoacylglycerole (MAG)
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Tabelle
3: N-Acylethanolamine (NAE)
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Tabelle
4: N-Acylethanolamine (NAE)
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Die
MAG Mengen für
20:4n-6 MAG, 22:4n-6 MAG und 22:6n-3 MAG in Tieren, die mit Nahrungsmitteln mit
ausreichend essentiellen Fettsäuren
gefüttert
wurden, waren statistisch nicht signifikant (sn-1 und 2 Isomere
kombiniert). Dies stellt einen wichtigen Befund dar, da spezifische
MAGs, wie beispielsweise 2-AG, bekanntermassen an CB Rezeptoren
binden und eine biologische Aktivität aufweisen.
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In
Tieren, die mit den 18:2n-6/18:3n-3 ausreichenden Nahrungen, die
mit AA und DHA ergänzt
waren, gefüttert
wurden, ergab sich ein Anstieg in 20:4n-6 NAE und 22:4n-6 NAE (22:4n-6
ist das um 2 Kohlenstoffe verlängerte
Produkt von AA), 22:6n-3 NAE, 20:5n-3 NAE und 22:5n-3 NAE (die beiden
letzten stellen Rückumwandlungsprodukte
von 22:6n-3 dar). Die Mengen dieser NAE Produkte waren denen in
mit Saumilch gefütterten
Ferkeln gefundenen ähnlich.
Es ist daher ein bemerkenswertes Merkmal der Erfindung, dass, wenn
ausreichend essentielle Fettsäuren
in der Nahrung bereitgestellt werden, die Ergänzung von AA und DHA auf in der
Brustmilch gefundene Mengen, die Wirkung aufweist die entsprechenden
NAE Produkte auf Mengen der in der Saumilch gefundenen Mengen zu
erhöhen.
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Die
erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Ergänzung von AA und DHA (nicht
gemäß der Erfindung) zu
Rezepten mit ausreichender essentieller Fettsäure minimale Wirkungen auf
Phospholipidkomponenten des Gehirns zeigen. In verblüffendem
Gegensatz jedoch führten
die gleichen Mengen einer Ergänzung
zu einem 4-fachen Anstieg in der Menge von vorhandenem 20:4n-3 NAE,
5,2-fachem Anstieg von 20:5n-3 NAE, und einem 9,5-fachen Anstieg
von 22:5n-3 und 22:6n-3 NAE.
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Um
die biologische Aktivität
der erfindungsgemäßen Zusammensetzung
auf tierisches Verhalten zu zeigen, wurde die Wirkung von mehrfach
ungesättigten
Nahrungsmittelfettsäuren
mit und ohne einem CB-1 Rezeptorantagonisten auf gleichermaßen angstlösende Antworten
an Mäusen
getestet. Zu diesem Zweck wurde der ELEVATED PLUS MAZE TEST angewendet
(angepasst nach Handley and Mithani (Naunyn. Schnied. Arch. Pharmacol.
327: 1–5,
1984).
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Für die Experimente
wurden von Elevage Janvier, Le Genest-Staint-Isle France erhaltene
männliche Rj:NMRI
Mäuse,
die bei Zulieferung 10–11
g und an Tag 42 33–51
g wogen, verwendet. Die Mäuse
wurden zu 10 pro Käfig
in Drahtkäfigen
mit Lager und normalem Tageszyklus gehalten. Sie erhielten für 42 Tage
ad libitum Mengen destilliertes Flaschenwasser und gereinigte pulverförmige Nahrung
(7,5 g/Maus) in Keramikschalen (10/Gruppe). Die Nahrung wurde bei –80°C in Tagesaliquots
unter Stickstoff gehalten und jeden Nachmittag vor Verabreichung
an die Mäuse
aufgetaut. Täglich
wurde nicht gefressene Nahrung verworfen.
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Das
Prinzip des Tests besteht darin, dass angstlösende Mittel die Anzahl von
Eintragungen in die offenen und häufig in die geschlossenen Arme
von den Erhobenen steigert. Folglich sollten sich Mäuse bewegen und
die Räume
erkunden und geschlossene Arme wollen als vielmehr ruhig in der
Mitte zu verweilen).
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Den
Mäusen
wurden die folgenden Mittel 60 Minuten vor dem Plus Maze Test intraperitoneal
verabreicht:
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Tween
80 diente als Placebo; das angstlösende Mittel Clobazam wurde
in einer nicht sedierenden Dosis für eine Testvalidierung verwendet
oder validierte Mengen von AM251 (Tocris Cookson LTD.,UK), einem CB-1
Rezeptorantagonist, um ein Binden endogener NAEs an den CB-1 Rezeptor
zu verhindern.
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Alle
Nahrungen enthielten 90% fettfreie AIN93G Nagernahrung in Pulverform
(Lot 9350-5 Dyets, Inc., Bethlehem, PA), 0,4% Milchfett, 1,2% Palmolein,
1,9% Trisun Sonnenblumenöl,
1,5% Sojabohnenöl
und 2,1–5,1%
Triacylglycerolöl
mittlerer Kettenlänge.
Teile des Triacylglycerolöls
mittlerer Kettenlänge
wurden gegen 1,1% Algenöl
(liefert 0,5 Nahrungsgew.-Arachidonsäure) in
Nahrung D, 1,9% Fischöl
(liefert 0,5 Nahrungsgew.-% Dokosahexaenonsäure) in Nahrung E und 1,1%
Algenöl
und 1,9% Fischöl
in Nahrungen F und G ausgetauscht. Die Nahrungsgruppen werden in
der nachstehenden Tabelle zusammengefasst:
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-
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Abkürzungen: AA, Arachidonsäure, DHA,
Dokosahexaenonsäure
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Das
Körpergewicht,
die Gewichtszunahme und Nahrungsaufnahme der Mäuse wurde während des Experiments überwacht.
Diese Parameter waren nicht signifikant durch die Aufnahme der verschiedenen
Nahrungen beeinflusst, wobei die klassische Einweganalyse der Varianz
(ANOVA) verwendet wurde. Dies zeigt, dass die in den Verhaltenstests
gefundenen Unterschiede lediglich den Bestandteilen in der variierten
Nahrung, namentlich mehrfach ungesättigter Nahrungsfettsäuren, zugeschrieben
werden können.
Um die Änderungen
in dem Plus Maze Test zu beurteilen, werden verallgemeinerte Lineare
Modelle (GLM) und die Poissonfamilie verwendet, da die erhaltenen
Antwortdaten nicht normal verteilte Zählungen darstellen.
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Anzahl von Eintragungen
in die geschlossenen Arme
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- A vs. B: Durchschnittliche Eintragungen waren 3,6 beziehungsweise
6,3 und die Differenz liegt an der Grenze statistischer Signifikanz
(p-Wert = 0,053). Dieses Ergebnis stellt heraus, dass das Angstlösende Mittel
Clobazam unter den vorliegenden Bedingungen die Eintragungen für geschlossene
Arme erhöhen
kann.
- A vs. C: Es gab keinen signifikanten Unterschied (p-Wert 0 0,19.
- A, D, E und F: Der p-Wert liegt insgesamt bei 0,06. Die geeigneten
Durchschnittseintragungen sind jeweils 3,6; 6,4 und 6,8. In Gruppe
D gibt es eine Maus mit 16 Eintragungen, was ungewöhnlich hoch
ist. Wird diese Maus wegelassen, dann wird der p-Wert signifikant
(0,02) und die Vorhersage für
Gruppe D verringert sich auf 5,3. Dieses Ergebnis stellt heraus,
dass die Kombination von Nahrung AA und DHA Angstlösende (Clobazam ähnlich)
Wirkungen erzeugen kann.
- F vs. G: Durchschnittseintragungen betragen jeweils 6,8 und
4,6 und die Differenz liegt an der Grenze statistischer Signifikanz
(p-Wert = 0,11). Dieses Ergebnis zeigt, dass die Angstlösenden Wirkungen
der Kombination von Nahrung AA und DHA über CB-1 Rezeptorbindung, d.h. über Bindung
von PUFA abgeleiteten NAEs übertragen
werden kann.
- C vs. G: Durchschnittliche Eintragungen betragen jeweils 2,3
und 4,6 und die Differenz liegt nahe an der statistischen Signifikanz
(p-Wert = 0,08). Dieses Ergebnis zeigt, dass CB-1 Rezeptoren nicht
die einzigen Rezeptoren sind, die Antworten beim Plus Maze Test
vermitteln, d.h. Nicht-CB-1 Rezeptoren können teilweise die Wirkungen
von Nahrungs-PUFA und (PUFA abgeleiteten) NAEs vermitteln. Außerdem kann
die Droge AM251 die CB-1 Rezeptorbindung nicht vollständig antagonisieren.
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Zusammengefasst
zeigen die Ergebnisse der Anzahl der Eintragungen in die geschlossenen
Arme bei dem ELEVATED PLUS MAZE TEST, dass Nahrung AA und DHA (nicht
gemäß der Erfindung)
und die Kombination der zwei (nicht gemäß der Erfindung) gleichermaßen Angstlösende Wirkungen
aufweisen, die über
ihre Umwandlung zu NAEs vermittelt zu sein scheinen und diese NAEs
wiederum binden an CB-1 Rezeptoren, die in Gehirnregionen lokalisiert
sind, welche bekannt sind Verhaltensantworten, wie beispielsweise
der Hippocampus, bei dem PLUS MAZE TEST zu erzeugen.
