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Das
Gebiet der Erfindung ist die Analyse von Cytokinen.
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[Hintergrund]
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Cytokine
sind Signalproteine, die auf vielen verschiedenen Gebieten der Forschung
und bei der Diagnose und klinischen Behandlung von Krankheiten wichtig
sind. Z.B. steuern Cytokine die Entzündungsantwort des Körpers auf
eine Infektion. Tumornekrosefaktor α, Interleukin-1, Interleukin-6
Interleukin-8 und Interleukin-12 sind entzündungsfördernde Cytokine, die an einer
Sepsis beteiligt sind. Entzündungshemmende Cytokine,
wie Interleukin-4 und Interleukin-10 werden ebenfalls als Antwort
auf eine Infektion gebildet, um die entzündliche Reaktion zu verringern.
Die Überwachung
von Serumgehalten dieser und anderer Cytokine kann ein Maß für die Immunaktivität des Wirtes
liefern. Z.B. haben verschiedene klinische Untersuchungen einen statistischen
Zusammenhang zwischen TNF-α-Gehalten
und der Schwere einer Infektion gezeigt. Ferner hat die Forschung
gezeigt, dass unterschiedliche Pathogene einzigartige Muster der
Cytokinexpression zeigen. Diese Daten zeigen, dass Cytokine ausgezeichnete
molekulare Marker für
die Diagnose einer septischen Entzündungsantwort sind.
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Die
derzeitigen Methoden der Wahl für
die Analyse der Cytokinexpression in Blutproben sind quantitative
RT-PCR und ELISA. Die quantitative RT-PCR misst den Gehalt an Cytokin-mRNA
in interessierenden Zellen. Diese Methode erfordert das Extrahieren
von mRNA aus Zellen und macht somit viel Vorbereitungsarbeit vor
der Bestimmung erforderlich. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt
dieses Assays ist auch der kapitalintensive Schritt (erfordert die
teuere RT-PCR-Vorrichtung), was die Erhöhung des Durchsatzes dieses
Assays ernsthaft beschränkt.
Zur Zeit können
nur zwei Cytokine durch eine Bestimmungsreaktion durch quantitative
RT-PCR nachgewiesen werden, was ebenfalls den potenziellen Durchsatz
dieses Assays begrenzt. ELISA misst andererseits direkt die Konzentration
an Cytokinprotein in Serum oder Zellüberständen. ELISA-Assays erfordern
keine Vorbereitung vor der Bestimmung. Der kapitalintensive Schritt
(Nachweis) ist bei ELISA nicht der längste Schritt, was ebenfalls
einen potenziellen größeren Durchsatz
als bei quantitativer RT-PCR erlaubt. Diese Assays messen jedoch
nur die Konzentration eines Cytokins pro Reaktion, was ihren Durchsatz beschränkt.
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R.T.
Carson & D.A.A.
Vignali (1999), J. Immunol. Meth. 227, 41–52 beschreiben ein auf Mehrstrom-Cytometrie
beruhendes Assay zur simultanen quantitativen Bestimmung von 15
Cytokinen, bei dem Einfangantikörper,
von denen jeder für
ein bestimmte Cytokin spezifisch ist, auf Perlen immobilisiert sind.
Sets von Perlen, die Perlen umfassen, die mit unterschiedlichen
Antikörpern überzogen
sind, werden in eine Anordnung von dicht verschlossenen Röhrchen gegeben.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Antikörper-Anordnungs-Technologie – ein sehr
wirksames Mittel zur parallelen Analyse von mehreren Genprodukten
auf den Proteingehalt. Diese Technologie ergänzt diejenige von DNA-Mikroanordnungen,
indem sie die Analyse von post-transkriptionellen Regulationsereignissen
erleichtert. Spezieller liefert die Erfindung ELISA-artige Bestimmungen,
bei denen die Konzentrationen von mehreren Proteinen, wie Cytokinen,
pro Reaktion bestimmt werden.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung liefert Methoden und Zusammensetzungen zur simultanen
quantitativen Bestimmung von Cytokinen in einer Probe. Bei den Methoden
wird eine Festphasenanordnung angewandt, umfassend eine Mehrzahl
von verschiedenen Antikörpern,
die in entsprechenden diskreten Anordnungselementen angeordnet sind
und für
eine entsprechende Mehrzahl von unterschiedlichen Cytokinen spezifisch
sind. Bei speziellen Ausführungsformen
sind die Cytokine ausgewählt
aus GM-CSF, IL1α,
IL1β, IL2,
IL4, IL6, IL7, IL8, IL10, IL12, TNFα, APO-1, sICAM-1, IFN-α, IFN-γ, IL3, IL5,
IL13, IL15, IL16, MCP-1, SAA und sVCAM-1; die Mehrzahl beträgt zumindest
fünf, vorzugsweise
zumindest acht, insbesondere 11; die Antikörper sind monoklonal; jeder
Antikörper
ist an ein anderes der entsprechenden Cytokine gebunden und die
Anordnung ist eine Mikroanordnung auf einem Kunststoff- oder Glas-Substrat,
die durch Kontaktabscheidung hergestellt worden ist. Die Erfindung
liefert auch Methoden zur Herstellung und Anwendung der Anordnungen
zur simultanen quantitativen Bestimmung von Cytokinen in Proben.
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BESCHREIBUNG
VON SPEZIELLEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
DER ERFINDUNG
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Die
folgenden Beschreibungen spezieller Ausführungsformen und Beispiele
werden zur Erläuterung und
keinesfalls zur Beschränkung
angegeben. Soweit es nicht unsinnig oder anders angegeben ist, bedeutet bei
diesen Ausführungsformen
und in der ganzen Beschreibung der Ausdruck "ein" bzw. "eine" ein oder mehrere
und der Ausdruck "oder" bedeutet "und/oder".
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Bei
den Methoden werden Festphasenanordnungen von cytokin-spezifischen
Antikörpern
angewandt, die in entsprechenden diskreten Anordnungselementen angeordnet
sind. Die Anordnungselemente sind diskrete Bereiche einer Substratoberfläche, in
fluider Verbindung, so dass alle Elemente der Anordnung in einem einzigen
kontinuierlichen Medium inkubiert, gewaschen usw. werden können. Daher
unterscheidet sich die Anordnung von Assayformaten, bei denen jeder
spezifische Antikörper
in diskreten für
Flüssigkeit
getrennten Vertiefungen zur Inkubation getrennt angeordnet ist,
wie in einer Mikrotiterplatte.
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Die
Antikörperanordnungen
können
nach einer Anzahl von bekannten Methoden auf einer großen Vielfalt
von Substraten, wie Glas, Silicon, Kunststoffen, Nylonmembranen
usw. erzeugt werden, einschließlich einer
Kontaktabscheidung, z.B.
US-PS
5 807 522 ,
5 770 151 usw.;
Methoden auf Basis von Strömungswegen, z.B.
US-PS 5 384 261 ; auf Nanolithographie
mit einem eingetauchten Stift beruhende Methoden, z.B. Piner et. al.,
Science 29. Jan 1999: 661–663
usw., usw. S. auch die gleichzeitige
USSN 09/150 502 , die Kapillar-Drucksysteme
beschreibt, die zur Erzeugung von Antikörperanordnungen angewandt werden
können.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform
werden die Antikörper
in entsprechenden diskreten Elementen in hoher Dichte angeordnet,
d.h. in Mikroanordnungen von mindestens 100, vorzugsweise mindestens
1000, insbesondere mindestens 10000, vor allem mindestens 100000,
diskreten Elementen pro Quadratzentimeter.
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Die
Antikörper
können
intakt oder Fragmente, gereinigt oder durch Rekombination exprimiert,
monoklonal oder polyklonal sein und können durch Affinität gereinigt
worden sein. Bei einer speziellen Ausführungsform ist jeder cytokin-spezifische
Antikörper
der Anordnung ein monoklonaler Antikörper Die Antikörper können für eine Mehrzahl
eines weiten Bereichs von Cytokinen, insbesondere Lymphokinen, spezifisch
sein. Geeignete Cytokine können
in gereinigter oder rekombinierter Form aus handelsüblichen
Quellen erworben, von kommerziell und/oder allgemein zugänglichen
Klonen exprimiert und/oder von Geweben gereinigt werden. Bei einer
speziellen Ausführungsform
haben die Cytokine eine native menschliche Sequenz, obwohl Homologe von
einer großen
Vielfalt von Tierarten, insbesondere Säugetierarten (z.B. Mäuse) häufig verfügbar sind
und angewandt werden können.
Eine unerwartete Feststellung im Rahmen der Erfindung war, dass
eine Mehrzahl von unterschiedlichen Cytokinen simultan in der gleichen,
einzigen Inkubation gemessen werden konnte, insbesondere, wen die
Mehrzahl mindestens fünf,
vorzugsweise mindestens acht, insbesondere mindestens elf, unterschiedliche
Cytokine beträgt.
Beispiele für
Cytokine mit menschlichen Sequenzen, von denen gezeigt werden konnte,
dass sie die nachgewiesen werden können, sind in Tabelle 1 angegeben.
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Tabelle
1: Cytokine, von denen gezeigt wurde, dass sie in Mehrfach-Immunoassays
spezifisch quantitativ bestimmt werden können.
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Folglich
können
die angegebenen Anordnungen angewandt werden, um solche Moleküle simultan quantitativ
in Proben zu bestimmen. Eine große Vielfalt von Cytokin enthaltenden
Proben kann der Analyse nach diesen Methoden unterworten werden,
z.B. Serum, Urin, Cerberal/Spinal-Flüssigkeit usw. Ferner kann die
Technologie mit Antikörperanordnungen,
im Gegensatz zu Methoden auf PCR-Basis, die Genexpression in Proben
messen, die keine RNA enthalten. Diese bessere Zugänglichkeit
führt zu
der Möglichkeit,
detaillierte statistische Untersuchungen mit Antikörperanordnungen
durchzuführen,
die mit anderen Assays nicht möglich sind.
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Die
Inkubations- und Waschbedingungen werden, wie unten gezeigt, leicht
empirisch bestimmt, so dass die vorgesehene Mehrzahl von Cytokinen
simultan in einem einzigen Inkubationsmedium bestimmt werden kann.
Es kann eine große
Vielfalt von Methoden angewandt werden, um die spezifisch gebundenen
Cytokin-Analyten nachzuweisen, einschließlich direkt markierte cytokin-spezifische
Antikörper-Reagenzien, Sandwich-Immunoassays,
Cytokin-Rezeptor-Bindungsassays usw. Tabelle 2 zeigt verschiedene
Gruppen von Cytokinen, die simultan nach beispielhaften Methoden
bestimmt werden können.
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Tabelle
2: Spezifische quantitative Bestimmung von Cytokinen in Mikro-Anordnungs-Immunoassays
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BEISPIELHAFTE VERSUCHSPROTOKOLLE
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Unter
Anwendung der folgenden Arbeitsweisen wurde ein Antikörperanordnungs-Prototyp zur simultanen
Bestimmung von 11 unterschiedlichen Cytokinen in Serum und Zellüberständen aufgebaut.
Dieses Assay beruhte auf einem ELISA-Sandwich-Format mit Chemoluminiszenz-Nachweis.
Der Chemoluminiszenz-Nachweis erfordert im Ge gensatz zum Fluoreszenz-Nachweis,
keine Anregung der Probe und ermöglicht die
simultane Messung von einigen unterschiedlichen Anordnungen gleichzeitig,
was zu einer wesentlichen Zunahme des Durchsatzes führt. Elf
unterschiedliche Cytokine wurden erfolgreich simultan quantitativ
bestimmt und die Messwerte durch Vergleich mit RT-PCR-Assays verifiziert.
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Aufbau
der Anordnung. Einfang-Antikörper
(Biosource International) von 11 Cytokinen (GM-CSF, IL1α, IL1β, IL2, IL4,
IL6, IL7, IL8, IL10, IL12 und TNFα)
wurden in einer Konzentration von 0,5 mg/ml direkt auf den Boden
von 12-Loch-Platten (Corning), die vorher zur optimalen Bindung
von Antikörpern überzogen
worden waren als Punkte aufgebracht, Mit Biotin behandeltes Rinderalbumin
wurde in einer Konzentration von 100 μg/ml als Bezugsmaterial aufgebracht.
Die Anordnungselemente hatten einen Durchmesser von grob 1000 μm mit einem
Abstand von Mitte zu Mitte von 3000 μm. Nachdem die Proben aufgebracht
waren, wurden die Platten sofort abgedeckt und über Nacht bei 4°C inkubiert.
Die Anordnungen wurden dann viermal mit einer Lösung von PBS (10 mM Phosphat,
2,7 mM Kaliumchlorid, 137 mM Natriumchlorid, pH 7,4) und 0,1% Tween-20 (Sigma)
gewaschen, um nicht gebundenen Antikörper zu entfernen. Die Platten
wurden dann 2 h bei Raumtemperatur mit einer Lösung, enthaltend 150 mM Natrium,
4 mM Kalium, 140 mM Phosphat (pH 7,4) und 5% BSA blockiert.
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Bedingungen
der Bestimmung. Die BSA-Lösung
wurde von jeder Anordnung entfernt und viermal mit einer Lösung von
0,005% Tween-20 in PBS gewaschen. 1 ml Probe wurde dann auf jede
Anordnung aufgebracht und unter Schütteln (120 UpM) 2 h bei Raumtemperatur
inkubiert. Die Proben wurden entfernt und die Anordnungen viermal
mit 0,005% Tween-20 in PBS gewaschen. 1 ml einer Lösung, enthaltend
mit Biotin behandelte Antikörper
gegen jedes der 11 Cytokine (GM-CSF, IL1α, IL1β, IL2, IL4, IL6, IL7, IL8, IL10,
IL12 und TNFα)
in einer Konzentration von 0,5 μg/ml
in 150 mM Natrium, 4 mM Kalium, 140 mM Chlorid, 10 mM Phosphat (pH
7,4) und 10% BSA, wurde in jede Vertiefung gegeben und unter Schütteln 1
h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Antikörper-Lösung wurde entfernt und 1 ml
Meerrettichperoxidase/Streptavidin-Konjugat (HRP-STR), 0,2 μg/ml in HPE-Verdünnungspuffer
(Research Diagnostics Inc.) wurde zu jeder Anordnung zugegeben und
30 min unter Schütteln
bei Raumtemperatur inkubiert. Die HRP-STR-Lösung wurde entfernt und die
Anordnungen viermal mit 0,005% Tween-20 in PBS gewaschen. SuperSignalTM (Pierce) Chemoluminiszenz-Substrat wurde
1:1 mit gelieferter Peroxid-Lösung
vermischt; 500 μl
dieses Gemisches wurden zu jeder Anordnung zugegeben und die gesamte
Platte simultan mit einem gekühlten
Peltier-CCD-Kamera-Abbildungssystem (ChemilmagerTM 4000,
Alpha Innotech Co.) abgebildet. Ein Röntgenfilm kann ebenfalls als
Nachweissystem angewandt werden. Die Daten können mit irgendeinem üblichen
Bildanalyseprogramm quantifiziert werden.
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Menschliche
THP-1-Zellen. Die Zelllinie THP-1 von menschlicher akuter monocytischen
Leukämie,
die bei dieser Untersuchung verwendet wurde, wurde in einem Feuchtigkeitsinkubator,
der 5% CO2 enthielt, bei 37°C gehalten.
Diese Zellen wuchsen in RPMI-1640-Medium (Gibco BRL) gehalten, das
mit 10% fötalem
Kälberserum
(Gibco BRL), Glucose (4,5 g/l), 5 × 10–5 M
b-Mercaptoethanol, 1 mM Natrium-pyruvat, Streptomycin (100 mg/ml)
und Penicillin (100 E/ml) ergänzt
war. Die Zellen wurden in 6-Loch-Zellkultur-Platten,
5 ml je Platte, mit einer Dichte von 5 × 105 Zellen/ml
in komplettem RPMI1640-Medium verteilt. Vor der Aktivierung der
Zellen mit E.coli oder P.aeruginosa als Entzündungs-Stimuli wurden die Zellen
48 h mit 1,6 × 10–9 M
Phorbol-12-myristat-13-acetat
(PMA) (Sigma) behandelt. Nach dieser Inkubationszeit wurden die
Zellen 8 h mit unterschiedlichen Konzentrationen (1 × 101–105 Zellen/ml) von exponentiell gewachsenen
E.coli und P.aeruginosa Bakterienzellen behandelt. Sowohl die Zellüberstände als
auch die ZelLperle wurden gesammelt und für spätere Cytokin-Bestimmungen und
RNA-Isolierung/RT-PCR-Nachweis von Cytokin mRNA bei –80°C aufbewahrt.
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Isolierung
von RNA. Die angewandte RNA-Isolierungs-Methode mit TRIzol-Reagens (Gibco BRL)
ist im wesentlichen wie von Chomoczynski, P. und N. Sacchi (1987,
Anal. Biochem. 162: 156–159)
entwickelt . Die gefrorenen Zellperlen (etwa 2,5 × 106 Zellen) wurden durch erneutes Suspendieren
in 1 ml TRIzol-Reagens (Gibco BRL) und wiederholtes Pipettieren
lysiert. Dann wurden 200 ml Chloroform zugegeben und die Proben
wurden durch 15 s langes Verwirbeln kräftig vermischt. Nach dem Zentrifugieren
der Proben mit 14000 UpM während
15 min bei 4°C
wurde die farblose obere wässrige
Phase, die die RNA enthielt, in ein frisches RNase-freies Röhrchen überführt. Die
RNA wurde durch Vermischen mit 0,5 ml Isopropylalkohol aus der wässrigen
Phase ausgefällt.
Proben wurden 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie 10
min mit 7500 UpM bei 4°C
zentrifugiert wurden. Die RNA-Perle wurde einmal mit 0,5 ml 75%igem
Ethanol gewaschen, bevor sie 10 min an der Luft trocknen konnte.
Die Konzentration und Reinheit der isolierten RNA wurde durch Messung von
OD260 in 2 mM Na3PO4 (pH 8,0) in einem Spektrophotometer und
durch Agarosegel-Elektrophorese
bestimmt.
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RT-PCR-Nachweis
von Cytokin-RNS. Das in dieser Arbeit angewandte RT-PCR-Assay ist im wesentlichen
wie an anderer Stelle beschrieben (Murphy et al., 1993, J. Immunol.
Methods, 162: 211–223).
Oligonucleotid-Primer, die auf einen 206-bp-Bereich des menschlichen
IL-6-Gens (Zilberstein et al., 1986, EMBO J. 5: 2529–2537) gerichtet
sind, wurden angewandt, um IL-6 spezifische mRNA in behandelten
THP-1-Zellen nachzuweisen. Diese IL-6-spezifischen Primer waren
auf der Basis der NCBI-Sequenz für
das menschliche IL-6-Gen (Zugangsnummer X04430) ausgebildet. Oligonucleotid-Primer, die auf einen
107-bp-Bereich des menschlichen IL-1β-Gens (Nishida et al., 1987)
gerichtet sind, wurden angewandt, um IL-1β spezifische mRNA in nicht behandelten
und behandelten THP-1-Zellen nachzuweisen. Diese IL-1β-spezifischen
PCR-Primer waren Basis der NCBI-Sequenz für das menschliche IL-1β-Gen (Zugangsnummer
M15330) ausgebildet Alle Primer wurden von Operon (Alameda, CA)
hergestellt. RT (Umkehr-Transkriptase) Reaktionen wurden in einem Endvolumen
von 20 ml, enthaltend 1 mg Gesamt-RNA und die von PE Applied Biosystems
(Foster City, CA) in dem TaqMan Gold RT-PCR-Kit gelieferten Komponenten,
durchgeführt.
RT-Reaktionen wurden wie in der Kit-Anleitung angegeben durchgeführt. Für die folgende
PCR-Reaktion wurde
1 ml der RT-Reaktionsprobe in einem Endvolumen von 30 ml, enthaltend
alle von PE Applied Biosystems in dem TaqMan Gold RT-PCR-Kit gelieferten
Komponenten, verwendet. PCR-Reaktionen wurden wie in der Kit-Anleitung
angegeben durchgeführt.
10 ml jedes PCR-Produktes wurden auf ein 3% NuSieve/1% SeaKem GTG-Agarosegel
(FMC BioProducts, Rockland, ME) in 1 × TBE-Puffer aufgebracht und
anschließend
wurde eine Elektrophorese 30 bis 45 min bei 200 V durchgeführt.
