DE60006944T2

DE60006944T2 - Verfahren und zusammensetzungen zur behandlung von leukämie

Info

Publication number: DE60006944T2
Application number: DE60006944T
Authority: DE
Inventors: M. Chaim ROIFMAN; Aviv Gazit; Alexander Levitzki
Original assignee: HSC Research and Development LP; Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: HSC Research and Development LP; Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1999-03-12
Filing date: 2000-03-13
Publication date: 2004-11-11
Anticipated expiration: 2020-03-14
Also published as: CA2265396A1; IL145385A0; AU3140300A; EP1161417B1; DE60006944D1; ATE255561T1; EP1161417A1; WO2000055128A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Tyrphostine oder Benzyliden-Malononitril-Verbindungen, welche als antiproliferative Arzneimittel zur Behandlung einer Vielzahl von zellproliferativen Erkrankungen geeignet sind.
Hintergrund der Erfindung
Es wurde eine Anzahl von Tyrphostinen oder Benzyliden-Malononitril-Derivaten beschrieben, die Tyrosinkinaseinhibitoren und für eine Hemmung von Zellproliferation, z.B. in Leukämie beim Menschen, wirksam sind (US-Patente Nr. 5,217,999 und 5,773,476).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert eine neue Gruppe von Tyrphostinen oder Benzyliden-Malononitril-Derivaten mit verbesserter Wirksamkeit als Inhibitoren von Zellwachstum.
Gemäß einer Ausführungsform haben die Verbindungen der Erfindung die allgemeine Formel:
wobei
R₁ H oder C1- bis C3-Alkyl ist,
R₂ Aryl oder -(CH₂)_n-Aryl und n 1 bis 4 ist,
R₃ Hoder CH₃ ist und
R₄ substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl, Pyridyl, Thiophen, Furan, Indol, Pyrrol, Thiazol oder Imidazol ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform haben die Verbindungen die oben genannte allgemeine Formel 1, wobei
R₁ H, Methyl oder Ethyl ist,
R₂ Phenyl, Benzyl, -(CH₂)₂-Phenyl, -(CH₂)₃-Phenyl oder 2-Thiobenzothiazol ist,
R₃ H ist und
R₄ Phenyl ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind die Verbindungen solche, wie sie in den 2 bis 6 gezeigt sind.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktiven Bestandteil eine Verbindung der oben genannten Formel 1 enthält. Gemäß einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktiven Bestandteil eine der in den 2 bis 6 gezeigten Verbindungen enthält.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung eine Verbindung der oben genannten Formel 1 zur Behandlung einer neoplastischen Erkrankung, vorzugsweise akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL) in einem Säuger.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung wenigstens eine der in den 2 bis 6 gezeigten Verbindungen zur Behandlung einer neoplastischen Erkrankung, vorzugsweise akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL) in einem Säuger.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung die Verwendung einer Verbindung der oben genannten Formel 1 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer neoplastischen Erkrankung, vorzugsweise akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL) in einem Säuger.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung wenigstens eine der in den 2 bis 6 gezeigten Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer neoplastischen Erkrankung, vorzugsweise akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL) in einem Säuger.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung eine Verbindung der oben genannten Formel 1 zur Behandlung einer zellproliferativen Erkrankung in einem Säuger.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung wenigstens eine der in den 2 bis 6 gezeigten Verbindungen zur Behandlung einer zellproliferativen Erkrankung in einem Säuger.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung die Verwendung einer Verbindung der oben genannten Formel 1 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer zellproliferativen Erkrankung in einem Säuger.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung wenigstens eine der in den 2 bis 6 gezeigten Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer zellproliferativen Erkrankung in einem Säuger.
Zusammenfassung der Figuren
1 zeigt in schematischer Form ein Verfahren zum Synthetisieren der Verbindungen der Erfindung. R₁ ist C1- bis C3-Alkyl; R₂ ist Aryl oder -(CH₂)_n-Aryl, wobei n 1 bis 4 ist; R₃ ist H oder CH₃, und R₄ ist substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl, Pyridyl, Thiophen, Furan, Indol, Pyrrol, Thiazol oder Imidazol.
2 bis 6 zeigen einige Beispiele der Verbindungen der Erfindung.
7 zeigt die inhibitorische Wirkung (ausgedrückt als Koloniebildung/1,5 × 10⁵ Zellen) von verschiedenen Verbindungen der Erfindung auf das Wachstum von G2-ALL-Zellen.
8 zeigt die inhibitorische Wirkung von verschiedenen Verbindungen der Erfindung auf das Wachstum von G2-ALL-Zellen.
9, 10, 11 und 12 zeigen die Wirkung der Verbindungen AG 1977, AG 1978, AG 2009 bzw. AG 2010 auf das Wachstum von normalen BM-Zellen, angegeben durch drei verschiedene Tests.
13 zeigt die Hemmung von G2-ALL-Zellen durch verschiedene Konzentrationen der Verbindungen der Erfindung.
14 zeigt eine Dosisantwortkurve von G2-ALL-Zellhemmung und der Konzentration von AG 2009.
15 zeigt die Hemmung von C1-ALL-Zellen durch verschiedene Konzentrationen von AG 1977 und 1978.
16 zeigt die Hemmung von A1-ALL-Zellen durch verschiedene Konzentrationen der Verbindungen der Erfindung.
17 zeigt die Hemmung von Blast-Zellen durch verschiedene Verbindungen der Erfindung.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Von einer Anzahl von Tyrphostinen, einschließlich der Verbindung α-Cyano-3,4-dihydroxyzimtaldehyd-benzylamid (AG 490), wurde zuvor gezeigt, daß sie das Wachstum von Leukämiezellen hemmen und als aktive Bestandteile in pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung von Leukämie geeignet sind.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben herausgefunden, daß eine Gruppe von substituierten Benzyliden-Malononitrilen unerwartet verbesserte Wirksamkeit bei der Behandlung von zellproliferativen Erkrankungen hat. Zum Beispiel haben die Erfinder gezeigt, daß die hierin beschriebenen Tyrphostine eine vollständige Unterdrückung der Proliferation von humanen Zellen von akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL) und von pre-B-ALL-Blast-Zellen lieferte, ohne normale Knochenmarkszellen signifikant zu beeinflussen, wie es in den Beispielen beschrieben ist.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung haben die Formel:
wobei
R₁ H oder C1- bis C3-Alkyl ist,
R₂ Aryl oder -(CH₂)_n-Aryl und n 1 bis 4 ist,
R₃ H oder CH₃ ist und
R₄ substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl, Pyridyl, Thiophen, Furan, Indol, Pyrrol, Thiazol oder Imidazol ist.
Die Verbindungen der Erfindung werden nach dem in 1 schematisch gezeigten Verfahren hergestellt. Die erforderlichen Aldehyde (a) sind handelsüblich erhältlich oder können synthetisiert werden, wie es zuvor beschrieben wurde (Gazit et al., (1993), J. Med. Chem., Band 36, S. 3556). Benzylcyanoacetamid (b) wird synthetisiert, wie es zuvor beschrieben wurde (Gazit et al., (1991), J. Med. Chem., Band 34, S. 1896).
Eine bevorzugte Gruppe von Verbindungen sind die in den 2 bis 6 gezeigten Verbindungen.
Die Verbindungen der Erfindung können zur Behandlung einer Vielzahl neoplastischer Erkrankungen eingesetzt werden, einschließlich Leukämie, Lymphomen, metastasenbildenden Karzinomen und anderen Formen von Krebs. Leukämien, welche behandelt werden können, umfassen akute immunphänotypische B-lymphoblastische Leukämie (ALL), wie die aggressive Philadelphia⁺-Leukämie, und akute myelozytische Leukämie und juvenile myelomonozytische Leukämie; Lymphome, welche behandelt werden können, umfassen phänotypisches B-Burkitts-Lymphom und Non-Hodgkins-Lymphome, wie die Ki-1-positiven, anaplastischen Großzelllymphome.
Die Verbindungen der Erfindung können auch dazu eingesetzt werden, Zellwachstum in einer Vielzahl von zellproliferativen Erkrankungen zu reduzieren oder zu hemmen, wie bei inflammatorischen Erkrankungen, allergischen Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen und Transplantatabstoßungssituationen, bei welchen eine Zellwachstumsunterdrückung und vorzugsweise eine Unterdrückung von T-Zellwachstum erwünscht ist.
Die Verbindungen der Erfindung können auch dazu eingesetzt werden, die Aktivität von Jak2-Kinase zu hemmen. Sie können daher zur Behandlung jeder Erkrankung, die mit erhöhter oder unerwünschter Jak2-Kinaseaktivität einhergeht, eingesetzt werden.
Die Verbindungen dieser Erfindung können in der Form der freien Base, in der Form von Salzen und als Hydrate eingesetzt werden. Alle Formen liegen im Umfang der Erfindung. Säureadditionssalze können hergestellt werden und stellen eine für die Verwendung geeignetere Form dar; in der Praxis kommt die Salzform inhärent der Verwendung der basischen Form gleich. Die Säuren, welche zur Herstellung der Säureadditionssalze verwendet werden können, umfassen vorzugsweise solche, welche, wenn sie mit der freien Base kombiniert werden, pharmazeutisch verträgliche Salze bilden, d.h. Salze, deren Anionen für den tierischen Organismus in pharmazeutischen Dosen der Salze nicht toxisch sind, so daß die vorteilhaften Eigenschaften, die der freien Base inhärent sind, durch Nebenwirkungen, die den Anionen zuzuschreiben sind, nicht beeinträchtigt werden. Obwohl pharmazeutisch verträgliche Salze der basischen Verbindungen bevorzugt werden, sind alle Säure additionssalze als Ausgangsstoffe für die Form der freien Base geeignet, auch wenn das spezielle Salz per se nur als ein Zwischenprodukt gewünscht wird, wie z.B. wenn das Salz nur zu Zwecken der Reinigung und Identifizierung gebildet wird oder wenn es als ein Zwischenprodukt bei der Herstellung eines pharmazeutisch verträglichen Salzes durch Ionenaustauschverfahren verwendet wird.
Pharmazeutisch verträgliche Salze innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung umfassen solche, die von den folgenden Säuren abgeleitet sind: Mineralsäuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und Sulfamidsäure, und organische Säuren, wie Essigsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Weinsäure, Malonsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Cyclohexylsulfamidsäure, Chinasäure und ähnliche.
Verbindungen können hinsichtlich ihrer Wirksamkeit bei der Hemmung von Zellwachstum in Zellproliferationstests, wie solchen, die hierin beschrieben sind, untersucht werden. Erfindungsgemäß können die Tyrphostine einem Leukämiepatienten in einer Vielzahl von Formen, abhängig von dem ausgewählten Weg der Verabreichung, was für den Fachmann auf dem Gebiet klar ist, verabreicht werden. Die Zusammensetzungen der Erfindung können oral oder parenteral verabreicht werden, wobei der letztgenannte Weg intravenöse und subkutane Verabreichung umfaßt. Parenterale Verabreichung kann durch kontinuierliche Infusion über einen ausgewählten Zeitraum erfolgen.
Die aktive Verbindung kann oral z.B. mit einem inerten Verdünnungsmittel oder mit einem assimilierbaren genießbaren Träger verabreicht werden oder sie kann in Gelatinekapseln mit harter oder weicher Hülle eingeschlossen sein oder sie kann zu Tabletten gepreßt sein oder sie kann direkt mit der Nahrung der Diät aufgenommen werden. Für eine orale therapeutische Verabreichung kann die aktive Verbindung mit einem Arzneistoffträger aufgenommen werden und in der Form von aufnehmbaren Tabletten, bukkalen Tabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirupen, Oblaten und ähnlichem eingesetzt werden.
Die aktive Verbindung kann auch parenteral oder intraperitoneal verabreicht werden. Lösungen der aktiven Verbindung als eine freie Base oder ein pharmakologisch verträgliches Salz können in Wasser, in geeigneter Weise gemischt mit einem oberflächenaktiven Mittel, wie Hydroxypropylzellulose, hergestellt werden. Eine Dispersion kann auch in Glycerin, flüssigen Polyethylenglycolen und Gemischen davon und in Ölen hergestellt werden. Unter herkömmlichen Lagerungs- und Verwendungsbedingungen enthalten diese Präparationen ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Die für eine injizierbare Verwendung geeigneten pharmazeutischen Formen umfassen sterile wäßrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die unvorbereitete Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen und Dispersionen. In allen Fällen muß die Form steril sein und in dem Maße flüssig, daß sie leicht injizierbar ist.
Die therapeutischen Verbindungen dieser Erfindung können einem Säuger alleine oder in Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Trägern, wie oben erwähnt, verabreicht werden, wobei deren Anteil anhand der Löslichkeit und der chemischen Natur der Verbindung, dem gewählten Verabreichungsweg und pharmazeutischer Standardpraxis bestimmt wird.
Tyrphostine werden anfänglich in einer geeigneten Dosis verabreicht, so daß eine Blutmenge von etwa 10 μM bereitgestellt wird. Die Dosis kann, wenn es erforderlich ist, in Abhängigkeit von der klinischen Reaktion angepaßt werden.
Ein alternativer therapeutischer Ansatz besteht dann, Knochenmark oder periphere Blutzellen, welche Stammzellen enthalten, von Patienten mit Leukämie oder Lymjphom zu erhalten und diese Zellen ex vivo mit einem Tyrphostin der Erfindung zu behandeln, um vorhandene Leukämie- oder Lymphomzellen unter minimaler Hemmung von normalen Stammzellen zu entfernen oder zu töten. Die behandelten Zellen werden gewaschen, um überschüssiges Tyrphostin zu entfernen, und in den Patienten zurückgeführt.
Für solch eine ex vivo Behandlung von Zellen über einen kurzen Zeitraum, z.B. etwa 5 Stunden, können höhere Dosen an Tyrphostin verwendet werden als für eine Langzeittherapie in vivo; z.B. können Konzentrationen von 50 μM oder höher eingesetzt werden.
Beispiele
Die Beispiele werden zu Erläuterungszwecken beschrieben und sollen den Schutzumfang der Erfindung nicht beschränken.
Beispiel 1
Synthese von Verbindungen
Die Verbindungen der Erfindung wurden im allgemeinen nach dem in 1 schematisch dargestellten Verfahren synthetisiert.
Verbindung AG 1946: N-Benzyl-2-cyano-3-(4-hydroxy-3'-methoxy-5'-methylenthiobenzylphenyl)-acrylamid
R₁ = CH₃, R₂ = Benzyl, R₃ = H, R₄ = Phenyl
(a) 207 mg 0,72 mM 4-Hydroxy-3-methoxy-5-methylenthiobenzylbenzaldehyd, 130 mg 0,75 mM N-Benzylcyanoacetamid und 10 mg β-Alanin wurden in 25 ml Ethanol für 3 Stunden unter Rückfluß gekocht. Eindampfen und Triturierung mit Dichlormethanhexan lieferten 305 mg gelbgrünen Feststoff, 95% Ausbeute, Smp.: 135°C.
NMR (Aceton d₆) δ 8,17 (1H, s, Vinyl), 7,70 (1H, d, J = 2,1 Hz), 7,57 (1H, d, J = 2,1 Hz), 7,3 (10H, m), 4,60 (2H, s), 3,93 (3H, s), 3,78 (2H, s), 3,74 (2H, s).
Verbindung AG 1977: N-Benzyl-2-cyano-3-(3',4'-dihydroxy-5'-methylenthiobenzylphenyl)-acrylamid
R₁ = CH₃, R₂ = Benzyl, R₃ = H, R₄ = Phenyl
(b) Zu 450 mg Produkt aus (a) in 30 ml Dichlormethan wurden 0,5 ml BBr₃ hinzugegeben. Nach Rühren für 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde Wasser hinzugegeben und die Reaktion mit Ethylacetat extrahiert. Eindampfen und Triturierung mit Trichlormethanhexan lieferten 340 mg gelben Feststoff, 78% Ausbeute, Smp.: 195°C.
NMR (Aceton d₆) δ 8,08 (1H, s, Vinyl), 7,62 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,3 (11H, m), 4,58 (2H, s), 3,78 (2H, s), 3,75 (2H, s).
MS m/e-430(M⁺, 16%), 175 (100%)
Verbindung AG 1951: N-Benzyl-2-cyano-3-(3'-ethoxy-4'-hydroxy-5'-methylenthiophenylphenyl)-acrylamid
R₁ = CH₂CH₃, R₂ = Phenyl, R₃ = H, R₄ = Phenyl
(c) 500 mg 1,74 mM 3-Ethoxy-4-hydroxy-5-methylenthiophenylbenzaldehyd, 310 mg 1,78 mM N-Benzylcyanoacetamid und 25 mg β-Alanin wurden in 40 ml Ethanol für 4 Stunden unter Rückfluß gekocht. Eindampfen und Triturierung mit Hexan lieferten 730 mg gelben Feststoff, 95% Ausbeute, Smp.: 108°C.
NMR (Aceton d₆) δ 8,10 (1H, s, Vinyl), 7,70 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,53 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,3 (10H, m), 4,58 (2H, d, J = 6,0 Hz), 4,26 (2H, s), 4,18 (2H, q, J = 7,0 Hz), 1,42 (3H, t, J = 7,0 Hz).
Verbindung AG 1978: N-Benzyl-2-cyano-3-(3',4-hydroxy-5'-methylenthiophenylphenyl)acrylamid
R₁ = H, R₂ = Phenyl, R₃ = H, R₄ = Phenyl
(d) Zu 200 mg Produkt aus (c) in 30 ml Dichlormethan wurden 0,4 ml BBr₃ hinzugefügt. Nach Rühren für 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde Wasser hinzugefügt und die Reaktion mit Ethylacetat extrahiert. Eindampfen und Triturierung mit Dichlormethanhexan lieferten 91 mg gelben Feststoff, 47% Ausbeute, Smp.: 175°C.
NMR (Aceton d₆) δ 8,01 (1H, s, Vinyl), 7,63 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,3 (11H, m), 4,58 (2H, s), 4,26 (2H, s).
MS m/e-416(M⁺, 16%), 309(12), 263(32), 196(37), 175(100%).
Verbindung AG 2007: N-Benzyl-2-cyano-3-(4'-hydroxy-3'-methoxy-5'-(methylenthioethylphenyl)-phenyl)-acrylamid
R₁ = CH₃, R₂ = CH₂CH₂Ph, R₃ = H, R₄ = Phenyl
(e) 400 mg 1,3 mM 4-Hydroxy-3-methoxy-5-methylenthiophenethylbenzaldehyd, 240 mg 1,38 mM N-Benzylcyanoacetamid und 20 mg β-Alanin wurden in 40 ml Ethanol für 4 Stunden unter Rückfluß gekocht. Eindampfen und Triturierung mit Dichlormethanhexan lieferten 450 mg gelben Feststoff, 88% Ausbeute, Smp.: 102°C.
NMR (CDCl₃) δ 8,25 (1H, s, Vinyl), 7,62 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,3 (11H, m), 4,61 (2H, d, J = 6,0 Hz), 3,96 (3H, s), 3,81 (2H, s), 2,80 (4H, m).
Verbindung AG 2009: N-Benzyl-2-cyano-3-(3',4'-dihydroxy-5'-(methylenthioethylphenyl)-phenyl)-acrylamid
R₁ = H, R₂ = CH₂CH₂Ph, R₃ = H, R₄ = Phenyl
(f) Zu 320 mg Produkt aus (e) in 25 ml Dichlormethan wurden 0,3 ml BBr₃ hinzugefügt. Nach Rühren für 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde Wasser hinzugefügt und die Reaktion mit Ethylacetat extrahiert. Eindampfen und Triturierung mit Dichlormethanhexan lieferten 110 mg gelben Feststoff, 35% Ausbeute, Smp.: 153°C.
NMR (Aceton d₆) δ 8,09 (1H, s, Vinyl), 7,63 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,3 (11H, m), 4,58 (2H, s), 3,58 (2H, s), 2,80 (4H, m).
Verbindung AG 2008: N-Benzyl-2-cyano-3-(4'-hydroxy-3'-methoxy-5'-(methylenthiopropylphenyl)-phenyl)-acrylamid
R₁ = CH₃, R₂ = CH₂CH₂CH₂Ph, R₃ = H, R₄ = Phenyl
(g) 800 mg 2,5 mM 4-Hydroxy-3-methoxy-5-methylenthiopropylphenylbenzaldehyd, 430 mg 2,5 mM N-Benzylcyanoacetamid und 20 mg β-Alanin wurden in 40 ml Ethanol für 4 Stunden unter Rückfluß gekocht. Eindampfen und Triturierung mit CCl₄ lieferten 760 mg gelben Feststoff, 63% Ausbeute, Smp.: 78°C.
NMR (CDCl₃) δ 8,25 (1H, s, Vinyl), 7,62 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,3 (11H, m), 4,61 (2H, d, J = 6,0 Hz), 3,96 (3H, s), 3,81 (2H, s), 2,69 (2H, t, J = 6,0 Hz), 2,50 (2H, t, J = 6,0 Hz), 1,90 (2H, quint., J = 6,0 Hz).
Verbindung AG 2010: N-Benzyl-2-cyano-3-(3',4'-dihydroxy-5'-(methylenthiopropylphenyl)-phenyl)-acrylamid
R₁ = H, R₂ = CH₂CH₂CH₂Ph, R₃ = H, R₄ = Phenyl
(h) Zu 660 mg Produkt aus (g) in 25 ml Dichlormethan wurden 0,6 ml BBr₃ hinzugefügt. Nach Rühren für 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde Wasser hinzugefügt und die Reaktion mit Ethylacetat extrahiert. Eindampfen und Triturierung mit Dichlormethanhexan lieferten 610 mg gelben Feststoff, 95% Ausbeute, Smp.: 138°C.
NMR (Aceton d₆) δ 8,17 (1H, s, Vinyl), 7,63 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,3 (11H, m), 4,58 (2H, s), 3,80 (2H, s), 2,69 (2H, t, J = 6,0 Hz), 2,52 (2H, t, J = 6,0 Hz), 1,90 (2H, quint., J = 6,0 Hz).
Verbindung AG 1976: N-Benzyl-2-cyano-3-(3',4'-dihydroxy-5'-methylen-(2'-thiobenzothiazol)-phenyl)-acrylamid
R₁ = H, R₂ = 2-Thiobenzothiazol, R₃ = H, R₄ = Phenyl
(i) 330 mg 1 mM 4-Hydroxy-3-methoxy-5-methylen-(2-thiobenzothiazol)-benzaldehyd, 180 mg 1,03 mM N-Benzylcyanoacetamid und 15 mg β-Alanin wurden in 20 ml Ethanol für 4 Stunden unter Rückfluß gekocht. Kühlen und Filtration lieferten 460 mg gelben Feststoff, 95% Ausbeute.
(j) Zu 200 mg 0,4 mM Feststoff aus (i) in 30 ml Dichlormethan wurden 0,4 ml BBr₃ hinzugefügt. Nach Rühren für 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden Wasser und 3 ml HCl hinzugefügt und die Reaktion mit Ethylacetat extrahiert. Eindampfen und Triturie rung mit Dichlormethanhexan lieferten 40 mg hellgelben Feststoff, 20% Ausbeute, Smp.: 225°C.
NMR Aceton d₆ δ 8,07 (1H, s, Vinyl), 7,95 (2H, m), 7,6 7,1 (9H, m), 4,60 (2H, s), 4,48 (2H, d, J = 5,9 Hz).
Beispiel 2
Hemmung von Koloniebildung
Zellinien akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL)
Die Hemmung von Koloniebildung wurde nach Verfahren untersucht, die zuvor beschrieben wurden (Kamel-Reid et al., (1992), Leukemia, Band 6, S. 8-17; Meydan et al., (1996), Nature, Band 379, S. 645-648).
ALL-Zellinien A1 (mit 8×10⁵ Zellen/ml), C1 (mit 4×10⁴ Zellen/ml) und G2 (mit 1,15×10⁶ Zellen/ml) wurden in Volumina von 1 ml in der Abwesenheit exogener Wachstumsfaktoren in 35 mm-Petrischalen (Nunc, Gibco), welche alpha-MEM (Gibco) mit 10% FCS (Cansera Rexdale, Ont.) in 0,9% (Vol./Vol.) Methylcellulose (Fluka, Schweiz) enthielten, ausplattiert. Die Kulturen wurden auf 37°C mit 5% CO₂ in einer befeuchteten Atmosphäre eingestellt, und 10 μM eines ausgewählten Tyrphostins wurden hinzugefügt. Kolonien, die aus mehr als 20 Zellen bestanden, wurden nach 12 Tagen (A1), 5 Tagen (C1) und 14 Tagen (G2) unter Verwendung eines Inversionsmikroskops gezählt. Die Ergebnisse mit G2 sind in 7 gezeigt. Ähnliche Ergebnisse wurden mit A1 und C1 erhalten.
Beispiel 3
Wirkung auf Knochenmarkszellen
Verbindungen, die eine Hemmung von ALL-Koloniebildung zeigten, wurden hinsichtlich ihrer Wirkung auf normale Knochenmarkszellen unter Verwendung eines modifizierten CFU-GEMM-Klontests untersucht.
Der Test wurde nach Fauser und Messner (1978), Blood, Band 52, S. 1243-1248, und Messner und Fausser (1980), Blut, Band 41, S. 327-333, mit einigen Abweichungen durchgeführt. Zusammengefaßt wurden heparinisierte Knochenmarkszellen über Percoll (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) mit einer Dichte von 1,077 g/ml geschichtet und bei 400 g bei 4°C für 10 Minuten zentrifugiert, um Neutrophile und RBCs zu entfernen. Die fraktionierten Knochenmarkszellen mit 2×10⁵ Zellen/ml wurden in IMDM (OCI, Toronto), welches 0,9% (Vol./Vol.) Methylcellulose enthielt und mit 30% FCS (Cansera Rexdale, Ont.) oder normalem menschlichem Plasma, einem Cocktail aus Cytokinen, bestehend aus G-CSF (10 ng/ml, Amgen), IL-3 (40 U/ml, Immunex), MGF (50 ng/ml, Immunex), Erythropoietin (2 U/ml, Epprex) oder TPO (10 ng/ml, Amgen), und 5×10^–5 2-Mercaptoethanol versetzt war, kultiviert. Das Kulturgemisch wurde in Volumina von 1 ml in 35 mm-Petrischalen ausplattiert und bei 37°C mit 5% CO₂ in einer befeuchteten Atmosphäre mit Konzentrationen an Tyrphostin von bis zu 40 μM inkubiert. Die Ergebnisse sind in den 9 bis 12 gezeigt.
Die BFU-Es (Erythroidkolonien) und die CFU-GEMM (gemischte Kolonien) zeigten eine Hemmung bei und oberhalb von 25 μM (Figur nicht gezeigt), während die CFU-Cs (Granulozyten, Monozyten und Makrophagen) einen dramatischen Anstieg der Kolonieproliferation mit einem Maximum bei 25 μM und eine Reduzierung durch 50 μM zeigten (Figur nicht gezeigt). AG 2010 zeigte eine signifikante Hemmung bei 40 μM, während die übrigen Verbindungen schwache bis signifikante Hemmung von Erythroid- und gemischten Kolonien, gefolgt von der Myeloidpopulation bei 20 μM zeigten.
Beispiel 4
Hemmung von ALL-Zellen
Verschiedene Konzentrationen von Tyrphostinen wurden hinsichtlich der Hemmung von ALL-Zellen in dem in Beispiel 2 beschriebenen Klontest untersucht. Die Verbindungen AG 1977, 1978, 2007, 2008, 2009 und 2010 wurden gegen die ALL-Zellinien A1, C1 und G2 in Dosen im Bereich von nanomolaren bis mikromolaren Werten getestet. Die Ergebnisse sind in den 8, 13, 15 und 16 gezeigt.
AG 2009 zeigte die stärkste Klonhemmung in einer dosisabhängigen Art und Weise gegenüber G2-Zellen (13). Es zeigte eine Hemmung von mehr als 5% bei einer Dosis von 16 nM und einen differentiellen therapeutischen Index von mehr als 2 Logs in einer Überlebenskurve (14) von normalen BM- und G2-Kolonien.
Beispiel 5
Hemmung von Blast-Zellen
Die Verbindungen wurden weiterhin in einem ALL-Blast-Kolonie-Test gegenüber Knochenmarksproben von zwei Patienten mit pre-B-ALL-Phänotyp, basierend auf deren FAB-Klassifikation, getestet.
Der ALL-Blast-Kolonie-Test wurde wie zuvor beschrieben (Estrov, Z. et al. (1988), Cancer Res., Band 48, S. 5901) mit einigen Modifikationen durchgeführt. Zusammengefaßt wurden heparinisierte Knochenmarkszellen über Percoll (Dichte: 1,077 g/l; Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.) geschichtet und für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert (400 g), um Neutrophile und RBCs zu entfernen. Die gesammelte Zwischenphasenfraktion wurde vor dem Ausplattieren weiter an Lymphoblasten unter Verwendung eines magnetischen Zellseparators, mini MACS, mit einer Trennsäule (Miltenyi Biotec Inc., 1250 Oakmead Park, Sunnyvale, Ca) angereichert. Nach diesem Verfahren wurden ALL-Blaste spezifisch aus der einkernigen Markzellfraktion unter Verwendung von direkt markiertem MACS CD19-Mikroperlen-monoklonalem-Anti-Mensch-CD19 (Maus IgG1, Kappa-Miltenyi Biotec Inc.) und/oder indirekter magnetischer Zellmarkierung unter Verwendung von primärem biotinyliertem Antikörper (monoklonaler Maus-Anti-Mensch-CD10-Antikörper, Caltag Laboratories, Ca.) und Streptavidin-Mikroperlen (Miltenyi Biotec Inc.) isoliert. Die positiv sortierten Zellen wurden dann mit 2×10⁵ Zellen/ml in alpha-MEM (Gibco), welches 0,9% (Vol./Vol.) Methylzellulose enthielt und mit 10% FCS (Cansera, Rexdale, Ont.) versetzt war, kultiviert. Bestrahlte autologe Leukämieblaste wurden als Feeder-Zellen (mit 3×10⁵ Zellen/ml) verwendet. Cytokine, welche normalerweise eingesetzt wurden, wurden weggelassen, so daß nur spontane Proliferation deutlich wurde.
Das Kulturgemisch wurde in 35 mm-Petrischalen (Nunc, Gibco), welche Volumina von 1 ml enthielten, ausplattiert und bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO₂ inkubiert. Kolo nien, die mehr als 20 Zellen enthielten, wurden unter Verwendung eines Inversionsmikroskops nach 5-7 Tagen ausgezählt.
In beiden Fällen wurde eine signifikante Hemmung von Blast-Kolonien beobachtet (siehe z.B. 17).
Beispiel 6
Hemmung von Jak2-Kinaseaktivität
Verbindungen, die auf der Grundlage ihrer Fähigkeit ausgewählt wurden, das Wachstum (Koloniebildung) der pre-B-Leukämiezellinie G2 zu hemmen, wurden hinsichtlich der Hemmung von Jak2-Kinase getestet.
Jak2-Kinase wurde aus einem 1%-Triton-X100-Lysat von 10×10⁶ G2-Zellen immunpräzipitiert. Ein in vitro-Kinasetest wurde an der immunpräzipitierten Jak2 in der Gegenwart oder Abwesenheit variierender Konzentrationen der Verbindungen AG 1977, AG 1978, AG 2009 und AG 2010 durchgeführt.
Stammlösungen von 100 mM Tyrphostin wurden in 100% DMSO hergestellt, und weitere Verdünnungen wurden in 10% DMSO zubereitet. Kontroll-Kinasetests, die in der Gegenwart von DMSO-Konzentrationen von 5 bis 30% alleine durchgeführt wurden, blieben von dessen Gegenwart unbeeinflußt.
Anfängliche Experimente wurden mit Tyrphostin-Konzentrationen von 0,1, 1,0 und 10 μM durchgeführt. Diese Konzentrationen hatten keinen Einfluß auf die Kinaseaktivität von Jak2. Bei Verwendung höherer Konzentrationen, 5, 25 und 50 μM, konnte eine Hemmung beobachtet werden, wie es nachfolgend in Tabelle 1 gezeigt ist. Diese Ergebnisse wurden durch Abtastung von Autoradiogrammen der Kinasetests erhalten.
TABELLE 1 Hemmung der Kinaseaktivität

Claims

Verbindung der allgemeinen Formel
wobei R₁ H oder C1- bis C3-Alkyl ist, R₂ Aryl oder -(CH₂)_n-Aryl und n 1 bis 4 ist, R₃ H oder CH₃ ist und R₄ substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl, Pyridyl, Thiophen, Furan, Indol, Pyrrol, Thiazol oder Imidazol ist, oder ein Salz oder Hydrat davon.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R₁ H, Methyl oder Ethyl ist, R₂ Phenyl, Benzyl, -(CH₂)₂-Phenyl, -(CH₂)₃-Phenyl oder 2-Thiobenzothiazol ist, R₃ H ist und R₄ Phenyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung N-Benzyl-2-cyano-3-(4'-hydroxy-3'-methoxy-5'-methylenthiobenzylphenyl)-acrylamid ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung N-Benzyl-2-cyano-3-(3'-ethoxy-4'-hydroxy-5'-methylenthiophenylphenyl)-acrylamid ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung N-Benzyl-2-cyano-3-(3',4'-dihydroxy-5'-methylen-(2'-thiobenzothiazol)-phenyl)-acrylamid ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung N-Benzyl-2-cyano-3-(3',4'-dihydroxy-5'-methylenthiobenzylphenyl)-acrylamid ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung N-Benzyl-2-cyano-3-(3',4'-dihydroxy-5'-methylenthiophenylphenyl)-acrylamid ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung N-Benzyl-2-cyano-3-(4'-hydroxy-3'-methoxy-5'-(methylenthioethylphenyl)-phenyl)-acrylamid ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung N-Benzyl-2-cyano-3-(4'-hydroxy-3'-methoxy-5'-(methylenthiopropylphenyl)-phenyl)-acrylamid ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung N-Benzyl-2-cyano-3-(3',4'-dihydroxy-5'-(methylenthioethylphenyl)-phenyl)-acrylamid ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung N-Benzyl-2-cyano-3-(3',4'-dihydroxy-5'-(methylenthiopropylphenyl)-phenyl)-acrylamid ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung mit einer Verbindung der Formel:
wobei R₁ H oder C1- bis C3-Alkyl ist, R₂ Aryl oder -(CH₂)_n-Aryl und n 1 bis 4 ist, R₃ H oder CH₃ ist und R₄ substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl, Pyridyl, Thiophen, Furan, Indol, Pyrrol, Thiazol oder Imidazol ist, oder einem Salz oder Hydrat davon und einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12 mit einer Verbindung der Formel 1, wobei R₁ H, Methyl oder Ethyl ist, R₂ Phenyl, Benzyl, -(CH₂)₂-Phenyl, -(CH₂)₃-Phenyl oder 2-Thiobenzothiazol ist, R₃ H ist und R₄ Phenyl ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Verbindung N-Benzyl-2-cyano-3-(4'-hydroxy-3'-methoxy-5'-methylenthiobenzylphenyl)-acrylamid ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Verbindung N-Benzyl-2-cyano-3-(3'-ethoxy-4'-hydroxy-5'-methylenthiophenylphenyl)-acrylamid ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Verbindung N-Benzyl-2-cyano-3-(3',4'-dihydroxy-5'-methylen-(2'-thiobenzothiazol)-phenyl)-acrylamid ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Verbindung N-Benzyl-2-cyano-3-(3',4'-dihydroxy-5'-methylenthiobenzylphenyl)-acrylamid ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Verbindung N-Benzyl-2-cyano-3-(3',4'-dihydroxy-5'-methylenthiophenylphenyl)-acrylamid ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Verbindung N-Benzyl-2-cyano-3-(4'-hydroxy-3'-methoxy-5'-(methylenthioethylphenyl)-phenyl)-acrylamid ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Verbindung N-Benzyl-2-cyano-3-(4'-hydroxy-3'-methoxy-5'-(methylenthiopropylphenyl)-phenyl)-acrylamid ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Verbindung N-Benzyl-2-cyano-3-(3',4'-dihydroxy-5'-(methylenthioethylphenyl)-phenyl)-acrylamid ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Verbindung N-Benzyl-2-cyano-3-(3',4'-dihydroxy-5'-(methylenthiopropylphenyl)-phenyl)-acrylamid ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 für das Behandeln einer neoplastischen Erkrankung in einem Säuger.
Verbindung nach Anspruch 23, wobei die neoplastische Erkrankung ein Lymphom, eine Leukämie oder ein metastasenbildendes Karzinom ist.
Verbindung nach Anspruch 23, wobei die neoplastische Erkrankung akute lymphoblastische Leukämie ist.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer neoplastischen Erkrankung in einem Säuger.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei die neoplastische Erkrankung ein Lymphom, eine Leukämie oder ein metastasenbildendes Karzinom ist.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei die neoplastische Erkrankung akute lymphoblastische Leukämie ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 für das Behandeln einer zell-proliferativen Erkrankung in einem Säuger.
Verbindung nach Anspruch 29, wobei die zell-proliferative Erkrankung aus der Gruppe, die aus einer inflammatorischen Erkrankung, einer allergischen Erkrankung, einer Autoimmunerkrankung oder Transplantatabstoßung besteht, ausgewählt ist.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 bei der Herstellung eines Medikaments für das Behandeln einer zell-proliferativen Erkrankung in einem Säuger.
Verwendung nach Anspruch 31, wobei die zell-proliferative Erkrankung aus der Gruppe, die aus einer inflammatorischen Erkrankung, einer allergischen Erkrankung, einer Autoimmunerkrankung oder Transplantatabstoßung besteht, ausgewählt ist.