DE4422859A1 - Wäßrige Zellextrakte und wäßrige Suspensionen von Zellwandfraktionen aus Mykobacterien - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft wäßrige Extrakte und wäßrige Suspensionen von Zellwandfraktionen aus in der Regel nicht menschenpathogenen Mykobacterien.

Es ist bekannt, daß Mykobacterium tuberculosis in der Varietät hominis und Mykobacterium leprae humanpathogen sind, aber daneben gibt es eine ganze Reihe Mykobacterien, die in der Regel nur tierpathogen sind; für viele Säugetiere ist beispielsweise Mycobacterium tuberculosis var. bovis pathogen und für Vögel ist Mycobacterium avium ein Krankheitserreger. Allerdings hat sich herausgestellt, daß gelegentlich in seltenen Fällen bei Menschen mit stark angegriffenem Immunsystem auch Infektionen mit an und für sich nur tierpathogenen Mykobacterien zu beobachten sind. Es ist auch bekannt, daß sowohl die Proteine als auch die verschiedenen Lipoidfraktionen der Mykobacterien antigenen Charakter haben, während die Polysacharide wahrscheinlich nur als Haptene im Sinne von Halbantigenen funktionieren. Es ist des weiteren bekannt, daß Tuberkelbakterien, die in einen Wirtsorganismus eindringen, der im Sinne einer durchgemachten Infektion schon zuvor mit Mykobacterien Kontakt hatte, eine Allergie auslösen, also eine immunologisch bedingte spezifisch veränderte Reaktionsbereitschaft. Der Zustand der Allergie gegen Tuberkelbakterien wird durch intrakutane Injektion von Tuberkulin geprüft; Tuberkulin besteht aus gelösten Zerfallsprodukten von Tuberkelbakterien. Mit der Tuberkulinprobe kann also abgeklärt werden, ob ein Wirtsorganismus gegenüber Tuberkelbazillen allergisch ist oder nicht. Ein allergischer Organismus reagiert viel rascher auf eine natürliche Infektion und vermag diese demzufolge eher einzudämmen als ein nicht allergischer Organismus. Diese Tatsache macht man sich zu nutze, um durch eine unspezifische Modulation der Immunfunktionen eine Fehlfunktion oder eine verzögerte Reaktionsbereitschaft des Immunsystems zu korrigieren.

Bei der Immunantwort des Körpers spielen Cytokine wie IL-1 und IL-6 eine zentrale Rolle in der Regulation, Proliferation und Differenzierung von Immunzellen. Eine unspezifische Modulation der Immunfunktion entsteht im wesentlichen durch eine Aktivierung von Monozyten bzw. Makrophagen, die daraufhin Cytokine im verstärkten Maße freisetzen.

Die Interleukinforschung befindet sich zwar noch im Stadium des Experiments, aber zwischenzeitlich ist bekannt, daß Interleukin 1 eine Steigerung der PHA-in­ duzierten Lymphozytenproliferation, Fibroplastenproliferation und eine Aktivitätssteigerung von natürlichen Killerzellen in Anwesenheit von IFN verursacht. Das Gleiche trifft im wesentlichen für Interleukin 6 zu, das ebenfalls eine Aktivitätssteigerung von natürlichen Killerzellen und eine T-Zellproliferation bedingt. Versuchsweise werden die Interleukine daher bei der Immuntherapie zur Behandlung von Tumoren wie zur Substitution bei T-Zelldefekten eingesetzt. Interleukin 2 wird beispielsweise mit Erfolg bei metastasierenden Nierenkarzinomen klinisch eingesetzt und die zu den Cytokinen zählenden Interferon-δ und Interferon-α 2B haben Erfolge bei rheumatoider Arthritis bzw. Haarzellenleukämie gebracht. Seit kurzem wird auch der granulocytenkolonie­ stimulierende Faktor G-CSF bei Leukopenien von Patienten mit vorangegangener myelosuppressiver Chemotherapie in der Klinik angewendet. Neben den isolierten Cytokinen finden aber auch Substanzen therapeutische Anwendung, die das Immunsystem unspezifisch stimulieren bzw. modulieren durch eine Aktivierung von Monozyten bzw. Makrophagen, die daraufhin Cytokine wie IL-1 und IL-6 freisetzen.

Es besteht daher immer noch ein starkes Bedürfnis nach Substanzen, die in der Lage sind eine unspezifische Immunmodulation erzeugen zu können, da durch eine erhöhte Freisetzung von Cytokinen und Interferonen eine ganze Reihe von Krankheiten bzw. deren Begleitsymptome therapeutisch beeinflußbar sind.

Erfindungsgemäß werden daher wäßrige Extrakte bzw. wäßrige Suspensionen von Zellwandfraktionen von in der Regel nicht humanpathogenen Mykobacterien mit den Merkmalen der Ansprüche 1 und 2 vorgeschlagen.

Als in der Regel nicht humanpathogene Mykobacterien können unter anderem eingesetzt werden M. tuberculosis var. bovis, M. avium, M. kansasii, M. marinum, M. scrofulaceum, M. intercellulare, M. xenopi, M. fortuitum und M. chelonae ssp. chelone. Diese Stämme sind als solche bekannt und können beispielsweise aus der umfassenden Londoner Stammsammlung des Centre for Public Health Laboratory, National Collection of Type Cultures bezogen werden. Dieses Institut informiert auch über die Kulturbedingungen der jeweiligen Spezies bzw. Subspezies.

Die erfindungsgemäß hergestellten Extrakte bzw. Suspensionen haben sich in den ersten klinischen Prüfungen als wirksame Immunmodulatoren erwiesen und können beispielsweise als unterstützende Therapie bei Infektionskrankheiten, neoplastischen Erkrankungen, Asthma bronchiale, Allergien unbekannter Genese und rheumatoider Arthritis eingesetzt werden.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1 Herstellung des Extraktes bzw. der Zellwandfraktionen

Für die Herstellung des wäßrigen Extraktes bzw. der Zellwandfraktion werden 250 ml Flüssigkeitsmedium aus 5 g/Liter Natriumchlorid, 14 g/Liter Pepton, 7 g/Liter Na₂HPO₄ × 2H₂O, 2 g/Liter KH₂PO₄, 3% Glycerin (85%) mit einer Bakterienöse mit einer Mykobacteriengebrauchskultur beimpft und 4 Wochen bei 35°C bebrütet. 4,5 g Bakterienfeuchtmasse werden über eine sterile Nutsche mit Glasfritte filtriert und anschließend homogen verrieben. Nach Zugabe von 100 ml sterilisierter isotonischer Natriumchloridlösung beträgt die Keimzahl 9,7 × 10⁶ KBE pro ml.

Die resuspendierten Bakterienzellen werden bei 12.000 RPM 20 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wird mit Glasperlen trocken vermengt, wiederum in Natriumchloridlösung aufgenommen und mit einer Vibrogen-Zellmühle bei 4°C 20 Minuten zerschlagen. Nach Abnutschen über eine Glasfritte und einer Zugabe von 3 Tropfen eines Antischaummittels erfolgt eine erneute Zentrifugation (18.000 RPM, 20 Minuten). Der gewonnene Überstand dient der Herstellung des Mykobacterien-Extraktes, das Pellet der Herstellung der Zellwandfraktion.

Bei der Weiterverarbeitung zum Extrakt werden 43 ml des Überstandes 20 Minuten bei 121°C autoklaviert und bei 4°C gelagert. Es folgt eine Filtration über Tiefenfilter (EKS) und eine Sterilfiltration (Sterilfilter mit Porengröße 0,54 µm). Abschließend wird der filtrierte Extrakt 2 Stunden bei 80°C im Wasserbad gehalten.

Zur Gewinnung der Zellwandfraktion wird das Pellet in 27 ml isotonischer Natriumchloridlösung resuspendiert.

Beispiel 2 Versuche zur Quantifizierung der Cytokininduktion

Bei diesen Versuchen wird auf eine Reihe von Veröffentlichungen Bezug genommen; die in Klammern gesetzten Ziffern beziehen sich auf die beigefügte Literaturliste.

Zellextrakt und Zellwandfraktion zeigen in einer dosisabhängigen Reaktion eine signifikante Induktion der Cytokine Interleukin-1 (IL-1) und Interleukin-6 (IL-6). Cytokine sind lebensnotwendige Botenstoffe, die zwischen den Zellen, u. a. den Zellen des Immunsystems vermitteln.

IL-1 und IL-6 sind pleiotrope Cytokine, die von verschiedenen Zellen produziert werden und eine zentrale Rolle bei der Immunabwehr und der Hämatopoese einnehmen. Sie bewirken eine Proliferation und Differenzierung von T- und B- Zellen (immunmodulierende Wirkung), die Regulation der Akutphase-Proteine durch die Leber im Rahmen eines Entzündungsprozesses (antiinflammatorische Wirkung) sowie die Stimulation der koloniebildenden Zellen für Megakaryozyten und Megakaryozyten selbst (Regulation der Hämatopoese). Außerdem induziert IL-1 die Synthese anderer Lymphokine wie lL-4, IL-5 und IL-6.

Isolierung von mononukleären Zellen

Heparinisiertes Blut aus gesunden Spendern wurde mit Hilfe einer Gradientenzentrifugation über Ficoll isoliert, mehrere Male gewaschen und in serumfreiem RPMI 1640 (1) mit L-Glutamin und Antibiotika inkubiert. Zur Cytokinproduktion (2) wurden die verschiedenen Stimuli 24 Stunden mit den Zellen inkubiert. Die Überstände wurden abgenommen, mit Schutzprotein versehen, bei -20°C aufbewahrt und anschließend im entsprechenden Cytokin- Test untersucht.

Isolierung von vaskulären Endothel- und glatten Muskelzellen

Endothel- und glatte Muskelzellen (EC und SMC) wurden aus Stücken der Vena saphena isoliert, die bei Bypass-Operationen nicht verwendet werden konnten. EC wurden durch Kollagenase-Behandlung (3) und SMC durch eine Auswuchstechnik (4) isoliert. Die Zellen wurden in M199, ECGF und Heparin bzw. DMEM mit 10% FCS, L-Glutamin und Antibiotika (5, 6, 7) inkubiert. Zur Cytokinproduktion wurden die verschiedenen Stimuli 24 Stunden mit den Zellen inkubiert. Die Überstände wurden abgenommen, mit Schutzprotein versehen, bei -20°C aufbewahrt und anschließend im entsprechenden Cytokin-Test untersucht.

7TD1-Assay zum Nachweis von IL-6

Die oben erwähnten Überstände von mononukleären und vaskulären Zellen wurden in 96 Loch Kulturplatten in 8 bis 12 Stufen verdünnt. Zu diesen Verdünnungsreihen wurden 2.000 Zellen/Loch der IL-6-abhängigen murinen B- Zellinie 7TD1 (8) hinzugefügt, ähnlich wie für B9-Zellen beschrieben. Die Kulturen wurden 72 Stunden inkubiert, für weitere 6 Stunden mit radioaktivem Thymidin versehen und die Proliferation der Zellen durch Messung der eingebauten Radioaktivität ermittelt. Die Aktivität der Proben wurde durch Vergleich der Proben mit einem definierten Standard mit Hilfe der Probit-Analyse (9) ermittelt.

Fibroblasten-Assay zum Nachweis von Interleukin-1

Fibroblasten wurden in 96 Loch Platten kultiviert. Nach 24 Stunden wurde das Medium gewechselt und Proben in Verdünnungsreihen zu den Fibroblastenkulturen hinzugefügt. Nach 72 Stunden wurden die Kulturen mit radioaktivem Thymidin versehen und nach weiteren 24 Stunden ausgewertet wie für 7TD1 Zellen beschrieben.

Ergebnisse

Der Extrakt induziert dosisabhängig IL-1 (pg/ml) wie folgt:
Konzentration 1 : 4 : 206 pg/ml; 1 : 16 : 1.250 pg/ml; 1 : 64 : 947 pg/ml; 1 : 1.024 : 625 pg/ml

Der Extrakt induziert dosisabhängig IL-6 (pg/ml) wie folgt:
Konzentration 1 : 4 : 95.082 pg/ml; 1 : 16 : 118.447 pg/ml; 1 : 64 : 76.326 pg/ml; 1 : 1.024 : 51.961 pg/ml

Die Zellwandfraktion induziert dosisabhängig IL-1 (pg/ml) wie folgt:
Konzentration 1 : 4 : 103 pg/ml; 1 : 16 : 1.649 pg/ml; 1 : 64 : 1.539 pg/ml; 1 : 1.024 : 54 pg/ml

Die Zellwandfraktion induziert dosisabhängig IL-6 (pg/ml) wie folgt:
Konzentration 1 : 4 : 2.013 pg/ml; 1 : 16 : 41.711 pg/ml; 1 : 64 : 35.374 pg/ml; 1 : 1.024 : 19.331 pg/ml

Literatur

• 1. Loppnow, H., H. Brade, I. Dürrbaum, C. A. Dinarello, S. Kusuioto, E. T. Rietschel and H.-D. Flad. 1989. IL1 induction capacity of defined lipopolysaccharia partial structures. J. Immunol. 142: 3229-3238.
• 2. Loppnow, H., H. Brade, E. T. Rietschel and H.-D. Flad. 1994. Induction of cytokines in mononuclear and vascular cells by endotoxin and other bacterial products. In: Virginia L. Clark and Patrik M. Bavoil (eds.), Methods in Enzymology; Bacterial pathogenesis, Part B; Interaction of pathogenic bacteria with host cells. Academic Press, Orlando. In press.
• 3. Jaffe, E. A., R L. Nachiann, C. G. Becker an C. R. Minick. 1973. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. J. Clin. Invest. 52: 2745-2756.
• 4. Ross, R. and B. Kariya. 1980. Morphogenesis of vascular smooth muscle in atherosclerosis and cell structure. In: "Handbook of Physiology" The Cardiovascular System, Section 2. (D. F. Bohr, A. P. Somlyo and H. Y. Sparks, eds.), American Physiological Society, Bethesda. p. 66-91.
• 5. Loppnow, H. and P. Libby. 1989. Adult human vascular endo­ thelial cells express the IL6 gene differentially in response to LPS or IL1. Cell. Immunol. 122: 493-503.
• 6. Loppnow, H. and P. Libby. 1990. Proliferating or Inter­ leukin 1-activated Human Vascular Smooth Muscle Cells Secrete Copious Interleukin 6. J. Clin. Invest. 85: 731-738.
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• 8. Van Snick, J., S. Cayphas, A. Vink, C. Uyttenhove, P. G. Coulie, M. R. Rubira and R. J. Simpson. 1986. Purification and NH₂-terminal amino acid sequence of a T-cell derived lymphokine with growth factor activity for B-cell hybridomas. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9679-9683.
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Claims (3)

1. Wäßriger Extrakt aus in der Regel nicht menschenpathogenen Mykobakterien, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt im Cytokintest nach J. Immunol. 120: 2027-2032 bei einer Konzentrationsänderung von 1 : 4 auf 1 : 16 eine Erhöhung des Gehaltes an Cytokinen IL-1 und IL-6 im Verhältnis von 1 : 6 bzw. 1 : 1,25 ergibt.

2. Wäßrige Suspension von Zellwandfraktionen von in der Regel nicht humanpathogenen Mykobakterien, dadurch gekennzeichnet, daß diese Fraktionen im Cytokintest nach J. Immunol. 120: 2027-2032 bei einer Konzentrationsänderung von 1 : 4 auf 1 : 16 IL-1 und IL-6 Cytokine im Verhältnis von 1 : 16 bzw. 1 : 20 induzieren.

3. Verfahren zur Herstellung eines wäßrigen Extraktes bzw. einer wäßrigen Suspension von Zellwandfraktionen von in der Regel nicht menschenpathogenen Mykobakterien, dadurch gekennzeichnet, daß die Mykobakterien 4 Wochen bei 35°Celsius auf einem Peptonagar bebrütet, vom Nährmedium abfiltriert, in isotonischer Kochsalzlösung resuspendiert und dann 20 Minuten bei 12.000 RPM zentrifugiert, das Sediment in Kochsalzlösung aufgenommen und bei 4°Celsius in einer Zellmühle zermahlen und erneut 20 Minuten bei 18.000 RPM zentrifugiert und der Überstand abgetrennt, autoklaviert und sterilfiltriert und anschließend bei 80°Celsius für eine Zeitspanne von 2 Stunden gehalten wird.