CZ285731B6

CZ285731B6 - Vodný extrakt buněk, vodná suspenze frakcí buněčných stěn a způsob jejich výroby

Info

Publication number: CZ285731B6
Application number: CZ963753A
Authority: CZ
Inventors: Hans-Georg Laves; Anne Thomsen
Original assignee: Laves Arzneimittel Gmbh
Priority date: 1994-06-30
Filing date: 1995-06-29
Publication date: 1999-10-13
Also published as: WO1996000579A1; DE4422859C2; JPH09507857A; DE4422859A1; NO965593D0; JP3031718B2; EP0804211A1; AU2888495A; PL317892A1; CZ375396A3; NO965593L; CA2194138A1

Abstract

Vodné extrakty buněk a vodné suspenze frakcí buněčných stěn mykrobakterií, pro člověka zpravidla nepathogenních zvyšují ve tkáních obsah cyktokinů v závislosti na podané dávce a je proto možno je použít k modulaci imunitních reakcí, zejména k jejich zesílení. Řešení se týká také způsobu výroby uvedených vodných extraktů a vodných suspenzí frakcí buněčných stěn. ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká vodných extraktů buněk a také vodných suspenzí frakcí buněčných stěn mykobakterií, pro člověka zpravidla nepatogenních. Tyto produkty vyvolávají nespecifickou modulaci imunitního systému.

Dosavadní stav techniky

Je známo, že Mycobacterium tuberculosis varietas hominis a Mycobacterium leprae jsou pathogenní pro člověka, avšak kromě toho existuje ještě celá řada mykobakterií, které jsou zpravidla pathogenní pouze pro zvířata. Pro řadu savců je například pathogenní Mycobacterium tuberculosis var. Bovis a pro ptáky Mycobacterium tuberculosis var. avium. V některých případech může také u lidí s nedostatečností imunitního systému dojít k infekci těmito druhy mykobakterií. Je rovněž známo, že nejen bílkoviny, nýbrž také různé lipoidní frakce těchto bakterií mají antigenní povahu, zatímco polysacharidy je možno považovat pouze za hapteny. Je také známo, že bakterie tuberkulózy, pronikající do organismu, který se již dostal do styku s těmito bakteriemi ve formě překonané infekce vyvolávají alergii, to znamená specificky podmíněnou pozměněnou reakci. Tuto alergii je možno prokázat intrakutánní injecí tuberkulinu, který je tvořen rozpuštěnými produkty rozkladu těchto bakterií. Pomocí tuberkulinu je tedy možno zjistit, zda je organismus alergický na bakterie tuberkulózy. Alergický organismus reaguje daleko rychleji na přirozenou infekci a je ji také schopen dříve tlumit než nealergický organismus. Tuto skutečnost je možno využít ke korekci chybějících funkcí nebo zpomalené reakce imunitního systému nespecifickou modulací jeho funkcí.

Při odpovědi imunitního systému hrají cytokiny, jako IL-1 a IL-6 ústřední úlohu při řízení, proliferaci a diferenciaci příslušných buněk. Nespecifická modulace imunitního systému spočívá v podstatě v aktivaci monocytů nebo makrofágů, které pak uvolňují cytokiny ve zvýšené míře.

Výzkum interleukinů se sice ještě nachází ve stadiu výzkumů, je však již zřejmé, že interleukin 1 vyvolává zvýšení PHA-indukované proliferace lymfocytů, proliferace fibroblastů a také zvýšení aktivity přirozených buněk-zabíječů v přítomnosti IFN. Totéž v podstatě platí i o interleukinu 6, který rovněž způsobuje zvýšení aktivity přirozených buněk-zabíječů a proliferaci T-buněk. Pokusně se proto interleukiny podávají při immunotherapii k léčení nádorů, například k substituci defektu T-buněk. Interleukin je například s dobiým výsledkem klinicky podáván při metastazujících zhoubných nádorech ledvin a interferony delta a alfa 2B, rovněž považované za cytokiny, jsou podávány při rheumatoidním zánětu kloubů a při leukémiích. Před krátkou dobou došlo již také k podávání faktoru, stimulujícího vznik kolonií granulocytů (G-CSF) při leukopeniích u nemocných po myelosupresivní chemotherapii. Kromě izolovaných cytokinů je však možno použít také látky, které imunitní systém stimulují nespecificky například aktivací monocytů nebo makrofágů, které pak uvolní cytokiny, jako IL-1 a IL-6.

Stále ještě je zapotřebí nalézt další látky, schopné vyvolat nespecifickou modulaci imunitního systému vzhledem k tomu, že zvýšeným uvolněním cytokunů a interferonu je možno příznivě ovlivnit celou řadu onemocnění nebo alespoň jejich příznaků.

Další informace, týkající se interleukinů a látek, vyvolávajících modulaci imunitního systému je možno nalézt v následujících publikacích:

-1 CZ 285731 B6

Literatura

1. Loppnow, Η., H. Bradě, I. Durrbaum, C. A. Dinarello, S. Kusomoto, E. T. Rietschel and H.D. Flad. 1989. IL1 induction capacity of defíned lipopolysaccharide partial structures.

J. Immunol. 142:3229-3238.

2. Loppnow, Η., H. Bradě, E. T. Rietschel and H.-D. Flad. 1994. Induction of cytokines in mononuclear and vascular cells by endotoxin and other bacterial products. In: Virginia L. Clark anc. Patrik M. Bavoil (eds.,), Methods in Enzymology; Bacterial pathogenesis, Part B; Interaction of pathogenic bacteria with host cells, Academie Press, Orlando, In press.

3. Jaffe, E. A., R. L. Nachmann, C. G. Becker and C. R. Minick. 1973. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. J. Clin. Invest. 52: 2745 - 2756.

4. Ross, R. and B. kariya. 1980. Morphogenesis of vascular smooth muscle in atherosclerosis and cell structure. In: „Handbook of Physiology“ The Cardiovascular Systém, Section 2. (D. F. Bohr, A. P. Somlyo and Η. Y. Sparks, eds.), Američan Physiological Society, Bethesda. P. 66-91.

5. Loppnow, H. and P. Libby. 1989. Adult human vascular endothelial cells express the IL6 gene differentially in response to LPS or IL1. Cell. Immunol. 122: 493 - 503.

6. Loppnow, H. and P. Libby. 1990. Proliferating or Interleukin 1-activated Human Vascular Smooth Muscle Cells Secrete Copious Interleukin 6. J. Clin. Invest. 85: 731 - 738.

7. Loppnow, H. and P. Libby. 1992. Functional significance of human vascular smooth muscle cell-derived interleukin 1 in paraerine and autoerine regulation pathways. Exp. Cell Res. 198: 283 - 290.

8. Van Snick, J., S. Cayphas, A. Vink, C. Uyttenhove, P. G. Coulie, M. R. Rubira and R. J. Simpson. 1986. Purification and NH-terminal amino acid sequence of a T-cell derived lymphokine with growth factor activity for B-cell hybridomas. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 9679 - 9683.

9. Gillis, S., Μ. M. Ferm, W. Ou and K. A. Smith. 1978. T-cell growth factor: parameters for production and a quantitative microassay for acivity. J. Immunol. 120: 2027 - 2032.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že k modulaci imunitního systému je také možno užít vodné extrakty buněk mykobakterií, které jsou pro člověka naptogenní a také vodnou suspenzi frakcí jejich buněčných stěn. Vynález se tedy týká následujících předmětů:

Vodný extrakt buněk mykobakterií, pro člověka nepatogenních, získatelný způsobem, při němž se mykobakterie pěstují 4 týdny při teplotě 35 °C v peptonovém agaru, pak se od živného prostředí odfiltrují, znovu se uvedou do suspenze ve fyziologickém roztoku chloridu sodného, odstředí 20 minut při 12 000 otáčkách za minutu, usazenina se smísí s fyziologickým roztokem chloridu sodného a mele v buněčném mlýnu při teplotě 4 °C, načež se znovu odstředí 20 minut při 18 000 otáčkách za minutu, supematant se oddělí, autoklavuje a sterilizuje filtrací a pak se udržuje 2 hodiny na teplotě 80 °C za získání extraktu, který při testu na cytokin vyvolá při změně koncentrace z 1 : 4 na 1 : 16 zvýšení obsahu cytokinů IL-1 a IL-6 v poměru 1 : 6 a 1 : 1,25, vztaženo na výchozí koncentraci 1 : 4.

-2CZ 285731 B6

Vodná suspenze frakcí buněčných stěn mykobakterií, pro člověka nepatogenních, získatelná způsobem, při němž se mykobakterie pěstují 4 týdny při teplotě 35 °C v peptonovém agaru, pak se od živného prostředí odfiltrují, znovu se uvedou do suspenze ve fyziologickém roztoku chloridu sodného, odstředí 20 minut při 12 000 otáčkách za minutu, usazenina se smísí s fyziologickým roztokem chloridu sodného a mele v buněčném mlýnu při teplotě 4 °C, načež se znovu odstředí 20 minut při 18 000 otáčkách za minutu, supematant se oddělí a usazenina, tvořená materiálem buněčných stěn se znovu uvede do suspenze v isotonickém roztoku chloridu sodného za získání vodné suspenze buněčných stěn mykobakterií, která při testu na cytokin vyvolá při změně koncentrace z 1 : 4 na 1 : 16 zvýšení obsahu cytokinů IL-1 a IL-6 v poměru 1 : 6 a 1 : 1,25, vztaženo na výchozí koncentraci 1 : 4.

Z mykobakterií, pro člověka zpravidla nepatogenních, je možno mimo jiné použít například M. tuberculosis, var. bovis, M. avium, M. kansasii, M. marinum, M. scrofulaceum, M. intercellulare, M. xenopi, M. fortuitum a M. chelonae ssp. chelonae. Tyto kmeny jsou známé a je možno je získat například z veřejné sbírky kultur Centre for Public Health Laboratory, National Collection of Type Cultures, Londýn. Tato instituce podává rovněž informace o podmínkách pro pěstování jednotlivých čeledí.

Při prvních klinických zkouškách bylo prokázáno, že Extrakty nebo suspenze podle vynálezu jsou účinnými modulátoiy imunitního systému a je proto možno je použít například při podpůrné terapii infekčních onemocnění, při nádorových onemocněních, v případě astma bronchiale, u alergií neznámého původu a také při rheumatoidních zánětech kloubů.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklad 1

Příprava extraktu a frakcí buněčných stěn

Při přípravě vodného extraktu nebo frakcí buněčných stěn se postupuje tak, že se 250 ml prostředí s obsahem 5 g/1 chloridu sodného, 14 g/1 peptonu, 7 g/1 Na₂HPO4.2H₂O, 2 g/1 KH₂PC>4, 3 % glycerolu (85%) naočkuje kulturou mykobakterií a kultura se pěstuje 4 týdny při teplotě 35 °C. Filtrací se získá 4,5 g vlhké hmotnosti bakterií (skleněná sterilní frita) a pak se bakterie homogenizují. Při přidání 100 ml sterilního isotonického roztoku chloridu sodného je obsah bakterií v roztoku 9,7 x 10⁶ KBE/ml.

Resuspendované bakteriální buňky se odstředí 20 minut při 12 000 RPM. Usazenina se zasucha smísí se skleněnými perlami, znovu se smísí s roztokem chloridu sodného a pak se rozruší při teplotě 4 °C po dobu 20 minut ve vibračním mlýnu. Po odfiltrování přes skleněnou fritu a po přidání 3 kapek protipěnivého činidla se materiál znovu odstředí 20 minut při 18 000 RPM. Takto připravený supematant slouží k přípravě extraktů z mykobakterií, usazenina slouží k výrobě frakcí buněčných stěn.

Při dalším zpracování na extrakt se 43 ml supematantu sterilizuje v autoklávu při teplotě 121 °C celkem 20 minut a pak se materiál uloží při teplotě 4 °C. Pak se materiál zfiltruje přes filtr EKS a pak ještě sterilizuje filtrací přes filtr s průměrem otvorů 0,54 mikrometrů. Nakonec se extrakt udržuje ještě 2 hodiny na vodní lázni s teplotou 80 °C.

K. získání frakce buněčných stěn se usazenina resuspenduje ve 27 ml isotonického roztoku chloridu sodného.

-3CZ 285731 B6

Příklad 2

Kvantitativní stanovení indukce tvorby cytokinů

Při těchto pokusech byly využity známé poznatky. Čísla, uvedená v závorkách, znamenají odkaz na číslo publikace v přiloženém seznamu publikací.

Buněčný extrakt a frakce buněčných stěn vyvolávají v závislosti na dávce významnou indukci tvorby cytokinů, interleukinu-1 (IL— 1) a interleukinu-6 (IL-6). Cytokiny jsou významné obranné látky, zprostředkující v imunitním systému projevy buněčné imunitní reakce.

IL—1 a IL-6 jsou pleiotropní cytokiny, které jsou produkovány různými buňkami a hrají ústřední úlohu při imunitních reakcích a také při krvetvorbě. Způsobující diferenciaci a proliferaci T-buněk a B-buněk (imunomodulační účinek), v játrech regulují bílkoviny akutní fáze v rámci zánětlivých pochodů (proti zánětlivý účinek) a stimulují vznik buněk, vytvářejících kolonie megakaryocytů i tvorbu samotných megakaryocytů (řízení krvetvorby). Mimoto indukuje IL—1 ještě tvorbu dalších lymfokinů, jako IL-4, IL-5 a IL-6.

Izolace mononukleámích buněk:

Heparinisovaná krev zdravých dárců se odstředí při použití gradientu Ficoll, usazenina se několikrát promyje a pak inkubuje v prostředí RPMI 1640 (1), prostém séra, s L-glutaminem a antibiotiky. K produkci cytokinů (2) se materiál inkubuje 24 hodin s buněčným materiálem. Supematanty se oddělí, přidá se ochranná bílkovina, materiál se uloží při teplotě -20 °C a pak se stanoví množství vytvořeného cytokinů.

Izolace endotheliálních buněk cév a buněk hladkých svalů

K izolaci endotheliálních buněk (EC) a buněk hladkých svalů (SMC) se užije úsek véna saphena, který nebylo možno použít pro tvorbu by-passu. Buňky endothelu se oddělí působením kolagenázy (3) a svalové buňky se izolují způsobem, popsaným v literatuře (4). Buněčný materiál se inkubuje v prostředí Ml99, ECGF s heparinem nebo DMEM s 10 % FCS, L-glutaminem a antibiotiky (5, 6, 7). K produkci cytokinů se materiál inkubuje 24 hodin s buněčným materiálem. Po inkubaci se získaný supematant smísí s ochrannou bílkovinou, uloží při teplotě -20 °C a pak se analyzuje na přítomnost cytokinů.

Stanovení IL-6 s použitím buněčné linie 7TD1

Svrchu získané supematanty po pěstování mononukleámích a cévních buněk byly naředěny v 8 až 12 stupních do vyhloubení ploten s 96 vyhloubeními. K této zřeďovací řadě bylo přidáno vždy 2000 buněk/vyhloubení myší buněčné linie 7TD1, závislé na IL-6 (8) tak, jak je popsáno pro buňky B9. Kultury byly inkubovány 72 hodin a pak ještě 6 hodin spolu s radioaktivním thyminem a proliferace buněk byla měřena v závislosti na množství radioaktivně značené látky, zabudované do buněk. Radioaktivita vzorků byla srovnávána s radioaktivitou standardních vzorků pomocí analýzy probitů (9).

Stanovení interleukinu IL—1 s použitím fibroblastů

Fibroblasty byly kultivovány na plotnách s 96 vyhloubeními. Po 24 hodinách bylo živné prostředí vyměněno za čerstvé živné prostředí a ke kulturám fibroblastů byly přidány vzorky ve formě zřeďovací řady. Po 72 hodinách byl ke kulturám přidán radioaktivní thymin a po dalších

-4CZ 285731 B6 hodinách bylo provedeno vyhodnocení pokusu tak, jak bylo popsáno svrchu pro buněčnou linii 7TD1.

Výsledky:

Extrakt indukoval v závislosti na použité dávce následující množství IL-1 (pg/ml):

koncentrace 1 : 4 206 pg/ml : 64 947 pg/ml : 16 : 1024

1250 pg/ml,

625 pg/ml

Extrakt indukoval v závislosti na použité dávce následující množství IL-6 (pg/ml):

koncentrace 1:4 95 082 pg/ml : 64 76 326 pg/ml : 16 : 1024

118 447 pg/ml

961 pg/ml

Frakce buněčných stěn indukovala (pg/ml):

v závislosti na použité dávce následující množství IL-1 koncentrace 1 : 4

1:64

103 pg/ml

1539 pg/ml : 16 : 1024

1649 pg/ml pg/ml

Frakce buněčných stěn indukovala (pg/ml):

v závislosti na použité dávce následující množství IL-6 koncentrace 1:4 2013 pg/ml : 64 35 374 pg/ml : 16 : 1024

711 pg/ml

331 pg/ml

-5CZ 285731 B6

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Vodný extrakt buněk mykobakterií, pro člověka nepatogenních, získátelný způsobem, při němž se mykobakterie pěstují 4 týdny při teplotě 35 °C v peptonovém agaru, pak se od živného prostředí odfiltrují, znovu se uvedou do suspenze ve fyziologickém roztoku chloridu sodného, odstředí 20 minut při 12 000 otáčkách za minutu, usazenina se smísí s fyziologickým roztokem chloridu sodného a mele v buněčném mlýnu při teplotě 4 °C, načež se znovu odstředí 20 minut při 18 000 otáčkách za minutu, supematant se oddělí, autoklavuje a sterilizuje filtrací a pak se udržuje 2 hodiny na teplotě 80 °C za získání extraktu, který při testu na cytokin vyvolá při změně koncentrace z 1 : 4 na 1 : 16 zvýšení obsahu cytokinů IL-1 a IL-6 v poměru 1 : 6 a 1 : 1,25, vztaženo na výchozí koncentraci 1 : 4.

2. Vodná suspenze frakcí buněčných stěn mykobakterií, pro člověka nepatogenních, získatelná způsobem, při němž se mykobakterie pěstují 4 týdny při teplotě 35 °C v peptonovém agaru, pak se od živného prostředí odfiltrují, znovu se uvedou do suspenze ve fyziologickém roztoku chloridu sodného, odstředí 20 minut při 12 000 otáčkách za minutu, usazenina se smísí a fyziologickým roztokem chloridu sodného a mele v buněčném mlýnu při teplotě 4 °C, načež se znovu odstředí 20 minut při 18 000 otáčkách za minutu, supematant se oddělí a usazenina, tvořená materiálem buněčných stěn se znovu uvede do suspenze v isotonickém roztoku chloridu sodného za získání vodné suspenze buněčných stěn mykobakterií, která při testu na cytokin vyvolá při změně koncentrace z 1 : 4 na 1 : 16 zvýšení obsahu cytoxinů IL—1 a IL-6 v poměru 1 : 6 a 1 : 1,25, vztaženo na výchozí koncentraci 1 : 4.