DE4419638C2 - Pipettiereinrichtung für sehr kleine Volumina - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Pipettiereinrichtung für sehr kleine Volumina.

Pipettiereinrichtungen für sehr kleine Volumina weisen als entscheidendes Bauteil eine Pipette auf mit einem robust handhabbaren Rohr von größerem Durchmesser im Milli­ meterbereich und geeigneter Länge von beispielsweise mehreren Zentimetern. An dem Rohr kann die Pipette gehaltert werden, bei­ spielsweise mit einem Mikromanipulator. Die in üblicher Glaszieh­ technik sehr dünn ausgezogene Spitze, die aus Stabilitätsgründen kurz ist, beispielsweise im Millimeterbereich, kann einen Innen­ durchmesser von wenigen µm aufweisen. Durch vorsichtiges An­ saugen und Ausschieben von Flüssigkeit durch die Spitze können extrem kleine Volumina bis herunter in den Femtoliterbereich auf­ genommen und abgegeben werden. Solche Pipetten bestehen üblicher­ weise aus Glas, sind aber auch aus anderen Materialien, wie beispielsweise Kunststoff herstellbar.

Ein wichtiger Anwendungsbereich derartiger Pipettiereinrichtungen liegt in der Medizin und Biologie bei der Manipulation von und an Zellen. Bei einem Innendurchmesser der Spitze von etwa 10 bis 100 µm können Zellen eingesaugt und abgegeben werden. Beispiels­ weise können bei der in vitro Befruchtung Samenzellen in die Pi­ pettiereinrichtung aufgenommen und nach Durchstechen der Eihülle in die Eizelle injiziert werden. Es können mit sehr dünnen Spitzen aus Zellen Proben entnommen und in andere Zellen übertragen werden. Auch das Pipettieren größerer Zellkompartimente ist bei geeignetem Innendurchmesser der Spitze möglich. Für andere An­ wendungsbereiche sind noch größere Innendurchmesser der Spitze möglich bis herauf zu etwa ein zehntel Millimeter, um größere Volumina zu pipettieren.

Eine mit Flüssigkeit gefüllte Pipettiereinrichtung ist aus der DE 42 14 430 A1 bekannt. Die dort beschriebene Konstruktion hat den Vorteil, daß vor Beginn des Pipettiervorganges die Pipette sehr einfach ge­ füllt werden kann. Dazu wird ein Ventil geöffnet, so daß von einem Anschluß her durch die Pipette hindurch Flüssigkeit gedrückt oder gesaugt werden kann, bis das System blasenfrei gefüllt ist. Nach Verschließen des Ventiles kann eine Verdrängungseinrichtung zum Pipettieren eingesetzt werden.

Nachteilig bei dieser Konstruktion ist aber die Verwendung von Schläuchen zwischen dem Rohr, der Verdrängungseinrichtung und dem Ventil. Es ergeben sich sehr große Volumina mit elastischen Oberflächen, so daß die Verdrängungseinrichtung nur sehr unprä­ zise arbeiten kann. Für die geschilderten Anwendungszwecke hin­ unter bis zum Femtoliterbereich zur Zellmanipulation ist diese Kon­ struktion daher nicht einsetzbar.

Aus der GB 2 211 11 A ist eine Pipettierungseinrichtung bekannt, die nur im Spitzenbereich flüssigkeitsgefüllt ist, während der Arbeitsraum im wesentlichen gasgefüllt ist. Durch Erhitzen und Abkühlen des Gasraumes wird das Gasvolumen verändert, so daß die Flüssigkeit in der Spitze gezielt verschoben wird. Die Reproduzierbarkeit der Volumenverschiebung in der sehr engen Spitze ist hierbei aber sehr schlecht. Es ist zu beachten, daß zwischen dem sehr großen Durchmesser des Rohres und dem sehr kleinen Durchmesser der Spitze eine erhebliche Querschnittsübersetzung über mehrere Größen­ anordnungen erfolgt. Eine sehr kleine Volumenänderung im Arbeits­ raum ergibt also eine sehr große Verschiebung in der Spitze. Sehr geringe Temperaturschwankungen durch Umgebungseinflüsse führen bereits dazu, daß eine in der Spitze aufgenommene Zelle um Millimeter verschoben und beispielsweise unbeabsichtigt ausgestoßen wird. Da die Gasfüllung des Rohres außerdem volumenela­ stisch ist, können Schwingungen auftreten, die schwer beherrschbar sind.

Eine von M. Zakolar, Microscopia Acta Vol. 84, No. 3 (1981) S. 231-237, beschriebene Pipettiereinrichtung für sehr kleine Volumina verwendet eine Pipette, bei der das der Spitze ab­ gelegene Ende dauerhaft verschlossen ist. Die gesamte Kanüle ist mit Flüssigkeit gefüllt, deren Volumen durch thermische Beeinflus­ sung verändert wird. Da Flüssigkeit inelastisch ist, ergibt sich eine wesentlich gesteigerte Reproduzierbarkeit der Flüssigkeitsverschie­ bung in der Spitze. Nachteilig bei dieser Konstruktion ist aber die äußerst aufwendige Herstellung, da das Rohr durch die sehr enge Spitze hindurch evakuiert und anschließend mit Flüssigkeit gefüllt werden muß. Eventuell noch verbleibende Blasen, die äußerst stö­ rend wirken, müssen durch Zentrifugieren entfernt werden. Für Routineanwendungen ist diese Konstruktion daher nicht geeignet.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Pipettier­ einrichtung zu schaffen, die bei gut reproduzierbarer Beherrschung von Volumina bis hinunter in den Femtoliterbereich einfach und kostengünstig herstellbar ist.

Diese Aufgabe wird durch eine Pipettiereinrichtung mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst.

Bei dieser Pipettiereinrichtung ist das Ventil unmittelbar in dem Rohr der Pipette angeordnet. Wird es geschlossen, so dient ein sehr kleiner Raum in der Pipette zur Verdrängung, dessen um­ gebende Wände starr sind. Die Verdrängungseinrichtung kann hier also sehr präzise kleinste Volumina bearbeiten. Dabei bleibt der Vorteil der einfachen Befüllung bei geöffnetem Ventil erhalten. In äußerst einfacher und kostengünstiger Konstruktion dient dabei der von der Stange beaufschlage Dichtkörper gleichzeitig als Ventil­ körper und in Schließstellung des Ventils als Verdrängungsein­ richtung, wobei er bei Betätigung der Stange volumenelastisch ver­ formt wird und das vor ihm liegende Flüssigkeitsvolumen verän­ dert. Das Rohr kann in seiner Länge ausreichend bleiben, um gute Angriffsmöglichkeiten z. B. für die Klemmvorrichtung eines Mi­ kromanipulators zu bieten.

Vorteilhafterweise kann die Verdrängungseinrichtung auf einfache Weise, z. B. als Gummi­ pfropfen am Ende oder innerhalb eines Rohres angeordnet sein und leicht von diesem abgenommen werden. Dadurch ist es möglich, einfache vorgefertigte Rohre ohne Verschließeinrichtung zu verwenden, wie sie in Labors in üblicher Technik für die fraglichen Zwecke ange­ fertigt werden. Der Benutzer ist also nicht auf vorgefertigte Größen angewiesen, sondern kann sich für seinen Bedarf Pipetten mit ge­ eigneten Spitzendurchmessern selbst anfertigen.

In einer vorteilhaften Ausbildungsform ist der am Ende einer Stange angeordnete Dichtkörper strömungsgünstig geformt, beispiels­ weise mit kugelähnlichen Oberflächen, so daß beim Füllen während der Flüssigkeitsfüllung keine Luftblasen hängen­ bleiben können. Dadurch wird auf einfache Weise eine blasen­ freie Füllung erreicht. Die strömungsgünstige Ausbildung wird nicht zur Erhöhung der Fließgeschwindigkeiten od. dgl. verwendet, sondern soll eine glatte und verrundete Oberflächengestaltung be­ zeichnen, also ohne scharfe Kanten, Vertiefungen u. dgl., an denen Blasen hängenbleiben könnten.

Bei Anschluß einer Pumpeinrichtung an die Pipette kann die Flüssigkeitsfüllung auf einfache Weise erfolgen.

In den Zeichnungen ist eine Ausführungsform der Pipettiereinrichtung schematisch dargestellt. Es zeigen:

Fig. 1a, 1b einen Achsschnitt durch die Pipette der Pipet­ tiereinrichtung in zwei Betriebsstellungen und

Fig. 2 einen Schnitt durch die Pipettiereinrichtung in Ge­ samtdarstellung.

Die Fig. 1a und 1b zeigen eine sehr einfach konstruierte Ausfüh­ rungsform der Pipettiereinrichtung mit einer Pipette 1, die in üblicher Technik aus Glas besteht. Diese ist aus einem Rohr 2 gebildet, das in handhabbaren Abmessungen ausgebil­ det ist, also beispielsweise mit einem Innendurchmesser von 1 mm, und einer Länge von mehreren Zentimetern. Eine Spitze 3 ist in üblicher Glasziehtechnik aus dem Rohr angezogen und weist - aus zeichnerischen Gründen ist die Darstellung nicht maßstabgetreu - eine Länge von wenigen mm aus und einen Innendurchmesser von beispielsweise einigen µm.

Eine Stange 41 führt zu einem nicht dargestellten Betätigungsmecha­ nismus, mit dem ein Verschließkörper 42 in die in Fig. 1b dar­ gestellte Verschlußanlage gebracht oder aus dieser abgehoben werden kann. Dadurch dient der Verschließkörper 42 als Ventilkörper, der einen Arbeitsraum 44 öffnen und schließen kann.

Das freie Ende des Rohres 2 ist abgedichtet von einem nicht darge­ stellten Pumpstutzen umgeben, der auf dem Ende des Rohres 2 dichtend aufsitzt, mit einer Gleitführung die Stange 41 passieren läßt und einen Anschluß aufweist, an dem eine nicht dargestellte Pumpe angeschlossen werden kann.

Bei geöffneter Ventilstellung des Verschließkörpers 42 kann durch die Spitze 3 hindurch Flüssigkeit in den Arbeitsraum 44 und durch den Innenraum des Pumpstutzens zur Pumpe gesaugt oder in um­ gekehrter Richtung gedrückt werden, und zwar so lange, bis der Arbeitsraum 44 blasenfrei mit Flüssigkeit gefüllt ist. Die darge­ stellte Konstruktion kann flüssigkeitsfrei angeliefert werden und vor Ort beispielsweise durch Ansaugen des Flüssigkeitsmediums, in dem später gearbeitet wird, gefüllt werden. Dadurch wird auch vermieden, bei der Arbeit, beispielsweise mit empfindlichen lebenden Zellen, fremde Füllflüssigkeiten verwenden zu müssen.

Wie Fig. 1a zeigt, ist der Verschließkörper 42 mit seiner zum Ar­ beitsraum 44 hin liegenden Fläche verrundet ausgebildet, also gut umströmbar, so daß Ecken oder Kanten, an denen Blasen hängen­ bleiben können, vermieden werden.

Der Durchmesser des Dichtkörpers 42 ist, wie Fig. 1a zeigt, kleiner als der Innendurchmesser des Rohres 2. In Stellung gemäß Fig. 1a ist also das Ventil geöffnet. Mit einem Pumpstutzen (vgl. Fig. 2) kann gefüllt werden. Wird die Betätigungsstange 41 in die Stellung gemäß Fig. 1b vorgeschoben, so dichtet der Dichtkörper 42 gegen den koni­ schen Übergangsteil 43 des Rohres ab, mit dem das Rohr 2 in die dünne Spitze 3 übergeht. Wird der Dichtkörper 42 in der Lage der Fig. 1b unter Aufrechterhaltung der Dichtkraft gehalten, so kann durch Vergrößern und Verkleinern der über die Stange 41 auf den Dichtkörper 42 ausgeübten Kraft die zur Spitze 3 hin freiliegende Oberfläche des Dichtkörpers 42, wie in Fig. 1b gestrichelt darge­ stellt, bewegt werden. Damit wird auf den davorliegenden Arbeits­ raum 44 flüssigkeitsverschiebend eingewirkt. Die Volumenbeein­ flussung wird also auch hier über die Stange 41 mechanisch be­ wirkt.

Hierbei handelt es sich um eine sehr einfache Konstruktion mit we­ nigen einfachen Bauteilen. Außerdem ist der Arbeitsraum 44 sehr klein. Dadurch wird das Übersetzungsverhältnis zwischen der Be­ wegung der Betätigungsstange 41 und der resultierenden Flüssig­ keitsverschiebung in der sehr engen Spitze 3 relativ klein gehalten, so daß die Anforderungen an die Genauigkeit des die Betätigungs­ stange 41 bewegenden Verstellmechanismus relativ gering gehalten werden können.

Fig. 2 zeigt in Gesamtdarstellung eine Pipettiereinrichtung der Aus­ führungsform der Fig. 1a und 1b. Es ist die Pipette 1 dargestellt mit der Betätigungsanlage 41 und dem Dichtkörper 42. Das Rohr 2 der Pipette 1 ist in einem Rohrstück 51 mit einem Dichtring 52 abge­ dichtet und kann mit einer Klemmschraube 53 arretiert werden. Die Betätigungsstange 41 verläuft durch das Rohrstück 51 zu einer Membran 54 und ist an dieser befestigt.

Die Membran 54 ist zwischen zwei Gehäuseteilen 55 und 56 am Ende des Rohrstutzens 51 mit Klemmen 57 eingespannt. Das rück­ wärtige Gehäuseteil 56 ist über einen Schlauch 58 an eine nicht dargestellte Druckerzeugungseinrichtung angeschlossen, die durch gesteuerte Druckbeeinflussung der Membran 54 die Betätigungs­ stange 41 in gewünschter Weise längsverstellt.

Der vor der Membran 54 liegende Gehäuseteil 55 mit dem Rohr­ stück 51 ist mit einem Anschluß 8 über einen Schlauch 59 an eine nicht dargestellte Pumpeinrichtung angeschlossen, mit der durch das Innere des Rohres 2 hindurch bei geöffnetem Ventil, also bei zurückgezogenem Dichtkörper 42, der Arbeitsraum 44 mit Flüssig­ keit gefüllt werden kann. Nach Lösen der Klemmschraube 53 kann die Pipette 1 herausgezogen und gegen eine andere geeignete Pi­ pette, beispielsweise mit anderem Innendurchmesser der Spitze 3 ausgewechselt werden.

Eine Pipette 1 wird in die in Fig. 2 dargestellte Lage gebracht. Nun wird bei geöffnetem Ventil 42, 43 (siehe Fig. 1a) der Arbeitsraum 44 mit Flüssigkeit gefüllt, beispielsweise durch Ansaugen durch die Spitze 3. Anschließend wird die Pipette 1 weiter in Richtung auf die Membran 54 vorgeschoben bis in die in Fig. 1b dargestellte Ver­ schließstellung des Ventiles. Es wird nun die Arretierschraube 53 angezogen und durch Druckbeaufschlagung der Membran 54 pipettiert.

Bei der dargestellten Ausführungsform sind Abwandlungen möglich, z. B. hinsichtlich der erforderlichen Steuerungsübertragung.

In der dargestellten Ausführungsform wird das Verschließen des Rohrs und die mechanische Volumenverstellung durch Längs­ verstellung der starren Stange 41 bewirkt.

Ist die Betätigungsstange 41 als Rohr ausgebildet, so kann durch deren Inneres die Rückseite des Dichtkörpers 42 druckbeaufschlagt werden, umn die in Fig. 1b gestrichelt angedeuteten Verformungen zu erzeugen.

Dabei kann, wenn man Fig. 2 betrachtet, die als Rohr ausgebildete Stange 41 an ein Loch in der Membran 54 angeschlossen sein. Die Membran 54 wäre in diesem Fall als starre Wand auszubilden. Druckverstellungen innerhalb des Gehäuses 56 wirken dann auf die Rückseite des Dichtkörpers 42 und verformen diesen.

Claims (4)

1. Pipettiereinrichtung für sehr kleine Volumina, mit einer Pi­ pette (1), die ein Rohr (2) größeren Innendurchmessers auf­ weist, das mit einem konischen Übergangsteil (43) in eine als ausgezogenes Ende des Rohres (2) ausgebildete Spitze (3) kleineren Innendurchmessers übergeht, sowie mit einem einen Arbeitsraum (44) im Rohr (2) gegenüber einem zur Flüssigkeitszu- oder -abfuhr im Arbeitsraum (44) dienenden Anschluß (8) verschließenden und einer das Volumen der im Arbeitsraum (44) zwischen dem Ventil (41, 42, 43) und der Spitze (3) des Rohres (2) befindlichen Flüssigkeit beeinflussenden Verdrängungseinrichtung (41, 42), wobei das Ventil (41, 42, 43) eine im Rohr (2) angeordnete Stange (41) mit an deren Enden befestigtem elastischem Dichtkörper (42) aufweist, der einen kleineren Außendurchmesser aufweist als der Innendurchmesser des Rohres (2) und durch axiale Ver­ schiebung der Stange (41) gegen den konischen Übergangs­ teil (43) des Rohres (2) in Ventileingriff bringbar ist, und wobei der Dichtkörper (42) elastisch verformbar ausgebildet ist und in Verschließstellung des Ventils (41, 42, 43) mit der Stange (41) eine Verdrängungseinrichtung (41, 42) zur Volumenbeeinflussung der Flüssigkeit im Arbeitsraum (44) bildet.

2. Pipettiereinrichtung nach Anspruch 1, wobei die Verdrängungseinrichtung (41, 42) vom Rohr (2) abnehmbar ausgebildet ist.

3. Pipettiereinrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Dichtungskörper (42) zur Spitze (3) hin strömungsgünstig geformt ist.

4. Pipettiereinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei an den Anschluß (8) eine Pumpeinrichtung abgedichtet angeschlossen ist.