DE4417879A1

DE4417879A1 - DNA-Sequenzen die die Synthese linearer alpha-1,4-Glukane in Pflanzen, Pilzen und Mikroorganismen ermöglichen

Info

Publication number: DE4417879A1
Application number: DE19944417879
Authority: DE
Inventors: Jens Dr Kosmann; Volker Dr Buettcher; Thomas Welsh
Original assignee: Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin GmbH
Current assignee: Bayer Bioscience GmbH
Priority date: 1994-05-18
Filing date: 1994-05-18
Publication date: 1995-11-23
Also published as: RU2272842C2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft gentechnologische Verfahren zur Herstellung von Pflanzen und Mikroorganismen, die in der Lage sind, intra- oder extrazellulär ein Protein zu exprimieren, das eine Amylosucrase-Aktivität aufweist und die Synthese linearer α-1,4-Glukane aus Saccharose katalysiert. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung neue DNA-Sequenzen und Plasmide, enthaltend diese DNA-Sequenzen, die nach Einführung in das Genom einer Pflanze oder nach Transformation in Mikroorganismen, insbesondere Bakterien oder Pilze, zur Expression eines Enzyms führen, das die Synthese von linearen α-1,4-Glukanen aus Saccharose katalysiert, sowie die transgenen Organismen (i.e. Pflanzen, Pilze und Mikroorganismen), die die obengenannten DNA-Sequenzen enthalten.

Beschreibung

Lineare α-1,4-Glukane sind Polysaccharide, die aus Glukosemonomeren aufgebaut sind. Dabei sind die Glukosemonomere ausschließlich über α-1,4-glykosidische Bindungen miteinander verbunden. Das am häufigsten in der Natur vorkommende α-1,4- Glukan ist die Amylose, ein Bestandteil der pflanzlichen Stärke. Der Verwendung linearer α-1,4-Glukane im industriellen Bereich kommt in letzter Zeit immer größere Bedeutung zu. Amylose kann aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften für die Herstellung selbsttragender Filme verwendet werden. Diese Filme sind farblos, geruch- und geschmacklos, nicht toxisch und biologisch abbaubar. Sie finden bereits heute eine ganze Reihe von Anwendungsmöglichkeiten, so z. B. in der Lebensmittelindustrie, der Textilindustrie, der Glasfaserindustrie und bei der Papierherstellung.

Weiterhin ist es gelungen, aus Amylose Fasern herzustellen, die in ihrem Verhalten der natürlichen Zellulosefaser ähnlich sind, und einen Teil- bzw. Vollaustausch für diese in der Papierherstellung ermöglichen.

Amylose als wichtigster Vertreter der linearen α-1,4-Glukane findet darüberhinaus Anwendung insbesondere als Bindemittel zur Tablettenherstellung, als Eindicker von Pudding und Cremes, als Gelatineersatz, als Binder bei der Herstellung schalldämmender Wandplatten und zur Verbesserung der Fließeigenschaften von paraffinhaltigen Ölen.

Eine weitere Eigenschaft der linearen α-1,4-Glukane, die in jüngster Zeit immer mehr Interesse findet, ist die Fähigkeit dieser Moleküle, aufgrund ihrer helikalen Struktur Einschlußverbindungen mit organischen Komplexanden einzugehen. Dieses ermöglicht eine Anwendung auf den verschiedensten Gebieten. Diskutiert wird die Verwendung zur molekularen Verkapselung von Vitaminen, Arzneistoffen und Aromastoffen, sowie die Verwendung zur chromatographischen Auftrennung von Substanzgemischen an immobilisierten linearen α-1,4-Glukanen.

Amylose dient ferner als Ausgangsstoff für die Herstellung von sogenannten Cyclodextrinen (auch Cycloamylosen, Cyclomaltosen), die ihrerseits breite Anwendung insbesondere in der Pharmaindustrie, Lebensmitteltechnologie, Kosmetik und analytischen Trenntechnik finden. Bei diesen handelt es sich um cyclische Maltooligosaccharide aus 6-8 Monosaccharideinheiten, die gut wasserlöslich sind, aber einen hydrophoben Hohlraum besitzen, der für die Bildung von Einschlußkomplexen genutzt werden kann.

Die Gewinnung linearer α-1,4-Glukane erfolgt heutzutage in Form von Amylose aus Stärke. Stärke selber ist aber aus zwei Komponenten aufgebaut. Eine Komponente bildet die Amylose als unverzweigte Kette aus α-1,4-verknüpften Glukoseeinheiten. Die andere Komponente bildet das Amylopektin, ein hochverzweigtes Polymer aus Glukoseeinheiten, bei dem neben den α-1,4- Verbindungen noch Verzweigungen der Glukoseketten über α-1,6- Verbindungen auftreten. Aufgrund der unterschiedlichen Struktur dieser beiden Komponenten und den daraus resultierenden physikalisch-chemischen Eigenschaften finden die beiden Komponenten auch weitgehend unterschiedliche Verwendungsmöglichkeiten. Um sich die Eigenschaften der einzelnen Komponenten direkt zu Nutze machen zu können, ist es erforderlich, diese in reiner Form zu gewinnen. Beide Komponenten können aus Stärke gewonnen werden, was jedoch eine Reihe von Reinigungsschritten erfordert und zeit- und kostenintensiv ist.

Es besteht daher ein dringender Bedarf, Möglichkeiten zu finden, die beiden Komponenten der Stärke bereits in einheitlicher Form gewinnen zu können. Um dieses zu erreichen, ging man bisher den Weg, stärkeproduzierende Pflanzen durch Züchtung oder gentechnische Manipulation dahingehend zu verändern, daß sie Stärke mit verändertem Amylose/Amylopektin- Verhältnis produzieren. Während der normale Amylopektinanteil bei Maisstärke z. B. bei ca. 70% liegt, gelang es, durch Züchtung eine Maissorte (waxy maize) zu etablieren, deren Stärke zu nahezu 100% aus Amylopektin besteht (Akatsuka and Nelson, 1966, J. Biol. Chem. 241: 2280-2285).

Des weiteren wurden verschiedene Maislinien mit einem erhöhten Amylosegehalt (60-70%) mittels züchterischer Maßnahmen erstellt, z. B. die Sorten amylose extender und dull (Wolf et al., 1955, J. Am. Chem. Soc. 77: 1654-1659; Boyer et al., 1976, Die Stärke: 28: 405-410). Auch in anderen Pflanzenspezies wurden Linien erstellt, die einheitliche Stärken in Form von Amylopektin synthetisieren, z. B. bei Reis (Sano, 1984, Theor. Appl. Genet. 68: 467-473) und Gerste (Shannon and Garwood, 1984, in: Whistler, Bemiller, Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academic Press, Orlando, 2nd Edition: 25-86) oder die hochgradig amylosehaltige Stärke synthetisieren (z. B. bei der Erbse).

Neben diesen auf klassisch-züchterischen Verfahren beruhenden Ansätzen besteht eine weitere Möglichkeit für die Herstellung von Pflanzen, die eine hochgradig amylosehaltige Stärke produzieren, in dem Transfer und der kontrollierten Expression von Genen homologen oder heterologen Ursprungs, die an der Stärkebiosynthese, dem Stärkeabbau oder der Stärkemodifikation beteiligt sind, in Pflanzen. Von Interesse ist dabei sowohl die Inhibition der Expression endogener Enzyme durch antisense- Konstrukte, als auch die Expression von Enzymen, deren Aktivität in Pflanzen nicht nachweisbar ist und die nicht den Regelmechanismen unterliegen, die auf die endogen in der Pflanze vorkommenden, an der Stärkebiosynthese, dem Stärkeabbau oder der Stärkemodifikation beteiligten Enzymen ausgeübten werden.

So ist aus Visser et al. (1991, Mol. Gen. Genet. 225: 289-296) bekannt, daß durch antisense-Inhibition des Gens für die Stärkekorn-gebundene Stärkesynthase in Kartoffel Sorten erzeugt werden können, die weitgehend reine Amylopektinstärke bilden.

Aus der WO 92/14827 ist ein Verzweigungsenzym der Kartoffel bekannt, das als Q-Enzym bezeichnet wird. Dieses führt die α-1,6- Verbindungen ein und ist somit für die Bildung der Amylopektinstärke verantwortlich. Mit Hilfe der DNA-Sequenzen, die die Information für dieses Enzym aus Solanum tuberosum enthalten, können durch antisense-Konstrukte transgene Kartoffelpflanzen hergestellt werden, bei denen die Expression dieses Enzyms stark inhibiert ist. Dies bewirkt, daß in diesen Pflanzen das Amylose/Amylopektin-Verhältnis der Stärke zugunsten eines erhöhten Amyloseanteils verändert ist. Eine hochgradig amylosehaltige Stärke wird von den in der WO 92/14827 beschriebenen Pflanzen jedoch nicht gebildet.

Trotz zahlreicher Bemühungen und verschiedenartiger Ansätze ist die Herstellung von Pflanzen, die eine reine Amylosestärke produzieren, bisher noch nicht gelungen.

Auch ist bisher keine Möglichkeit beschrieben worden, Mikroorganismen zur Synthese von hochgradig reiner Amylose bzw. reiner linearer α-1,4-Glukane zu verwenden.

Aus dem Mikroorganismus Neisseria polysaccharea ist ein Enzym bekannt, die Amylosucrase (auch Sucrose:1,4-α-D-Glucan 4-α- Glucosyltransferase, E.C. 2.4.1.4.), für das der folgende Reaktionsmechanismus vorgeschlagen wird:

Saccharose + (α-1,4-D-Glykosyl) n →
D-Fruktose + (α-1,4-D-Glykosyl) n + 1

Es handelt sich dabei um eine Transglykosylierung. Die Produkte dieser Reaktion sind unlösliche lineare α-1,4-Glukane und Fruktose. Cofaktoren werden nicht benötigt. Amylosucraseaktivität wurde bisher nur in wenigen Bakterienarten gefunden, darunter hauptsächlich Neisseria Spezies (MacKenzie et al., 1978, Can. J. Microbiol. 24: 357-362) und das Enzym ist bisher lediglich in seiner enzymatischen Aktivität untersucht worden. Das partiell aufgereinigte Enzym aus Neisseria perflava führt nach Zugabe von Saccharose zur Synthese glykogenartiger Polysaccharide, die zu einem geringen Ausmaß Verzweigungen aufweisen (Okada et al., 1974, J. Biol. Chem., 249: 126-135). Ebenso zeigen auch die intra- bzw. extrazellulär synthetisierten Glukane von Neisseria perflava bzw. Neisseria polysaccharea einen gewissen Verzweigungsgrad (Riou et al., 1986, Can. J. Microbiol. 32: 909-911). Ob diese Verzweigungen durch die Amylosucrase eingeführt werden oder durch ein anderes Enzym, das in aufgereinigten Amylosucrase- Präparationen als Kontamination auftritt, konnte bisher nicht geklärt werden. Da der Nachweis eines Enzyms, das Verzweigungen einführt, bisher nicht gelungen ist, wurde vermutet, daß sowohl die Polymerisierungs- als auch die Verzweigungsreaktionen von Amylosucrase katalysiert werden (Okada et al., 1974, J. Biol. Chem., 249: 126-135).

Das Enzym, das in Neisseria konstitutiv exprimiert wird, ist extrem stabil, bindet sehr fest an die Polymerisationsprodukte und wird kompetitiv durch das Produkt Fruktose inhibiert (MacKenzie et al., 1977, Can. J. Microbiol. 23: 1303-1307). Bei der Neisseria Spezies Neisseria polysaccharea wird die Amylosucrase sekretiert (Riou et al., 1986, Can. J. Microbiol. 32: 909-911), wohingegen sie bei den anderen Neisseria Arten in der Zelle verbleibt.

Enzyme mit einer Amylosucrase-Aktivität konnten bisher nur in Mikroorganismen nachgewiesen werden. Aus Pflanzen sind Amylosucrasen nicht bekannt.

Ebenso wurden bisher keine DNA-Sequenzen, die für eine Amylosucrase kodieren, beschrieben.

Die vorliegende Erfindung stellt nun DNA-Sequenzen und Verfahren zur Verfügung, die es ermöglichen, Pflanzen herzustellen, die in der Lage sind, reine Amylosestärke zu produzieren, sowie stärkeproduzierende Pflanzen dahingehend zu verändern, daß sie insgesamt höhere Stärkeerträge mit gleichzeitig erhöhtem Amylose/Amylopektin-Verhältnis liefern. Weiterhin können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen dazu verwendet werden, Mikroorganismen und Pilze, insbesondere Hefen, herzustellen, die in der Lage sind, ein Enzym zu produzieren, das die Synthese linearer α-1,4-Glukane aus Saccharose katalysiert.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher DNA-Sequenzen aus Mikroorganismen, die für eine Amylosucrase-Aktivität kodieren, dadurch gekennzeichnet, daß es nach Einführung dieser DNA-Sequenzen in Zellen zur Expression einer Amylosucrase- Aktivität kommt, die die Synthese linearer α-1,4-Glukane aus Saccharose katalysiert.

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere DNA-Sequenzen aus einem gram-negativen Bakterium der Spezies Neisseria polysaccharea, die folgende Nukleotidabfolge aufweisen (Seq ID No. 1):

Diese DNA-Sequenzen kodieren für ein Enzym mit Amylosucrase- Aktivität und wurden aus dem Mikroorganismus Neisseria polysaccharea isoliert.

Die unter Seq ID No. 1 dargestellten DNA-Sequenzen sind neu. Nach Einführung dieser DNA-Sequenzen in Mikroorganismen, Pilzen oder Pflanzen kommt es zur Expression eines Polypeptids mit Amylosucrase-Aktivität. Absorptionsmessungen der durch diese Enzymaktivität bei Anwesenheit von Saccharose synthetisierten Glukane weisen darauf hin, daß keine Verzweigungen auftreten, sondern Produkte entstehen, die physikalische Eigenschaften vergleichbar der Amylose aufweisen.

Die Erfindung umfaßt darüberhinaus Derivate der unter Seq ID No. 1 dargestellten Sequenz, die durch Austausch einzelner oder mehrerer Basen, Deletion, Insertion oder Rekombination erhalten werden und für ein Polypeptid kodieren, das Amylosucrase- Aktivität besitzt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und von Plasmiden enthaltend diese DNA-Sequenzen zur Transformation pro- und eukaryontischer Zellen, zur Herstellung von Derivaten durch Substitution, Deletion, Insertion oder Rekombination, sowie die Verwendung zur Isolierung ähnlicher Sequenzen aus dem Genom anderer Organismen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist darüberhinaus ein Verfahren zur gentechnischen Transformation von Pflanzenzellen, dadurch gekennzeichnet, daß in die Pflanzenzellen eine heterologe DNA-Sequenz eingeführt und exprimiert wird, die eine für eine Amylosucrase-Aktivität kodierende Region umfaßt.

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Verfahrensschritte umfaßt:

a) Herstellung einer DNA-Sequenz mit folgenden Teilsequenzen:
i) einem Promotor, der in Pflanzen aktiv ist und die Bildung einer RNA in dem vorgesehenen Zielgewebe oder den Zielzellen sicherstellt,
ii) einer heterologen DNA-Sequenz, die für eine Amylosucrase kodiert und in sense-Orientierung an den Promotor fusioniert ist,
iii) einem in Pflanzen funktionalen Signal für die Transkriptionstermination und Polyadenylierung eines RNA- Moleküls,
b) Transfer und Einbau der DNA-Sequenz in das pflanzliche Genom und
c) Regeneration von intakten ganzen Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.

Einen weiteren Gegenstand der Erfindung bilden die aus den genannten erfindungsgemäßen Verfahren resultierenden veränderten Pflanzen.

Als Promotoren kommen sowohl solche in Frage, die eine konstitutive Expression des Gens in allen Geweben der Pflanze gewährleisten, wie zum Beispiel der 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (CaMV), als auch solche, die eine Expression nur in bestimmten Organen oder zu bestimmten Zeitpunkten in der Entwicklung der Pflanze sicherstellen. Bekannt sind Promotoren, die eine spezifische Expression in den Knollen der Kartoffelpflanze gewährleisten, wie z. B. der B33- Promotor (Liu et al., 1990, Mol. Gen. Genet. 223: 401-406) oder solche, mit deren Hilfe eine spezifische Expression in den Rüben der Zuckerrübe erreicht werden kann. Weiterhin sind auch DNA-Sequenzen beschrieben, die eine lichtabhängige und gewebespezifische Expression von nachgeschalteten Genen in den Blättern erlauben (Orozco and Ogren, 1993, Plant Mol. Biol. 23: 1129-1138).

Die im Verfahrensschritt a) ii) aufgeführte DNA-Sequenz weist vorzugsweise die unter Seq ID No. 1 aufgeführte Nukleotidsequenz oder Teile davon auf. Diese ist in sense- Orientierung an den Promotor gekoppelt (3′-Ende des Promotors zum 5′-Ende der kodierenden Sequenz). Diese Sequenz kann aber auch vor oder nach Verknüpfung mit den die Transkription steuernden Elementen (Promotor und Terminationssignal) modifiziert werden, um gegebenenfalls Eigenschaften des Polypeptids oder seine Lokalisation zu variieren, wie unten ausführlicher beschrieben wird. Die unter Seq ID No. 1 dargestellte DNA-Sequenz kodiert für eine extrazelluläre Amylosucrase. Die Sekretion wird gewährleistet durch eine Signalsequenz, die die 16 N-terminalen Aminosäurereste umfaßt, kodiert durch die Nukleotide 939 bis 986 der unter Seq ID No. 1 dargestellten Sequenz. Da derartige prokaryontische Signalsequenzen in der Regel auch in pflanzlichen Zellen zu einer Sekretion des Proteins führen, wird bei der Verwendung der unter Seq ID No. 1 angegebenen DNA-Sequenz das exprimierte Protein in den Apoplasten der Pflanzen transportiert.

Um das Enzym im Cytosol der pflanzlichen Zellen zu exprimieren, muß die Signalsequenz, die die Sekretion bewirkt, entfernt werden. Soll das zu exprimierende Enzym in bestimmte subzelluläre Kompartimente wie Chloroplasten, Amyloplasten, Mitochondrien oder die Vakuole dirigiert werden, dann muß an die Stelle der die Sekretion bewirkenden Signalsequenz eine Signalsequenz oder eine ein Transitpeptid kodierende Sequenz eingesetzt werden, die den Transport des exprimierten Proteins in das jeweilige Kompartiment gewährleistet. Derartige Sequenzen sind bekannt. Für den Transport in die Plastiden kommen z. B. die Transitpeptide der Vorläuferproteine der kleinen Untereinheit der Ribulosebisphosphat-Carboxylase (RUBISCO) aus Kartoffel (Wolter et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 846-850) oder des Acyl Carrier Proteins (ACP) in Betracht. Für den Transport in die Vakuole kann die Signalsequenz des Patatins verwendet werden (Sonnewald et al., 1991, Plant J. 1: 95-106) . Die verwendeten Sequenzen müssen jeweils im selben Leserahmen wie die das Enzym kodierende DNA- Sequenz sein.

Anstatt der unter Seq ID No. 1 angegebenen Sequenz können auch DNA-Sequenzen verwendet werden, die sich aus dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion ableiten lassen, sofern die enzymatische Aktivität dadurch nicht beeinträchtigt wird.

Mit Hilfe der unter Seq ID No. 1 dargestellten DNA-Sequenzen ist es daher möglich, Pflanzen dahingehend zu verändern, daß sie eine Amylosucrase-Aktivität exprimieren. Dies ermöglicht die Synthese linearer α-1,4-Glukane in den Pflanzen. Da lineare α-1,4- Glukane ihrem chemischen Aufbau nach mit der in Pflanzen synthetisierten Amylose identisch sind, ist es somit möglich, Pflanzen herzustellen, die reine Amylose synthetisieren, sowie stärkeproduzierende Pflanzen dahingehend zu verändern, daß sie eine Stärke mit einem erhöhten Amyloseanteil synthetisieren.

Bei den meisten Pflanzen werden die im Verlaufe der Photosynthese gebildeten Photoassimilate innerhalb einer Pflanze in Form von Zuckern und zwar vorwiegend in Form der Saccharose zu den jeweiligen Zielorganen transportiert. Da das Substrat für die Polymerisationsreaktion der Amylosucrase Saccharose ist, können daher mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens im Prinzip alle Pflanzen, sowohl dikotyle als auch monokotyle, im Hinblick auf eine Amylosucrase-Expression verändert werden. Bevorzugt sind Nutzpflanzen wie Mais, Reis, Weizen, Gerste, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Tabak oder Kartoffel, aber auch Obst- und Gemüsearten wie Apfel, Pflaume, Karotte, Tomate oder Maniok.

Die Expression einer Amylosucraseaktivität in Pflanzen kann u. a. dazu verwendet werden, um durch die Synthese von Amylose eine Viskositätsänderung von gegebenenfalls aus den Pflanzen gewonnenen Extrakten zu erreichen.

Eine Expression der Amylosucrase ist insbesondere in solchen Organen der Pflanzen von Vorteil, die große Mengen an Saccharose speichern. Solche Organe sind z. B. die Rübe der Zuckerrübe oder der Stamm des Zuckerrohrs. Da diese Pflanzen normalerweise keine nennenswerten Mengen an Stärke synthetisieren, ließen sich aus diesen Pflanzen die durch die Amylosucrase synthetisierten linearen α-1,4-Glukanen in reiner Form isolieren.

Der Ort der Biosynthese der Saccharose in pflanzlichen Zellen ist das Cytosol. Der Ort der Speicherung hingegen ist die Vakuole. Beim Transport in das Speichergewebe der Zuckerrübe bzw. der Kartoffel oder beim Transport in das Endosperm von Samen muß die Saccharose den Interzellularraum durchqueren. Für die Expression der Amylosucrase zur Synthese von linearen Glukanen kommen also alle drei Kompartimente in Betracht, d. h. Cytosol, Vakuole und Interzellularraum.

Bei stärkeproduzierenden Pflanzen wie der Kartoffel oder Mais, bei denen die Stärkesynthese und Stärkespeicherung normalerweise in den Amyloplasten erfolgt, würde eine Expression der Amylosucrase im Interzellularraum, im Cytosol oder-in der Vakuole zu einer zusätzlichen Synthese von Glukanen in diesen Kompartimenten führen, was insgesamt eine erhebliche Steigerung des Ertrages bedeuten kann.

Da es bei der Kartoffel möglich ist, die in den Amyloplasten synthetisierte Stärke von den im Interzellularraum, im Cytosol oder in der Vakuole mit Hilfe der Amylosucrase synthetisierten linearen α-1,4-Glukanen bei der Stärkegewinnung zu trennen, ließe sich in diesem Fall dieselbe Pflanze zur Gewinnung von Stärke und von linearen α-1,4-Glukanen verwenden.

Weiterhin sind transgene Kartoffelpflanzen sowie Maispflanzen bekannt, bei denen es infolge der Inhibierung der ADP-Glucose- Pyrophosphorylase durch ein antisense-Konstrukt zur völligen Inhibierung der Stärkesynthese in den Knollen bzw. in den Körnern kommt. Statt dessen tritt z. B. bei Kartoffeln eine Akkumulation von löslichen Zuckern, insbesondere Saccharose und Glukose in den Knollen auf (Müller-Röber et al., 1992, EMBO J. 11: 1229-1238; EP 0 455 316). Durch die Expression einer Amylosucrase im Cytosol, der Vakuole oder dem Apoplasten dieser Pflanzen, also in Kompartimenten, in denen keine Verzweigungsenzyme vorhanden sind, kann somit die Synthese hochgradig amylosehaltiger, d. h. Stärke, die überwiegend aus linearen α-1,4-Glukanen besteht, in diesen Pflanzen erreicht werden.

Der Reaktionsmechanismus, den die Amylosucrase katalysiert, zeichnet sich dadurch aus, daß ein Glukoserest direkt von Saccharose auf ein lineares Glukan übertragen wird. Dagegen wird bei der Biosynthese von linearen Glukanen aus Saccharose in Pflanzen die Saccharose erst wieder in Glukose und Fruktose gespalten, die dann jeweils in die aktivierte Zwischenstufe ADP-Glukose umgewandelt werden. Von der ADP-Glukose wird der Glukoserest durch das Enzym Stärkesynthase auf ein bereits vorhandenes Glukan übertragen, wobei ADP freigesetzt wird. Die Umwandlung der Saccharose in zwei Moleküle ADP-Glukose erfordert dabei mehrere energieverbrauchende Reaktionen.

Daher ist die Energiebilanz der durch die Amylosucrase katalysierten Reaktion im Vergleich zu der Energiebilanz der Synthese von Amylose aus Saccharose in pflanzlichen Zellen wesentlich günstiger, was zu einer erhöhten Ausbeute an synthetisierten Glukanen in Pflanzen, die eine Amylosucraseaktivität exprimieren, führt.

Die mit Hilfe der Amylosucrase in den Pflanzen gebildeten linearen α-1,4-Glukane können in gleicher Weise wie die normalerweise gebildete Stärke aus transgenen Pflanzen isoliert werden.

Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E.coli-Zellen verwendet. Transformierte E.coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen, Sequenzierungsreaktionen und weitere biochemisch molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid DNA gespalten und mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten. Je nach Einführungsmethode der gewünschten Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA- Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation) Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker- Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al., 1978, Mol. Gen. Genet. 163: 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.

Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerÿ Kanters B.V., Alblasserdam, 1985, Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 und An et al., 1985, EMBO J. 4: 277-287 beschrieben worden.

Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen- Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden.

Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.

Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Glufosinate u. a. vermittelt. Der individuelle gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.

Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Zelle in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al., 1986, Plant Cell Reports 5: 81-84). Diese Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.

Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.

Die Erfindung betrifft darüberhinaus die Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz mit der Nukleotidabfolge Seq ID No. 1 oder Teile davon für die Expression eines Polypeptides mit Amylosucrase-Aktivität in Mikroorganismen, die keine endogene Amylosucrase-Aktivität aufweisen.

Unter Mikroorganismen werden in dieser Anmeldung alle Protisten verstanden, so wie sie z. B. in Schlegel "Allgemeine Mikrobiologie" (Georg Thieme Verlag, 1985, Seite 1-2) definiert sind.

Die biotechnologische Forschung verwendet heutzutage in großem Umfang Mikroorganismen zur Synthese und Verarbeitung verschiedenster Stoffe. Ermöglicht wird dies durch die Bereitstellung einer Vielzahl verschiedener Systeme für die effiziente Expression von prokaryontischen als auch eukaryontischen Genen in Mikroorganismen (für eine Übersicht siehe z. B. Methods in Enzymology 153: 385-516). Vielfach verwendet werden z. B. Stämme der Bakterienspezies Escherichia coli und Bacillus subtilis. Durch die Bereitstellung der unter Seq ID No. 1 dargestellten DNA-Sequenz ist es nun möglich, eine Amylosucrase-Aktivität in Mikroorganismen, für die geeignete Expressionssysteme zur Verfügung stehen, zu exprimieren.

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen, die in der Lage sind, intra- oder extrazellulär eine Amylosucrase-Aktivität zu exprimieren, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt:

a) Herstellung einer DNA-Sequenz mit folgenden Teilsequenzen:
i) einem Promotor, ,der in dem gewählten Mikroorganismus aktiv ist und die Transkription des nachgeschalteten DNA- Abschnitts sicherstellt,
ii) einer heterologen DNA-Sequenz, die für eine Amylosucrase-Aktivität kodiert und in sense-Orientierung an den Promotor fusioniert ist,
iii) einem in Mikroorganismen funktionalen Signal für die Transkriptionstermination eines RNA-Moleküls und
b) Transformation eines geeigneten Mikroorganismus mit der in Schritt a) konstruierten DNA-Sequenz,
c) Kultivierung des transformierten Mikroorganismus unter Bedingungen, die die Expression des Polypeptids erlauben.

Expressionsvektoren sind in großem Umfang in der Literatur beschrieben. Sie enthalten neben einem Selektionsmarker-Gen und einem die Replikation in dem gewählten Wirt sicherstellenden Replikationsursprung in der Regel einen bakteriellen oder viralen Promotor, sowie ein Terminationssignal für die Transkription. Zwischen Promotor und Terminationssignal befindet sich mindestens eine Restriktionsschnittstelle oder ein Polylinker, die die Insertion einer kodierenden DNA-Sequenz ermöglichen. Als Promotorsequenz kann, sofern sie in dem gewählten Organismus aktiv ist, die natürlicherweise die Transkription des entsprechenden Gens steuernde DNA-Sequenz verwendet werden. Diese Sequenz kann aber auch gegen andere Promotor-Sequenzen ausgetauscht werden. Es können sowohl Promotoren verwendet werden, die eine konstitutive Expression des Gens bewirken, als auch induzierbare Promotoren, die eine gezielte Regulation der Expression des nachgeschalteten Gens erlauben. Bakterielle und virale Promotorsequenzen mit diesen Eigenschaften sind in der Literatur ausführlich beschrieben. Promotoren, die eine besonders starke Expression des nachgeschalteten Gens erlauben, sind z. B. der T7-Promotor (Studier et al., 1990, in Methods in Enzymology 185: 60-89), lacuv5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer et al, in Rodriguez, R.L. and Chamberlin, M.J., (Eds.), Promotors, Structure and Function; Praeger, New York, 1982, pp. 462-481; DeBoer et al, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25), lp₁, rac (Boros et al., 1986, Gen 42: 97-100) oder ompF.

Die im Verfahrensschritt a) aufgeführte DNA-Sequenz, die für eine Amylosucrase-Aktivität kodiert, weist vorzugsweise die unter Seq ID No. 1 aufgeführte Nukleotidsequenz auf, wobei diese in sense-Orientierung an den Promotor gekoppelt ist (3′- Ende des Promotors zum 5′-Ende der kodierenden Sequenz). Diese Sequenz kann aber auch vor oder nach Integration in den Expressionsvektor modifiziert werden, um gegebenenfalls Eigenschaften des Polypeptids oder seine Lokalisation zu variieren, wie unten ausführlicher beschrieben wird.

Die Transformation der Mikroorganismen in Schritt b) kann in der Regel nach Standardmethoden durchgeführt werden, wie beschrieben in Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press).

Die Kultivierung des transformierten Mikroorganismus erfolgt in Medien, die den Bedürfnissen des jeweils verwendeten Wirts entsprechen müssen, insbesondere unter Berücksichtigung von pH- Wert, Temperatur, Belüftung, etc.

Die von Neisseria polysaccharea exprimierte Amylosucrase ist ein extrazelluläres Enzym, das außerhalb der Zellen lineare α-1,4- Glukane ausgehend von Saccharose synthetisiert. Dazu werden weder aktivierte Glukosederivate noch Kofaktoren benötigt, wie bei den meisten Synthesewegen für Polysaccharide, die innerhalb der Zellen ablaufen. Die Energie, die für die Bildung der α-1,4-gly kosidischen Bindung zwischen den kondensierten Glukoseresten benötigt wird, wird direkt aus der Hydrolyse der Bindung zwischen der Glukose- und der Fruktoseeinheit im Saccharosemolekül gewonnen.

Es besteht daher die Möglichkeit, Amylosucrase sekretierende Mikroorganismen, die mit Hilfe der oben beschriebenen Verfahrensschritte hergestellt wurden, in saccharosehaltigem Medium zu kultivieren, wobei die sekretierte Amylosucrase im Medium zu einer Synthese linearer α-1,4-Glukane aus Saccharose führt. Diese können aus dem Kulturmedium isoliert werden.

Ferner besteht die Möglichkeit, α-1,4-Glukane in vitro mit Hilfe einer zellfreien Enzympräparation zu synthetisieren.

In diesem Fall werden Amylosucrase sekretierende Mikroorganismen in einem saccharosefreiem Medium, das die Expression der Amylosucrase erlaubt, bis zum Erreichen der stationären Wachstumsphase kultiviert. Nach Abzentrifugieren der Zellen aus dem Wachstumsmedium, kann das sekretierte Enzym aus dem Überstand gewonnen werden. Das Enzym kann dann saccharosehaltigen Lösungen zur Synthese linearer α-1,4-Glukane zugesetzt werden. Im Vergleich zu der Synthese linearer α-1,4- Glukane direkt in einem saccharosehaltigen Wachstumsmedium bietet dieses Verfahren den Vorteil, daß sich die Reaktionsbedingungen besser kontrollieren lassen und die Reaktionsprodukte wesentlich reiner sind und sich einfacher weiter aufreinigen lassen.

Die Reinigung des Enzyms aus dem Kulturmedium kann nach herkömmlichen Reinigungsmethoden wie Fällung, Ionenaustausch- Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Gelfiltration, HPLC Reverse Phase Chromatographie etc. erfolgen.

Weiterhin ist es aber auch möglich, durch Modifikation der in den Expressionsvektor inserierten DNA-Sequenz ein Polypeptid zu exprimieren, das sich aufgrund bestimmter Eigenschaften leichter aus dem Kulturmedium isolieren läßt. So besteht die Möglichkeit, das zu exprimierende Enzym als Fusionsprotein mit einer weiteren Polypeptidsequenz zu exprimieren, deren spezifische Bindungseigenschaften die Isolierung des Fusionsproteins über Affinitätschromatographie ermöglichen.

Bekannt sind z. B. die Expression als Fusionprotein mit Glutathion-S-Transferase und die anschließende Reinigung über Affinitätschromatographie an Glutathion-Säulen. Dabei wird die Bindung der Gluthation-S-Transferase an Glutathion ausgenutzt (Smith and Johnson, 1988, Gene 67: 31-40). Weiterhin bekannt ist die Expression als Fusionprotein mit dem Maltose Binding Protein (MBP) und anschließende Reinigung über eine Amylosesäule (Guan et al., 1988, Gene 67: 21-30; Maina et al., 1988, Gene 74: 365-373).

Neben der Möglichkeit, das gereinigte Enzym einer saccharosehaltigen Lösung zur Synthese linearer α-1,4-Glukane direkt zuzusetzen, besteht auch die Alternative, das Enzym an einem Trägermaterial zu immobilisieren. Eine derartige Immobilisierung bietet den Vorteil, daß das Enzym als Katalysator der Synthesereaktion auf einfache Weise aus dem Reaktionsgemisch wiedergewonnen und mehrfach verwendet werden kann. Da die Aufreinigung von Enzymen in der Regel zeit- und kostenintensiv ist, ermöglicht eine Immobilisierung und Wiederverwendung des Enzyms eine erhebliche Kosteneinsparung. Ein weiterer Vorteil ist der hohe Reinheitsgrad der Reaktionsprodukte, der unter anderem darauf beruht, daß sich bei der Verwendung immobilisierter Enzyme die Reaktionsbedingungen gut kontrollieren lassen. Die als Reaktionsprodukte auftretenden unlöslichen linearen Glukane lassen sich dann auf einfache Weise weiter aufreinigen.

Für die Immobilisierung von Proteinen stehen eine Vielzahl von Trägermaterialien zur Verfügung, wobei die Kopplung an das Trägermaterial über kovalente oder nicht-kovalente Bindung erfolgen kann (für eine Übersicht siehe: Methods in Enzymology Vol. 135, 136 und 137). Weite Verbreitung als Trägermaterialien haben z. B. Agarose, Zellulose, Polyacrylamid, Silica oder Nylon.

Ebenso wie das gereinigte Enzym lassen sich auch Mikroorganismen, die das gewünschtes Polypeptid exprimieren oder ein bestimmtes Stoffwechselprodukt ausscheiden, immobilisieren. Die Immobilisierung erfolgt hierbei in der Regel durch Einschluß der Zellen in ein geeignetes Material wie z. B. Alginat, Polyacrylamid, Gelatine, Celulose oder Chitosan. Möglich ist aber auch die Adsorption oder die kovalente Bindung der Zellen an ein Trägermaterial (Brodelius and Mosbach, in Methods in Enzymology, Vol. 135: 173-175). Ein Vorteil der Immobilisierung von Zellen ist, daß dadurch wesentlich höhere Zelldichten erreicht werden können, als bei einer Kultivierung in Flüssigkultur. Daraus resultiert eine höhere Produktivität. Weiterhin verringern sich die Kosten für Agitation und Belüftung der Kultur, sowie für Maßnahmen zur Aufrechterhaltung der Sterilität. Ein wichtiger Gesichtspunkt ist auch, daß eine kontinuierliche Produktion möglich ist, so daß lange unproduktive Phasen, die regelmäßig bei Fermentationsprozessen auftreten, vermieden oder zumindest stark reduziert werden können.

Ebenso wie in Mikroorganismen läßt sich die erfindungsgemäße DNA-Sequenz auch für die Expression einer Amylosucrase- Aktivität in Pilzen, insbesondere Hefen, z. B. Saccharomyces cerevisiae, verwenden. Vektoren für die Expression heterologer Gene in Hefen sind beschrieben (z. B. Bitter et al., 1987, Methods in Enzymology 153: 516-544). Diese Vektoren enthalten neben einem Selektionsmarker-Gen und einem Replikationsursprung für die Vermehrung in Bakterien mindestens ein weiteres Selektionsmarker-Gen, das die Identifizierung transformierter Hefezellen erlaubt, eine die Replikation in Hefen gewährleistende DNA-Sequenz und einen Polylinker für die Insertion der gewünschten Expressionskassette. Die Expressionskassette wird konstruiert aus Promotor, zu exprimierender DNA-Sequenz und einer DNA-Sequenz, die die Transkriptionstermination und die Polyadenylierung des Transkriptes gewährleistet. Promotoren und Transkriptionsterminationssignale aus Saccharomyces sind ebenfalls beschrieben und verfügbar. Ein Expressionsvektor kann in Hefezellen nach Standardmethoden durch Transformation eingeführt werden (Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1990). Zellen, die den Vektor enthalten, werden auf geeignetem Selektionsmedien selektiert und propagiert. In Hefen besteht darüberhinaus die Möglichkeit, die Expressionskassette unter Verwendung eines geeigneten Vektors über homologe Rekombination in das Genom einer Zelle zu integrieren. Das führt zu einer stabilen Vererbung des Merkmals.

Amylosucrase exprimierende Hefe-Stämme lassen sich analog zu Mikroorganismen für die Gewinnung einer sekretierten Amylosucrase verwenden. Kultivierungsmethoden für Hefen sind ausreichend beschrieben (Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1990). Auch die Immobilisierung von Hefezellen ist möglich und wird bereits bei der industriellen Ethanolherstellung angewendet (Nagashima et al., in Methods in Enzymology, Vol. 136: 394-405; Nojima and Yamada, in Methods in Enzymology Vol. 136: 380-394).

Die Verwendung von Amylosucrase-sekretierenden Hefen für die Synthese linearer α-1,4-Glukane in saccharosehaltigem Medium ist dagegen nicht ohne weiteres möglich, da Hefen eine Invertase sezernieren, die extrazelluläre Saccharose spaltet. Die Hefen nehmen die entstehenden Hexosen über einen Hexosetransporter auf. In Riesmeier et al. (1992, EMBO J. 11: 4705-4713) wird jedoch ein Hefestamm beschrieben, der ein defektes suc2-Gen trägt und daher keine Invertase sezernieren kann. Darüber hinaus enthalten diese Hefezellen auch kein Transportsystem, das Saccharose in die Zellen importieren kann. Wird ein derartiger Stamm mit Hilfe der erfindungsgemäßen DNA- Sequenz dahingehend verändert, daß er eine Amylosucrase ins Kulturmedium sezerniert, so erfolgt in einem saccharosehaltigem Kulturmedium die Synthese linearer α-1,4-Glukane durch die Amylosucrase. Die dabei als Reaktionsprodukt entstehende Fruktose kann anschließend von den Hefen aufgenommen werden.

Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz kann ferner durch Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Insertion, Deletion, Substitution oder Rekombination weiter modifiziert werden, um bestimmte Eigenschaften des zu exprimierenden Proteins zu verändern. Darunter fallen z. B. auch die Deletion der Signalsequenz, die die Sekretion des Enzyms gewährleisten, sowie die Insertionen anderer Signalsequenzen oder DNA- Sequenzen, die für Transitpeptide kodieren, und dadurch die Lokalisation des exprimierten Proteins beeinflussen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der unter Seq ID No. 1 angeführten erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder Teile davon, um zu bestimmen, ob in bestimmten Organismen homologe DNA-Sequenzen vorhanden sind oder exprimiert werden. Dazu werden DNA- bzw. mRNA-Proben des jeweiligen Organismus mit der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen nach bekannten Standardmethoden hybridisiert.

Weiterhin ist es möglich mit Hilfe der erfindungsgemäßen DNA- Sequenz nach Standardverfahren aus dem Genom verschiedener Organismen ähnliche Sequenzen zu isolieren, die ebenfalls Amylosucrasen oder Enzyme mit ähnlichen Eigenschaften kodieren. Mit diesen Sequenzen können dann wiederum Konstruktionen zur Transformation von Pflanzen, Hefen oder Mikroorganismen hergestellt werden.

Um verwandte DNA-Sequenzen zu bestimmen, müssen zunächst Genbanken des jeweils zu untersuchenden Organismus angelegt werden, die repräsentativ für den Gehalt der Gene des Organismus oder für die Expression von Genen in dem Organismus oder einem bestimmten Gewebe des Organismus sind. Erstere sind genomische, letztere sind cDNA-Banken. Aus diesen können mit Hilfe der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz als Sonde verwandte Sequenzen isoliert werden. Als Sonde können auch Teilsequenzen der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz verwendet werden. Bei den als Sonde verwendeten DNA-Fragmente kann es sich auch um synthetische DNA-Fragmente handeln, die mit Hilfe der gängigen DNA-Synthesetechniken hergestellt wurden. Hat man die dazugehörigen Gene identifiziert und isoliert, ist eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Sequenz kodierten Proteine erforderlich.

Hinterlegung

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung hergestellten und verwendeten Plasmide wurden bei der als internationale Hinterlegungsstelle anerkannten Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, entsprechend den Anforderungen des Budapester Vertrages für die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke der Patentierung hinterlegt.

Am 06. 05. 1994 wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, folgendes Plasmid hinterlegt (Hinterlegungsnummer):

Plasmid pNB2 (DSM 9196)

Verwendete Abkürzungen

IPTG Isopropyl β-D-Thiogalacto-Pyranosid

Verwendete Medien und Lösungen

YT-Medium
8 g Bacto-Trypton
5 g Yeast Extract
5 g NaCl
ad 1000 ml mit ddH₂O

Yt-Platten
YT-Medium mit 15 g Bacto-Agar/1000 ml

Lugolsche Lösung
12 g KI
6 g I₂
ad 1,8 l mit ddH₂O

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt das Plasmid pNB2 (DSM 9196).

Die fein gezogene Linie entspricht der Sequenz des Klonierungsvektors pBluescript SK(-). Die starke Linie repräsentiert die ca. 4.2 kb lange Insertion genomische DNA aus Neisseria polysaccharea. Die kodierende Region für Amylosucrase ist als Pfeil unterhalb der Insertion dargestellt.

Oberhalb der Insertion ist der sequenzierte Bereich dargestellt. Alle Zahlenangaben beziehen sich auf diesen 2883 bp langen Bereich.

Fig. 2 zeigt den Nachweis der Expression einer Amylosucrase- Aktivität in transformierten E.coli-Zellen durch Jodbedampfung.

E.coli-Zellen, die mit dem pBluescript II SK-Plasmid transformiert worden waren (A) und E.coli-Zellen, die mit dem Plasmid pNB2 transformiert worden waren (B), wurden auf YT- Platten (1.5% Agar; 100 µg/ml Ampicillin; 5% Saccharose; 0.2 mM IPTG) ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Platten mit Jod bedampft. Kolonien der Zellen, die mit dem Plasmid pNB2 transformiert waren, wiesen einen deutlichen blauen Hof auf.

Beispiele Beispiel 1 Isolierung einer genomischen DNA-Sequenz, die für eine Amylosucrase-Aktivität kodiert, aus Neisseria polysaccharea

Für die Isolierung einer DNA-Sequenz, die für eine Amylosucrase-Aktivität kodiert, aus Neisseria polysaccharea, wurde zunächst eine genomische DNA-Bibliothek angelegt. Hierzu wurden Neisseria polysaccharea-Zellen auf "Columbia blood agar"-Platten (Difco) für 2 Tage bei 37°C angezogen. Die entstandenen Kolonien wurden von den Platten geerntet. Genomische DNA wurde nach der Methode von Ausubel et al. (in: Current Protocols in Molecular Biology (1987); J. Wiley, NY) isoliert und aufgearbeitet. Die so gewonnene DNA wurde mit der Restriktionsendonuklease Sau3A partiell verdaut. Die resultierenden DNA-Fragmente wurden in den mit BamHI geschnittenen Vektor pBluescriptSK(-) ligiert. Die Ligationsprodukte wurden in E.coli XL1-Blue-Zellen transformiert. Die Zellen wurden zur Selektion auf YT-Platten mit Ampicillin als Selektionsmarker ausplattiert. Das Selektionsmedium enthielt zusätzlich 5% Saccharose und 1 mM IPTG. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die gewachsenen Bakterienkolonien einer Jodfärbung unterzogen. Dies erfolgte, indem kristallines Jod in den Deckel einer Petrischale gegeben wurde und die Kulturschalen mit den Bakterienkolonien jeweils 10 min kopfüber auf die Petrischale gelegt wurden. Durch das bei Raumtemperatur verdampfende Jod wurden Bereiche auf den Kulturschalen, die amyloseartige Glukane enthielten blau angefärbt. Aus Bakterienkolonien, die von einem blauen Hof umgeben waren, wurde nach der Methode von Birnboim (1979, Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523) Plasmid- DNA isoliert. Diese wurde retransformiert in E.coli SURE- Zellen. Die transformierten Zellen wurden auf YT-Platten mit Ampicillin als Selektionsmarker ausplattiert. Positive Klone wurden isoliert.

Beispiel 2 Sequenzanalyse der genomischen DNA-Insertion des Plasmids pNB2

Aus einem entsprechend Ausführungsbeispiel 1 erhaltenen E.coli- Klon wurde ein rekombinantes Plasmid isoliert. Restriktionsanalysen ergaben, daß dieses Plasmid ein Ligationsprodukt aus zwei Vektormolekülen und einem ca. 4.2 kb großen genomischen Fragment war. Das Plasmid wurde mit der Restriktionsendonuklease Pst I geschnitten, und das genomische Fragment wurde isoliert (GeneClean, Bio101). Das so erhaltene Fragment wurde in einen mit Pst I linearisierten pBluescript II SK-Vektor ligiert. Dadurch erfolgte eine Verdoppelung der Pst I- und Sma I-Schnittstellen. Das Ligationsprodukt wurde in E.coli-Zellen transformiert, und diese wurden zur Selektion auf Ampicillin-Platten ausgestrichen. Positive Klone wurden isoliert. Aus einem dieser Klone wurde das Plasmid pNB2 (Fig. 1) isoliert und ein Teil der Sequenz seiner genomischen DNA- Insertion durch Standardverfahren mittels der Didesoxymethode (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467) bestimmt. Die gesamte Insertion ist ca. 4.2 kbp lang. Die Nukleotidsequenz wurde von einer Teilsequenz mit einer Länge von 2883 bp bestimmt. Diese Nukleotidsequenz ist oben angegeben (Seq. ID No. 1). Die Lokalisation des sequenzierten Bereiches in der genomischen Insertion ist in Fig. 1 angegeben.

Beispiel 3 Expression einer extrazellulären Amylosucrase-Aktivität in transformierten E. coli-Zellen a) Nachweis einer Amylosucrase-Aktivität bei Wachstum auf YT- Platten

Für die Expression einer extrazellulären Amylosucrase-Aktivität wurden E. coli-Zellen nach Standardmethoden mit dem Vektor pNB2 transformiert. Eine Kolonie des transformierten Stammes wurde auf YT-Platten (1.5% Agar; 100 µg/ml Ampicillin; 5% Saccharose; 0.2 mM IPTG) über Nacht bei 37°C inkubiert. Der Nachweis der Amylosucrase-Aktivität erfolgte durch Bedampfung mit Jod (Fig. 2). Amylosucrase-exprimierende Kolonien weisen einen blauen Hof auf. Amylosucrase-Aktivität ist auch bei Abwesenheit von IPTG zu beobachten aufgrund der Aktivität des endogenen Amylosucrase-Promotors.

b) Nachweis einer Amylosucrase-Aktivität bei Wachstum in YT- Medium

Für die Expression einer extrazellulären Amylosucrase-Aktivität wurden E. coli-Zellen nach Standardmethoden mit dem Vektor pNB2 transformiert. YT-Medium (100 µg/ml Ampicillin; 5% Saccharose) wurde mit einer Kolonie des transformierten Stammes angeimpft. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C unter ständiger Bewegung (Rotationsschüttler; 150-200 rpm) inkubiert. Der Nachweis der Produkte der durch Amylosucrase katalysierten Reaktion erfolgte durch Zugabe von Lugolscher Lösung zum Kulturüberstand.

c) Nachweis der Amylosucrase-Aktivität in den Kulturüberständen von transformierten E. coli-Zellen, die in Abwesenheit von Saccharose kultiviert wurden

Für die Expression einer extrazellulären Amylosucrase-Aktivität wurden E. coli-Zellen nach Standardmethoden mit dem Vektor pNB2 transformiert. YT-Medium (100 µg/ml Ampicillin) wurde mit einer Kolonie des transformierten Stammes angeimpft. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C unter ständiger Bewegung (Rotationsschüttler; 150-200 rpm) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert (30 min, 4°C, 5500 rpm, JA10 Beckmann-Rotor). Der Überstand wurde durch einen 0.2 µm Filter (Schleicher) sterilfiltriert.

Der Nachweis einer Amylosucrase-Aktivität erfolgte

i) durch Inkubation des Überstandes auf einer saccharosehaltigen Agarplatte. Hierzu wurden 40 µl des Überstandes in ein ausgestanztes Loch auf einer Agarplatte (5% Saccharose in 50 mM Natriumcitrat-Puffer pH 6.5) gegeben und für mindestens eine Stunde bei 37°C inkubiert. Der Nachweis der Produkte der durch Amylosucrase katalysierten Reaktion erfolgte durch Anfärben mittels Iodbedampfung. Vorhandensein von Reaktionsprodukten ruft eine Blaufärbung hervor;
ii) oder durch gelelektrophoretische Auftrennung der Proteine des Überstandes in einem nativen Gel und Nachweis der Reaktionsprodukte im Gel nach Inkubation mit Saccharose. Hierzu wurden 40-80 µl des Überstandes auf einem 8%igen nativen Polyacrylamidgel (0.375 M Tris pH 8.8) bei einer Spannung von 100 V gelelektrophoretisch aufgetrennt. Das Gel wurde anschließend zweimal 15 min mit ca. 100 ml 50 mM Natriumcitrat-Puffer (pH 6.5) äquilibriert und über Nacht bei 37°C in Natriumcitrat- Puffer pH 6.5/5% Saccharose inkubiert. Zur Sichtbarmachung der Reaktionsprodukte der durch Amylosucrase katalysierten Reaktion wurde das Gel in Lugolscher Lösung geschwenkt. Banden mit Amylosucrase-Aktivität weisen eine Blaufärbung auf.

Beispiel 4 In-vitro-Produktion von Glukanen mit partiell gereinigter Amylosucrase

Anschließend wurde der Überstand unter Verwendung einer Amicon- Kammer (YM30-Membran mit einer Ausschlußgröße von 30 kDa, Fa. Amicon) unter Druck (p=3 bar) 200-fach aufkonzentriert. Dieser konzentrierte Überstand wurde zu 50 ml Saccharoselösung (5% Saccharose in 50 mM Natrium-Citrat-Puffer pH 6.5) hinzugegeben. Der gesamte Ansatz wurde bei 37°C inkubiert. Es kommt zur Bildung weißlicher unlöslicher Polysaccharide.

Beispiel 5 Charakterisierung der durch Amylosucrase synthetisierten Reaktionsprodukte aus Beispiel 4

Die in Beispiel 4 beschriebenen unlöslichen Reaktionsprodukte sind in 1 M NaOH löslich. Die Charakterisierung der Reaktionsprodukte erfolgte durch Messung des Absorptionsmaximums. Hierzu wurden ca. 100 mg der isolierten Reaktionsprodukte (Naßgewicht) in 200 µl 1 M NaOH gelöst und 1 : 10 mit H₂O verdünnt. Zu 100 µl dieser Verdünnung wurden 900 µl 0.1 M NaOH und 1 ml Lugolsche Lösung gegeben. Es wurde das Absorptionsspektrum zwischen 400 und 700 nm gemessen. Das Maximum liegt bei 605 nm (Absorptionsmaximum von Amylose: ca. 614 nm).

Eine HPLC-Analyse des Reaktionsansatzes von Beispiel 4 auf einer CARBOPAC PA1-Säule (DIONEX) zeigte, daß neben den unlöslichen Produkten auch lösliche Produkte entstehen. Es handelt sich hierbei um kurzkettige Polysaccharide. Die Kettenlänge lag in diesem Fall zwischen ca. 5 und ca. 50 Glukoseeinheiten. In geringem Maße waren jedoch auch kürzere und längere Moleküle nachweisbar.

Mit den zur Verfügung stehenden Analysemethoden war es nicht möglich, Verzweigungen in den Syntheseprodukten nachzuweisen. Es ist aber nicht auszuschließen, daß in geringfügigem Maße Verzweigungen auftreten.

Beispiel 6 Expression einer intrazellulären Amylosucrase-Aktivität in transformierten E. coli-Zellen

Mit Hilfe einer "Polymerase Chain Reaction" (PCR) wurde aus dem Plasmid pNB2 ein Fragment amplifiziert, das die Nukleotide 981 bis 2871 der unter Seq ID No. 1 dargestellten Sequenz umfaßt. Als Primer wurden folgende Oligonukleotide verwendet:

TPN2 5′ - CTC ACC ATG GGC ATC TTG GAC ATC - 3′
TPC1 5′ - CTG CCA TGG TTC AGA CGG CAT TTG G - 3′

Das resultierende Fragment enthält die kodierende Region für Amylosucrase mit Ausnahme der Nukleotide, die für die 14 N-ter minalen Aminosäuren kodieren. Diese Aminosäuren umfassen die Sequenzen, die für eine Sekretion des Enzyms aus der Zelle notwendig sind. Darüberhinaus enthält dieses PCR-Fragment 88 bp des 3′ nichttranslatierten Bereiches. Durch die verwendeten Primer wurden an beiden Enden des Fragmentes Nco I- Schnittstellen eingeführt.

Nach Verdau mit der Restriktionsendonuklease Nco I wurde das resultierende Fragment in den mit Nco I geschnittenen Expressionsvektor pMex 7 ligiert. Die Ligationsprodukte wurden in E.coli-Zellen transformiert und transformierte Klone selektiert. Positive Klone wurden auf YT-Platten (1.5% Agar; 100 µg/ml Ampicillin; 5% Saccharose; 0.2 mM IPTG) über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach Jodbedampfung wurde keine Blaufärbung im Bereich der Bakterienkolonien beobachtet. Um die Funktionalität des Proteins zu überprüfen, wurden in YT-Medium kultivierte transformierte Zellen mittels Ultraschall aufgeschlossen und der erhaltene Rohextrakt auf saccharosehaltige Agarplatten pipettiert. Nach Jodbedampfung war eine Blaufärbung zu beobachten.

SEQ ID NO.: 1
ART DER SEQUENZ: Nukleotid mit entsprechendem Protein
SEQUENZLÄNGE: 2883 Basenpaare

STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: genomische DNA

URSPRÜNGLICHE HERKUNFT
ORGANISMUS: Neisseria polysaccharea
HERKUNFT: genomische Bibliothek im Plasmid pBluescriptII SK
MERKMALE: von Nukleotid 939-2780 kodierende Region

EIGENSCHAFTEN: Amylosucrase (E.C. 2.4.1.4.)

Claims

1. Verfahren zur gentechnischen Transformation von Pflanzenzellen, dadurch gekennzeichnet, daß in die Pflanzenzellen eine heterologe DNA-Sequenz eingeführt und exprimiert wird, die eine für eine Amylosucrase-Aktivität kodierende Region umfaßt.

2. Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Verfahrensschritte umfaßt:

a) Herstellung einer DNA-Sequenz mit folgenden Teilsequenzen:
- i) einem Promotor, der in Pflanzen aktiv ist und die Bildung einer RNA in dem vorgesehenen Zielgewebe oder den Zielzellen sicherstellt,
- ii) einer heterologen DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid mit Amylosucrase-Aktivität kodiert und in sense- Orientierung an den Promotor fusioniert ist,
- iii) einem in Pflanzen funktionalen Signal für die Transkriptionstermination und Polyadenylierung eines RNA- Moleküls,
b) Transfer und Einbau der DNA-Sequenz in das pflanzliche Genom und
c) Regeneration von intakten ganzen Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen gemäß Anspruch.

3. Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen, die intra- oder extrazellulär ein Polypeptid mit Amylosucrase-Aktivität exprimieren, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Verfahrensschritte umfaßt:

a) Herstellung einer DNA-Sequenz mit folgenden Teilsequenzen:
- i) einem Promotor, der in dem gewählten Mikroorganismus aktiv ist und die Transkription des nachgeschalteten DNA- Abschnitts sicherstellt,
- ii) einer heterologen DNA-Sequenz, die für eine Amylosucrase-Aktivität kodiert und in sense-Orientierung an den Promotor fusioniert ist,
- iii) einem in Mikroorganismen funktionalen Signal für die Transkriptionstermination eines RNA-Moleküls und
b) Transformation eines geeigneten Mikroorganismus mit der in Schritt a) konstruierten DNA-Sequenz.

4. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die kodierende DNA-Sequenz für ein Polypeptid mit Amylosucrase-Aktivität kodiert und diese Sequenz aus einem Mikroorganismus der Gattung Neisseria stammt.

5. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die kodierende DNA-Sequenz für ein Polypeptid mit Amylosucrase-Aktivität kodiert, das folgende Aminosäuresequenz aufweist oder Teile davon, wobei diese Teile lang genug sind, um Amylosucrase-Aktivität aufzuweisen.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, worin die kodierende DNA-Sequenz die folgende Nukleotidsequenz (Seq ID No. 1) oder einen Teil davon umfaßt oder Derivate davon, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von dieser Sequenz abgeleitet sind, wobei diese DNA-Sequenzen nach Expression zur Synthese eines Polypeptides führen, das eine Amylosucrase-Aktivität aufweist.

7. DNA-Sequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenzen aus einem gram-negativen Bakterium der Spezies Neisseria polysaccharea stammen und folgende Nukleotidabfolge (Seq ID No. 1): oder Teile davon aufweisen.

8. Derivate von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß diese Derivate durch Austausch einzelner oder mehrerer Basen, Deletion, Insertion oder Rekombination erhalten werden und für ein Polypeptid kodieren, das Amylosucrase-Aktivität besitzt.

9. Plasmide, enthaltend

a) einen geeigneten in Mikroorganismen aktiven Promotor, der sicherstellt, daß die nachgeschaltete kodierende Sequenz in Mikroorganismen abgelesen wird, und
b) eine fremde DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das Amylosucrase-Aktivität aufweist, und die so an den Promotor gekoppelt ist, daß die Bildung einer in ein Polypeptid translatierbaren RNA erlaubt wird.

10. Plasmide, enthaltend

a) einen geeigneten in Pflanzen aktiven Promotor, der sicherstellt, daß die nachgeschaltete kodierende Sequenz zum geeigneten Zeitpunkt bzw. in einem geeigneten Entwicklungszustand in einer transgenen Pflanze oder in bestimmten Geweben einer transgenen Pflanze abgelesen wird, und
b) eine fremde DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das Amylosucrase-Aktivität aufweist, und die so an den Promotor gekoppelt ist, daß die Bildung einer in ein Polypeptid translatierbaren RNA erlaubt wird.

11. Plasmide nach einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 10, die bin DNA-Fragment enthalten, das aus dem Genom einer Neisseria Spezies stammt.

12. Plasmide nach einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 11, enthaltend DNA-Sequenzen gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 8.

13. Plasmid pNB2, das unter der DSM-Nr. 9196 hinterlegt wurde.

14. Bakterien, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 8 als Bestandteil rekombinanter DNA.

15. Bakterien, enthaltend ein Plasmid gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 13.

16. Pilze, insbesondere der Spezies Saccharomyces cerevisiae, enthaltend ein Plasmid gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 9, 11, 12 oder 13.

17. Pilze, insbesondere der Spezies Saccharomyces cerevisiae, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 8 als Bestandteil rekombinanter DNA.

18. Verwendung der Plasmide gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 13 oder Derivate oder Teile davon zur Transformation pro- und eukaryontischer Zellen.

19. Verwendung der DNA-Sequenzen gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 8 zur Herstellung von Bakterien, die eine Amylosucrase-Aktivität exprimieren.

20. Verwendung der Plasmide gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 9, 11, 12 oder 13 zur Herstellung von Bakterien, die eine Amylosucrase-Aktivität exprimieren.

21. Verwendung der DNA-Sequenzen gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 8 zur Herstellung von Pilzen, insbesondere der Spezies Saccharomyces cerevisiae, die eine Amylosucrase- Aktivität exprimieren.

22. Verwendung der Plasmide gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 9, 11 oder 12 zur Herstellung von Pilzen, insbesondere der Spezies Saccharoinyces cerevisiae, die eine Amylosucrase-Aktivität exprimieren.

23. Verwendung der DNA-Sequenzen gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 8 zur Herstellung von Pflanzen, die eine Amylosucrase-Aktivität exprimieren.

24. Verwendung der Plasmide gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 10, 11 oder 12 zur Herstellung von Pflanzen, die eine Amylosucrase-Aktivität exprimieren.

25. Verwendung der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 7 zur Herstellung von Derivaten durch zielgerichtete oder nicht-zielgerichtete Mutagenese.

26. Verwendung der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 7 zur Isolierung ähnlicher Sequenzen aus dem Genom von Organismen.

27. Transgene Pflanzenzellen und Pflanzen, enthaltend eine DNA- Sequenz gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 8.

28. Transgene Pflanzenzellen und Pflanzen, die eine heterologe DNA-Sequenz stabil in ihrem Genom integriert besitzen, die für ein Polypeptid mit Amylosucrase-Aktivität kodiert.

29. Pflanze gemäß den Ansprüchen 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Nutzpflanze ist.

30. Pflanze gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Mais-, Reis-, Weizen-, Gersten-, Zuckerrüben-, Zuckerrohr-, Tabak-, Tomaten- oder Kartoffelpflanze ist.