DE4224878A1

DE4224878A1 - Amphiphile Dinucleosidphosphatanaloga, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE4224878A1
Application number: DE19924224878
Authority: DE
Inventors: Herbert Prof Dr Schott; Reto Albert Dr Schwendener; Frederique Odile Dr Guerin
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-07-28
Filing date: 1992-07-28
Publication date: 1994-02-03

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue amphiphile Di nucleosidphosphatanaloga, deren Herstellung sowie deren Verwendung bei der Behandlung von Krebserkrankungen und virusbedingten Infektionskrankeiten.

Nucleosidanaloga, die bestimmte Strukturmerkmale aufweisen, sind bewährte Arzneimittel in der Chemotherapie von Krebs erkrankungen und von virusbedingten Infektionskrankheiten (AIDS Res. Human Retroviruses 8, 119 (1992)). Die therapeu tische Wirkung von Cytosinnucleosidanaloga beispielsweise von araC ist dadurch limitiert, daß körpereigene Cytosin desaminasen die Aminogruppe der Nucleobase zu schnell des aminieren, und die dabei gebildeten Uracilnucleosidanaloga in der Regel therapeutisch unwirksam sind (Biochem. Pharma col. 33, 2159 (1984)). Zur Erzielung einer therapeutischen Wirkung müssen Cytosinnucleosidanaloga daher in hohen Dosen appliziert werden, die für den Patienten mit schwerwiegen den Nebenwirkungen verbunden sind. Mit Cytosinnucleosid analoga, deren Aminogruppen mit Schutzgruppen versehen ist, versucht man die therapeutische Wirkung zu optimieren.

3′-Azido-2′,3′-didesoxythymidin (AZT) ist beispielsweise in der Chemotherapie der AIDS-Erkrankung das am häufigsten an gewendete Virusstatikum. Die antiretrovirale Wirkung ba siert darauf, daß AZT nach der Zellaufnahme zum 5′-Triphos phatderivat anabolisiert wird, das dann selektiv die Re verse-Transkriptase des Humanen-Immundefizienz Virus (HIV) bindet, durch das die AIDS-Erkrankung ausgelöst wird. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1986, 38, 8333-8337). Mit AZT-Derivaten, die von den infizierten Zellen besser aufge nommen werden oder aufgrund einer behinderten Hydrolyse AZT nur verzögert freisetzen (Depotwirkung), versucht man, die Anti-HIV-Wirkung von AZT zu steigern und die schwerwiegen den toxischen Nebenwirkungen zu mindern. Nach einem anderen Konzept versucht man mit Liposomen, die AZT verkapselt oder Glycerophöspholipid-AZT-Konjugate in ihrer Lipidmembran eingebaut haben, das große HIV-Reservoir von Makrophagen gezielt auszuschalten. Man hofft, daß die Makrophagen den größten Teil der applizierten Liposomen bevor sie hydroly sieren phagozitieren, so daß nur wenig freigesetztes AZT von anderen Zellen aufgenommen wird und damit die toxischen Nebenwirkungen verringert werden. In einem neuen Therapie schema, mit dem der therapeutische Index von AZT verbessert werden kann, wird AZT zusammen mit 2′,3′-Didesoxycytidin (ddC) appliziert. Den Vorteil einer solchen Kombinations therapie versucht man auch über Dinucleosidphosphatanaloga zu erreichen, in denen AZT mit anderen antiretroviralen Di desoxynucleosidanaloga kovalent verbunden ist, wobei aller dings die wirksamsten Nucleoside AZT und ddC noch nicht gekuppelt wurden (AIDS Res. Human, Retro. 1988, 4, 449-454; Antimicrob. Agents Chemother. 1990, 34, 1061-1067). Die Dimerisierung unterschiedlicher antiretroviral wirksa mer Verbindungen ist allerdings nur dann zweckmäßig, wenn beide Reagenzien bei etwa der gleichen Konzentration ihre Wirkung entfalten. Ein bedenklicher Nachteil der beschrie benen Dimeren ist ihr zu hydrophiler Charakter. Hierdurch werden die Passage durch die Zellmembran und der stabile Einbau in Liposomen erschwert, sowie die enzymatische Hy drolyse nicht verzögert.

Aufgabe dieser Erfindung ist es, neue Dinucleosidphosphat analoga zu synthetisieren, mit denen Krebserkrankungen und virusbedingten Infektionen noch wirksamer bekämpft werden können.

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß im Rahmen dieser Er findung neue amphiphile Dinucleosidphosphatanaloga synthe tisiert wurden, die die Vorteile der genannten unterschied lichen Konzepte vereinigen und die mit einem vertretbaren Aufwand in präparativen Mengen zugänglich sind. Hierbei wurden lipophile Nucleotidderivate an hydrophile therapeu tisch wirksame Nucleosidanaloga über Phosphodiesterbrücken kovalent verbunden oder lipophile therapeutisch wirksame Nucleosidanaloga an hydrophile Nucleotidderivate gekuppelt.

Gegenstand der Erfindung sind amphiphile Dinucleosidphos phatanaloga der Formel I

worin
R¹ eine Hydroxyl-, Amino-, acylierte oder alkylierte Ami nogruppe ist, deren Acyl- oder Alkylrest 1 bis 24 C-Atome und 0 bis 2 Doppelbindungen aufweist, linear oder verzweigt ist, bedeutet, und
R² Wasserstoff, Fluor, ein 2-Bromovinylrest oder ein C₁ bis C₂₄ linearer oder verzweigter Alkylrest ist, und
R³ und R⁴, die gleich oder verschieden sein können, Wasser stoff oder Hydroxyl, und
R⁵ ein Nucleosidderivat der Formel II, bedeutet,

worin
R⁶ eine Hydroxyl-, Amino-, acylierte oder alkylierte Amino gruppe ist, deren Acyl- oder Alkylrest 1 bis 24 C-Atome und 0 bis 2 Doppelbindungen aufweist, linear oder verzweigt ist, bedeutet,
aber R⁶ ungleich R¹ gewählt wird, und
R⁷ Wasserstoff, Fluor, ein 2-Bromovinylrest oder ein C₁ bis C₂₄ linearer oder verzweigter Alkylrest ist, und genau ei ner der Reste
R⁸ bis R¹⁰, die gleich oder verschieden sein können, Sauer stoff, und die jeweils anderen Reste aus der Gruppe beste hend aus Wasserstoff oder Hydroxyl ausgewählt sind, bedeu ten.

Ist R¹ oder R⁶ eine alkylierte Aminogruppe, so kommen als Alkylreste Hexadecyl und Oktadecyl in Betracht.

Ist R¹ oder R⁶ eine acylierte Aminogruppe, so sind folgende Acylreste bevorzugt: Palmitoyl, Oleoyl und Behenoyl (Decasanoyl).

Für R² sind Wasserstoff, Fluor, Ethyl; für
R³, R⁴′ R⁸ Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe; für
R⁷ Wasserstoff oder eine Methylgruppe und für
R⁹ und R¹⁰ sind Wasserstoff, Sauerstoff oder eine Hydroxyl gruppe bevorzugt.

Die neuen amphiphilen Dinucleosidphosphatanaloga der Formel I lassen sich herstellen, indem man

a) aus Verbindungen der Formel III worin R¹ bis R⁵ die angegebene Bedeutung hat, den chlorier ten Phenylrest abspaltet oder
b) eine Verbindung der Formel IV worin R¹ bis R⁵ die angegebene Bedeutung hat, oxidiert.

Die Abspaltung des chlorierten Phenylrestes gemäß a) ge lingt besonders gut, wenn man auf die Verbindungen III, die in einem organischen Lösungsmittelgemisch gelöst werden, ein Gemisch aus Nitrobenzaldoxim und Tetramethylguanidin während 0.5-2 Std. oder Tetrabutylammoniumfluorid 45 min. bei Raumtemperatur einwirken läßt.

Die Oxidation der Verbindungen IV gemäß b) gelingt beson ders gut bei Raumtemperatur mit Jod in organisch-wäßrigen Lösungsmitteln.

Die so erhaltenen Reaktionsprodukte können durch Chromato graphie gereinigt werden.

Die als Ausgangsmaterial verwendeten Verbindungen der Formel III lassen sich durch Kondensation von Verbindungen der Formel V

worin
R⁶, R⁷, R⁸ die angegebene Bedeutung hat, und
R¹¹ und R¹² 4-Monomethoxytriphenylmethoxy, Acetyl oder 2- Chlorphenylphosphat bedeutet, mit Verbindung der Formel VI

worin R¹ bis R⁴ die angegebene Bedeutung hat, unter Zuhilfenahme von Kondensationsmitteln in an sich bekannter Weise herstellen (Makromol. Chem. 188, 1313 (1987)). Der 4-Mono methoxytriphenylmethylrest wird anschließend unter saueren Bedingungen, der Acetylrest unter alkalischen Bedingungen gegen Hydroxyl ausgetauscht.

Die als Ausgangsmaterial verwendeten Verbindungen der Formel IV lassen sich durch Kondensation einer Verbindung der Formel VII

worin
R⁶, R⁷, R⁸ die angegebene Bedeutung hat und
R¹³ und R¹⁴ 4-Monomethoxytriphenylmethoxyl, Acetyl oder Hy drogenphosphonat bedeutet, mit einer Verbindung der Formel VI in Gegenwart eines Säurechlorids und anschließender Oxi dation in an sich bekannter Weise darstellen (Tetrahedron Lett. 27, 469 (1986)). Nach der Oxidation und chromatogra phischen Aufarbeitung wird der 4-Monomethoxytriphylmethyl und/oder Acetylrest gegen Hydroxyl ausgetauscht.

Die für die Umsetzungen benötigten Ausgangsmaterialien sind bekannte Stoffe oder lassen sich in Analogie zu bekannten Verfahren herstellen (J.C.S. Perkin I 1171 (1982); Makro mol. Chem. 187, 809 (1986); Tetrahedron Lett. 27, 2661 (1986)).

Die Überführung der therapeutisch wirksamen Nucleosid analoga in amphiphile Dinucleosidphosphatanaloga bedingt ein stark verändertes pharmakokinetisches Verhalten, wo durch die zu applizierende Dosis im Vergleich zum jeweili gen Monomer erhöht werden kann ohne daß es gleichzeitig zu einer Verstärkung aller toxischen Nebeneffekte dieser hoch potenten Medikamente führt.

Der amphilphile Charakter der erfindungsgemäßen Dinucleo sidphosphatanaloga ermöglicht unterschiedliche Applika tionsschemen. Die lipophile Nucleosidkomponente der Di nucleosidphosphatanaloga bewirkt, daß die Dimeren zusammen mit Matrixlipiden stabil in die Lipidmembran von Liposomen eingebaut werden. Die hydrophile Nucleosidkomponente ermög licht, daß die Dimeren vermutlich über eine Micellenbildung auch wasserlöslich sind. Die lipophile Nucleosidkomponente begünstigt die Zellaufnahme der in Wasser gelösten amphi philen Dinucleosidphosphatanaloga und schützt sie gleich zeitig vor einer zu schnellen enzymatischen Hydrolyse, so daß die gewünschte Depotwirkung der Dimeren nicht nur in einer Liposomendispersion sondern auch in wäßrigen Lösun gen erreicht wird. Die alternative Applikationsmöglichkeit der amphiphilen Dinucleosidphosphatanaloga hat den Vorteil, daß man nicht ausschließlich auf die Liposomentechnologie angewiesen ist, sie aber bei Bedarf nutzen kann, was wie derum bei nur wasserlöslichen Dinucleosidphosphaten nicht problemlos möglich ist.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen amphiphilen Di nucleosidphosphatanaloga liegt darin, daß sie zusammen mit einem oder mehreren anderen Wirkstoffen in unterschied lichen Mengen in Liposomen eingebaut werden können, wobei synergistische Wirkungen resultieren. Mit diesen amphiphi len Dinucleosidphosphatanaloga und/oder in Zusammensetzung mit einem biologisch verträglichen Träger und/oder mit Mit teln, die die erfindungsgemäßen Verbindungen mindestens in einer oder mehreren der Zusammensetzungen enthalten, kann die Therapie von Krebserkrankungen und virusbedingten Infektionskrankheiten optimiert werden.

Für eine möglichst wirksame Applikation der erfindungsge mäßen Verbindungen werden weiterhin Zusammensetzungen ver schiedener Art bereitgestellt. Allen diesen Zusammensetzun gen ist gemeinsam, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen in Verbindung mit einem organischen Träger stehen.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Zusammensetzung sieht die Assoziation der erfindungsgemäßen Verbindungen in Form von uni- bis oligolamellaren Liposomen mit einem Durchmes ser von maximal 0.4 µm vor. Die erfindungsgemäßen Verbin dungen werden dabei in die Lipiddoppelschicht der Liposomen integriert. Zur Liposomenbildung können alle an sich be kannten Verfahren der Liposomendarstellung verwendet werden wie beispielsweise Ultraschall, Gelchromatographie, Deter genzanalyse. Die jeweils eingeführten lipophilen Reste be einflussen maßgeblich die Größe und Stabilität der Liposo men, die sich aus den jeweiligen Dinucleosidphosphatanaloga zusammen mit weiteren Lipidkomponenten bilden.

Eine weitere Möglichkeit, die erfindungsgemäßen Verbindun gen mit einem organischen Träger zu verbinden, ist der Ein schluß der Verbindungen in ein biologisch verträgliches Na nopartikel. Als Nanopartikel werden organisch-chemische Po lymere bezeichnet, denen bei der Polymerisation die er findungsgemäßen Verbindungen zugesetzt werden, so daß sie mit einer gewissen Effizienz in das Nanopartikel einge schlossen werden.

Die Zusammensetzung wird in einer bevorzugten Ausführungs form mit Komponenten ausgeführt, die sich in den zu thera pierenden Zellen und/oder Organen spezifisch anreichern. Dabei kann beispielsweise die Zusammensetzung der Liposomen so gewählt werden, daß die Liposomen zusätzlich mit Molekü len wie z. B. Antikörper, geladene Lipide, mit hydrophilen Kopfgruppen modifizierte Lipide versehen werden, damit die Zusammensetzung sich bevorzugt in den zu therapierenden Zellen und/oder Organen anreichert. Eine solche Zusammen setzung mit spezifisch gegen Tumorzellen, virusinfizierten Zellen und/oder Organe gerichteten Molekülen erhöht die therapeutische Wirkung der Arzneimittel und reduziert gleichzeitig die Toxizität für nicht infiziertes Gewebe.

Die Zusammensetzungen können zu einem Mittel verarbeitet werden, das neben den erfindungsgemäßen Verbindungen und gegebenenfalls dem organischen Träger weiterhin übliche Träger- und/oder Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoffe enthält. Übliche Trägermittel sind beispielsweise Glucose, Dextrose, Albumine oder ähnliches, während als Verdünnungs mittel im wesentlichen physiologische Kochsalzlösungen oder eine 5%ige Glucoselösung dient. Weiterhin ist es üblich, die Lösungen mit geeigneten Reagenzien, beispielsweise Phosphaten, abzupuffern. Darüber hinaus können alle weite ren, für die Zubereitung von pharmazeutischen Mitteln üb lichen Mittel hinzugesetzt werden, vorausgesetzt, sie grei fen die Zusammensetzung aus dem organischen Träger und den erfindungsgemäßen Verbindungen nicht an. Das Mittel kann beispielsweise als Infusionslösung verabreicht werden.

Durch die Überführung in amphiphile Dinucleosidphosphat analoga lassen sich aber nicht nur die enzymatische Hydrolysebeständigkeit erhöhen und die Applikationsformen deutlich erweitern, sondern überraschenderweise auch zytostatische und virusstatische Wirkungen optimieren.

Die amphiphile Dinucleosidphosphatanaloga lassen sich gegen maligne Erkrankungen der blutbildenden Zellen und andere Tumore einsetzen.

Es ist zu erwarten, daß durch die verbesserte zytostatische Wirkung a) sehr viel weniger gravierende Nebenwirkungen auftreten, b) höhere Dosen der zytostatisch wirksamen er findungsgemäßen Verbindungen eingesetzt werden können und c) in zeitlichen Intervallen therapiert werden kann.

Überraschenderweise zeigen die erfindungsgemäßen Dinucleo sidphosphatanaloga auch virustatische Wirkungen, so daß sie in der Chemotherapie von virusbedingten Infektionen wie beispielweise der AIDS Erkrankung verwendbar sind.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Darstellung von 2′-Desoxythymidylyl-(3′-5′)-N⁴-palmitoyl- 2′,3′-didesoxycytidin a) Herstellung des Ausgangsmaterials

5.5 g (7.4 mmol) des Bariumsalzes von 5′-O-(4-Monometh oxy)triphenylmethyl-2′-desoxyribothymidin-3′-O-(2-chlorphe nyl)phosphat werden zusammen mit 2.2 g (4.9 mmol) N⁴-Palmi toyl-2′,3′-didesoxycytidin in ca. 15 ml wasserfreiem Pyri din gelöst. Unter Feuchtigkeitsausschluß werden der Lösung zunächst 2.0 g (6.4 mmol) 2,4,6-Triisopropylbenzolsulfon säurechlorid, wenige Minuten später 1.6 ml (19.7 mmol) N- Methylimidazol zugegeben. Anschließend wird das Reaktions gemisch unter Feuchtigkeitsausschluß 40 min. bei Raumtempe ratur geschüttelt und dann mit 5 ml Wasser versetzt. Die Lösung wird im Vakuum konzentriert, zweimal mit jeweils 50 ml Toluol abrotiert, in 50 ml Chloroform aufgenommen und an schließend an einer Kieselgelsäule mit einem fünfstufigen Chloroform/Methanol-Gradienten fraktioniert. Das Produkt wird ab der 4. Gradientenstufe eluiert. Nach Trocknung des isolierten Eluats erhält man 3.7 g 5′-O-(4-Monomethoxy)- triphenyl-2′-desoxythymidylyl(2-chlorphenyl)-(3′-5′)-N⁴- palmitoyl-2′,3′-didesoxycytidin als festen weißen Schaum.

b) Herstellung des Endprodukts

Der gemäß a) erhaltene Schaum wird zu einer Lösung von 3,0 g (10 mmol) Tetrabutylammoniumfluorid in 180 ml Tetra hydrofuran/Pyridin/Wasser; 8/1/1/; V/V/V gegeben und 45 min. bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird konzen triert, zweimal mit je 50 ml Toluol abrotiert und in 200 ml Ethylacetat aufgenommen. Es entsteht eine trübe Lösung, die jedoch keinen Niederschlag enthält. Diese wird mit 100 ml Wasser ausgeschüttelt. Aus der nun klaren organischen Phase fällt beim Ausschütteln mit gesättigter NaCl-Lösung das gewünschte Produkt als weißer, flockiger Niederschlag aus, der über eine Fritte abgetrennt wird. Der Vorgang wird wiederholt, bis kein Produkt mehr aus der Ethylacetatlösung ausfällt. Nach der Trocknung des Niederschlags am Ölpumpen vakuum erhält man 2.2 g 5′-O-(4-Monomethoxy)triphenyl methyl-2′-desoxythymidylyl-(3′-5′)-N⁴-palmitoyl-2′,3′- didesoxycytidin als weißes, kristallines Pulver.

Zum Austausch der 4-Monomethoxytriphenylmethylgruppe gegen Hydroxyl wird das Produkt mit 50 ml Essigsäure/Wasser; 8/2; V/V versetzt und ca. 20 min. unter gelegentlichem Durch schütteln bei 50°C belassen. Die Lösung wird zum Öl konzen triert, das in 20 ml Chloroform/Methanol; 8/2; V/V aufge nommen und an einer Kieselgelsäule mit einem dreistufigen Chloroform/Methanol-Gradienten fraktioniert wird. Das Pro dukt wird ab der dritten Gradientenstufe eluiert. Nach Trocknung des isolierten Eluats erhält man 1.3 g 2′-Desoxy thymidylyl-(3′-5′)-N⁴-palmitoyl-2′,3′-didesoxycytidin als weißes feinkristallines Pulver (Zers.< 210°C), das auf der Kieselgeldünnschichtplatte im Laufmittelsystem Chloro form/Methanol; 6/4; V/V einen R_f-Wert von 0.63 aufweist.

Beispiel 2 Darstellung von N⁴-Hexadecyl-2′-desoxycytidylyl-(3′-5′)- 2′,3′-didesoxycytidin a) Herstellung des Ausgangsmaterials

13.1 g (16.6 mmol) N⁴-Hexadecyl-5′-O-(4-monomethoxy)triphe nylmethyl-2′-desoxycytidin-3′-O-hydrogenphosphonat und 5 g (11.1 mmol) N⁴-Palmitoyl-2′,3′-didesoxycytidin werden in 30 ml wasserfreiem Pyridin mit 8 ml (64.5 mmol) Pivalin säurechlorid unter Feuchtigkeitsausschluß versetzt. Die Lösung wird bei Raumtemperatur 10 min. gerührt, zum Sirup einrotiert, der dann zweimal mit 50 ml Toluol zum Öl abrotiert wird.

b) Herstellung des Endprodukts

Das gemäß a) erhaltene Öl wird mit 100 ml einer 0.2 M Jod lösung (Tetrahydrofuran/Pyridin/Wasser; 18/1/; V/V/V) ver setzt und 40 min. bei Raumtemperatur belassen. Nach dieser Oxidation wird der Reaktionsansatz mit einem Gemisch aus 350 ml Chloroform und 350 ml 2%iger wäßriger NaHSO₃- Lösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wird zweimal mit 100 ml gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, im Vakuum bis auf 100 ml konzentriert, die dann an einer Kieselgelsäule in dreistufigem Chloroform/ Methanol-Gradienten fraktioniert werden. Das gewünschte Produkt wird ab der dritten Gradientenstufe eluiert. Das isolierte Eluat wird im Vacuum zum Sirup konzentriert.

Zum Austausch der 4-Monomethoxy)-triphenylmethylgruppe gegen Hydroxyl wird der Sirup mit 50 ml Essigsäure/Wasser; 4/1; V/V 12 h bei Raumtemperatur behandelt und anschließend an einer Kieselgelsäule gereinigt. Das hierbei isolierte Eluat wird wiederum zum Sirup konzentriert, in 50 ml Methanol, das mit Ammoniak gesättigt ist, aufgenommen und verschlos sen 12 h bei Raumtemperatur belasssen. Nach einer erneuten chromatographischen Reinigung an Kieselgel und Aufarbeitung des isolierten Eluats erhält man N⁴-Hexadecyl-2′-desoxy cytidylyl-(3′-5′)-2′,3′-didesoxycytidin als weißes feinkristallines Pulver, das sich oberhalb von 180°C zersetzt und im Laufmittelsystem Chloroform/Methanol; 7/3; V/V einen R_f-Wert von 0.39 aufweist.

Beispiel 3 Darstellung von N⁴-Hexadecyl-2′desoxycytidylyl-(3′-5′)-5- ethyl-2′-desoxyuridin a) Herstellung des Ausgangsmaterials

5.1 g (5.4 mmol) des Natriumsalzes von N⁴-Hexadecyl-5′-O- (4-monomethoxy)triphenylmethyl-2′-desoxycytidin-3′-O-(2- chlorphenyl)phosphat werden zusammen mit 1.4 g (5.4 mmol) 5-Ethyl-2′-desoxyuridin in Analogie zu Beispiel 1 konden siert. Das Kondensationsgemisch wird an einer Kieselgel säule mit Chloroform chromatographisch gereinigt.

b) Herstellung des Endprodukts

Der gemäß a) erhaltene Schaum wird 90 min. bei Raum temperatur mit 20 ml einer Lösung behandelt, die folgende Zusammensetzung aufweist. In 80 ml Chloroform/Methanol; 9/1; V/V werden 10 g Nitrobenzaldoxim und 5 ml Tetramethyl guanidin gelöst. Nach der Reaktion wird das Gemisch an einer Kieselgelsäule mit Chloroform/Methanol-Gradienten fraktioniert. Das isolierte Eluat wird im Vacuum zum Sirup konzentriert. Zum Austausch der 4-Monomethoxytriphenyl methylgruppe gegen Hydroxyl wird der Sirup mit 50 ml Essigsäure/Wasser; 4/1 12 h bei Raumtemperatur behandelt. Die Lösung wird am Rotationsverdampfer zum Sirup konzen triert, der in 5 ml Methanol aufgenommen wird. Durch Ein tropfen in 100 ml Ether fällt das gewünschte Produkt aus. Der Niederschlag wird abgenutscht, getrocknet, in 25 ml Chloroform aufgenommen und wiederum an einer Kieselgelsäule mit Chloroform/Methanol fraktioniert. Das hierbei isolierte Produkt wird in 5 ml Wasser aufgenommen und an einer Sephadex G-10 Säule mit Wasser chromatographiert. Das Produkt enthaltende Eluat wird lyophilisiert, wobei N⁴-Hexadecyl-2′-desoxycytidylyl-(3′-5′)-5-ethyl-2′- desoxyuridin erhalten wird, das im Laufmittelsystem chloroform/Methanol; 1/1; V/V einen Rf-Wert von 0.54 und einen Zersetzungspunkt < 169°C aufweist.

Beispiel 4

Die zytostatische Wirkung der neuen amphiphilen Dinucleo sidphosphatanaloga läßt sich in folgender Versuchsanordnung zeigen:

DBA/2-Mäusen werden L1210 Tumorzellen intravenös injiziert, wodurch eine Leukämie simuliert wird. Am Tag 3 und 7 nach der Tumorzell-Injektion werden den tumortragenden Tieren verschiedene Dosierungen der Testsubstanz oder Lösungsmit tel verabreicht. Insgesamt ergibt sich folgende Einteilung in die einzelnen Versuchsgruppen:

- Kontrollgruppe (Lösungsmittel)
- i.v. Applikation (2 Dosierungen)
- i.p Applikation (2 Dosierungen)
- i.v. AraC als Referenz (2 Dosierungen)
- i.p. AraC als Referenz (2 Dosierungen).

Als Parameter für den Therapieerfolg wird die mediane Über lebenszeit der einzelnen Versuchsgruppen (10 Tiere pro Gruppe) berechnet. In diesen Versuchen zeigen die neuen am phiphile Dinucleosidphosphatanaloga eine bessere Wirkung als beispielsweise das bekannte Zytostatikum araC.

Beispiel 5

Die virusstatische Wirkung der neuen amphiphilen Dinucleo sidphosphatanaloga läßt sich in folgender Versuchsanordnung zeigen:

Mäuse-Embryo-Zellkulturen werden mit Herpes simplex Viren (HSV-1 oder HSV-2) infiziert. Zu diesen Zellkulturen gibt man die amphiphilen Dinucleosidphosphatanaloga, die im Me dium in Konzentrationen von 500 µl/ml, 50 µl/ml und 5 µl/ml gelöst sind. Nach 3 Tagen Inkubationszeit zeigt sich an der Reduktion der Plaquezahl die virustatische Wirkung. Hierbei zeigen die neuen Verbindungen bessere Wirkungen als bei spielsweise das bekannte Virustatikum 5-Ethyl-2′-desoxy uridin.

Beispiel 6 Herstellung einer Zusammensetzung, enthaltend einen orga nischen Träger, eine der erfindungsgemäßen amphiphile Di nucleosidphosphatanaloga, Cholesterol und ein Antioxidans 1. Zusammensetzung der Liposomen Liposomen mit 10 mg der erfindungsgemäßen Verbindung pro ml

100 ml Liposomen enthalten: 4.0 g Phosphatidylcholin, 0.4 g Cholesterol, 0.02 g α-DL-Tocopherol, 1.0 g Dinucleosidphos phatanaloga dispergiert in 0.9% Kochsalzlösung, die, wenn nötig, zum Beispiel mit Phosphatpuffer auf einen gewünsch ten pH-Wert eingestellt ist. Anstelle der gegebenenfalls gepufferten Kochsalzlösung kann auch ein 67 mM physiolo gischer Phosphatpuffer oder eine 5%ige Glucoselösung ver wendet werden.

2. Herstellung Herstellung von 100 ml Liposomendispersion, die 10 mg der erfindungsgemäßen Verbindung pro ml enthalten

Die Lipide (4.0 g Phosphatidylcholin, 0.4 g Cholesterol, 0.02 g α-DL-Tocopherol und 1.0 g amphiphile Dinucleosid phosphatanaloga werden mit einer geeigneten Menge Methylen chlorid/Methanol; 1/1; V/V (100 bis 500 ml) in einem 500 ml Rundkolben gelöst. Die organischen Lösungsmittel werden bei 40°C in einem Rotationsverdampfer entfernt. Die entstan dene, lösungsmittelfreie Lipid/Wirkstoff Mischung wird durch Zugabe einer entsprechenden Menge von 0.9% Kochsalz lösung, die zum Beispiel mit 10 mM Phosphatpuffer abgepuf fert sein kann, in 100 ml solubilisiert. Anstelle der gege benenfalls gepufferten Kochsalzlösung kann auch ein 67 mM physiologischer Phosphatpuffer oder eine 5%ige Glucose lösung verwendet werden. Die entstehenden, sogenannten mul tilamellaren Liposomen können mit einem geeigneten Verfah ren, z . B. Ultrabeschallung, Hochdruckfiltration, Detergens dialyse, Mikroemulgation oder anderen geeigneten Methoden, weiterverarbeitet werden.

Beispiel 7 Darstellung der Liposomenpräparate durch Ultraschall

Für die Herstellung von Liposomendispersionen werden pro ml Chloroform/Methanol; 1/1; V/V jeweils 100 mg Soja-Phospha tidylcholin, 10 mg Cholesterol, 1 mg α-DL-Tocopherol, 7 mg N²-Palmitoyl-N⁶-succinoyl-L-lysin und 2 bis 12 mg der er findungsgemäßen amphiphilen Dinucleosidphosphatanaloga ge löst. 0.6 bis 2.4 ml dieser Lipidstammlösung werden in ei nem Reagenzglas durch Verblasen mit Luft in einen Lipidfilm überführt, der anschließend ca. 1 h bei 50°C im Vakuum ge trocknet wird. Der Lipidfilm wird mit 3 ml 10 mM PBS (0.9% NaCl und 10 mM NaH₂PO₄, pH 7.3) versetzt und mit Hilfe ei ner Mikrospitze eines Desintegrators 30 min. mit 40 Watt beschallt. Hierbei bildet sich eine opaleszente Liposomen dispersion.

Beispiel 8 Darstellung der Immunoliposomen

1.2 nmol eines Antikörpers werden als Lyophilisat mit 50 µl des Liposomenpräparats aus Beispiel 7 und 7 mg (27 µmol) N(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimid X HCL (EDC) versetzt und durch Zugabe von 30 µl PBS (pH 1) auf pH 4 eingestellt. Im einstündigen Abstand werden noch zweimal jeweils 7 mg EDC zugegeben. Nach ca. 5 h Rühren bei Raum temperatur wird der Reaktionsansatz auf eine Ultrogel ACA 22-Säule aufgetragen und mit PBS (pH 7.4) fraktioniert. Fraktionen deren Absorptionsverhältnisse mit den Werten des eingesetzten Liposomenpräparats übereinstimmen, werden ver einigt und zum Zelltargeting verwendet.

Claims

1. Amphiphile Dinucleosidphosphatanaloga der Formel I worin
R¹ eine Hydroxyl-, Amino-, acylierte oder alkylierte Ami nogruppe ist, deren Acyl- oder Alkylrest 1 bis 24 C-Atome und 0 bis 2 Doppelbindungen aufweist, linear oder verzweigt ist, bedeutet, und
R² Wasserstoff, Fluor, ein 2-Bromovinylrest oder ein C₁ bis C₂₄ linearer oder verzweigter Alkylrest, und
R³ und R⁴, die gleich oder verschieden sein können, Wasser stoff oder Hydroxyl, und
R⁵ ein Nucleosidderivat der Formel II, bedeutet, worin
R⁶ eine Hydroxyl-, Amino-, acylierte oder alkylierte Amino gruppe ist, deren Acyl- oder Alkylrest 1 bis 24 C-Atome und
0 bis 2 Doppelbindungen aufweist, linear oder verzweigt ist, bedeutet, aber
R⁶ ungleich R¹ gewählt wird, und
R⁷ Wasserstoff, Fluor, ein 2-Bromovinylrest oder ein C₁ bis C₂₄ linearer oder verzweigter Alkylrest ist, und genau ei ner der Reste
R⁸ bis R¹⁰, die gleich oder verschieden sein können, Sauer stoff, und die jeweils anderen Reste aus der Gruppe beste hend aus Wasserstoff oder Hydroxyl ausgewählt sind, bedeu ten.

2. Amphiphile Dinucleosidphosphatanaloga gemäß Anspruch 1, worin
R⁶ eine alkylierte Aminogruppe, deren Alkylrest Hexadecyl oder Oktadecyl, und
R⁷, R⁸ Wasserstoff bedeuten.

3. Amphiphile Dinucleosidphosphatanaloga gemäß Anspruch 2, worin
R¹ eine Aminogruppe,
R² Wasserstoff,
R³, R⁴, R⁹, R¹⁰ aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, Sauerstoff ausgewählt sind, und genau R⁹ oder R¹⁰ Sauerstoff bedeuten.

4. Amphiphile Dinucleosidphosphatanaloga gemäß der obigen Ansprüche, worin R³ und R⁴ Wasserstoff bedeuten.

5. Amphiphile Dinucleosidphosphatanaloga gemäß Anspruch 1 bis 3 worin R³ und R⁴ Hydroxyl bedeuten.

6. Amphiphile Dinucleosidphosphatanaloga gemäß Anspruch 2, worin
R¹, R⁴ Hydroxyl,
R² Ethyl oder Fluor
R³ Wasserstoff, und genau
R⁹ oder R¹⁰ Sauerstoff bedeuten.

7. Amphiphile Dinucleotidphosphatanaloga gemäß Anspruch 1, worin
R⁶ eine acylierte Aminogruppe, deren Acylrest Palmitoyl, Oleoyl oder Behenoyl, und
R¹, R⁴ Hydroxyl,
R² Ethyl oder Fluor,
R³, R⁷, R⁸ Wasserstoff, und genau
R⁹ oder R¹⁰ Sauerstoff bedeuten.

8. Amphiphile Dinucleosidphosphatanaloga gemäß Anspruch 1, worin
R⁶ eine Hydroxylgruppe,
R⁷ Methyl,
R², R⁸ Wasserstoff,
R³, R⁴, R⁹, R¹⁰ aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, Sauerstoff ausgewählt sind, und genau
R⁹ oder R¹⁰ Sauerstoff bedeuten.

9. Amphiphile Dinucleosidphosphatanaloga gemäß Anspruch 1 und 8, worin
R¹ eine acylierte Aminogruppe, deren Acylrest Palmitoyl, Oleoyl oder Behenoyl, und genau
R³ und R⁴ entweder Wasserstoff oder Hydroxyl bedeuten.

10. Amphiphile Dinucleosidphosphatanaloga gemäß Anspruch 1 und 8, worin
R¹ eine alkylierte Aminogruppe, deren Alkylrest Hexadecyl und Oktadecyl, und genau
R³ und R⁴ Hydroxyl bedeuten.

11. Amphiphile Dinucleosidphosphatanaloga gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Analoga in Form von Lipo somenpräparaten vorliegen.

12. Mittel gemäß einem der vorstehenden Ansprüche zur Be handlung von Infektionskrankheiten und/oder Krebserkrankun gen dadurch gekennzeichnet, daß es eine der Verbindungen gemäß einem der vorstehenden Ansprüche in einem üblich pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel, gegebenenfalls in Verbindung mit einem pharmazeutisch ver träglichen Formulierungsmittel oder in Liposomen eingebaut, enthält.

13. Verfahren zur Herstellung der amphiphilen Dinucleosid phosphatanaloga der Formel I gemäß Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß man aus den Verbindungen der Formel III worin R¹ bis R⁵ die angegebene Bedeutung hat, den chlorier ten Phenylrest abspaltet.

14. Verfahren zur Herstellung der amphiphilen Dinucleosid phosphatanaloga der Formel I gemäß Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß man Verbindungen der Formel IV worin R¹ bis R⁵ die angegebene Bedeutung hat, oxidiert.

15. Verwendung der amphiphilen Dinucleosidphosphatanaloga gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Behandlung von In fektionskrankheiten, insbesondere von virusbedingten Er krankungen.

16. Verwendung der amphiphilen Dinucleosidphosphatanaloga gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Behandlung von Krebserkrankungen.