DE4212912A1 - Verfahren zur Herstellung von Biosensoren - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Biosensoren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Biosensoren dienen zur Messung von chemischen Substan­ zen und sind in der chemischen Analytik und Prozeßkon­ trolle auf verschiedenen Gebieten wie der Biotechnolo­ gie, dem Umweltschutz, dem Gesundheitswesen und in der pharmazeutischen und chemischen Industrie einsetzbar.

Bei bekannten Biosensoren erfolgt die Immobilisierung von Biomolekülen auf oder vor chemischen Transduktoren üblicherweise durch Auflegen einer separaten Membran, beispielweise einer Enzymmembran. Es sind auch Biosen­ soren bekannt geworden, bei denen die Biomoleküle durch chemische Bindung an eine chemisch oder adhäsiv auf einem Sensor fixierte Trägerschicht gebunden sind. Auch ein physikalischer Einschluß in einer solche Träger­ schicht ist möglich.

Die Herstellung von Biosensoren nach den genannten Prinzipien ist aufwendig, da sie zumeist in viel­ stufigen naßchemischen Prozessen erfolgt. Häufig ist die Herstellung mit dem Umgang mit giftigen Stoffen verbunden und erfordert große Sicherheitsvorkehrungen. Insbesondere genügen diese Prozesse nicht den hohen Anforderungen an die Reinstraumtauglichkeit für die Herstellung von mikroelektronischen Schaltungen.

Aus der EP 134 041 A1 ist ein Verfahren bekannt, mit dem hydroxylgruppenhaltige Polymere auf Kohlehydrat­ basis aktiviert und nachfolgend Proteine immobilisiert werden können. Mit diesem Verfahren können auf bestimm­ ten chemischen Transduktoren technisch vorgefertigte Cellulose-, Sepharose- oder Sephadexfabrikate aktiviert werden. Allerdings erfolgt diese Aktivierung in der Lösung, so daß die Gefahr der Auflösung und des Auf­ quellens der Schicht besteht.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines Biosensors anzugeben, bei dem beliebige Transduktoren sowie zusätzliche Polymerklassen eingesetzt werden können, und das sich technologisch in die Herstellung von Sensorchips integrieren läßt.

Diese Aufgabe wird durch die im Anspruch 1 angegebenen Merkmale gelöst. Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Immobili­ sierung auf dünnen Polymerfilmen, die nicht in Lösung abgelöst oder unzuverlässig aufgequollen werden. Durch das Aufbringen der fest haftenden dünnen Schicht ge­ lingt die Einstellung geeigneter Diffusionsbedingungen für die zu detektierenden Molekülen zur aktiven Sen­ sorfläche. Gegenüber einer Aktivierung in Lösung er­ folgt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eine direkte Immobilisierung von aktiven Biokomponenten auf beliebi­ gen Sensoren in Serienfertigung.

Die Ansprüche 2 und 3 betreffen vorteilhafte Ausgestal­ tungen des Transduktors. Nach den in diesen Ansprüchen angegebenen Verfahren werden die Biosensoren nicht auf chemischen, sondern auf physikalischen Transduktoren aufgebaut. Dadurch kann ein beliebiger fester Träger eingesetzt werden. Als besonders vorteilhaft erweisen sich Dünnschicht-Platinelektroden, die mit den bekann­ ten Methoden der Siliziumtechnologie auf einem Chip aufgebracht werden. Diese Elektroden können unmittelbar zur elektrischen Kontaktierung verwendet werden. Die Haftung der Platinelektroden für Polymerschichten ist besonders gut.

Nach Anspruch 4 wird zur Erzeugung der Polymerschicht Polyurethan verwendet, das beispielsweise in Aceton gelöst sein kann. Damit wird eine neue Polymerklasse zur Herstellung von Biosensoren erschlossen, die bishe­ rigen Verfahren nicht zugänglich war.

Das Aufbringen dieser Polymere gemäß der Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß neben freien Hydroxyl­ gruppen eine hohe Klebekraft zur Haftung auf ebenen Sensoren und eine porige Struktur für adäquate Diffusi­ onsbedingungen für die zu detektierenden Moleküle, sowie eine grobe Polymeroberfläche gewährleistet sind.

Nach Anspruch 5 ist auch die Verwendung herkömmlicher technisch vorgefertigter Polymere möglich.

Ein besonders vorteilhaftes Verfahren ist im Anspruch 6 gekennzeichnet. Danach wird eine für die Herstellung des Biosensors besonders geeignete Verbindung verwen­ det. Durch den Kontakt mit dieser Verbindung werden die polymeren Hydroxylgruppen aktiviert.

Die Bindung der bioaktiven Moleküle an die aktivierte Polymerschicht erfolgt nach Anspruch 7 unmittelbar vor dem analytischen Einsatz. Dadurch wird das Verfahren vorteilhaft zweigeteilt. In einer ersten Stufe erfolgt die Herstellung des Biosensors bis zur Aktivierung der Polymerschicht. Der so aktivierte Sensor kann dann beispielsweise in eine wasserdampfundurchlässige Folie eingeschweißt werden. Dadurch wird es möglich, den Biosensor bis zum Einsatz beliebig lange aufzubewahren. Die Aufbewahrung kann auch in einer Exsikkation erfol­ gen. Erst kurz vor der Anwendung werden die bioaktiven Moleküle gebunden. Erst dann werden die Lagerstabilität und die Einsatzdauer vor der Stabilität der benutzten Biokomponente bestimmt.

Nach Anspruch 8 werden die bioaktiven Moleküle aus einer wäßrigen Lösung heraus an die Polymerschicht gebunden. Hierzu werden die aktivierten Sensoren ledig­ lich in eine wäßrige Lösung von aminogruppenhaltigen Biomolekülen wie z. B. Enzyme oder Immunoproteine ge­ taucht und beladen sich selbst durch kovalente Anbin­ dung der Proteinseitenketten oder sonstiger aminogrup­ penhaltiger Moleküle (z. B. Antigene u. a.).

In Anspruch 9 ist ein besonders einfach ausführbares Verfahren gekennzeichnet. Die Polymerschicht bildet sich bei der Lufttrocknung der Polyurethanlösung auf den Platinelektroden. Die Aktivierung erfolgt in einer trockenen Exsikkatoratmosphäre. Daß die Aktivierung von Hydroxylgruppen mit Carboxydiimiden durch einfaches Antrocknen von 5-Narbonen-2,3-dicarboximido-carbono­ chloridat (CLCOONB) ist ein besonders überraschender und nicht vorhersehbarer Effekt des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Nach Anspruch 10 werden gleichzeitig viele identische Biosensoren hergestellt. Dadurch wird eine besonders preisgünstige Massenproduktion ermöglicht.

Gemäß Anspruch 11 werden auf einem Silizium-Chip ein oder mehrere Biosensoren gemeinsam mit einer Auswerte­ schaltung integriert. Damit können sie von den Biosen­ soren abgenommenen Signale unmittelbar ausgewertet und beispielsweise mit an anderen Stellen gewonnenen Ergeb­ nissen verglichen werden. Mit diesem Verfahren ist ein Biosensor in Systemintegration herstellbar.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens bestehen insbesondere darin, daß es sich zur Massenproduktion von kurzfristig einsetzbaren elektrochemischen und optischen Chip-Biosensoren eignet. Das Verfahren ist weder auf besondere Transduktoren noch auf bestimmte Polymerklassen beschränkt. Es zeichnet sich durch be­ sondere Einfachheit aus. Durch die mögliche Zweiteilung des Verfahrens wird eine besonders hohe Lagerfähigkeit erzielt.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Ausführungs­ beispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnung exempla­ risch beschrieben, in der zeigt

Fig. 1a Aktivierung von hydroxylgruppenhaltigen Poly­ meren,

Fig. 1b Immobilisierung eines Proteins,

Fig. 2 Meßprotokoll der Bestimmung der Menge mit CLCOONB immobilisierter Glucoseoxidase,

Fig. 3 Antwort eines Chip-Biosensors auf 1 mmol/l Glucose.

Die chemischen Reaktionen zur Aktivierung von hydroxyl­ gruppenhaltigen Polymeren unter Zuhilfenahme von 5- Narbonen-2,3-dicarboximido-carbono-chloridat (Cl-CO- ONB) ist in Fig. 1a dargestellt (nach EP 0 134 041).

Die Fig. 1b zeigt die Immobilisierung eines H₂NR Ligan­ den (nach EP 0 134 041). Das bei dieser Immobilisierung entstehende N-Hydroxy-5-narbonen-2,3-dicarboximid (HONB) ist gut wasserlöslich und kann leicht entfernt werden.

Die angegebenen Reaktionen werden bei dem erfindungsge­ mäßen Verfahren zur Herstellung eines Biosensors einge­ setzt.

Auf einem 8 mal 8 mm groben Silizium-Chip mit einer oder mehreren Platinelektroden werden 20 µl einer Lö­ sung von 1% Polyurethan in Aceton auf die aktive Fläche getropft. Durch eine Lufttrocknung von zwei Stunden bildet sich ein dünner Polymerfilm aus. Anschließend werden auf dem Polymerfilm 30 µl einer 1%igen Lösung von 5-Narbonen-2,3-dicarboximido-carbono-chloridat in Dioxan getropft oder gesprüht und der Chip unmittelbar in eine trockene Exsikkatoratmosphäre überführt. Dort bleibt der Chip mindestens 5 Stunden. Dabei erfolgt die Aktivierung der Hydroxylgruppen des Polymers.

Nach der Aktivierung wird der Chip 12 Stunden in eine Lösung von 10 mg Glucoseoxidase in 0,1 mol/l Phosphat­ puffer gestellt.

Dabei wird Glucoseoxidase mit CLCOONB immobilisiert. Die Fig. 2 zeigt die Bestimmung der Menge mit CLCOONB immobilisierter Glucoseoxidase auf einem 7 mm² Silizi­ umchip mit einer Platin-Dünnfilmelektrode (Pt/Si-Elek­ trode) durch Messung der in 10 min. umgesetzten Menge Glucose (0,1 mol/l Glucose in 0,1 mol/l Acetatpuffer pH 5,5). Bei der Messung wird die Energiedifferenz E/µA durch die Umsetzung in Abhängigkeit von der Zeit be­ stimmt.

Nach Abspülen mit reiner Pufferlösung ist der Chip zur amperometrischen Messung von Glucose einsetzbar. Fig. 3 zeigt die Reaktion eines erfindungsgemäßen Chip-Biosen­ sors auf 1 mmol/l Glucose (60D an CLCOONB-aktiviertem Cellulose-2,5-acetat auf 7 mm² Pt/Si-Elektrode). Dabei wird in Abhängigkeit von der Zeit die Energiedifferenz pA/nA durch die Zugabe der Glucose gemessen.

Claims (11)

1. Verfahren zur Herstellung von Biosensoren, bei dem Biomoleküle auf einen Transduktor immobilisiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß auf einem Transduktor eine fest haftende Schicht aus organischen Polymeren erzeugt wird, daß die Polymerschicht mit einem, deren Hydroxyl­ funktionen aktivierenden bifunktionellen Reagenz in Kontakt gebracht wird, und daß an die aktivierte Poly­ merschicht bioaktive Moleküle gebunden werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Transduktor ein physi­ kalischer Transduktor verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Transduktor eine auf einem Silizium-Chip aufgebrachte Dünnschicht-Platin­ elektrode verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als organisches Polymer Polyurethan verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als organisches Polymer Cellulose, Sepharose oder Sephadex verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als bifunktionelles Reagenz eine Lösung von 5-Narbonen-2,3-dicarboximido-carbono­ chloridat in Dioxan verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die bioaktiven Moleküle unmittelbar vor dem analytischen Einsatz an die akti­ vierte Polymerschicht gebunden werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die bioaktiven Moleküle aus einer wäßrigen Lösung heraus an die aktivierte Poly­ merschicht gebunden werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß auf einem Siliziumchip eine Dünnschicht-Platinelektrode aufgebracht wird, daß auf die Elektrode eine Lösung von 1% Polyurethan in Aceton aufgetropft wird, daß nach etwa 2 Stunden Lufttrocknung auf den gebildeten Polymerfilm eine 1%ige Lösung von 5-Narbonen-2,3-dicarboximido-carbonchloridat aufge­ tropft oder aufgesprüht wird, daß der so behandelte Chip mehrere Stunden einer trockenen Exsikkatoratmos­ phäre ausgesetzt und anschließend mehrere Stunden in eine Lösung von Glucoseoxidase in Phosphatpuffer ge­ stellt wird, und schließlich mit reiner Pufferlösung abgespült wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß gleichzeitig viele Biosenso­ ren auf einem oder mehreren Wafern hergestellt werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß auf einem gemeinsamen Chip sowohl ein oder mehrere Biosensoren als auch eine elek­ tronische Auswerteschaltung hergestellt werden.