DE4130584A1

DE4130584A1 - Verfahren und testkit zur bestimmung der temperatur in multikuevetten mit thermochromen indikatorsystemen

Info

Publication number: DE4130584A1
Application number: DE19914130584
Authority: DE
Inventors: Klaus Dr Schilling; Anton Prof Horn; Eva Dr Hoffmann-Blume
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Current assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Priority date: 1991-09-13
Filing date: 1991-09-13
Publication date: 1993-03-25
Anticipated expiration: 2011-09-14
Also published as: DE4130584C2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und einen Testkit zur Bestimmung der Temperatur in Multiküvetten mit thermochromen Indikatorsystemen gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

In den letzten Jahren werden in zunehmenden Maße Multiküvetten für zahlreiche analytische Fragestellungen eingesetzt. Auch die temperierte kinetische Messung von Enzymaktivitäten gehört zu diesen Aufgabenstellungen. Hier ergeben sich allerdings Probleme bei der exakten Temperierung der Proben, die nach den Forderungen der Internationalen Gesellschaft für Klinische Chemie (IFCC) in engen Grenzen zu erfolgen hat, die eine diesbezügliche Verbreitung dieser Technik bisher eingeschränkt hat. Die Schwierigkeiten ergeben sich unter anderem auch aus der Notwendigkeit, daß die Temperatur in einer Vielzahl flüssiger Proben gleichzeitig überprüft werden muß. Die exakte Temperaturmessung mit herkömmlichen Thermistoren oder anderen Thermosonden in der Vielzahl der Einzelküvetten ist technisch sehr aufwendig und bei Probenvolumen im Ultramikroliterbereich aus praktischen Gründen nicht mehr möglich.

Um diese Schwierigkeiten zu umgehen, werden optische Thermometer eingesetzt. Sie nutzen die Temperaturabhängigkeit chemischer oder enzymatischer Reaktionen oder der spektralen Eigenschaften von Farbstoffen, oder sie basieren auf der temperaturabhängigen Änderung der Wasserstoffionenkonzentration von Puffersystemen, die ihrerseits durch einen pH-Indikator in unterschiedliche Farbintensitäten transformiert werden. Die Präzision einer Temperaturbestimmung mit solchen optischen Thermometern hängt entscheidend von der Größe der optischen Meßfehler ab. Dieser Sachverhalt gilt besonders für die Vertikalphotometrie von Multiküvettensystemen vom Typ der Mikrotiterplatten, die mit nach oben offenen Einzelküvetten arbeiten und für solche, bei denen durch die Verringerung des Lichtweges mit relativ großen Schichtdickenfehlern zu rechnen ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und einen Testkit zu schaffen, mit dem es gelingt, in Multiküvetten die Homogenität der Temperaturverteilung mit hoher Auflösung zu bestimmen und durch Einführung einer Referenzmessung Aussagen über den absoluten Wert der Temperatur zu machen. Darüber hinaus soll das Verfahren die simultane Verfolgung des Temperaturverlaufs in allen Einzelküvetten der Multiküvette erlauben.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst.

Die Bestimmung der Temperatur erfolgt mittels eines optischen Signals, welches durch Mehrwellenlängenphotometrie gewonnen und durch Quotientenbildung aus zumindestens zwei optischen Messungen bei zumindestens 2 Wellenlängen gebildet wird, die temperaturabhängige oder temperaturunabhängige Signale liefern, wobei zumindestens ein optisches Signal das temperaturabhängige Indikatorsignal EI darstellt und bei der Indikatorwellenlänge LI gemessen wird und zumindestens ein zweites Signal, welches bei einer Referenzwellenlänge LR gewonnen wird, das Referenzsignal ER darstellt. Die erhaltenen optischen Einzelsignale werden mit den Parametern eines temperaturabhängigen Signals, S = f(T), die unter vergleichbaren Bedingungen gewonnen wurden, verrechnet. Die zu messende Temperatur ist somit festgelegt.

Speziell für das thermochrome Indikatorsystem TRIS/Kresolrot läßt sich die Homogenität der Temperaturverteilung, die Einstellzeit der Solltemperatur und der absolute Wert der Temperatur vorteilhaft mit optimalen Präzisionen bestimmen, wenn die Extinktionen bei der stark temperaturabhängigen Indikator wellenlänge (550-580 nm) und bei der Referenzwellenlänge (400-550 nm) so eingestellt werden, daß sie im Bereich von 0,5-1,5 liegen und annähernd gleich groß sind.

Die Aufgabe der Erfindung wird durch einen Testkit erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß eine TRIS-Kresolrot-Lösung mit einer Deklaration für eine Solltemperatur und für ein Photometer versehen ist.

Die TRIS-Kresolrot-Mischung ist mit antibakteriell wirkenden Agentien, vorzugsweise Azid in der Konzentration von 0,02% bis 0,2%, versetzt. Die Tris-Kresolmischung ist in sterilisierte Einwegflaschen mit Volumina von 30 ml bis 100 ml steril eingefüllt und verpackt.

Die Deklarierung enthält den allgemeinen Algorithmus, die Parameter zur Temperaturermittlung für das entsprechende photometrische Gerät und die zu verwendeten Wellenlängen für die Ermittlung der Solltemperatur.

Die Erfindung wird durch Ausführungsbeispiele beschrieben. Es zeigen

Fig. 1 Temperaturabhängigkeit des Spektrums von Kresolrot in TRIS-Puffer (0,1 M, pH=7,5),

Fig. 2 Temperaturabhängigkeit des Spektrums von Kresolrot in einer Mischung aus 60, Phosphatpuffer (0,127 M) und 40%, HEPES-Puffer (0,065 M) bei pH=7.6,

Fig. 3 Tabellarische Übersicht der seriellen photometrischen Fehler (Sigma In S) und der korrespondierenden Fehler der Temperaturbestimmung (Sigma T) bei Ein- und Mehr wellenlängenmessungen mit zwei verschiedenen Arten von Multiküvetten,

Fig. 4 Dynamik der Temperaturverteilung in den 96 Kavitäten einer Mikrotiterplatte nach Erreichen der Solltemperatur von 37°C,

Fig. 5 Zeitverlauf der Temperatur in ausgewählten Kavitäten einer Mikrotiterplatte während des Aufwärmvorganges im temperierten Probenraum eines thermostatisierten Readers.

Ausführungsbeispiel 1

Verbesserung der Präzision der Temperaturmessung mit optischen Thermometern durch Reduktion des Fehlers der optischen Messung.

Wie Fig. 1 zeigt, hat das Spektrum eines TRIS/Kresolrot-Systems, welches als optisches Thermometer verwendet wird, bestimmte Wellenlängenbereiche, bei denen die gemessene Extinktion tem peraturabhängig ist, und andere Bereiche, bei denen keine oder nur eine geringfügige Abhängigkeit der Extinktion von der Tem peratur feststellbar ist. Wird nur die Extinktionsmessung bei einer temperaturabhängigen Wellenlänge als Signal für die Temperaturberechnung genutzt, so überträgt sich der optische Meßfehler vollständig auf die Temperaturbestimmung. Inhärente Komponenten des bei photometrischen Messungen beobachteten Fehlers sind Toleranzen der effektiven Schichtdicke der Küvetten und unterschiedliche Lichtdurchlässigkeiten von deren optischen Flächen. Dominierend werden solche Fehler beispielsweise bei Multiküvetten mit starker Verminderung der Schichtdicke (SUMAL- Multiküvette) oder bei der Vertikalphotometrie in Mikrotiterplatten.

In diesen Fällen bieten mehrwellenlängenphotometrische Messungen die Möglichkeit zur Gewinnung eines temperaturabhängigen Signals S, das von den genannten Fehlern bereinigt ist und eine deutliche Verbesserung der Präzision der Temperaturmessung erwarten läßt. Das wurde für die beiden genannten Multiküvettentypen nachgewiesen.

Um dabei den Einfluß unvermeidlicher Temperaturunterschiede auszuschalten, wird ein nahezu temperaturunabhängiges Puffer- Indikatorsystem eingesetzt.

Es besteht aus 1 bis 12 mg Kresolrot (in Abhängigkeit von der Schichtdicke bzw. dem Füllvolumen der Küvette), das in einer Mischung (pH = 7.6) aus 60 ml Phosphatpuffer (0,127 M) und 40 ml HEFES-Puffer (0,065 M) gelöst wird. Seine spektralen Eigenschaften sind mit Ausnahme der Temperaturabhängigkeit dem originären TRIS/Kresolrot System sehr ähnlich. (Vergleiche Fig. 1 und Fig. 2.

Mit diesem Puffersystem wird eine Temperaturmessung unter Nutzung mehrwellenlängenphotometrischer Auswertealgorithmen, S2=EI/ER und S3=(EI-EB)/(ER-EB), simuliert und die gefundenen optischen Fehler Sigma In S, unter Verwendung der unter vergleichbaren Bedingungen gefundenen Temperaturkoeffizienten in Temperaturfehler Sigma T, umgerechnet. Aus Fig. 3, die die Ergebnisse in tabellarischer Form zusammenfaßt, ist zu entnehmen, daß schon die Bildung des einfachen Quotienten S2 aus der Extinktion EI, gemessen bei der Indikatorwellenlänge LI, und der Extinktion ER, gemessen bei der Referenzwellenlänge LR, zu einer drastischen Verbesserung des optischen Signals und dadurch notwendig zu einer Verbesserung der Präzision der Temperaturmessung führt. Dieser Effekt ist besonders deutlich bei Multiküvetten vom Mikrotiterplattentyp. Die Einführung des Differenzenquotienten S3 führt unter den angegebenen experimentellen Bedingungen zu keiner weiteren Verbesserung der photometrischen Präzision.

Ausführungsbeispiel 2

Temperaturverteilung in einer Multiküvette vom Mikrotiterplattentyp.

Die Fig. 4 zeigt die Temperaturverteilung in den Einzelküvetten einer Mikrotiterplatte 10, 12 und 14 Minuten nach dem Start des Aufheizvorganges auf 37°C in einem temperierten Mikrotiterplattenphotometer. In die einzelnen Küvettenpositionen werden 250 µl einer Mischung, bestehend aus 0,1 M TRIS (pH=7,5) und 3 mg/100 ml Kresolrot, abgemessen und zu den angegebenen Zeiten in allen Positionen die Extinktion bei 570 und 450 nm ge messen. Als mehrwellenlängenphotometrisches Signal wird der Quotient S2 = E₅₇₀/E₄₅₀ verwendet, aus dem mit einem Tischrechner und geeigneter Software nach der Gleichung In S= -aT + b Temperaturen errechnet wird. Die Parameter der Kalibrierungskurve, a= -0,037 und b= 1,3, werden in separaten Experimenten mit dem gleichen Photometer unter Verwendung einer Temperatursonde YSI 45 Gin als Referenz gewonnen. In Fig. 4 sind die Abweichungen von der mittleren Temperatur aller Einzelküvetten in °C dargestellt. Noch nach 10 Minuten Inkubationszeit sind besonders in den Außenbezirken starke Temperaturabweichungen zu beobachten. Diese Unterschiede werden mit zunehmender Inkubationszeit geringer. Die am Ende des Versuches beobachtete gleichmäßige Temperierung der inneren Positionen der Multiküvette zeigt auch die geringe Streuung der mit der erfindungsgemäßen Methodik bestimmten Temperaturen an.

Ausführungsbeispiel 3

Temperatur-Zeitverlauf in einzelnen Positionen einer Mikrotiterplatte.

Die Fig. 5 zeigt einen Temperatur-Zeit-Verlauf, der in Analogie zur im Anwendungsbeispiel 2 beschrieben Methodik bestimmt wird. Es ist zu erkennen, daß es deutliche Unterschiede zwischen den Außenpositionen und den Innenpositionen, die beispielhaft darge stellt worden sind, nicht nur hinsichtlich des Endwertes der eingestellten Temperatur, sondern auch hinsichtlich der Ge schwindigkeit der Einstellung gibt.

Ausführungsbeispiel 4

Testkit zur Bestimmung der Homogenität der Temperierung von Multiküvetten.

Testkits werden jeweils für einen bestimmten Photometertyp und einen definierten Temperaturbereich angeboten. Im folgenden wird ein Kit beschrieben, der zur Messung von Temperaturen um 37°C in Mikrotiterplatten-Readern eingesetzt wird. Er besteht aus folgenden Komponenten:

- Behälter mit einer sterilen Lösung von 3mg Kresolrot in 100 ml THIS-Puffer (0,1 M, pH 7,5).
- Angaben zu den photometrischen Meßbedingungen
- Füllvolumen pro Kavität: 250 µl.
- Wellenlängenauswahl und Anzahl der Messungen:

1. Messung von EI bei 570 nm, 2. Messung von ER bei 450 nm,

- Schütteln: Vor der 1. Messung ist die Platte 10 sec mit hoher Intensität zu schütteln.
- Angaben zur Temperaturberechnung unter Verwendung des vom Hersteller angegebenen Temperaturkoeffizienten β, der Indikatorlösung.
- Für jede einzelne Küvettenposition i ist der natürliche Logarithmus des Quotienten aus der 1. und 2. Messung zu berechnen, In Si=In (EI/ER), anschließend werden diese Werte gemittelt und man erhält In Sm.
- Nach der Gleichung Delta Ti= (In Si-In Sm)/β, mit β= -0,037, erfolgt die Berechnung der Abweichung der Temperatur Ti der Einzelküvette i von der mittleren Temperatur der Multiküvette Tm.

Ausführungsbeispiel 5

Testkit zur Bestimmung der Temperaturen in den Einzelküvetten einer Multiküvette.

Zusätzlich zu den bereits im Ausführungsbeispiel 4 beschriebenen Komponenten enthält dieser Testkit:

- eine Multiküvette mit einem Temperaturmeßfühler, der sich in einer der Einzelküvetten in unmittelbarem Kontakt mit der Indikatorlösung, aber nicht innerhalb des Lichtweges befindet,
- einen Meßverstärker, der mit einem dünnen, flexiblen Kabel, das die Hantierung der Multiküvette nicht behindert, mit dem Meßfühler verbunden ist, so daß die aktuelle Temperatur der Indikatorlösung ständig digital anzeigt und auf Anforderung an den Auswerterechner weitergegeben wird,
- Angaben zur Temperaturberechnung unter Verwendung des vom Hersteller angegebenen Temperaturkoeffizienten β, der Indikatorlösung,
- Für jede einzelne Küvettenposition i ist der natürliche Logarithmus des Quotienten aus der 1. und 2. Messung zu berechnen, In Si=In (EI/ER). Dem für die Position f, des Meßfühlers gefundenen Wert Sf, wird die zum Zeitpunkt der optischen Messungen anliegende Meßfühlertemperatur Tf, zugeordnet,
- Nach der Gleichung Ti=Tf+(In Si-In Sf)/β, mit β= -0,037, er folgt die Berechnung der Temperatur Ti in der Einzelküvette i.

Liste der verwendeten Bezugszeichen:

S temperaturabhängiges Signal, ermittels aus optischen Meßwerten
Sm Mittlerer S-Wert einer Multiküvette
Si Signal, ermittelt für die Position i einer Multiküvette
Sf Signal, ermittelt für die Meßfühlerposition f einer Multiküvette
S1 temperaturabhängiges Signal, das durch einfache Extinktionsmessung erhalten wird
S2 temperaturabhängiges Signal, das durch Quotientenbildung zweier Extinktionswerte gebildet wird
S3 temperaturabhängiges Signal, das sich durch Bildung des Differenzquotienten aus drei Extinktionswerten ergibt
Sigma In S Fehler des temperaturabhängigen, aus optischen Messungen gewonnenen Signals S
T Temperatur
Tm Mittlere Temperatur einer Multiküvette
Ti Temperatur in der Position i einer Multiküvette
Tf Temperatur, die in der Position f mit einem unabhängigen, aus physikalischen Prinzipien basierenden Meßfühler ermittelt wird
Sigma T Fehler der Temperatur
β Temperaturkoeffizient der thermochromen Indikatorlösung
t Zeit
LI Indikatorwellenlänge
LR Referenzwellenlänge
LB Blindwertwellenlänge
EI Extinktion, gemessen bei LI
ER Extinktion, gemessen bei LR
EB Extinktion, gemessen bei LB
a, b Parameter der Geradengleichung y = bx + a

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Temperatur in Multiküvetten mit thermochromen Indikatorsystemen, dadurch gekennzeichnet, daß,
mindestens ein thermochromer Indikator, mit zumindest zwei Extrema im Spektralbereich eingesetzt wird,
wobei mindestens ein Extremum temperaturabhängig ist,
mindestens zwei optische Signale bei mindestens zwei verschiedenen Wellenlängen gemessen werden, wobei mindestens bei einer Wellenlänge eine Temperaturabhängigkeit gegeben ist und
die erhaltenen Einzelsignale zur Temperaturberechnung verwendet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Signale aus mindestens zwei optischen Messungen bei verschiedenen Wellenlängen durch Mehrwellenlängenphotometrie im Spektralbereich von 330 nm bis 800 nm gewonnen werden und durch Quotientenbildung ein Signal gebildet wird.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß
mindestens ein erstes optisches Signal das temperaturabhängige Indikatorsignal EI darstellt und bei der Indikatorwellenlänge LI gemessen wird und mindestens ein zweites optisches Signal, welches bei einer Referenzwellenlänge LR gewonnen wird, das Referenzsignal ER darstellt und
die erhaltenen optischen Einzelsignale mit den Parametern der Funktion S = f(T), die unter vergleichbaren Bedingungen gewonnen wurden, verrechnet werden und so die zu messende Temperatur bestimmt wird.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das thermochrome Indikatorsystem aus Tris-Puffer und Kresolrot besteht.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß in die einzelnen Küvettenplätze der Multiküvette eine Mischung aus TRIS-Puffer und Kresolrot im pH Bereich von 7,0 bis 8,5, bei einer TRIS-Konzentration im Bereich von 0,05 bis 0,5 Mol/L, einer Kresolrotkonzentration im Bereich von 0,05 bis 2 mMol/L, für eine Solltemperatur im Bereich von 10 bis 90°C bei effektiven Schichtdicken im Bereich von 0,5 bis 20 mm so abgemessen wird, daß die gemessenen Extinktionen, bestimmt bei der Indikatorwellenlänge und bei der Referenzwellenlänge nahezu gleich groß sind, und im Bereich von 0,5-1,5 liegen.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die bestimmte Temperatur in mindestens einer Einzelküvette mit einer unabhängigen physikalischen Temperaturmeßtechnik verglichen und geeicht wird und über diesen Eichwert alle übrigen Temperaturwerte der Einzelküvetten korrigiert werden.

7. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich bei einer temperaturunabhängigen Blindwertwellenlänge LB eine Blindwertmessung erfolgt, die sehr niedrige, von der Konzentration des Puffer-Indikatorsystems nahezu unabhängige Extinktionswerte EB liefert.

8. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß die Referenzwellenlänge LR im Bereich von 330 bis 550 nm liegt und die Indikatorwellenlänge LI im Bereich von 550 nm bis 580 nm liegt.

9. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Signal S aus EI/ER gebildet wird.

10. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Signal S aus (EI-ED)/(ER-EB) gebildet wird, wobei die Referenzwellenlänge LR im Bereich von 330 bis 550 nm liegt, die Indikatorwellenlänge LI im Bereich von 550 bis 580 nm liegt und EB bei LB im Wellenlängenbereich oberhalb 620 nm, vorzugsweise bei 680 nm, bestimmt wird.

11. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperaturfunktion der natürliche Logarithmus des Mehrwellenlängensignals S ist und die Parameter der Funktion im Bereich der Solltemperatur nahezu konstant sind.

12. Verfahren nach den Ansprüchen 1-9 dadurch gekennzeichnet, daß zur Temperaturberechnung, graphischen Anzeige und zur Dokumentation Software verwendet wird, die auf gängigen Rechnern eingesetzt wird.

13. Testkit zur Bestimmung der Temperatur in Multiküvetten mit thermochromen Indikatorsystemen, gekennzeichnet durch eine TRIS-Kresolrot-Lösung mit einer Deklarierung für eine Solltemperatur und für ein Photometer versehen ist.

14. Testkit nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die TRIS-Kresolrot-Lösung mit antibakteriell wirkenden Agentien, vorzugsweise Azid in der Konzentration von 0,02, bis 0,2% versetzt ist.

15. Testkit nach den Ansprüchen 13 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Tris-Kresolrot-Lösung in sterilisierte Einwegflaschen mit Volumina von 30 ml bis 100 ml steril eingefüllt und verpackt ist.

16. Testkit nach den Ansprüchen 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Deklarierung den allgemeinen Algorithmus, die Parameter zur Temperaturermittlung für das entsprechende photometrische Gerät und die zu verwendeten Wellenlängen für die Ermittlung Solltemperatur enthält.