DE4041570A1

DE4041570A1 - Protein-polyalkylenglykolderivate, ihre herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE4041570A1
Application number: DE19904041570
Authority: DE
Inventors: Karl-Hermann Dr Strube; Juergen Dr Schweden; Verena Dr Baldinger; Margarete Dr Schwarz
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1990-12-22
Filing date: 1990-12-22
Publication date: 1992-06-25

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Protein-Polyalkylenglykolderivate, deren Herstellung und Verwendung zur Prophylaxe und Therapie von Krankheiten des Gerinnungssystems.

Ancrod ist ein Fibrinogen-spaltendes Enzym, welches aus dem Gift der malaiischen Grubenotter (Agkistrodon rhodostoma) gewonnen werden kann und antikoagulatorische Eigenschaften besitzt (Biochem, J. 131, 799, 1973).

Ancrod besitzt ein Molekulargewicht von etwa 38 000 Dalton und einen Kohlenhydratanteil von etwa 38%.

Aus der malaiischen Grubenotter isoliertes Ancrod hat die folgende Amino säure-Sequenz, wobei an den Asparaginresten Asn₂₃, Asn₇₉, Asn₉₉, Asn₁₄₈ und Asn₂₂₉ Oligosaccharid-Seitenketten kovalent verknüpft vorliegen (Pfeiffer et al., 15. Carbohydrate Symposium Yokohama, Japan, 1990).

1 VIGGDECNIN EHRFLVAVYE GTNWEFICGG VLIHPEWVIT AEHCARRRMN
51 LVFGMHRKSE KFDDEQERYP KKRYFIRCNK TRTSWDEDIM LIRLNKPVNN
101 SEHIAPLSLP SNPPIVGSDC RVMGWGSINR RIHVLSDEPR CANINLHNFT
151 MCHGLFRKMP KKGRVLCAGD LRGRRDSCNS DSGGPLICNE ELHGIVARGP
201 NPCAQPNKPA LYTSVYDYRD WVNNVIAGNA TCSP,

Ancrod kann auch leicht gentechnologisch hergestellt werden. Die Vor gehensweise dazu ist z. B. in WO 90/06 362 ausführlich beschrieben. Bei einer Expression in Säugerzellen, Insektenzellen oder Pilzen sind Kohlen hydratstrukturen an den genannten Asparaginresten vorhanden. Bei einer rekombinanten Herstellung in prokaryontischen Zellen wie E. coli dagegen wird Ancrod nicht glykosyliert.

Protein-Polyalkylenglykolderivate der Formel I

[A-(CH₂)_n-(O-(CH₂)_q)_m-B-)]_pX (I)

worin

A einen der Reste -OH, -NH₂, -NH-CO-R, -O-R oder -O-CO-R (mit R in der Bedeutung einer C₁-C₄-Alkylgruppe
n die Zahl 2, 3 oder 4
m eine Zahl von 30 bis 500
q die Zahl 2, 3 oder 4
B eine direkte kovalente Bindung oder ein Linker,
p die Zahl 1-10 bedeuten und
X ein über NH₂-Gruppen an den (die) A-(CH₂)_n-(O-(CH₂)_q)_m Rest(e) gebundenes Polypeptid mit Ancrod-Wirkung darstellt.

In der Formel I kann X Ancrod sein, welches die oben ausgeführte Formel besitzt.

X kann auch ein Ancrod sein, in dem 1-105 Aminosäuren ausgetauscht sind, ohne daß die Wirkung des Ancrod verlorengegangen ist.

Weiter kommen für X Polypeptide mit der gleichen enzymatischen Wirkung wie Ancrod in Frage. Ein solches Polypeptid ist beispielsweise das Batroxcobin.

Der Rest A-(CH₂)_n-(O-(CH₂)_q)_m-B- ist vorzugsweise ein Polyethylenglykolrest (PEG), insbesondere mit dem Molekulargewicht von 1500 bis 15 000 Dalton.

Zur Herstellung der erfindungsgemäß beschriebenen Protein-Konjugate können die in WO 90/06 362 beschriebenen teilglykosylierten oder nicht glykosylierten Proteine, die durch gezielte Mutagenese der potentiellen Glykosy lierungsstellen im Ancrod-Protein enthalten werden können, Verwendung finden.

Darüber hinaus kommen zur Kopplung an Polymere auch solche Proteine in Frage, die eine dem Ancrod vergleichbare Wirkung besitzen und/oder mit Ancrod auf der Aminosäureebene eine mindestens 55%ige Homologie aufweisen.

Die Anwendungsdauer der bisher in der Therapie von thrombotischen Zu ständen eingesetzten Fibrinogen-spaltenden Enzyme ist aufgrund ihrer hohen Immunogenität stark eingeschränkt. Unter Therapie kommt es binnen 6-8 Wochen zur Resistenzentwicklung, vermutlich aufgrund der Bildung Ancrod-neutralisierender Antikörper. Die Anwendung der bisher beschriebenen Fibrinogen-senkenden Enzyme ist demnach auf die Akut-Therapie beschränkt.

Es ist bekannt, daß die Immunogenität von Proteinen durch die Konjugation mit Makromolekülen herabgesetzt werden kann (V. P. Torchilin, Adw. Drug Delivery Reviews 1, 41-86 (1987); Wilemann et al., J. Pharm. Pharmacol. 38, No. 4, 264-271 (1986)). Oftmals wird mit einer solchen Derivatisierung mit z. B. Polyethylenglykol eine signifikante Verschlechterung der enzymatischen Aktivität beobachtet, was die Anwendbarkeit der modifizierten Proteine stark einschränkt.

Durch die gleichzeitig zu beobachtende längere Halbwertzeit der Konjugate wird dieser Nachteil zum Teil jedoch ausgeglichen.

So haben die erfindungsgemäß beanspruchten Protein-Konjugate eine ver längerte Halbwertzeit und weisen eine geringere Immunogenität auf. Obwohl durch die Kopplung der Polymere an die Proteine ein Aktivitätsverlust zu verzeichnen ist, ist die Wirksamkeit der Protein-Konjugate durch die längere Halbwertzeit stark verbessert. Protein-Konjugate können daher in niedrigeren Dosierungen angewendet werden. Die verringerte Immunogenität der Protein-Konjugate eröffnet neue Anwendungsmöglichkeiten über die Akut-Therapie hinaus.

Die neuen Protein-Polyalkylenglykolkonjugate sind also dem bisher ange wendeten Ancrod in bezug auf Halbwertzeit, Wirksamkeit, Immunogenität, therapeutischer Anwendung und Stabilität wesentlich überlegen.

Es ist bereits bekannt, daß die Halbwertzeit von Proteinen durch die Kopplung von PEG verlängert werden kann (Torchilin et al, Adv. Drug Delivery Reviews 1, 41-86 (1987). Dabei wird eine Abhängigkeit zwischen höherem PEG-Anteil und länger werdender Halbwertzeit beobachtet (Veronese et al, Applied Biochemistry and Biotechnologie Vol. 11, S. 141-152, 1985).

Aus der längeren Halbwertzeit resultiert eine bessere biologische Wirksamkeit, da die Protein-Konjugate sich in der Zirkulation länger aufhalten. Eine Folge davon ist, daß die Substanzen in einer niedrigeren Dosierung eingesetzt werden können.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß bei den Polyalkylen-Ancrod- Konjugaten die Abhängigkeit nicht besteht, daß es vielmehr ein optimales PEG/Ancrod-Verhältnis gibt, das bei 2-6 PEG-Molekülen/Protein-Molekül liegt. Eine Modifizierung des Ancrods über dieses Maß hinaus führt trotz Verlängerung der Halbwertzeit nicht mehr zu einer verbesserten Wirksamkeit der Substanz. So zeigten Versuche mit verschieden stark PEG-modifizierten Ancrod-Molekülen, daß mit dem Protein, welches mit 2-6 PEG- Molekülen (PEG_I-Protein) konjugiert ist, eine bessere Wirksamkeit beobachtet wird als mit dem Protein, das mit 7-10 PEG-Molekülen (PEG_II-Ancrod) konjugiert ist.

Neben dem überraschenden Befund der nichtproportionalen Abhängigkeit zwischen PEG-Modifikation und Wirksamkeit weisen die PEG-Protein-Konjugate weitere interessante Eigenschaften auf. So ist bekannt, daß Ancrod gegen über Denaturierung durch Einfrieren sehr empfindlich ist, was sich darin äußert, daß Ancrod-Lösungen beim Einfrieren sehr schnell an enzymatischer Aktivität verlieren. Aus diesem Grund wird Ancrod nur in wäßriger Lösung und bei höchstens 4°C aufbewahrt und als Injektionslösung vertrieben. Diese Aufbewahrungsmethode ist aufwendig, die Herstellung eines leichter zu handhabenden Lyophilisats aber aus den genannten Stabilitätsgründen nicht möglich. Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die Konjugation mit PEG die Stabilität von Ancrod gegenüber Denaturierung durch Einfrieren erhöht, was die Herstellung eines Lyophilisats möglich macht. So wird selbst nach mehrmaligem Auftauen und Einfrieren beim PEG-Ancrod ein deut lich geringerer Aktivitätsverlust beobachtet. Im Gegensatz dazu nimmt die Aktivität des Schlangenenzyms kontinuierlich ab. Die erfindungsgemäß be schriebenen Protein-Konjugate weisen demnach Eigenschaften auf, die sie für eine breite Anwendung in der Therapie und Prophylaxe thromboembolitischer Erkrankungen interessant erscheinen lassen.

Eine Konjugation von Proteinen mit Makromolekülen wird häufig über die Reaktion der Carboxylgruppen der Aminosäuren Asparaginsäure oder Glutaminsäure, über die Reaktion der Sulfhydrylgruppe der Aminosäure Cystein oder durch Umsetzung der Seitenketten-Aminogruppe der Aminosäure Lysin des ent sprechenden Proteins erreicht.

Das Protein enthält mehrere Asparaginsäure-, Glutaminsäure- und Lysinreste.

Darüber hinaus wäre eine Kopplung über den C-Terminus oder den N-Terminus des Moleküls denkbar.

Aufgrund der leichteren Durchführbarkeit ist jedoch die Kopplung an Lysin- Reste bevorzugt.

Als Linker B in der Formel I kommen folgende Gruppen in Betracht:

-X-CO-; -X-CO-NH-W-NH-CO-; -X-CO-CH₂-CH₂-CO-; -X-CH₂-CO- oder

mit

X in der Bedeutung von -S-, -O-, -NH- und
W in der Bedeutung einer C₂-C₆-Alkylengruppe oder einer p-Phenylengruppe und
Y in der Bedeutung von -Cl, -OH oder H.

Die neuen Proteinpolyalkylenglykolderivate lassen sich herstellen, indem man das natürliche oder rekombinante Ancrod, die in WO 90/06 362 beschriebenen Muteine, Polypeptide, die in mehr als 55% der Aminosäuren mit der Formel II identisch sind, oder Proteine mit gleicher Wirkung wie Ancrod umsetzt mit Polyalkylenglykolderivaten der Formel III

(A-(CH₂)_n-(O-(CH₂)_q)_m-E (III)

worin

A, m und n die bereits angegebene Bedeutung besitzen und
E einen der Reste -X-CO-Z, -X-CO-NH-W-N=C=O, -X-CO-CH₂-CH₂-CO-Z, -X-CH₂-CO-Z,

oder -O-SO₂-R
(mit X, W und Y in der angegebenen Bedeutung und
Z in der Bedeutung von

Q in der Bedeutung von 1-3 Halogenatomen oder 1-2 Nitrofunktionen oder einer Acetyl-Gruppe und
R in der Bedeutung von Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, Phenyl, Tolyl oder Tresyl)
darstellt.

Die Umsetzung von III mit natürlichem oder rekombinantem Ancrod oder mit den in WO 90/06 362 genannten Muteinen von Ancrod, oder mit Polypeptiden, die in mehr als 55% der Aminosäuren mit der Formel II identisch sind sowie mit fibrinogen-spaltenden Enzymen geschieht wie folgt:

Das aktivierte Polyalkylenglykol der Formel III wird in stöchiometrischen Mengen oder mit einem Überschuß in einem geeigneten Puffer (pH 6-10), in Wasser, gegebenenfalls unter Zusatz einer Hilfsbase wie Natrium- oder Kalium-carbonat oder -hydrogencarbonat, Alkalihydroxid, Triethylamin bei Temperaturen zwischen 4 und 40°C, mit Schlangen-Ancrod, rekombinantem Ancrod, den in WO 90/06 362 beschriebenen Muteinen von Ancrod, Polypeptiden, die in mehr als 55% der Aminosäuren mit der Formel II identisch sind, zur Reaktion gebracht. Die entstandenen Kunjugate werden in der Proteinchemie mit üblichen chromatographischen Methoden isoliert, gereinigt und charakterisiert.

Die erfindungsgemäß beschriebenen Polyalkylen-Ancrod-Konjugate weisen wertvolle pharmakologische Eigenschaften auf. Sie besitzen nicht nur die günstigen Eigenschaften des Ancrods, sondern weisen darüber hinaus eine deutlich verlängerte biologische Wirksamkeit und eine geringere Immuno genität auf. Darüber hinaus sind sie gegenüber Kältedenaturierung stabi ler, was zu dem Vorteil der Herstellung eines Lyophilisats führt. Aufgrund dieser Eigenschaften sind die beschriebenen Polyalkylen-Konjugate gegenüber den bisher verwendeten Schlangen-Ancrod bei der Behandlung und Pro phylaxe von arteriellen oder venösen thrombotischen Zuständen überlegen.

Gegenstand der Erfindung sind auch Arzneimittel, die die erfindungsgemäß hergestellte Protein-Konjugate enthalten, gegebenenfalls in einem pharma zeutisch verträglichen Träger oder Bindemittel. Die Arzneimittel können auch Kombinationen der erfindungsgemäß hergestellten Protein-Konjugate mit anderen pharmakologisch wirksamen Therapeutika enthalten, wie z. B. mit Thrombolytika (tPA, Streptokinase), Hirudin oder Thromboxanrezeptor-Anta gonisten.

Die erfindungsgemäßen Polyalkylenglykol-Ancrod-Konjugate eignen sich zur Behandlung von Glomerulonephritis, Herzinfarkt, non-ischämischem Schlag anfall, peripheren arteriellen Durchblutungsstörungen (insbesondere Atherosclerosis obliterans, Thrombangitis obliterans, diabetische Mikroangiopathie und Morbus Raynaud), instabiler Angina pectoris, tiefer Venenthrombose und anderen Thrombosen, Rethrombosierung nach throm bolytischer Therapie, Rethrombosierung nach gefäßchirurgischen Eingriffen wie bei der Implantation arterieller oder venöser Gefäßplastiken sowie zur Vermeidung von Thrombosen im extrakorporalen Kreislauf und in der Throm bose-Prophylaxe. Die hier beschriebenen Polymerkonjugate führen nicht zu der üblicherweise nach Applikation der nicht konjugierten Proteine beobachteten immunologischen Reaktion und können aufgrund einer wesentlich verlängerten Wirkung in niedrigerer Dosierung als die nicht konjugierten Proteine eingesetzt werden. Darüber hinaus kann durch die Konjugation das Medikament in lyophilisierter Form bereitgestellt werden.

Das Protein-Polymer-Konjugat wird in Form einer physiologisch verträglichen Lösung verwendet. Das Protein-Polymer-Konjugat wird im allgemeinen subkutan injiziert. Die Behandlung kann stationär oder, falls die regel mäßige, zur Überwachung der Therapie erforderliche Kontrolle der Fibrinogenkonzentrate sichergestellt ist, auch ambulant durchgeführt werden.

Die intravenöse Gabe von Protein-Polymer-Konjugat ist möglich, sollte jedoch nur in Ausnahmefällen und unter stationärer Beobachtung erfolgen.

Die neuen Protein-Polymer-Konjugate sind grundsätzlich individuell zu dosieren. Maßgebend ist das Verhalten der Fibrinogenkonzentration im Plasma. Diese ist langsam auf 70-100 mg/100ml Plasma zu senken. Während der gesamten Behandlungszeit ist die Fibrinogenkonzentration auf Werte innerhalb dieses Bereiches einzustellen.

Unter diesen Bedingungen sind u. a. die Fließeigenschaften des Blutes ausreichend verbessert, die PAI-1- und PGI₂-Serumkonzentration erniedrigt und die Konzentration von tPA im Serum erhöht.

Beispiel 1 Darstellung von rekombinantem Ancrod aus C127-Zellkulturüberständen

Rekombinantes Ancrod wurde aus Überständen stabil transfizierter C127 Zellen mit den in der Proteinchemie etablierten Methoden aufgereinigt. Dazu kommen ein Anionenaustauscher, eine Metallchelatsäule und 2 Affinitätschromatographien an Arginin- und Heparin-Sepharose® zum Einsatz. Die Chromatographie-Säulen werden in der angegebenen Reihenfolge eingesetzt und führen zu einem rekombinanten Protein dessen spezifische Aktivität identisch ist mit der des Schlangenenzyms.

Beispiel 2 pH-Abhängigkeit der Kopplung von Methoxypolyethylenglykol-Nitrophenyl-Car bonat (MW 5000) an Ancrod

Ancrod wurde mit Methoxypolyethylenglykol-Nitrophenyl-Carbonat (MW 5000) in 20 mM TRIS-Puffer verschiedener pH-Werte umgesetzt. Dazu wurden zu 300 µl Ancrod (3,35 mg/ml in H₂O) 100 µl Methoxypolyethylenglykol-Nitro phenyl-Carbonat (MW 5000, 50 mg/ml) gegeben und die Lösung auf 1500 µl mit TRIS-Puffer der pH-Werte 7,5; 8,0; 8,3; 9,0 und 9,5 aufgefüllt. Dieser Ansatz wurde dann für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Beendigung der Inkubation wurden die erhaltenen Proben auf SDS-Gelen aufgetrennt und der Umsatz von Ancrod mit Methoxypolyethylenglykol-Nitrophenyl-Carbonat (MW 5000) densitometrisch bestimmt. Folgende Umsätze wurden gemessen.

Der Versuch zeigt, daß eine optimale Umsetzung des eingesetzten Ancrods bei pH-Werten größer als 8,3 erfolgt. Unterhalb 8,3 ist dagegen nur eine schlechte Umsetzung zu beobachten, die bei weiterem Absenken des pH-Wertes auf 7,0 gegen 0 geht.

Beispiel 3 Einfluß des Methoxypolyethylenglykol-Nitrophenyl-Carbonat-Überschusses (MW 5000) auf die Kopplung an Ancrod

Methoxypolyethylenglykol-Nitrophenyl-Carbonat (MW 5000) wurde in 20 mM Tris/HCl pH 8,3 in unterschiedlichem molaren Überschuß (20 : 1-1000 : 1) mit Ancrod bei Raumtemperatur 2 Stunden umgesetzt. Nach Beendigung der Umsetzung wurden die Proben auf SDS-Gelen analysiert und die erhaltenen PEG-Ancrod-Konjugate densitometrisch bestimmt. Es zeigte sich, daß unter den angewandten Bedingungen bei einem molaren Überschuß von 100 : 1 an Methoxypolyethylenglykol-Nitrophenyl-Carbonat (MW 5000) ca. 75% des eingesetzten Ancrod umgesetzt worden waren.

Beispiel 4 Einfluß der Inkubationszeit auf die Kopplung von Methoxypolyethylenglykol- Nitrophenyl-Carbonat (MW 5000) an Ancrod

Methoxypolyethylenglykol-Nitrophenyl-Carbonat (MW 5000) wurde mit einem molaren Überschuß von 50 : 1 in 50 mM Boratpuffer, 0,15 M NaCl pH 9,0 bei 37°C unter Variation der Inkubationszeit mit Ancrod umgesetzt. Die Ansätze wurden 2, 3, 4 und 6 Stunden bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Nach Beendigung der Inkubation wurden die Ansätze auf SDS-Gelen analysiert und der Umsatz densitometrisch bestimmt.

Nach zwei Stunden Inkubation bei 37°C waren bereits 80% des Ausgangs materials mit PEG konjugiert.

Beispiel 5 Darstellung von PEG-Ancrod mit unterschiedlichem Konjugationsgrad

Methoxypolyethylenglykol-Nitrophenyl-Carbonat (MW 5000) wurde mit Ancrod in einem molaren Verhältnis von 50 : 1 in 50 mM Borat-Puffer, 150 mM NaCl pH 9,0 bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Inkubationszeit wurde dabei, um unterschiedlich stark konjugierte Ancrod-Derivate zu erhalten, zwischen 2 und 5 Stunden variiert. Die Reaktion des aktivierten Polyethylenglykols mit dem Ancrod wurde durch Zugabe von 1 M Tris-Lösung gestoppt und die Ansätze anschließend auf einer Sephadex® G-75-Gelfiltrationssäule (Pharmacia, Schweden) aufgetrennt. Die Gelfiltrationssäule diente dabei einerseits zur Abtrennung des bei der Reaktion entstehenden Nitrophenols und des nicht umgesetzten Methoxypolyethylenglykol-Nitrophenyl-Carbonats und andererseits zur Fraktionierung der PEG-Ancrod-Konjugate. Aus dem 2 Stunden Inkubationsansatz wurde als Hauptspezies ein PEG-Ancrod-Konjugat mit MW 60-80 kDa (PEG_I-Ancrod) und aus dem 5 Stunden Inkubationsansatz ein PEG-Ancrod-Konjugat mit MW<80-100 kDa (PEG_II-Ancrod) isoliert. Nach Entfernung eventuell vorhandener Endotoxine durch Detoxi-Gel® (Piece, USA) waren die PEG-Ancrod-Konjugate für Tierversuche geeignet.

Beispiel 6

PEG_I-Ancrod, 60-80 kDa und PEG_II-Ancrod, 80-110 kDa wurden pharmakologisch untersucht. Die Wirksamkeit der beiden Enzyme im Vergleich mit Handels-Ancrod wurde am Kaninchen geprüft. Die Wirksamkeit wurden mit jeweils 1 U/kg i. v. als Bolus injiziert und der Verlauf der Fibrinogen spiegel über 8 Stunden verfolgt (s. Fig.).

Auffallend ist, daß PEG-Ancrod - speziell PEG-Ancrod mit MG von 60-80 kDa - in vivo einen schnelleren und länger anhaltenden Fibrinogenabfall bewirkt als Ancrod.

Beispiel 7 Darstellung des Methoxy-polyethylenglykol(8000)-N-succinimido-carbonats a) N-Succinimido-chloroformiat

In eine Lösung von ca. 30 g Phosgen in 200 ml Dichlormethan wurden bei 0°C innerhalb von 30 Minuten 21,0 g N-Hydroxysuccinimid-Kaliumsalz einge tragen und das Gemisch 2 h bei 0°C gerührt. Anschließend wurde für 1 h Stickstoff durch die Suspension geleitet, um überschüssiges Phosgen abzu blasen (Waschturm!). Die Suspension wurde filtriert und das Filtrat im Vacuum zur Trockene eingeengt. Die 10,6 g N-Succinimido-chloroformiat lagen als gelbliches Öl vor und waren mit anorganischen Salze und Di succinimido-carbonat verunreinigt. Das Rohprodukt konnte ohne weitere Reinigung für die Umsetzung mit Polyalkylenglykolen eingesetzt werden, oder durch Lösen in 150 ml Diethylether, Filtration und erneutes Einengen von anorganischen Salze befreit werden.

b) Methoxy-polyethylenglykol(8000)-N-succinimido-carbonat

10,0 g Methoxy-PEG(8000)-OH wurden durch leichtes Erwärmen in 20 ml trockenem Pyridin gelöst. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Lösung mit 890 mg N-Succinimido-chloroformiat versetzt und über Nacht gerührt. Nach Zugabe von einem Überschuß Diethylether wurde das Gemisch 30 min im Eisbad gerührt, der ausgefallene Feststoff abfiltriert, 2 mal aus Isopropanol umkristallisiert, aus Diethylether gefällt, filtriert und getrocknet. 8,10 g Methoxy-polyethylenglykol(8000)-N-succinimido-carbonat fielen als farbloser Feststoff an.

Beispiel 8 Darstellung von Methoxy-polyethylenglykol(8000)-4-nitrophenyl-carbonat a) 4-Nitrophenyl-chloroformiat

In eine Suspension von 20,0 g Nitrophenol in 60 ml Toluol wurden bei 0°C ca. 43 g Phosgen eingegast. Das Gemisch wurde 4-5 h bei 0°C gerührt. Anschließend wurde bei -15°C langsam eine Lösung von 20 ml Triethylamin in 20 ml Toluol zugetropft und über Nacht im auftauenden Kältebad gerührt. überschüssiges Phosgen wurde durch Stickstoff ausgeblasen und das Reaktionsgemisch anschließend filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum bis zur Trockene eingeengt. Die 33,7 g öliger, bräunlicher Rückstand enthielten neben 4-Nitrophenol-chloroformiat noch Lösungsmittel und Salz. Das Gemisch kristallisierte im Kühlschrank und konnte ohne weitere Reinigung eingesetzt werden.

b) Methoxy-polyethylenglykol(8000)-4-nitrophenyl-carbonat

Darstellung und Reinigung analog zu Beispiel 7.

Beispiel 9 Darstellung von Methoxy-polyethylenglykol(8000)-2,4,5-trichlor-phenylcarbonat a) 2,4,5-Trichlorphenyl-chloroformiat

In eine Lösung von 10,0 g 2,4,5-Trichlorphenol in 50 ml Dichlormethan wurden bei 0°C ca. 7 g Phosgen eingerastet und das Gemisch 15 min bei 0°C gerührt.7,2 ml Chinolin in 20 ml Dichlormethan wurden innerhalb von 30 min zugetropft und die orangefarbenen Suspension noch 1 h im Eisbad gerührt. Anschließend wurde 1 h Stickstoff durch die Suspension geleitet, um überschüssiges Phosgen abzublasen (Waschturm). Das Gemisch wurde an schließend filtriert, das Filtrat 2 mal mit Wasser gewaschen, getrocknet, erneut filtriert und im Vakuum bis zur Trockene eingeengt. Die 4,45 g öliger, bräunlicher Rückstand sind relativ sauberes 2,4,5-Trichlorphenyl chloroformiat, das im Kühlschrank kristallisierte und ohne weitere Reinigung eingesetzt werden kann.

b) Methoxy-polyethylenglykol(8000)-2,4,5-trichlor-phenylcarbonat

Darstellung und Reinigung analog zu Beispiel 7.

Claims

1. Protein-Polyalkylenglykolderivate der Formel I [A-(CH₂)_n-(O-(CH₂)_q)_m-B-)]_pX (I)worin A einen der Reste -OH, -NH₂, -NH-CO-R, -O-R oder -O-CO-R (mit R in der Bedeutung einer C₁-C₄-Alkylgruppe
n die Zahl 2, 3 oder 4
m eine Zahl von 30 bis 500
q die Zahl 2, 3 oder 4
B eine direkte kovalente Bindung oder ein Linker,
p die Zahl 1-10 bedeuten und
X ein über NH₂-Gruppen an den (die) A-(CH₂)_n-(O-(CH₂)_q)_m Rest(e) gebundenes Polypeptid mit Ancrod-Wirkung darstellt.

2. Konjugate gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Poly alkylenglykol ein Polyethylenglykol ist.

3. Konjugate gemäß Anspruch 2, wobei das Molgewicht des Polyethlylen glykols zwischen 1500 und 15 000 Da liegt.

4. Protein-Polyalkylenglykolderivate gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein Ancrod ist.

5. Protein-Polyalkylenglykolderivate gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein Ancrod ist bei dem 1-105 Aminosäuren ausgetauscht sind.

6. Verfahren zur Herstellung der Polyalylenglykolderivate gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man beide Reaktanden in Lösung miteinander reagieren läßt.

7. Konjugate der Ansprüche 1 bis 3, zur Verwendung bei der Vorbeugung und Bekämpfung von Krankheiten des Gerinnungssystems.

8. Konjugate der Ansprüche 1 bis 3, zur Verwendung bei der Vorbeutung und Bekämpfung von Krankheiten, die mit erhöhten Fibrinogenspiegeln einhergehen.

9. Konjugate der Ansprüche 1 bis 3, zur Verwendung als Kofibrinolytikum bei der Behandlung des Herzinfarkts und Hirnschlages.