DE4033752A1

DE4033752A1 - Verfahren zur herstellung von lysostaphin

Info

Publication number: DE4033752A1
Application number: DE19904033752
Authority: DE
Inventors: Rolf Dr Reissbrodt; Peter Dr Paul
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-10-24
Filing date: 1990-10-24
Publication date: 1992-04-30

Description

Lysostaphin ist ein von Staphylococcus staphylolflicus gebildeter Enzymkomplex, der Stämme des Genus Staphylococcus lysiert. Stämme des Genus Micrococcus sind dagegen unempfindlich gegen Lysostaphin. Dieser Unterschied wird im Routinelaboratorium benutzt, um Staphylo kokken von Mikrokokken einfach und schnell abzugrenzen. Ein weiteres Anwendungsgebiet ist der Aufschluß von Staphylokokkenzellwand mittels Lysostaphin für bakteriengenetische Untersuchungen und die Isolierung von Bakterieninhaltsstoffen.

Das nach dem bekannten Verfahren (U.S. Patent 33 98 056, 20.8.1968: Process for producing lysostaphin by fermentation; U.S. Patent 32 78 378, 11.10.1966: Staphylococcus-derived antibiotic; Schindler, C. A. und V. T. Schuhardt, Biochim. Biophys. Act., 97 (1965), 242: Purification and properties of lysostaphin - a lytic agent for Staphylococcus aureus; Iversen, O.-J. and A. Grov, Eur. J. Biochem. 38, 293-300 (1973): Studies on lysostaphin, separation and characterization of three enzymes) hergestellte Lysostaphin enthält größere Mengen DNase. Ohne eine aufwendige Reinigung und eine Abtrennung der DNase anzuschließen, ist das Präparat für bakteriengenetische Untersuchungen nicht verwendbar. Außerdem fallen in Abhängigkeit vom eingesetzten Pepton im Nährmedium bei der Reinigung unterschiedliche Lysostaphinqualitäten an. Ein Teil des vom Produktionsstamm ausgeschiedenen Lysostaphins ist labil und hochmolekular, es kann nicht lyophilisiert werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, das es ermöglicht, ein für diagnostische Zwecke, bakteriengenetische Untersuchungen sowie für die Isolierung von Bakterieninhaltsstoffen von Staphylokokken geeignetes Lysostaphinpräparat zu gewinnen. Das Präparat soll DNase-arm und hochaktiv sein.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst, indem ein lysostaphinproduzieren der Stamm in einem bekannten Nährmedium in der Grundzusammensetzung nach Robinson, J. M., Keating, M. S. und C. L. Sloan/Journal of General Micro biology, (1980) 118, 529-5337 angezüchtet wird und die Bakterien mit ge eigneten Methoden (Zentrifugieren, Filtrieren) abgetrennt werden. Das im Überstand vorhandene Lysostaphin wird mit festem Ammoniumsulfat bei 4°C (pH 7,5) ausgefällt. Der in Tris-HCl-Puffer gelöste Niederschlag wird zur Nucleaseabtrennung mit 6 M Harnstoff behandelt und danach dialysiert. Die Reinigung und Trennung des Lysostaphins erfolgt durch Curomatografie an DEAE-Cellulose mit Steigendem Salzgradienten von 0-1,0 M NaCl bei pH 6,5. Die bei dem Gradienten 0-0,15 M NaCl erhaltenen Fraktionen werden durch Ultrafiltration bei 4-6°C konzentriert, gewaschen und lyophilisiert. Je nach eingesetztem Caseinpepton, das durch nährstoff analytische Untersuchungen charakterisiert wurde, erhält man die Haupt aktivität im Säulendurchlauf oder beim 0,15 M NaCl-Gradienten. Die Lysosta phinqualitäten besitzen eine Enzymaktivität zwischen 5 und 150 Einheiten/mg Substanz (40-50% Protein n. LOWRY), die für die oben genannten Zwecke geeignet sind.

Der in der 1,0 M Fraktion des NaCl-Gradienten enthaltene Enzymkomplex wird durch Ultrafiltration konzentriert, gegen Leitungswasser dialysiert, mit Gelatine/Saccharose stabilisiert und anschließend lyophilisiert. Man er hält Produkte von 1-5 Einheiten/mg, die für diagnostische Zwecke aus reichen und dort eingesetzt werden können.

Ausführungsbeispiel

Zur Vorkultur werden 20 ml eines in seiner Grundzusammensetzung bekannten Nährmediums [Robinson et al. (1980)] mit einer frischen Blutagar-Kultur des Stammes Staphylococcus simulans, var. staphylolflicus, Mutante RNC beimpft und 4 Stunden bei 37°C geschüttelt.

¹) Der Proteose-Pepton-Quotient (PQ) ist der Quotient aus den Trübungs messungen des Stammes S. aureus NCTC 6571 nach Wachstum in 1%iger Peptonlösung (Schüttelkultur, 37°C, 8 h) bei 620 nm:

unter gleichen Bedingungen.

Das Medium enthält pro Liter: 60 g pankreatisches Caseinpepton, 5 g papaini sches Soja Pepton, 5 g NaCl, 3,2 g K₂HPO₄×3 H₂O und 10 ml Glycerol; pH 7,5.

In einen 2-l-Erlenmeyerkolben, durch dessen Stopfen ein mit steriler Watte versehenes Glasrohr zur Belüftung geführt wird, werden 20 ml Nähr medium gegeben und mit der Vorkultur beimpft. Nach 20stündigem Schütteln (longitudinal, Schüttelfrequenz 190 min^-1) bei 37°C, wird unter Kühlung (4°C) bei 5000 rpm 40 min. zentrifugiert. Das im Überstand vorhandene Lysostaphin wird mit 180 g (NH₄)₂SO₄ (45%ige Sättigung) unter Rühren aus gefällt. Nach 45minütigem Stehen im Kühlschrank bei 4°C und pH 7,5 wird der Niederschlag bei 4°C abzentrifugiert (5000 rpm) und in Tris-HCl-Puffer (0,05 M, pH 7,5) gelöst. Man versetzt den Rohextrakt mit Harnstoff (6 M Endkonzentration), läßt 20 min. bei Raumtemperatur stehen, dialysiert sofort gegen Leitungswasser und anschließend über Nacht bei 4°C gegen Tris-HCl-Puffer (0,005 M). Der auf pH 6,5 eingestellte Rohextrakt wird über eine mit DEAE-Gellulose (Reanal, 25 ml bei 600 ml Medium) gefüllte und mit Tris-HCl-Puffer (0,005 M, pH 6,5) äquilibrierte Chromatografie säule gepumpt. Säulendurchlauf und der erste Gradient mit 0,05 M NaCl werden als Durchlauffraktion gesammelt. Durch Elution mit 0,15 M NaCl wird eine weitere lysostaphinhaltige Fraktion gewonnen, die ebenso wie die Durchlauffraktion durch Ultrafiltration (Filtermembran PM 10, Amicon Corporation Lexington Mass. 02173, Europe Amicon B.V. Oosterhout (N.B.) Holland) bei 4-6°C konzentriert, mit aqua dest. gewaschen unter Stick stoff eingefroren und lyophilisiert wird. Ist der Proteose-Pepton-Quotient¹) des eingesetzten Caseinpeptons größer als 0,3, so erhält man die Haupt aktivität des Lysostaphins in der Durchlauffraktion. Bei einem kleineren PQ als 0,3 kehren sich die Verhältnisse um und die Lysostaphinaktivitäten findet man vorwiegend in der 0,15 M Fraktion.

Durch Elution mit 1,0 M NaCl-Gradienten wird ein höher molekularer Lysosta phin-Enzymkomplex eluiert und sofort eingefroren.

Mehrere 1,0 M NaCl Fraktionen von verschiedenen Trennungen werden aufgetaut, durch Ultrafiltration an einer Filtermembran PM 10 bei 4°C konzentriert, dialysiert und mit Gelatine-Saccharose-Medium [Patzwaldt, H. G. und D. Winkler, Z. med. Labortechnik 10 (1969) 40-44: Die Eignung eines gepufferten Gelatine- Saccharose-Mediums für die Gefriertrocknung] 1 : 30 versetzt und lyophilisiert.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Lysostaphin, einem Staphylokokken lysieren den Enzymkomplex aus Staphylococcus simulans, var. staphylolflicus, dadurch gekennzeichnet, daß man
- a) dem bekannten Nährmedium für die Anzüchtung des Produktionsstammes nach nährstoffanalytischen Parametern ausgewähltes pankreatisches Caseinpepton zusetzt und dadurch den nachfolgenden Reinigungsprozeß steuert,
- b) eine Vorreinigung des Lysostaphins durch fraktionierte Ammoniumsulfat fällung aus dem Kulturüberstand erreicht,
- c) eine ausreichende DNase-Abtrennung aus dem Roh-Lysostaphin durch Behandlung mit Harnstoff und anschließender Dialyse bewirkt und
- d) daß man den labilen Lysostaphinkomplex des 1,0 M NaCl-Gradienten durch Schutzkolloide, z. B. Gelatine/Saccharose, stabilisieren und lyophili sieren kann.