DE4005366A1

DE4005366A1 - Extraktionsverfahren mit zwei nicht oder nur begrenzt miteinander mischbaren fluessigen phasen

Info

Publication number: DE4005366A1
Application number: DE19904005366
Authority: DE
Inventors: Manfred Mistler; Manfred Radke; Walter Dr Troesch; Hans Dr Weber
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV; Schott Glaswerke AG
Current assignee: SCHOTT GLAS, 55122 MAINZ, DE FRAUNHOFER-GESELLSCHA
Priority date: 1990-02-21
Filing date: 1990-02-21
Publication date: 1991-08-22
Also published as: DE4005366C2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.

Die sogenannte Flüssig-Flüssig-Extraktion ist ein an sich bekanntes Verfahren zur Isolierung und Anreicherung eines Stoffes aus einem flüssigen Substanzgemisch mit Hilfe eines geeigneten Lösungsmittels. Das Grundprinzip des Verfahrens besteht darin, daß der Stoff aus seinem einen Lösungsmittel mittels eines anderen, mit dem ersten nicht oder nur be grenzt mischbaren Lösungsmittels, in welchem er eine größere Löslichkeit als in dem ersten besitzt, herausgezogen wird. Der Verfahrensablauf sieht dabei im allgemeinen so aus, daß beide Phasen vorerst miteinander in Kontakt gebracht werden, wobei insbesondere die Größe der Berührungsfläche zwischen beiden Phasen für die Schnelligkeit des Stoffübertritts in das Extraktionsmittel verantwortlich ist. Eine möglichst große Berührungsfläche wird in der Regel dadurch erzielt, daß beide Phasen durch Energieeintrag, z. B. durch Rühren, Pulsation, Zentrifugieren, so lange miteinander durchmischt werden, bis eine Phase fein verteilt in der anderen vor liegt, d. h., bis eine Suspension aus beiden Phasen herge stellt ist. Nach dem Übergang des Stoffes in das Extraktionsmittel wird dem System in entsprechenden Beruhi gungsphasen oder -zonen, d. h. Phasen oder Zonen ohne oder mit nur geringem Energieeintrag, die Gelegenheit zur spontan erfolgenden Phasentrennung gegeben. Die fein suspendierten Teile verbinden sich nach und nach zu größeren Tropfen bis schließlich beide Phasen wieder in leicht voneinander trenn baren, separaten Flüssigkeitsschichten vorliegen. Nach dem Abtrennen einer der beiden Phasen kann dann der extrahierte Stoff aus dem Extraktionsmittel isoliert werden.

Ein bevorzugtes Anwendungsgebiet für das oben beschriebene Verfahren ist zum Beispiel die Aufarbeitung fermentativ her gestellter Bioprodukte in der Biotechnologie, insbesondere biotechnologisch erzeugter niedermolekularer Naturstoffe, wie z. B. Essigsäure oder Antibiotica, insbesondere Penicil lin G, Bacitracin, Erythromycin, oder Steroide, z. B. Predni solon, oder Chemotherapeutica, wie Dactinomycin. Diese Stoffe werden von Mikroorganismen erzeugt, die eigens zu diesem Zweck in wäßrigen Nährlösungen kultiviert werden. Der größte Teil dieser mikrobiellen Stoffwechselprodukte wird dabei von den Mikroorganismen in ihre wäßrige Umgebung aus geschieden. Auf diese Weise entsteht eine Fermenterbrühe, bestehend aus verbrauchter Nährlösung, Mikroorganismen und deren Stoffwechselprodukte. Da die Stoffe in der Fermenter brühe meist in hoher Verdünnung vorliegen, müssen diese an gereichert und von den vielen, oft chemisch ähnlichen Begleitstoffen isoliert werden. Die extrem hohe Verdünnung ist dabei maßgeblich dafür verantwortlich, daß für die Auf arbeitung und Reinigung bis zu 60% des Gesamtaufwandes zur Herstellung von biotechnischen Produkten aufgewendet werden müssen.

Die Aufarbeitung der obengenannten Bioprodukte beginnt nun in der Regel damit, daß nach dem Abtöten der Mikroorganismen vorerst die Zellmasse mittels eines Drehfilters von der Fer menterbrühe abgetrennt wird. Der so erhaltenen Flüssigkeit - man bezeichnet sie auch als Kulturfiltrat - wird an schließend ein geeignetes organisches Lösungsmittel wie z. B. Diethylether, Ethylenchlorid, Ethylacetat, Methylisobutylke ton (MIBK), n-Butanol, Essigsäure-Butylester (Butylacetat), Amylacetat, usw, zugegeben. Dabei hat sich ein Phasenver hältnis von wäßriger zu organischer Phase von 4 : 1 für die meisten der oben aufgeführten mikrobiellen Stoffwechselpro dukte bewährt. Die Extraktion wird üblicherweise in mehrstu figen Verfahren, z. B. in Extraktionskolonnen, durchgeführt.

Im Bereich der Biotechnologie kommt es hier bei der Phasen trennung zu Schwierigkeiten. Aus unterschiedlichsten Grün den, z. B. durch Zellyse, können in der wäßrigen Phase Proteine enthalten sein, die sich auf der Oberfläche eines feinen Tropfens anlagern und damit ein Vereinigen der Trop fen verhindern. Die Suspension bleibt stabil und die Phasen trennung wird verhindert.

Dieses Problem tritt z. B. auch bei der in der industriellen Praxis heutzutage im großtechnischen Maßstab durchgeführten Fermentation von Penicillin G auf. Die Extraktion der freien Penicillin-G- und V-Säuren aus dem Kulturfiltrat erfolgt in der Regel mit den organischen Lösungsmitteln Butylacetat oder Amylacetat bei pH = 2,5 bis 3,0. Bei diesem pH-Wert wird die Extraktion begünstigt, da der Schwerpunkt des Ver teilungsgleichgewichts praktisch vollständig auf der Seite der organischen Phase liegt. Andererseits findet im sauren Medium ein verstärkter Abbau des Penicillins statt, so daß die Verweilzeit im kritischen pH-Bereich möglichst gering gehalten werden muß. Die Säure wird daher, um die Verluste gering zu halten, üblicherweise erst unmittelbar vor dem Eintritt in den Extraktor zugegeben und die Extraktion bei 0-3°C in kontinuierlichen mehrstufigen Gegenstrom-Zen trifugalextraktoren bei sehr kurzen Kontaktzeiten durchge führt. Trotz der niedrigen Temperatur und der kurzen Kontaktzeit sind die Verluste an Penicillin G dennoch be trächtlich. Sie liegen bei etwa 15-20%.

Mit dem Ansäuern des Mediums geht darüber hinaus noch die Ausfällung der die Phasentrennung behindernden Proteine ein her. Um die Bildung einer stabilen Emulsion möglichst zu verhindern, ist man heutzutage weitgehend dazu übergegan gen, das Kulturfiltrat nach dem Ansäuern für eine kurze Zeit zwischenlagern zu lassen, so daß die Ausfällung noch vor dem Eintritt in den Extraktor erfolgt. Dies hat jedoch den Nachteil, daß durch die längere Verweilzeit im sauren Medium ein noch größerer Anteil des Penicillins denaturiert wird. Auf jeden Fall ist es zur Erzielung einer sauberen organi schen Phase erforderlich, das Zweiphasensystem zu zentrifu gieren, womit u. a. ein hoher apparativer Aufwand wie auch ein hoher Energieverbrauch verbunden ist. Gelegentlich wird auch mit emulsionsbrechenden Mitteln gearbeitet. Diese Vor gehensweise sollte jedoch wegen ihrer nachteiligen Auswir kungen auf die Stabilität des Penicillins nur als Notlösung betrachtet werden.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Flüssig-Flüssig-Extraktion bereitzustellen, welche auch bei Systemen, die zur Bildung stabiler Emulsionen neigen, einen schnellen Verfahrensablauf verbunden mit einer voll ständigen und sauberen Phasentrennung gewährleistet. Insbe sondere soll die Aufarbeitung und Reinigung fermentativ hergestellter Naturstoffe vereinfacht werden.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit dem im Patentanspruch 1 beschriebenen Verfahren gelöst. In Anspruch 13 wird die Verwendung von porösen, chemisch inerten, festen offenpori gen Körpern, deren Poren eine flüssige Phase enthalten, als flüssige Phase bei einer Flüssig-Flüssig-Extraktion be schrieben.

Das an sich bekannte Extraktionsverfahren wird dahingehend modifiziert, daß eine der beiden flüssigen Phasen während aller Verfahrensschritte durch Adhäsion an die Oberfläche eines festen inerten Trägermaterials gebunden wird. Vorzugs weise liegt das Trägermaterial in Form einer Vielzahl ein zelner Trägerkörper mit einer großen Gesamtoberfläche vor, um, analog zur Suspension, eine möglichst feine Verteilung der einen Phase in der anderen und damit eine möglichst große Berührungsfläche zwischen beiden Phasen zu gewährlei sten. Eine schnelle und saubere Trennung beider Phasen wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auch bei Systemen, die zur Bildung stabiler Emulsionen neigen, in einfacher Weise dadurch erreicht, daß die nicht gebundene Phase von den mit der gebundenen Phase beladenen Trägerkörpern abgezogen wird. Dies kann z. B. durch Absaugen über eine Filternutsche er folgen. Ebenso ist es möglich, die nicht gebundene Phase, z. B. unterstützt durch Anlegen eines leichten Luftstroms, aus dem Behälter mit den beladenen Trägerkörpern einfach abfließen zu lasen.

Sofern es sich bei der gebundenen Phase um das Extraktions mittel handelt, kann es auch empfehlenswert sein, die bela denen Trägerkörper im Anschluß an die Phasentrennung noch mit einer geeigneten Waschflüssigkeit nachzuwaschen, um auch noch letzte Reste der nicht gebundenen Phase abzutrennen.

Insbesondere bei der Extraktion mikrobieller Stoffwechsel produkte aus wäßrigen Lösungen ist es zweckmäßig, die Trä gerkörper mit dem Extraktionsmittel zu beladen und das Kulturfiltrat als nicht gebundene Phase einzusetzen. Da mit der Isolation des Stoffes üblicherweise auch eine Aufkonzen trierung einhergeht, bedeutet diese Vorgehensweise eine er hebliche Ersparnis an Trägermaterial.

Prinzipiell ist es jedoch auch möglich, die Trägerkörper mit der den zu extrahierenden Stoff enthaltenden Phase zu bela den und mit dem Extraktionsmittel zu behandeln.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl in an sich be kannter Weise einstufig als auch mehrstufig durchgeführt werden. Dabei werden die mit dem Extraktionsmittel beladenen Trägerkörper in die den zu extrahierenden Stoff enthaltende Phase gegeben und z. B. mittels eines Rührers intensiv mit dieser verwirbelt. Anschließend wird die nicht gebundene Phase abgesaugt und erforderlichenfalls einer weiteren Ex traktionsstufe mit neuen Trägerkörpern mit frischem Extrak tionsmittel zugeführt. Der extrahierte Stoff kann schließlich aus dem Extraktionsmittel in den Trägerkörpern z. B. wie bei herkömmlichen Extraktionsverfahren üblich, durch Rückextraktion in ein geeignetes Lösungsmittel oder durch Verdünnen durch Umspülen der beladenen Trägerkörper mit frischem Extraktionsmittel herausgezogen werden. Letzte res ist allerdings mit einem erheblichen Verbrauch an Ex traktionsmittel verbunden.

Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren jedoch mehr stufig mit einer Säule durchgeführt. Bei dieser Verfahrens varianten, die sowohl im Festbett als auch im Fließbett durchgeführt werden kann, werden die beladenen Trägerkörper in eine Säule gefüllt und in der Säule mit der den zu extra hierenden Stoff enthaltenden Phase beschickt. Diese durch fließt die Säule im Idealfall so, daß alle Trägerkörper gleichmäßig umspült werden. Dabei stellt sich in Flußrich tung von Trägerkörper zu Trägerkörper kontinuierlich ein neues Verteilungsgleichgewicht ein. Vorteilhafterweise wird die in einem Verfahrensschritt auf die Säule gegebene Menge an Extraktionsgut so bemessen, daß die in den Trägerkörpern befindliche Menge an Extraktionsmittel ausreicht, um den zu extrahierenden Stoff vollständig aufzunehmen. Die Rückgewin nung des extrahierten Stoffes aus den Trägerkörpern kann dann analog zur einstufigen Extraktion erfolgen.

Das Trägermaterial muß erfindungsgemäß formstabil und in bezug auf die Lösungsmittel und die darin gelösten Stoffe chemisch inert sein.

Zweckmäßigerweise wird ein poröses Material mit offenen Po ren zur Aufnahme der flüssigen Phase verwendet, wobei die Porengröße so bemessen ist, daß die Flüssigkeit in den Poren durch Kapillarkräfte festgehalten wird. Für eine bestmögli che Ausnutzung des Trägermaterials ist es anzustreben, das gesamte offene Porenvolumen mit der flüssigen Phase zu fül len.

Die Größe der Poren, d. h. der Durchmesser der als im wesent lichen kugelförmig angenommenen Hohlräume muß so bemessen sein, daß die Kapillarkräfte groß genug sind, um die Flüs sigkeit insbesondere gegen die Schwerkraft oder gegen die bei Bewegung der Trägerkörper, z. B. im Fließbett, auftreten den Trägheits- und Fliehkräfte in den Poren zurückzuhalten. Es hat sich gezeigt, daß bei den üblicherweise in Extrak tionsverfahren eingesetzten wäßrigen Lösungen und organi schen Lösungsmitteln in Trägerkörpern mit hydrophiler bzw. hydrophober Oberfläche mit Porendurchmessern bis zu 2 mm noch eine ausreichende Bindung an das Trägermaterial gewähr leistet ist. Bevorzugt werden jedoch poröse Materialien mit Porendurchmessern bis zu maximal 1 mm eingesetzt, um sicher zustellen, daß auch nicht kleinere Mengen an gebundener Pha se beim Durchmischen oder Beschicken mit der nicht gebundenen Phase aus den Porenöffnungen an der Trägerober fläche herausgespült werden können.

Nach unten hin ist der Porengröße erst dann eine Grenze ge setzt, wenn Molekülabmessungen erreicht werden. Die Poren sollten groß genug sein, um die am Verfahren beteiligten Moleküle nicht in ihrer Beweglichkeit zu behindern. Für die meisten der obengenannten Naturstoffe liegen die Molekül größen jedoch noch im nm-Bereich.

Wegen ihrer im allgemeinen größeren Festigkeit und besseren chemischen Beständigkeit werden als Trägermaterialien anor ganische gegenüber organischen Materialien bevorzugt. Prin zipiell ist jedoch auch der Einsatz organischer Materialien denkbar, sofern sie für die spezielle Anwendung ausreichend formstabil und chemisch inert sind.

Bevorzugt werden Trägerkörper aus Keramik, Glaskeramik und insbesondere aus Glas verwendet. Unter diesen Materialien lassen sich nicht nur solche mit einer hohen chemischen Be ständigkeit finden, sie zeichnen sich darüber hinaus im all gemeinen noch durch definierte Oberflächeneigenschaften aus, was z. B. hinsichtlich einer gleichmäßigen Beladung mit Lö sungsmittel von Bedeutung ist.

Geeignete poröse Trägerkörper aus Glas, Keramik oder Glaske ramik können z. B. Sinterkörper aus diesen Materialien sein. Insbesondere für Glas sind Verfahren zur Herstellung von offenporigen Sinterkörpern mit definierter Porosität bekannt und erprobt. So wird z. B. in der DE-PS 33 05 854 C1 ein Ver fahren beschrieben, wonach offenporige Sinterkörper aus Glas mit einem vorbestimmten großen offenen Porenvolumen sowie mit definiert einstellbaren, ggfls. auch engen, Porengrößen verteilungen herstellbar sind. Bei diesem Verfahren wird ein Glaspulver mit einem inerten Material gemischt. Nach der Formgebung und dem Sintern wird der inerte Anteil ausgewa schen. Durch eine entsprechende Auswahl der Korngröße und des Volumenanteils können die Porengröße und das Porenvolu men des offenporigen Sinterglases in weiten Grenzen variiert und den jeweiligen Anforderungen gezielt angepaßt werden.

Die Verwendung von Glas als Trägermaterial hat noch den wei teren Vorteil, daß poröses Glas nicht kompaktierbar ist, so daß die Trägerkörper ohne weiteres auch als Säulenfüllung eingesetzt werden können.

Die Art des verwendeten Glases kann an die jeweiligen spe ziellen Anforderungen, z. B. an die chemische Beständigkeit, angepaßt werden. So kann die Verwendung eines preiswerten Kalk-Natron-Glases durchaus ausreichend sein. Die oben be schriebenen Sinterkörper können aber auch aus chemisch be ständigeren Borosilikatgläsern gefertigt werden.

Poröse Sinterglaskörper der obengenannten Art sind in den unterschiedlichsten Formen, z. B. als Kugel, Hohlzylinder, usw., herstellbar. Für die Verwendung im Extraktionsverfah ren wird jedoch wegen der besseren Raumausnutzung die Kugel gestalt bevorzugt.

Um einen Trägerkörper mit einer möglichst großen Menge an Lösungsmittel beladen zu können, ist ein möglichst großes offenes Porenvolumen erstrebenswert, dieses muß aber mit einer noch ausreichenden mechanischen Stabilität vereinbar sein. Besonders bevorzugt ist daher bei der Verwendung von Glas als Trägermaterial ein offenes Porenvolumen, das zwi schen 50 und 65% liegt. Werden die Trägerkörper mechanisch nicht zu stark belastet, z. B. bei nicht zu hohen Säulen, so sind noch offene Porenvolumina bis zu 70% möglich. Wird jedoch dieser Wert überschritten, so ist insbesondere bei Säulenfüllungen damit zu rechnen, daß die zuunterst liegen den Sinterkörper durch das Gewicht der darüber liegenden zerbröselt werden.

Nach unten hin ist dem offenen Porenvolumen praktisch nur eine Grenze durch die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens ge setzt. Je kleiner das offene Porenvolumen ist, desto mehr Trägermaterial muß zum Binden einer bestimmten Lösungsmit telmenge eingesetzt werden.

Der Übergang des gelösten Stoffes aus seinem Lösungsmittel in das Extraktionsmittel findet an den an der Oberfläche der Trägerkörper gelegenen Porenöffnungen statt. Nur dort kommen im allgemeinen beide Phasen miteinander in Berührung. Der Konzentrationsausgleich im Inneren eines Trägerkörpers er folgt dabei durch Diffusion. Es ist daher von Vorteil, Trä gerkörper mit einem möglichst kleinen Durchmesser zu verwenden. Mit der daraus resultierenden Vergrößerung der gesamten Trägeroberfläche geht auch eine Vergrößerung der gesamten Berührungsfläche zwischen den beiden flüssigen Pha sen einher, so daß ein schnellerer Stoffaustausch gewährlei stet ist. Zusätzlich tragen noch die kürzeren Diffusionswege zu einem beschleunigten Verfahrensablauf bei. Ein weiterer Vorteil von kleinen Durchmessern liegt in der größeren Packungsdichte bei Säulenfüllungen. Der nicht nutzbare Raum zwischen den Trägerkörpern wird vermindert. Mit Trägerkör pern mit einem Durchmesser kleiner oder gleich 1 mm werden gerade bei der auf einen schnellen Verfahrensablauf angewie senen Penicillin-Extraktion bereits gute Ergebnisse erzielt. Bevorzugt werden die kleinsten derzeit herstellbaren Sin terglaskörper der obengenannten Art mit Durchmessern bis zu 0,4 mm eingesetzt. Prinzipiell sind jedoch zu kleineren Durchmessern hin keine Grenzen gesetzt, so lange, z. B. bei gleichbleibender Porengröße, das offene Porenvolumen nicht über die oben angegebene Grenze hinauswächst oder bei maß stabsgerechter Verkleinerung der Poren diese nicht so klein werden, daß die an der Extraktion beteiligten Moleküle in ihrer Bewegung behindert werden.

Bei Verwendung der Trägerkörper als Säulenfüllung sollte der Durchmesser der Kugeln 5 mm nicht überschreiten, da es sich gezeigt hat, daß die nicht gebundene Phase bei noch größeren Kugeln in zunehmendem Maße in Kanälen durch die Säule hin durchfließt und ein Umspülen aller Kügelchen nicht mehr ge währleistet ist.

Zur Verbesserung der Bindung eines Lösungsmittels an das Trägermaterial ist es vorgesehen, dessen Oberfläche, je nach Art des Lösungsmittels, hydrophil bzw. hydrophob zu modifi zieren. Verfahren hierzu wie auch geeignete Substanzen sind an sich bekannt und z. B. in K. K. Unger (1979) Chemical Mo dification of the silica surface. In: K. K. Unger (Hrsg) Porous Silica its Properties and use as Support in Column Liquid Chromatography (s. 83-130) Elsevier Scientific Pub lishing Company, Amsterdam, Oxford, New York beschrieben.

Dabei wird im Falle der porösen Sinterglaskörper die an sich durch an der Oberfläche gebundene OH-Gruppen leicht hydro phile Glasoberfläche mit einer sehr dünnen Schicht einer geeigneten Substanz, z. B. ein Silan, mit endständigen hydro philen (OH) oder hydrophoben (CH₂Cl) Gruppen überzogen.

Bezüglich geeigneter Lösungsmittel bestehen für das erfin dungsgemäße Verfahren die gleichen Beschränkungen wie für die bekannte Extraktion auch. Die an der Extraktion teilneh menden Phasen sollten nicht oder nur begrenzt miteinander mischbar sein. Vorteilhafterweise arbeitet man, wie auch im Falle der herkömmlichen Extraktionsverfahren, mit gegenein ander abgesättigten Lösungsmitteln, um zu verhindern, daß eine zu große Menge an Extraktionsmittel aus den Trägerkör pern herausgezogen wird. Brauchbare Lösungsmittel für die Extraktion aus wäßriger Phase sind z. B. noch Methylisobutyl keton, n-Butanol und Diethylether, welche in H₂O eine Lös lichkeit von weniger als 22 Gew.-% im interessierenden Temperaturbereich von 20-37°C aufweisen. Bevorzugt werden jedoch n-Butylacetat oder Chloroform mit einer Löslichkeit von weniger als einem Gew.-% in H₂O oder das in H₂O nahezu nicht lösliche Butylsulfat eingesetzt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch keineswegs auf die genannten Lösungs mittel beschränkt.

Das Beladen der Trägerkörper mit einer flüssigen Phase, z. B. mit Extraktionsmittel, erfolgt in einfacher Weise dadurch, daß in einem Behälter zu den Trägerkörpern, deren Oberfläche hydrophil oder hydrophob behandelt sein kann, die flüssige Phase im Überschuß zugegeben wird. Nachdem sich die Träger körper vollgesaugt haben, wird die nicht absorbierte flüssi ge Phase wieder abgezogen und die Trägerkörper werden getrocknet. Es kann mitunter vorteilhaft sein, die Luft aus den Poren der Trägerkörper vor dem Tränken mit dem Lösungs mittel durch Evakuieren zu entfernen. Die Menge an gebunde ner Phase kann z. B. durch Differenzwägung bestimmt werden.

Methoden zum Beladen von Trägermaterial mit einer flüssigen Phase sind z. B. auch aus der Chromatographie bekannt.

Einmal beladene Trägerkörper können nach der Rückextraktion des extrahierten Stoffes zumindest für das gleiche Extrak tionsverfahren immer wieder eingesetzt werden, ohne erneut mit frischem Lösungsmittel beladen werden zu müssen. Inwie weit der Einsatz auch für die Extraktion eines anderen Stof fes sinnvoll ist, hängt von der Vollständigkeit der Rückextraktion ab.

Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt insbeson dere darin, daß das vorzugsweise bei der Extraktion mikro bieller Stoffwechselprodukte aus wäßrigen Phasen mittels organischer Phasen auftretende Problem der Bildung stabiler Emulsionen mit einfachen Mitteln umgangen wird. Die bei den etablierten Verfahren zur Erzielung einer sauberen Phasen trennung üblicherweise vorgesehenen Maßnahmen, die teils mit nachteiligen Wirkungen auf die Stoffausbeute, teils mit ei nem hohen energetischen und apparativen Aufwand verbunden sind, können vollständig entfallen, was das erfindungsgemäße Verfahren gerade für diese Anwendungen, insbesondere, da es auch als kontinuierlicher Prozeß im Großbetrieb eingesetzt werden kann, besonders geeignet macht.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch keineswegs auf diese Anwendungen beschränkt. Das Prinzip der trägergebunde nen Extraktion läßt sich z. B. auch ohne weiteres auf die Reaktivextraktion übertragen, wobei der Stoffaustausch zwi schen beiden Phasen nicht durch das Nernst′sche Verteilungs gleichgewicht, sondern durch eine chemische Reaktion bestimmt wird.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand der Ausführungsbei spiele näher erläutert:

1. Extraktion von Penicillin G mittels Essigsäure-Butyl ester (Butylacetat) 1.1. Einstufige Extraktion

Als Trägerkörper wurden poröse Sinterglaskugeln aus Kalk- Natron-Glas mit einem Durchmesser von 1-2 mm, einer Poren größe von 60-300µm und einem offenen Porenvolumen von 55- 60% mit hydrophobisierter Oberfläche verwendet.

62 g dieser Kugeln wurden in einen Erlenmeyerkolben eingewo gen und Butylacetat im Überschuß zugegeben. Nach ca. 5 min wurde das nicht absorbierte Lösungsmittel mit Hilfe einer Filternutsche abgesaugt. Die Menge des absorbierten Lösungs mittels wurde durch Differenzwägung bestimmt. Es wurden 27,1 g (=30,8 ml) Butylacetat absorbiert. Die Löslichkeit von Penicillin G in Butylacetat beträgt 60 g/l. Die maximale Aufnahmekapazität des absorbierten Butylacetats liegt bei 1,85 g Penicillin G.

Die Fermentationsbrühe wurde mit Hilfe eines Drehzellenfil ters von der Zellmasse befreit. Der Penicillin-G-Gehalt wur de mittels HPLC - Analyse bestimmt. Er betrug etwa 1 Vol-%.

Die Aufkonzentrierung erfolgte durch Extraktion in die or ganische Phase (Butylacetat) nach vorhergehender pH-Absen kung. (Bei pH 2 liegt das Verteilungsgleichgewicht praktisch quantitativ auf der Seite der organischen Phase). Der pH- Wert wurde durch Zugabe von 20 ml H₂SO₄ eingestellt. Ein Nachteil des Ansäuerns ist, daß bei pH 2 lösliche Proteine ausfallen, welche durch Konglomeratbildung die Extraktion üblicherweise behindern.

Die vorbereiteten, mit Butylacetat beladenen porösen Glas kugeln wurden mit 200 ml Kulturfiltrat (+20 ml H₂SO₄) versetzt und ca. 5 min im Erlenmeyerkolben geschüttelt. Aus dem Überstand wurde eine HPLC-Probe genommen. Nach Absaugen des Kulturfiltrats über eine Filternutsche und Waschen mit 400 ml 1%-iger H₂SO₄ wurde das Penicillin durch Verdünnen mit frischem Butylacetat aus den beladenen Trägerkörpern herausgezogen. Dies erfolgte durch 3-maliges Ausschütteln mit (110 ml, 120 ml, 20 ml) Butylacetat. Von der organi schen Phase wurde anschließend ebenfalls eine HPLC-Probe genommen.

Die HPLC-Analysen ergaben

2,394 g Penicillin lagen absolut im Kulturfiltrat vor. Die Aufnahmekapazität des absorbierten Butylacetats für Pe nicillin G betrug 1,85 g. Davon konnten 1,15 g mit Bu tylacetat extrahiert werden. Die Wiederfindungsrate lag also bei 62%. 0,794 g Penicillin lagen weiterhin in der wäßrigen Phase vor. Bei der etablierten Penicillin-Extraktion liegt die Wiederfindungsrate in der organischen Phase bei 98%.

Das Versuchsergebnis kann wie folgt interpretiert werden: Vermutlich behinderten die koagulierten Proteine den Übergang des Penicillins in die organische Phase durch Ver stopfen der Poren in den Trägerkörpern.

1.2. Mehrstufige Extraktion über eine Säule

In eine Säule mit einem Durchmesser von 26 mm und einer Schütthöhe von 490 mm wurden 176,18 g poröse Sinterglasku geln aus Kalk-Natron-Glas mit hydrophober Oberfläche ge füllt. Der Durchmesser der Kugeln betrug 0,4-1 mm, die Porengröße war < 120 µm und das offene Porenvolumen lag bei 55-60%.

Zum Beladen der Trägerkörper wurde Butylacetat im Überschuß auf die Säule gegeben. Das nicht absorbierte Lösungsmsittel wurde anschließend durch Anlegen eines leichten Luftstroms aus der Säule verdrängt und aufgefangen. Die Differenzwägung ergab 97 ml in den Trägerkörpern absorbiertes Lösungsmit tel.

Bei der großtechnischen mehrstufigen Extraktion hat sich ein Verhältnis von Butylacetat zu Kulturfiltrat (KF = von der Zellmasse befreite Fermentationsbrühe) von 1 : 4 bewährt. Es wurden daher 388 ml KF mit 8,33 ml 20,8%-iger H₂SO₄ auf pH 2,0 eingestellt (Zeitbedarf: ca. 10-15 s; resultierendes Gesamtvolumen (KF + H₂SO₄): 396,33 ml) und über die Säule geschickt. Die aufgefangene Brühe wurde noch zwei weitere male über die Säule geschickt. Nach jedem Durchgang wurde eine Probe zur HPLC-Analyse gezogen (Proben Al, A2, A3). Anschließend wurde die Säule mit 550 ml angesäuertem H₂O nachgewaschen. Das Waschwasser wurde aufgefangen und eine Probe zur HPLC-Analyse genommen.

Mit 300 ml Butylacetat wurde das Penicillin durch Verdünnen aus den Trägern herausgezogen, das Lösungsmittel wurde auf gefangen und analysiert (A_ABA). Die Ergebnisse der HPLC-Ana lysen sind zusammen mit den Ergebnissen des nachfolgenden Ausführungsbeispiels in Tabelle 1 dargestellt.

1.3. Einstufige Extraktion bei simultaner pH-Einstellung

In einem weiteren Ausführungsbeispiel wurden 176,6 g poröse Sinterglaskugeln der in 1.2. genannten Art durch Zugabe von Butylacetat und Absaugen des überschüssigen Lösungsmittels über eine Filternutsche beladen. Die Differenzwägung ergab 118 ml Butylacetat in den Trägerkörpern. Anschließend wurde die 4-fache Menge an Kulturfiltrat (472 ml) zugegeben. Mit Hilfe eines Laborrührers wurde das Trägermaterial im Ver suchsansatz intensiv verwirbelt. Durch Zugabe von 10,25 ml H₂SO₄ wurde der pH auf 2,0 eingestellt. Anschließend wurde das Kulturfiltrat über eine Filternutsche abgesaugt und eine HPLC-Probe des Filtrats (B₁) genommen. Mit 750 ml ange säuertem H₂O wurde nachgewaschen und eine HPLC-Analyse des Waschwassers (B_w) vorgenommen.

Die Extraktion des Penicillin G aus den Trägerkörpern er folgte durch 3-maliges Auswaschen mit je 138 ml Butylacetat. Der Penicillin G-Gehalt im Butylacetat wurde mittels HPLC (B_ABA) bestimmt.

Tabelle 1

Penicillinkonzentration im Kulturfiltrat: 8557 mg/l

Ausführungsbeispiel 1.2

In den Proben A1, A2, A3 und Aw sind lediglich 1,5% des eingesetzten Penicillingehaltes nachweisbar. Dies zeigt daß die eingesetzte Penicillinmenge fast quantitativ in den Trägern aufgenommen wurde. Offensichtlich war der Auswasch vorgang mit Butylacetat jedoch nicht sehr effektiv, denn die Wiederfindungsrate beträgt hier nur 62%.

Durch eine vielfache Menge an Butylacetat könnte die Wieder findungsrate wohl erheblich gesteigert werden, dies würde jedoch zu einer zu großen Verdünnung führen. Als wesentlich effektiver würde sich in diesem Fall wohl eine Rückextrak tion in die wäßrige Phase (Na₂CO₃ bzw. K₂CO₃ -Lösung) erwei sen.

Ausführungsbeispiel 1.3

Auch hier war die eingesetzte Menge an Penicillin G nahezu quantitativ im Träger absorbiert (Verlust betrug 3,7%).

Die gegenüber Versuch A erhöhte Wiederfindungsrate könnte durch die etwas größere Menge an Butylacetat beim Auswaschen erklärt werden.

Außerdem wurde durch die pH-Einstellung im vorgelegten Zwei phasensystem eine Desaktivierung des Penicillins minimiert.

2. Extraktion von Essigsäure mit Methylisobutylketon (MIBK)

79 g poröse Sinterglaskugeln aus Kalk-Natron-Glas mit 0,15 m²/g Oberfläche, Kugeldurchmessern von 2-3 mm, einer Porengröße von 60-300 µm und einem offenen Porenvolumen von 55% wurden in ein geschlossenes Gefäß eingewogen, 108 g MIBK zugesetzt und 30 min lang leicht geschüttelt. Nach Ab dekantieren wurde das Abtropfgewicht bestimmt. Daraus wurde die Belastung des feuchten Trägers mit MIBK berechnet. Es wurden ca. 35,6 g MIBK in den Trägerkörpern gebunden.

Zur Gegenüberstellung der Ergebnisse wurde die Extraktion mit und ohne Träger durchgeführt. Extrahiert wurden jeweils 100 ml Essigsäure in Wasser (20 g/l, 1/3 M, pH 3,05) mit jeweils 35,7 g MIBK. Die Menge an Essigsäure vor und nach der Extraktion wurde in der wäßrigen Phase durch potentiome trische Titration mit 0,1 M NaOH bestimmt.

Tabelle 2 zeigt die Kinetik der Extraktion für MIBK mit und ohne Träger:

Tabelle 2

Das Verteilungsgleichgewicht stellt sich relativ schnell ein. Bei der Berechnung der Verteilungskoeffizienten wurde die Dissoziation der Essigsäure bei pH 3,05 nicht berück sichtigt, das bedeutet, daß die Werte mit einem konstanten, noch zu berechnenden Korrekturfaktor multipliziert werden mußten. Außerdem wurde die Temperatur nicht exakt konstant gehalten.

Aus den berechneten Werten wird aber folgendes deutlich:

1. Das Gleichgewicht stellt sich auch mit Träger rasch ein.
2. Die Lage des Gleichgewichts wird durch den Träger nicht meßbar beeinflußt.

Claims

1. Extraktionsverfahren mit zwei nicht oder nur begrenzt miteinander mischbaren flüssigen Phasen, insbesondere zur Isolierung und Anreicherung mikrobieller Stoffwech selprodukte aus wäßrigen Phasen mittels organischer Phasen, dadurch gekennzeichnet, daß eine der beiden Phasen während der an sich bekann ten Verfahrensschritte der Extraktion durch Adhä sionskräfte an die Oberfläche von Trägerkörpern aus einem chemisch inerten, festen Material gebunden ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Extraktionsmittel an die Trägerkörper gebunden ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion in einem mehrstufigen Verfahren mit einer Säule durchgeführt wird, wobei die mit dem Ex traktionsmittel beladenen Trägerkörper sich in der Säu le befinden und mit dem Extraktionsgut beschickt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der extrahierte Stoff durch Rückextraktion mit ei nem geeigneten Lösungsmittel oder durch Verdünnen mit ungebundenem Extraktionsmittel aus den beladenen Trä gerkörpern wieder herausgezogen wird.

5. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerkörper aus einem offenporigen porösen Material bestehen und die gebundene Phase sich in den Poren befindet.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser der Poren < 1 mm beträgt.

7. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß poröse Trägerkörper aus einem anorganischen Mate rial verwendet werden.

8. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägerkörper poröse offenporige Sinterglasku geln verwendet werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das offene Porenvolumen der Sinterglaskugeln < 70% beträgt.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das offene Porenvolumen der Sinterglaskugeln 50-65% beträgt.

11. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 8-10, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche der Sinterglaskugeln hydrophob oder hydrophil modifiziert ist.

12. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 8-11, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser der Sinterglaskugeln < 5 mm be trägt.

13. Verwendung von porösen, chemisch inerten, festen offen porigen Körpern, deren Poren eine flüssige Phase ent halten, als flüssige Phase bei einer Flüssig-Flüssig- Extraktion.

14. Verwendung von porösen Körpern nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser der Poren < 1 mm beträgt.

15. Verwendung von porösen Körpern nach Anspruch 13 od. 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Körper aus einem anorganischen Material beste hen.

16. Verwendung von porösen Körpern nach wenigstens einem der Ansprüche 13-15, dadurch gekennzeichnet, daß die Körper poröse offenporige Sinterglaskugeln sind.

17. Verwendung von porösen Körpern nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das offene Porenvolumen der Sinterglaskugeln < 70% beträgt.

18. Verwendung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß das offene Porenvolumen der Sinterglaskugeln 50- 65% beträgt.

19. Verwendung von porösen Körpern nach wenigstens einem der Ansprüche 16-18, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche der Sinterglaskugeln hydrophob oder hydrophil modifiziert ist.

20. Verwendung von porösen Körpern nach wenigstens einem der Ansprüche 16-19, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser der Sinterglaskugeln < 5 mm be trägt.