WO2009040312A1 - Vorrichtung und verfahren zum behandeln von flüssigkeiten mit magnetischen partikeln - Google Patents

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WO2009040312A1
WO2009040312A1 PCT/EP2008/062539 EP2008062539W WO2009040312A1 WO 2009040312 A1 WO2009040312 A1 WO 2009040312A1 EP 2008062539 W EP2008062539 W EP 2008062539W WO 2009040312 A1 WO2009040312 A1 WO 2009040312A1
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magnetic
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Ralf Himmelreich
Thomas Rothmann
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Qiagen Gmbh
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    • B03C2201/26—Details of magnetic or electrostatic separation for use in medical applications

Definitions

  • the present invention relates to an apparatus and a method for treating liquids with magnetic particles.
  • the device and the method are suitable, for example, for applications in biochemistry, clinical chemistry, molecular biology, microbiology, medical diagnostics or forensic medicine.
  • the basic principle of the magnetic separation of substances from complex mixtures is based on the fact that magnetic particles e.g. be provided by chemical treatment of their surface with specific binding properties for the target substances to be separated.
  • the size of such magnetic particles is generally in the range of about 0.05 to 500 microns so as to provide a large surface area for the binding reaction.
  • the magnetic particles may have a density similar to the density of the liquid in which they are suspended. In this case, sedimentation of the magnetic particles can take several hours.
  • the magnetic particles are immobilized by applying magnetic forces or a magnetic field, for example by means of a permanent magnet, at one point. This accumulation of magnetic particles is also referred to as pellet or magnetic sediment. Subsequently, the liquid supernatant is separated, for example, by suction or decantation and discarded. Since the magnetic particles are immobilized by the magnetic forces, it is largely prevented that magnetic particles are separated together with the supernatant.
  • the immobilized magnetic particles are then resuspended.
  • an elution liquid or an elution buffer is used to enrich the bound target substances.
  • the bond between the target Substance and the magnetic particles is dissolved and released the target substance molecules from the magnetic particles.
  • the target substance molecules can then be separated together with the elution liquid, while the magnetic particles are immobilized by the action of a magnetic field.
  • the target substance molecules can not only be enriched, but also concentrated.
  • one or more washing steps can be carried out.
  • US 2001/0022948 describes an apparatus in which a magnetic rod is immersed in a first reaction vessel containing magnetic particles suspended in liquid.
  • the magnetic rod attracts the magnetic particles so that the magnetic particles adhere to the rod.
  • the magnetic rod is then pulled out of the reaction vessel together with the adhering magnetic particles and introduced into a second reaction vessel. There, the magnetic force of the rod is then reduced or switched off, so that the magnetic particles detach from the rod and are suspended in a liquid present in the reaction vessel. Similar methods are also known from US 6,065,605 and WO 2005/005049.
  • EP 0 965 842 discloses a device in which the magnetic particles, together with the liquid in which they are suspended, are drawn up in a pipette.
  • the pipette tip has a special separation area, which can be acted upon by a magnet with a magnetic field.
  • the magnetic particles as a pellet or magnetic sediment immobilized on the inside of the pipette tip.
  • the aspirated liquid is removed from the pipette tip by the pipetting function of the device.
  • EP 015 905 520 Another principle for the separation of magnetic particles is described in EP 015 905 520.
  • the magnetic particles remain in the same reaction vessel while the liquid in this vessel is exchanged.
  • the magnetic sediments can be immobilized at a desired height on the side wall of the reaction vessel for adaptation to a respective process step. This is done by providing magnets which are arranged on different arms of a rotatably mounted carrier at a different distance from the axis of rotation. By rotating the carrier, a particular arm can be brought into the vicinity of the side wall of the reaction vessel, and thus a specific magnet. At this point, the magnetic particles are then immobilized as a pellet.
  • the present invention has for its object to overcome the described, resulting from the prior art disadvantages and in particular for a wide range of applications to provide a device and a method in which a treatment of liquids with magnetic particles in a simple manner possible is.
  • an apparatus for treating liquids with magnetic particles comprising a plurality of first, disposed in the liquid magnetic particles and at least one, arranged in the liquid, preferably rod, dumbbell and / or ellipsoidal shaped magnetic and / or magnetizable central element in which the ratio of the longest diameter d2 of the at least one central element to the ratio of the average diameter d1 of the magnetic particles is at least
  • central element is understood to mean, in particular, any article which is capable of being subjected to magnetic field action, possibly under the action of a further, “external” magnet (as described below) - to bind at rest in at least the majority of the magnetic particles.
  • the at least one central element comprises a magnet, preferably a permanent magnet; According to an alternative preferred embodiment of the invention, the at least one central element comprises a magnetizable material, e.g. Iron.
  • liquids is understood to mean, but is not limited to, aqueous solutions, suspensions and / or biphasic emulsions with water as a phase containing biomolecules.
  • treating in the sense of the present invention is understood in particular to mean that certain biomolecules can attach to the magnetic particles in a separation step, but the present invention is expressly not limited thereto.
  • diameter of the magnetic particles is meant in particular, when the magnetic particles are not spherical or substantially spherical, the respective longest diameter of the magnetic particles.
  • average diameter is meant in particular the arithmetic mean of the diameters of the magnetic particles, which can be measured randomly, in particular (but not limited thereto).
  • Such a device provides at least one of the following advantages for a wide range of applications within the present inventions: Characterized in that at least one central element is provided, a homogenization of the magnetic particles as well as a separation of the magnetic particles from the solution in a simple manner possible, as described below, inter alia.
  • the device allows use in "closed" systems, this is a preferred embodiment of the invention in that it requires no further means (such as a bar magnet, etc.) which dip directly into the liquid and thus constitute a potential source of contamination. It results in a very fast and easy for most applications
  • the ratio of the longest diameter d2 of the at least one central element to the ratio of the average diameter d1 of the magnetic particles d2 (mm) is> 50 * dl (mm), more preferably d2 (mm)> 100 * dl (mm Further, d2 (mm)> 200 * dl (mm), and most preferably d2 (mm)> 300 * dl (mm).
  • the ratio of the volume V2 is the at least one central element to the ratio of the average volume Vl of the magnetic particles V2 (mm 3)> 100 * V1 (mm 3), more preferably, V2 (mm 3)> 1000 * V1 (mm 3 ) and most preferably V2 (mm 3 )> 10 5 * V1 (mm 3 ).
  • the number of magnetic particles per central element is> 10 4 to ⁇ 10 8 , preferably> 5 ⁇ 10 5 to ⁇ 5 ⁇ 10 6 .
  • the magnetic particles comprise a material selected from the group of paramagnetic materials, superparamagnetic materials, ferromagnetic materials, ferromagnetic materials and mixtures thereof.
  • the average saturation magnetization of the magnetic particles is> 1 Am 2 / kg and 250 AmVkg, preferably> 10 AmVkg and 240 Am 2 / kg, and most preferably> 20 AmVkg and 235 AmVkg.
  • the at least one central element is rod, dumbbell and / or ellipsoidal and the ratio of the longest diameter a to the ratio of the shortest diameter b is from
  • the at least one central element is rod, dumbbell and / or ellipsoidal in shape and the ratio of the longest diameter a to the ratio of the shortest diameter b is from a / b> 1.5 to a / b ⁇ 8, preferably a / b> 2 to a / b ⁇ 5.
  • the magnetic particles and the at least one central element are arranged in a closed vessel.
  • the added volume V m of the magnetic particles and that of the at least one central element are> 0.25% to ⁇ 50% of the total volume V G of the vessel. This has proven to be beneficial for many applications.
  • the added volume V m of the magnetic particles and that of the at least one central element are> 0.5% to ⁇ 20%, more preferably> 1% to ⁇ 15% of the total volume V G of the vessel.
  • the device according to the invention further comprises at least one external magnet, which is designed to interact with the at least one central element.
  • the central element is a permanent magnet
  • the ratio of the magnet strength H3 of the at least one external magnet to the magnet strength H 2 of the at least one central element H 3 > 1.5 * H 2 to H 3 ⁇ 8 * H 2 , even more preferably H 3 > 2 * H 2 to H 3 ⁇ 5 * H 2 .
  • the at least one external magnet is and / or comprises an electromagnet (s) which is operated to homogenize the magnetic particles under alternating voltage.
  • the central element is then preferably a (permanent) magnet.
  • the at least one external magnet is and / or comprises a permanent magnet (s).
  • the present invention also relates to a method of treating liquids with magnetic particles comprising a plurality of first magnetic particles arranged in the liquid and at least one in the liquid, preferably rod, dumbbell and / or ellipsoidal - Shaped trained magnetic or magnetizable central element, comprising the steps
  • step a) comprises a resuspension of the magnetic particles in the liquid.
  • step a) prior to step a) the magnetic particles were at least partially, preferably almost completely, attached to the at least one central element and step a) takes place by the action of an external force on the at least one central element.
  • step b) is supported by means of a further, external permanent magnet.
  • a further, external permanent magnet is brought into the vicinity of the vessel in which the magnetic particles and the at least one central element are located.
  • the method according to the invention comprises a device according to the invention.
  • the present invention also relates to the use of a device according to the invention and / or a method according to the invention for the at least partial separation of biomolecules from / in a preferably aqueous solution.
  • biomolecules includes, but is not limited to, all biomolecules, such as lipids, carbohydrates, metabolites, metabolites, all types of nucleic acids, all types of peptides and proteins, and also substituted or functionalized peptides and / or proteins understood.
  • biomolecules are understood to mean, but is not limited to, all naturally occurring or artificially introduced molecules in biological samples.
  • the device according to the invention and / or the method according to the invention is used for the at least partial removal of nucleic acids from / in a preferably aqueous solution.
  • nucleic acid in the context of the present invention particularly, but not limited to, natural, preferably isolated, linear, branched or circular nucleic acids such as RNA, in particular mRNA, siRNA, miRNA, snRNA, tRNA, hnRNA or ribozymes, DNA and the like, synthetic or modified nucleic acids, for example oligonucleotides, in particular primers, probes or standards used for the PCR, nucleic acids labeled with digoxigenin, biotin or fluorescent dyes or so-called PNAs ("peptide nucleic acids").
  • RNA in particular mRNA, siRNA, miRNA, snRNA, tRNA, hnRNA or ribozymes, DNA and the like
  • synthetic or modified nucleic acids for example oligonucleotides, in particular primers, probes or standards used for the PCR, nucleic acids labeled with digoxigenin, biotin or fluorescent dyes or so-called PNAs ("peptide nucle
  • FIG. 1 shows a very schematic view of a device according to the invention according to an embodiment of the invention prior to "homogenization" of the magnetic particles;
  • Fig. 2 shows the device of Fig. 1 after "homogenization"
  • FIG. 3 shows a UV curve of a DNA elution solution after carrying out a preparation of genomic DNA according to Example I.
  • FIG. 3 shows a UV curve of a DNA elution solution after carrying out a preparation of genomic DNA according to Example I.
  • FIG. 1 shows a very schematic view of a device according to the invention according to an embodiment. It should be noted that FIGS. 1 and 2 are highly schematic, and in most of the inventors' applications, the actual ratios (whether size ratios such as the number of magnetic particles) will be different.
  • the device comprises a plurality of first magnetic particles 10, which are deposited in the "resting state" on a central element 20.
  • Magnetic particles 10 and central magnet 20 are arranged in a (preferably closed) vessel 100, which optionally via (schematically indicated by dashed lines) inlets and outlets 110 or 120.
  • the vessel 100 is preferably filled with a liquid 150 so high that the magnetic particles 10 and the central element 20 are in the liquid.
  • the central member 20 is a permanent magnet; however, this is not limiting.
  • the central element 20 may also contain a magnetizable material such as iron.
  • Another embodiment for moving the at least one central element is a one-dimensional oscillating movement. Due to the effect of a magnetic field that moves back and forth along a line, the at least one central element is "hewn" alternately against the opposite vessel walls, as a result of which the magnetic particles are also shaken off effectively by the central element 20.
  • a shaking movement of the at least one central element can also take place by means of an electromagnet when it is operated under alternating voltage and the magnetic field polarity changes alternately, in that respect this also constitutes a preferred embodiment of the invention. Changing the operating mode to direct current thus finds a magnetic separation instead of.
  • the magnetic particles 10 re-attach to the central element 20, so that (substantially) the state of FIG. 1 is reached again.
  • the liquid 150 may now be e.g. be removed from the vessel or other reagents may be added, depending on the specific application.
  • Example I Preparation of genomic DNA from 5 ml of whole blood
  • Buffer AL brand product from QIAGEN
  • QIAGEN Proteinase K
  • the supernatant was removed, followed by air drying of the magnetic particles for 20 min.
  • the UV curve of the supernatant can be seen in FIG. Based on the UV spectrum, the yield can be estimated, which was approximately quantitative in Example 1 (about 170 micrograms of genomic DNA from 5 ml of whole blood).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zum Behandeln von Flüssigkeiten mit magnetischen Partikeln, wobei zusätzlich mindestens ein weiteres Zentralelement vorhanden ist, der für das Sammeln und Homogenisieren der Partikel sorgt.

Description

VORRICHTUNG UND VERFAHREN ZUM BEHANDELN VON FLÜSSIGKEITEN MIT MAGNETISCHEN PARTIKELN
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zum Behandeln von Flüssigkeiten mit magnetischen Partikeln. Die Vorrichtung sowie das Verfahren sind beispielsweise für Anwendungszwecke in der Biochemie, kli- nischen Chemie, Molekularbiologie, Mikrobiologie, medizinischen Diagnostik oder forensischen Medizin geeignet.
Technischer Hintergrund
Im Stand der Technik ist eine Vielzahl von Verfahren zum Behandeln von Flüssigkeiten mit magnetischen Partikeln bekannt, wobei sich diese meist auf das Abtrennen von Nukleinsäuren oder anderen biologisch oder biochemisch relevanten Stoffen aus einer Lösung beziehen.
Verfahren, die auf der magnetischen Abtrennung unter Verwendung von spezifisch und/oder unspezifisch bindenden, magnetischen Partikeln beruhen, haben im Bereich der Probenvorbereitung für diagnostische oder analytische Untersuchungen, insbesondere für die Isolierung von Nukleinsäuren, Proteinen und Zellen, zunehmende Bedeutung erlangt.
Dies gilt insbesondere für automatisierte Verfahren, da auf diese Weise eine große Anzahl von Proben innerhalb kurzer Zeit vorbereitet werden können und auf ar- beitsaufwendige Zentrifugationsschritte verzichtet werden kann. Dadurch werden die Voraussetzungen für einen effizienten und hohen Probendurchsatz geschaffen. Dies ist von enormer Bedeutung, da eine rein manuelle Handhabung von sehr großen Probenzahlen praktisch nicht zu bewältigen ist.
Das Grundprinzip der magnetischen Abtrennung von Substanzen aus komplexen Gemischen beruht darauf, dass magnetische Partikel z.B. durch chemische Behandlung ihrer Oberfläche mit spezifischen Bindungseigenschaften für die abzutrennenden Zielsubstanzen ausgestattet werden. Die Größe solcher Magnetpartikel liegt im Allgemeinen im Bereich von ca. 0,05 bis 500 μm, so dass sie eine große Oberfläche für die Bindungsreaktion bereitstellen. In Abhängigkeit von ihrer Größe und Beschaffenheit können die magnetischen Partikel eine Dichte aufweisen, die ähnlich der Dichte der Flüssigkeit ist, in der sie suspendiert sind. In diesem Fall kann eine Sedimentierung der magnetischen Partikel durchaus einige Stunden dauern.
Bei bekannten Trennverfahren werden die Magnetpartikel durch Anwendung magnetischer Kräfte bzw. eines Magnetfeldes, beispielsweise mittels eines Permanentmagneten, an einer Stelle immobilisiert. Diese Ansammlung der Magnet- partikel wird auch als Pellet oder Magnetsediment bezeichnet. Nachfolgend wird der flüssige Überstand beispielsweise durch Absaugen oder Dekantieren abgetrennt und verworfen. Da die Magnetpartikel durch die magnetischen Kräfte immobilisiert sind, wird weitgehend verhindert, dass magnetische Partikel zusammen mit dem Überstand abgetrennt werden.
Typischerweise werden die immobilisierten Magnetpartikel anschließend resuspendiert. Zur Anreicherung der gebundenen Zielsubstanzen wird eine Eluti- onsflüssigkeit bzw. ein Elutionspuffer verwendet. Die Bindung zwischen der Ziel- Substanz und den Magnetpartikeln wird gelöst und die Zielsubstanz-Moleküle von den Magnetpartikeln freigesetzt. Die Zielsubstanz-Moleküle können dann zusammen mit der Elutionsflüssigkeit abgetrennt werden, während die Magnetpartikel durch Einwirkung eines Magnetfeldes immobilisiert werden. Durch Verringe- rung des Volumens an Elutionsflüssigkeit in Bezug zum primären Ausgangsvolumen zur Bindung, können die Zielsubstanz-Moleküle nicht nur angereichert, sondern auch konzentriert werden. Vor dem Elutionsschritt können ein oder mehrere Waschschritte durchgeführt werden.
Für die Durchführung solcher Trennverfahren mittels magnetischer Partikel sind verschiedenartige Vorrichtungen beschrieben worden. So beschreibt US 2001/0022948 eine Vorrichtung, bei der ein magnetischer Stab in ein erstes Reaktionsgefäß eintaucht, das in Flüssigkeit suspendierte magnetische Partikel enthält.
Dort zieht der magnetische Stab die magnetischen Partikel an, so dass die Magnetpartikel an dem Stab anhaften. Der magnetische Stab wird dann zusammen mit den daran anhaftenden magnetischen Partikeln aus dem Reaktionsgefäß gezogen und in ein zweites Reaktionsgefäß eingeführt. Dort wird dann die Magnetkraft des Stabes verringert bzw. abgeschaltet, so dass sich die magnetischen Partikel von dem Stab lösen und in einer im Reaktionsgefäß befindlichen Flüssigkeit suspendiert werden. Ähnliche Verfahren sind auch aus der US 6,065,605 und der WO 2005/005049 bekannt.
Hingegen ist aus der EP 0 965 842 eine Vorrichtung bekannt, bei der die magneti- sehen Partikel zusammen mit der Flüssigkeit, in der sie suspendiert sind, in einer Pipette aufgezogen werden. Die Pipettenspitze weist einen speziellen Separationsbereich auf, der durch einen Magneten mit einem Magnetfeld beaufschlagt werden kann. Dadurch werden die Magnetpartikel als Pellet oder Magnetsediment an der Innenseite der Pipettenspitze immobilisiert. Anschließend wird die aspirierte Flüssigkeit durch die Pipettierfunktion der Vorrichtung aus der Pipettenspitze entfernt.
Danach kann das Magnetfeld im Separationsbereich wieder entfernt werden, wodurch die im Pellet immobilisierten Magnetpartikel wieder freigegeben werden. Ein ähnliches Verfahren und eine ähnliche Vorrichtung sind in der US 6,187,270 beschrieben.
Ein anderes Prinzip zur Abtrennung magnetischer Partikel beschreibt die EP 015 905 520. Dabei verbleiben die magnetischen Partikel in demselben Reaktionsgefäß während die Flüssigkeit in diesem Gefäß ausgetauscht wird. Die Magnetsedimente können zur Anpassung an einen jeweiligen Prozessschritt in einer gewünschten Höhe an der Seitenwand des Reaktionsgefäßes immobilisiert werden. Dies erfolgt durch Bereitstellung von Magneten, die auf verschiedenen Armen eines drehbar gelagerten Trägers in jeweils unterschiedlicher Entfernung von der Drehachse angeordnet sind. Durch Drehen des Trägers kann jeweils ein bestimmter Arm - und damit ein bestimmter Magnet - in die Nähe der Seitenwand des Reaktionsgefäßes gebracht werden. An dieser Stelle werden dann die Magnetpartikel als Pellet immobilisiert.
Die genannten herkömmlichen Vorrichtungen und Verfahren weisen alle die gemeinsame Eigenschaft auf, dass sie als so genannte „offene Systeme" ausgebildet sind, da gemäß ihrem jeweiligen Funktionsprinzip magnetische Stäbe oder Pipet- ten ein- oder mehrmals in das Reaktionsgefäß eingeführt werden müssen. Dadurch besteht bei diesen herkömmlichen Vorrichtungen und Verfahren das Risiko einer Kreuzkontamination anderer Reaktionsgefäße durch Aerosol- und/oder
- A - Tropfenbildung. Untersuchungsergebnisse können verfälscht oder sogar unbrauchbar werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die beschriebenen, sich aus dem Stand der Technik ergebenden Nachteile zu überwinden und insbesondere für eine weite Spanne von Anwendungen eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zu schaffen, bei dem ein Behandeln von Flüssigkeiten mit magnetischen Partikeln auf einfache Weise möglich ist.
Die Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gemäß Anspruch 1 der vorliegenden Erfindung gelöst. Demgemäß wird eine Vorrichtung zum Behandeln von Flüssigkeiten mit magnetischen Partikeln, umfassend eine Vielzahl von ersten, in der Flüssigkeit angeordneten magnetischen Partikeln sowie mindestens ein, in der Flüssigkeit angeordnetes, bevorzugt stab-, hantel- und/oder ellipsoidförmig ausgebildetes magnetisches und/oder magnetisierbares Zentralelement, wobei das Verhältnis des längsten Durchmessers d2 des mindestens einen Zentralelements zum Verhältnis des durchschnittlichen Durchmessers dl der magnetischen Parti- kel mindestens
d2 (mm) > 15*dl (mm)
beträgt.
Unter dem Begriff „Zentralelement" wird im Sinne der vorliegenden Erfindung insbesondere jeder Gegenstand verstanden, welcher in der Lage ist, durch Magnetfeldeinwirkung - ggf. unter Einwirkung eines weiteren, „externen" Magneten (wie im Folgenden beschrieben) - im Ruhezustand zumindest die Mehrzahl der magnetischen Partikel an sich zu binden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das mindes- tens eine Zentralelement einen Magneten, bevorzugt einen Permanentmagnet; gemäß einer alternativen, bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das mindestens eine Zentralelement ein magnetisierbares Material, wie z.B. Eisen.
Unter dem Begriff „Flüssigkeiten" werden - aber nicht darauf beschränkt - im Sinne der vorliegenden Erfindung insbesondere wässrige Lösungen, Suspensionen und/oder zweiphasige Emulsionen mit Wasser als einer Phase, die Biomoleküle enthalten verstanden.
Unter dem Begriff „Behandeln" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird insbe- sondere verstanden, dass in einem Separationsschritt bestimmte Biomo leküle sich an die Magnetpartikel anlagern können; die vorliegende Erfindung ist jedoch ausdrücklich nicht darauf beschränkt.
Unter dem Begriff „Durchmesser" der Magnetpartikel ist insbesondere, wenn die Magnetpartikel nicht kugelförmig oder im wesentlichen kugelförmig sind, der jeweils längste Durchmesser der Magnetpartikel gemeint.
Unter dem Begriff „durchschnittlicher Durchmesser" ist insbesondere das arithmetische Mittel der Durchmesser der Magnetpartikel gemeint, welches insbeson- dere (aber nicht darauf beschränkt) stichprobenartig gemessen werden kann.
Eine derartige Vorrichtung bietet für eine weite Spanne von Anwendungen innerhalb der vorliegenden Erfindungen mindestens einen der folgenden Vorteile: Dadurch, dass mindestens ein Zentralelement vorgesehen ist, ist eine Homogenisierung der Magnetpartikel wie auch eine Separierung der Magnetpartikel von der Lösung auf einfache Weise möglich, wie u.a. nachfolgend beschrieben. - Die Vorrichtung erlaubt den Einsatz in „geschlossenen" Systemen; dies stellt insofern eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar. Es sind keine weiteren Mittel (wie ein Stabmagnet etc.) notwendig, die direkt in die Flüssigkeit eintauchen und somit eine potentielle Kontaminationsquelle darstellen. - Es ergibt sich für die meisten Anwendungen eine sehr schnelle und leichte
Homogenisierung der Magnetpartikel.
Weiterhin ist meist eine sehr schnelle Separation der Magnetpartikel möglich. - Neben dem einfachen Aufbau der Vorrichtung ist gleichzeitig der zu betreibende technische Aufwand meist sehr gering.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Verhältnis des längsten Durchmessers d2 des mindestens einen Zentralelements zum Verhältnis des durchschnittlichen Durchmessers dl der magnetischen Partikel d2 (mm) >50 *dl (mm), noch bevorzugt d2 (mm) >100 *dl (mm), ferner bevorzugt d2 (mm) >200 *dl (mm), sowie am meisten bevorzugt d2 (mm) >300 *dl (mm).
Dies hat sich für eine breite Spanne von Anwendungen innerhalb der vorliegenden Erfindung als vorteilhaft herausgestellt, da so die gewünschten erfinderischen Effekte oftmals auf einfache Weise erzielt werden können.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Verhältnis des Volumens V2 des mindestens einen Zentralelements zum Verhältnis des durchschnittlichen Volumens Vl der magnetischen Partikel V2 (mm3) > 10 *Vl (mm3).
Dies hat sich ebenfalls als günstig herausgestellt, da so insbesondere sichergestellt werden kann, dass nach einer Homogenisierung (Resuspendierung) der Magnetpartikel diese sich wieder an den Magneten anlagern.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Verhältnis des Volumens V2 des mindestens einen Zentralelements zum Verhältnis des durchschnittlichen Volumens Vl der magnetischen Partikel V2 (mm3) > 100 *V1 (mm3), noch bevorzugt V2 (mm3) > 1000 *V1 (mm3) sowie am meisten bevorzugt V2 (mm3) > 105 *V1 (mm3).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beträgt die Anzahl der magnetischen Partikel pro Zentralelement >104 bis <108, bevorzugt >5 x 105 bis < 5 x 106.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beinhalten die magne- tischen Partikel ein Material, ausgewählt aus der Gruppe paramagnetische Materialien, superparamagnetische Materialien, ferromagnetische Materialien, ferri- magnetische Materialien sowie Mischungen daraus.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beträgt die durch- schnittliche Sättigungsmagnetisierung der magnetischen Partikel >1 Am2/kg und 250 AmVkg, bevorzugt >10 AmVkg und 240 Am2/kg, sowie am meisten bevorzugt >20 AmVkg und 235 AmVkg. Dies hat sich für viele Anwendungen der vorliegenden Erfindung als vorteilhaft herausgestellt. Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung ist das mindestens eine Zentralelement stab-, hantel- und/oder ellipsoidförmig ausgebildet und das Verhältnis des längsten Durchmessers a zum Verhältnis des kürzesten Durchmessers b ist von
a/b > 1.1 bis a/b <10.
Dies hat sich insbesondere für eine einfache Homogenisierung der Magnetpartikel bei vielen Anwendungen als günstig herausgestellt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das mindestens eine Zentralelement stab-, hantel- und/oder ellipsoidförmig ausgebildet und das Verhältnis des längsten Durchmessers a zum Verhältnis des kürzesten Durchmessers b ist von a/b > 1.5 bis a/b <8, bevorzugt a/b > 2 bis a/b <5.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die magnetischen Partikel und das mindestens eine Zentralelement in einem geschlossenen Gefäß angeordnet.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung betragen das addierte Volumen Vm der magnetischen Partikel sowie das des mindestens einen Zentralelements >0,25% bis <50% des Gesamtvolumens VG des Gefäßes. Dies hat sich für viele Anwendungen als günstig herausgestellt.
Bevorzugt betragen das addierte Volumen Vm der magnetischen Partikel sowie das des mindestens einen Zentralelements >0,5% bis <20%, noch mehr bevorzugt >1% bis <15%, des Gesamtvolumens VG des Gefäßes. Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung umfasst die erfindungsgemäße Vorrichtung weiterhin mindestens einen externen Magneten, welcher zur Interaktion mit dem mindestens einen Zentralelement ausgebildet ist.
Für den Fall, dass es sich bei dem Zentralelement um einen Permanentmagneten handelt, ist gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung das Verhältnis der Magnetstärke H3 des mindestens einen externen Magneten zur Magnetstärke H2 des mindestens einen Zentralelements
H3 > l.l* H2bis H3 < 10* H2
Dies hat sich als günstig herausgestellt, da so der mindestens eine Zentralelement auf der einen Seite erfindungemäß häufig sehr gut beeinfiusst werden kann, auf der anderen Seite die Homogenisierung bzw. Anlagerung der Magnetpartikel an das mindestens eine Zentralelement nicht unnötig beeinfiusst wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Verhältnis der Magnetstärke H3 des mindestens einen externen Magneten zur Magnetstärke H2 des mindestens einen Zentralelements H3 > 1.5* H2 bis H3 < 8* H2, noch mehr bevorzugt H3 > 2* H2 bis H3 < 5* H2.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist und/oder umfasst der mindestens eine externe Magnet ein(en) Elektromagnet(en), der zur Homogenisierung der magnetischen Partikel unter Wechselspannung betrieben wird. In dieser Ausführung ist dann bevorzugt das Zentralelement ein (Permanent-) Magnet. Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung ist und/oder umfasst der mindestens eine externe Magnet ein(en) Permanentmagnet(en).
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zum Behan- dein von Flüssigkeiten mit magnetischen Partikeln, umfassend eine Vielzahl von ersten, in der Flüssigkeit angeordneten magnetischen Partikeln sowie mindestens ein, in der Flüssigkeit angeordnetes, bevorzugt stab-, hantel- und/oder ellipsoid- förmig ausgebildetes magnetisches oder magnetisierbares Zentralelement, umfassend die Schritte
a) Verteilen der magnetischen Partikel in der Flüssigkeit sowie nachfolgend b) Anlagern der magnetischen Partikel an das mindestens eine Zentralelement.
Ein derartiges Verfahren bietet für eine weite Spanne von Anwendungen inner- halb der vorliegenden Erfindungen mindestens einen der folgenden Vorteile:
Dadurch, dass mindestens ein Zentralelement vorgesehen ist, ist eine Homogenisierung der Magnetpartikel wie auch eine Separierung der Magnetpartikel von der Lösung auf einfache Weise möglich, wie u.a. nachfolgend beschrieben.
Das Verfahren erlaubt den Einsatz in „geschlossenen" Systemen. Es sind keine weiteren Mittel (wie ein Stabmagnet etc.) notwendig, die in die Flüssigkeit eintauchen und somit eine potentielle Kontaminationsquelle darstellen. - Es ergibt sich für die meisten Anwendungen eine sehr schnelle und leichte
Homogenisierung der Magnetpartikel
Weiterhin ist meist eine sehr schnelle Separation der Magnetpartikel möglich - Neben dem einfachen Aufbau des Verfahrens ist gleichzeitig der zu betreibende technische Aufwand meist sehr gering.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst Schritt a) eine Resuspendierung der magnetischen Partikel in der Flüssigkeit.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung waren vor dem Schritt a) die magnetischen Partikel zumindest teilweise, bevorzugt fast vollständig, an das mindestens eine Zentralelement angelagert und Schritt a) erfolgt durch Ein- Wirkung einer externen Kraft auf das mindestens eine Zentralelement.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Schritt b) mittels eines weiteren, externen Permanentmagneten unterstützt. Dabei geschieht dies bevorzugt dergestalt, dass ein externer Permanentmagnet in die Nähe des Gefäßes gebracht wird, in der sich die Magnetpartikel und das mindestens eine Zentralelement befinden. Dadurch kann bei vielen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung das Anlagern der Magnetpartikel an das mindestens eine Zentralelement deutlich schneller gestaltet werden. Diese Ausführungsform hat sich auch insbesondere dann als vorteilhaft herausgestellt, wenn das mindestens eine Zent- ralelement kein Permanentmagnet ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das erfindungsgemäße Verfahren eine erfindungsgemäße Vorrichtung.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung und/oder eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur zumindest teilweisen Abtrennung von Biomo lekülen aus/in einer vorzugsweise wässrigen Lösung. Unter dem Term „Biomoleküle" werden - aber nicht darauf beschränkt - im Sinne der vorliegenden Erfindung sämtliche Biomoleküle, wie z. B Lipide, Kohlenhydrate, Metabolite, Stoffwechselprodukte, alle Arten von Nukleinsäuren, alle Arten von Peptiden und Proteinen, auch substutierte oder funktionalisierte Peptide und/oder Proteine verstanden.
Unter dem Term „Biomoleküle" werden weiterhin - aber nicht darauf beschränkt - im Sinne der vorliegenden Erfindung sämtlich in biologischen Proben natürlicherweise vorkommende oder künstlich eingebrachte Moleküle verstanden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die erfindungsgemäße Vorrichtung und/oder das erfindungsgemäße Verfahren zur zumindest teilweisen Abtrennung von Nukleinsäuren aus/in einer vorzugsweise wässrigen Lösung verwendet.
Unter dem Term „Nukleinsäure" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird insbesondere - aber nicht darauf beschränkt - natürliche, vorzugsweise isolierte, lineare, verzweigte oder zirkuläre Nukleinsäuren wie RNA, insbesondere mRNA, siRNA, miRNA, snRNA, tRNA, hnRNA oder Ribozyme, DNA und dergleichen, synthetische oder modifizierte Nukleinsäuren, beispielsweise Oligonukleotide, insbesondere für die PCR verwendete Primer, Sonden oder Standards, mit Digo- xigenin, Biotin oder Fluoreszensfarbstoffen markierte Nukleinsäuren oder sogenannte PNAs (,peptide nucleic acids") verstanden.
Die vorgenannten sowie die beanspruchten und in den Ausführungsbeispielen beschriebenen, erfindungsgemäß zu verwendenden Komponenten unterliegen in ihrer Größe, Formgestaltung, Materialauswahl und technischen Konzeption keinen besonderen Ausnahmebedingungen, so dass die in dem Anwendungsgebiet bekannten Auswahlkriterien uneingeschränkt Anwendung finden können. Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile des Gegenstandes der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen sowie aus der nachfolgenden Beschreibung der zugehörigen Figuren und Beispiele, in denen - beispielhaft - mehrere Ausfüh- rungsbeispiele sowie Einsatzmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung dargestellt sind.
Fig. 1 zeigt eine sehr schematische Ansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß eines Ausführungsbeispiels der Erfindung vor „Homogenisie- rung" der Magnetpartikel;
Fig. 2 zeigt die Vorrichtung aus Fig. 1 nach „Homogenisierung"; sowie
Fig. 3 eine UV-Kurve einer DNA-E lutionslösung nach Durchführung einer Prä- paration von genomischer DNA gemäß Beispiel I.
Fig. 1 zeigt eine sehr schematische Ansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel. Es sei angemerkt, dass Fig. 1 und 2 hochgradig schematisch sind und bei den meisten Anwendungen der Erfinder die tatsäch- liehen Verhältnisse (sei es Größenverhältnisse wie die Anzahl der Magnetpartikel) anders sein werden.
Die Vorrichtung umfasst mehrere erste Magnetpartikel 10, die im „Ruhezustand" an ein Zentralelement 20 angelagert sind. Magnetpartikel 10 und zentraler Magnet 20 sind dabei in einem (vorzugsweise geschlossenen) Gefäß 100 angeordnet, welches wahlweise über (schematisch strichartig angedeutete) Ein- und Ablässe 110 bzw. 120 verfügen kann. Das Gefäß 100 ist vorzugsweise mit einer Flüssigkeit 150 so hoch gefüllt, dass sich die Magnetpartikel 10 und das Zentralelement 20 in der Flüssigkeit befinden. In der vorliegenden Ausführungsform ist das Zentralelement 20 ein Permanentmagnet; dies ist jedoch nicht beschränkend. Wie bereits geschildert kann das Zentralelement 20 auch ein magnetisierbares Material wie Eisen enthalten.
Durch Bewegen des Zentralelements 20 (z.B. durch Drehen in Richtung des Pfeils A oder alternativ durch Rütteln), welches vorzugsweise mittels eines weiteren (in der Fig. nicht gezeigten) Magneten erfolgt, ist es möglich, die Magnetpartikel von dem Zentralelement 20 zu „lösen" (quasi „abzuschütteln") und im Gefäß zu ver- teilen, so dass sich (abhängig von der konkreten Anwendung) z.B. Biomoleküle an die Magnetpartikel anlagern können.
Es sei an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass es sich bei vielen Anwendungen der vorliegenden Erfindung als günstig erwiesen hat, dass, wenn eine Kreis- (oder kreisartige) Bewegung des Zentralelements 20 stattfindet, der Mittelpunkt dieses „imaginären" Kreises sich nicht in der Nähe des Mittelpunktes des Gefäßes 100 befindet. Durch diese Anordnung wird oftmals bewirkt, dass die Magnetpartikel 10 bei der Homogenisierung vom Zentralelement 20 regelrecht „weggeschleudert" werden, was den Schritt der Homogenisierung nochmals erleichtert. Somit stellt dies eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.
Eine weitere Ausführungsform zur Bewegung des mindestens einen Zentralelements ist eine eindimensionale oszillierende Bewegung. Durch die Auswirkung eines Magnetfeldes, das sich auf einer Linie vor- und zurückbewegt, wird das mindestens eine Zentralelemente alternierend an die gegenüberliegenden Gefäßwände „gehauen", wodurch die Magnetpartikel von dem Zentralelement 20 auch effektiv abgeschüttelt werden. Eine Rüttelbewegung des mindestens einen Zentralelements kann auch mittels eines Elektromagneten erfolgen wenn dieser unter Wechselspannung betrieben wird und sich die Magnetfeld-Polung alternierend ändert, insofern stellt dies ebenfalls eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar. Ändert man die Be- triebsart auf Gleichstrom so findet eine Magnetseparation statt.
Der Zustand nach dieser „Homogenisierung" ist sehr schematisch in Fig. 2 gezeigt.
Wird die Bewegung des Zentralelements 20 gestoppt, so lagern sich die Magnetpartikel 10 wieder an das Zentralelement 20 an, so dass (im Wesentlichen) der Zustand der Fig. 1 wieder erreicht wird. Die Flüssigkeit 150 kann nun z.B. aus dem Gefäß entfernt werden oder es können weitere Reagenzien zugegeben werden, je nach konkreter Anwendung.
Die Erfindung wird nachfolgend ebenfalls anhand von Beispielen erläutert. Es versteht sich, dass diese rein illustrativ zu betrachten sind und keine Einschränkung der vorliegenden Erfindung darstellen sollen, welche ausschließlich durch die Ansprüche festgelegt wird.
Es sei insbesondere explizit angemerkt, dass das vorliegende Beispiel auch im Hinblick auf die beschriebenen Größen-/Volumen-/Mengenangaben bzw. die geometrischen Gestaltungsformen des Reaktionsgefäßes rein illustrativ zu verstehen ist. Die vorliegende Erfindung ist, wie sich bei vielen Anwendungen und Ausfüh- rungsbespielen gezeigt hat, innerhalb einer weiten Größenordnung anwendbar und ein Fachmann wird dementsprechend andere Dimensionen bzw. Anordnungen wählen. Neben dem Vorteil das Verfahren als geschlossenes System zu betreiben, liegt natürlich die Option offen dies auch als offenes System zu gestalten (siehe Beispiel I). Insbesondere hat sich gezeigt, dass die vorliegende Erfindung auch bei Mikro Systemen, wie Mikromischern etc., bei vielen Anwendungen sehr gut einsetzbar ist, was eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt.
Beispiel I: Präparation von genomischer DNA aus 5 ml Vollblut
Aus 5 ml Vollblut wurden mittels des folgenden Protokolls die genomische DNA isoliert:
5 ml Blut wurden in ein 30 ml Becherglas mit einem Zentralelement (Standard Teflon-ummantelter Rührfisch; Länge 2 cm; Durchmesser 7 mm) gegeben.
Anschließend wurden 5 ml Buffer AL (Markenprodukt der Fa. QIAGEN) sowie 500 μl Proteinase K (QIAGEN) zugegeben. Es erfolgte eine Inkubation für 30 min bei 600C auf einem Magnetheizrührer bei langsamer Rührgeschwindigkeit.
Danach wurden 5 ml Isopropanol und 500 μl MagAttract Suspension G (QIAGEN) zugegeben, welche die Magnetpartikel enthielt; der durchschnittliche Durchmesser der Partikel ist 8 μm.
Mittels eines externen Magnetrührers wurde 5 min. gerührt, um die genomische DNA an die Magnetpartikel zu binden.
Anschließend wurde der Rührer gestoppt, worauf sich die Magnetpartikel an das Zentralelement anlagerten. Der Überstand wurde entfernt, anschließend wurden 15 ml Waschpuffer AWl (QIAGEN) zugeben. Es erfolgte eine Homogenisieren der Magnetpartikel durch Rühren für 60 sec, anschließend erneut eine Magnetseparation durch Rührstopp.
Es erfolgte ein erneutes Entfernen des Überstandes sowie die Zugabe von 15 ml Waschpuffer AW2 (QIAGEN). Danach wurden die Magnetpartikel durch Rühren für 60 sec. Homogenisiert. Nach Rührstopp erfolgte eine Anlagerung der Magnetpartikel an das Zentralelement.
Der Überstand wurde entfernt, danach erfolgte ein Lufttrocknen der Magnetparti- kel für 20 min.
Um die DNA zu eluieren wurden 5 ml Buffer TE (DNA Elution, QIAGEN) zugegeben. Danach wurden die Magnetpartikel durch Rühren für 5 min homogenisiert, nach Rührstopp erfolgte die Anlagerung der Magnetpartikel an das Zentralele- ment.
Der Überstand, der nun die DNA enthielt, wurde in ein geeignetes Lagerungs- röhrchen überführt und die DNA- Konzentration durch UV-Quantifizierung und OD Scan gemessen.
Die UV-Kurve des Überstandes ist in Fig.3 zu sehen. Anhand des UV-Spektrums kann die Ausbeute abgeschätzt werden, die in Beispiel 1 annähernd quantitativ erfolgte (ca. 170 μg genomische DNA aus 5 ml Vollblut).

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Vorrichtung zum Behandeln von Flüssigkeiten mit magnetischen Partikeln, umfassend eine Vielzahl von in der Flüssigkeit angeordneten magnetischen
Partikeln sowie mindestens ein, in der Flüssigkeit angeordnetes, bevorzugt stab-, hantel- und/oder ellipsoidförmig ausgebildetes magnetisches und/oder magnetisierbares Zentralelement, wobei das Verhältnis des längsten Durchmessers d2 des mindestens einen Zentralelements zum Verhältnis des durch- schnittlichen Durchmessers dl der magnetischen Partikel mindestens
d2 (mm) >15 *dl (mm)
beträgt.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Verhältnis des Volumens V2 des mindestens einen Zentralelements zum Verhältnis des durchschnittlichen Volumens dl eines magnetischen Partikels
V2 (mm3) > 10 *Vl (mm3) beträgt.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Anzahl der magnetischen Partikel pro Zentralelement >104 beträgt.
4. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die magnetischen Partikel ein Material, ausgewählt aus der Gruppe paramagnetische Materialien, superparamagnetische Materialien, ferromagnetische Materialien, fer- rimagnetische Materialien sowie Mischungen daraus beinhalten.
5. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das mindestens eine Zentralelement stab-, hantel- und/oder ellipsoidförmig ausgebildet ist und das Verhältnis des längsten Durchmessers a zum Verhältnis des kürzesten Durchmessers b von
a/b > 1.1 bis a/b <10
beträgt.
6. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die durchschnitt Ii- che Sättigungsmagnetisierung der magnetischen Partikel >1 Am 2 //kg und 250 Am2/kg beträgt.
7. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das addierte VoIu- men Vm der magnetischen Partikel sowie des mindestens einen Zentralelements >0,25% bis <50% des Gesamtvolumens VG des Gefäßes betragen.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, zusätzlich umfassend mindestens einen externen Magneten, welcher zur Interaktion mit dem mindes- tens einen Zentralelement ausgebildet ist.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Zentralelement mindestens einen Permanentmagneten umfasst und das Verhältnis der Mag- netstärke H3 des mindestens einen externen Magneten zur Magnetstärke H2 des mindestens einen Zentralelements
Figure imgf000023_0001
beträgt.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der mindestens eine externe Magnet ein Elektromagnet ist.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der mindestens eine externe Magnet ein Permanentmagnet ist.
12. Verfahren zum Behandeln von Flüssigkeiten mit magnetischen Partikeln, umfassend eine Vielzahl von ersten, in der Flüssigkeit angeordneten, magnetischen Partikeln sowie mindestens ein, in der Flüssigkeit angeordnetes, bevorzugt stab-, hantel- und/oder ellipsoidförmig ausgebildetes Zentralelement, umfassend die Schritte
a) Verteilen der magnetischen Partikel in der Flüssigkeit sowie nachfolgend b) Anlagern der magnetischen Partikel an das mindestens eine Zentralelement.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt a) eine Resuspendierung der magnetischen Partikel in der Flüssigkeit umfasst.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Schritt a) die magnetischen Partikel zumindest teilweise an das mindestens eine Zentralelement angelagert waren und Schritt a) durch Einwirkung einer Kraft auf das mindestens eine Zentralelement erfolgt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, gekennzeichnet durch die Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
16. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und/oder eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15 zur zumindest teilweisen Abtrennung von Biomo lekülen aus/in einer vorzugsweise wässrigen Lösung.
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