DE3908131A1

DE3908131A1 - Dna mit genetischer information von lipase

Info

Publication number: DE3908131A1
Application number: DE19893908131
Authority: DE
Inventors: Hitoshi Sagai; Harumi Ohta; Koji Suzuki; Shigeyuki Imamura
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1988-03-14
Filing date: 1989-03-13
Publication date: 1989-10-05
Also published as: GB2216528A; GB2216528B; JPH0235083A; GB8904650D0; NL8900596A; JP2639677B2

Description

Die Erfindung betrifft eine DNA mit genetischer Information von Lipase. Im einzelnen betrifft die Erfindung eine DNA mit genetischer Information von Lipase und mit einer Basensequenz, die eine 319 Aminosäuresequenz codiert, einen Vektor, der diese DNA umfaßt, einen Transformanten, der diese DNA umfaßt, und ein Polypeptid, welches die Aktivität der Lipase zeigt und das die erwähnte Aminosäuresequenz umfaßt, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Polypeptids.

Lipase ist ein Enzym, das eine Reaktion katalysiert, bei der Triglyceride oder Diglyceride zu Fettsäuren und Glycerin hydrolysiert werden, oder die umgekehrte Reaktion katalysiert. Sie wird in weitem Umfang auf einer Vielzahl von Anwendungsgebieten verwendet, wie als Verdauungsmittel, als diagnostisches Mittel, als Katalysator zur Herstellung verschiedener Fettsäuren oder zur Reformation von Glyceriden, und dergl. Bekannte Quellen für Lipase sind Magensaft von Tieren, Pankreassaft von Tieren, Pflanzensamen und Mikroorganismen einschließlich Hefen und Bakterien. Unter dem Gesichtspunkt einer stabilen Versorgung mit den Rohmaterialien wird aus Mikroorganismen stammende Lipase am umfangreichsten verwendet.

Charakteristika von Lipase, die als Diagnosereagens oder als Katalysator für die Herstellung von Fettsäuren verwendet werden soll, sind hohe Stabilität gegen pH, Hitze, Surfaktantien und dergl. Man hat neue Mikroorganismen daraufhin untersucht, ob sie zur Herstellung von Lipase geeignet sind, die derartige vorteilhafte Charakteristika besitzen (siehe z. B. JP-OS 29787/1971).

Als ein Ergebnis der jüngsten Entwicklungen von genetischen Rekombinationstechniken wurde über eine Anzahl von DNAs berichtet, welche Polypeptide codieren, die verschiedene Typen von physiologischer Aktivität aufweisen. Es gibt auch einige Berichte auf dem Gebiet des Genetic Engineering, die sich mit Lipase befassen, z. B. ein Bericht, der ein Verfahren zur Klonung einer DNA aus Lipase erzeugenden Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas oder Bacillus betrifft und zur Herstellung von Lipase unter Nutzung einer derartigen DNA (JP-OS 2 28 279/1987); ein weiterer Bericht betrifft ein Verfahren zur Klonung einer DNA aus Lipase erzeugenden Mikroorganismen der Gattung Aspergillus und zur Herstellung von Lipase unter Nutzung einer solchen DNA (JP-OS 2 72 988/1987).

Von den Erfindern wurden umfangreiche Untersuchungen mit dem Ziel durchgeführt, unter Verwendung von Genetic Engineering-Techniken eine DNA zu erhalten, die für eine solche brauchbare Lipase codiert. Dabei haben die Erfinder eine rekombinante DNA hergestellt unter Verwendung einer DNA, die aus einem Lipase produzierenden Mikroorganismus der Gattung Chromobacterium abgetrennt wurde. Die Erfinder haben festgestellt, daß diese DNA eine neue DNA ist mit einer Basensequenz, die eine spezifische Aminosäuresequenz codiert, und daß die beiden Sequenzen sich deutlich von denen herkömmlicher Polypeptide unterscheiden, welche Lipase-Aktivität zeigen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit die Schaffung einer DNA mit genetischer Information von Lipase und umfassend eine Basensequenz, die die folgende Aminosäuresequenz (I) von der ersten Aminosäure (Ala) an der N-terminalen Seite bis einschließlich 319. Aminosäure (Val) codiert:

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat die Basensequenz, welche für die erwähnte Aminosäuresequenz codiert, die folgende Formel (II):

Es ist ferner Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Vektor zu schaffen, der eine derartige DNA umfaßt, einen Transformanten, der eine solche DNA umfaßt, und ein Polypeptid, das Lipase-Aktivität zeigt und die erwähnte Aminosäuresequenz umfaßt, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Polypeptids.

Andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung noch deutlicher.

Fig. 1 zeigt einen Endonucleaseplan für Plasmid pLIP1 und

Fig. 2 zeigt einen ähnlichen Plan für Plasmid pLIP10.

Die DNA der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise hergestellt werden unter Anwendung der folgenden Methode von Genetic Engineering-Techniken. DNA eines Mikroorganismus, der einen Lipasegendonor darstellt und eine Lipase erzeugende Fähigkeit aufweist, beispielsweise ein Lipase erzeugender Mikroorganismus der Gattung Chromobacterium, wird zunächst abgetrennt und gereinigt. Diese DNA wird verdaut unter Verwendung von Ultraschallwellen oder Restriktionsendonucleasen. Diese verdaute DNA und eine Expressionsvektor-DNA, welche verdaut und linear gemacht wurde, werden mit Hilfe einer DNA-Ligase oder ähnlichen Maßnahmen an den abgestumpften oder kohäsiven Enden der beiden DNAs vereinigt unter Bildung eines geschlossenen Kreises. Der so erhaltene, rekombinante DNA-Vektor wird in einen reproduzierbaren Wirts- Mikroorganismus eingeschleust. Mikroorganismen, welche den erwähnten, rekombinanten DNA-Vektor aufweisen und die mittels eines Screeningverfahrens unter Verwendung eines Vektormarkers und der Lipase-Aktivität als Indikatoren selektiert wurden, werden kultiviert. Der rekombinante DNA-Vektor wird anschließend aus den kultivierten Zellen abgetrennt und gereinigt. Die erfindungsgemäße DNA, welche die genetische Information der Lipase besitzt, wird dann von dem rekombinanten DNA-Vektor abgetrennt.

Beliebige Mikroorganismen mit der Fähigkeit zur Lipaseerzeugung können für Zwecke der vorliegenden Erfindung als Lipasegen-spendender Mikroorganismus verwendet werden. Beispiele von Lipasegen-spendenden Mikroorganismen sind Chromobacterium viscosum var.paralipoliticum, Chromobacterium viscosum ATCC 6918, Chrombacterium violaceum ATCC 12 472 und dergl.

Ein transformierter Mikroorganismus, der unter Verwendung von Genetic Engineering Lipase-Erzeugungsfähigkeit erlangt hat, kann ebenfalls als Lipasegen-spendender Mikroorganismus verwendet werden.

Im folgenden wird die Isolierungsmethode von DNA aus dem Gen-spendenden Mikroorganismus erläutert. Ein beliebiger der oben erwähnten Gen-spendenden Mikroorganismen wird zunächst in einem flüssigen Kulturmedium unter Belüftung 1 bis 3 Tage kultiviert. Die Kulturbrühe wird zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln; anschließend werden die Zellen lysiert, um ein Bakteriolysat mit einem Gehalt des Lipasegens zu erzeugen. Die Behandlung mit einem Zellwand-lysierenden Enzym, wie Lysozym oder β-Glucanase, kann für das Bakteriolysat verwendet werden, gegebenenfalls in Kombination mit einem anderen Enzym, wie Protease, oder einem oberflächenaktiven Mittel, wie Natriumlaurylsulfat. Zusätzlich kann man eine physikalische Verdauung der Zellwände durchführen, z. B. mittels Gefrieren-Auftauen oder mittels einer französischen Presse (French press). Diese Maßnahmen können zusammen mit der oben erwähnten Behandlung angewandt werden.

Herkömmliche Methoden der Reinigung einschließlich beispielsweise Deproteinisierung durch Phenolextraktion, Proteasebehandlung, Ribonucleasebehandlung, Alkoholfällung und Zentrifugieren können angewandt werden, und zwar entweder unabhängig oder in Kombination, um die DNA aus dem Bakteriolysat abzutrennen und zu reinigen.

Die Verdauung der Mikroorganismus-DNA, die auf diese Weise abgetrennt und gereinigt wurde, kann durchgeführt werden mittels Behandlung mit Ultraschallwellen oder Restriktionsendonucleasen. Um zu gewährleisten, daß die DNA-Fragmente und die Vektor-DNA sich bereitwillig verbinden, ist jedoch die Verwendung von Restriktionsendonucleasen, speziell von Typ II Endonucleasen, die auf spezifische Nucleotidsequenzen wirken, wie EcoRI, HindIII, BamHI oder dergl., bevorzugt.

Ein für den Einsatz besonders geeigneter Vektor ist ein Phage oder eine Plasmid-DNA mit der Fähigkeit, in den Wirtsbakterienzellen autonom zu wachsen, und die für die Verwendung als genetischer Rekombinantvektor durch künstliche Behandlung rekonstruiert wurde.

Falls Escherichia coli als Wirts-Mikroorganismus eingesetzt wird, können beispielsweise λ gt · λ C, λ gt · λ B oder dergl. als Phage verwendet werden.

Als Plasmid wird pBR322, pBR325, pACYC184, pUC12, pUC13, pUC18, pUC19 oder dergl. verwendet, falls Escherichia coli der Wirts-Mikroorganismus ist, während pUB110, pC194 oder dergl. eingesetzt wird, falls Bacillus subtilis der Wirts-Mikroorganismus ist. Bei Verwendung von Saccharomyces cerevisiae als Wirts- Mikroorganismus kann YRp7, pYC1, YEp13, pJDB, YIp1 oder dergl. eingesetzt werden. Zusätzlich können Shuttlevektoren verwendet werden, welche in zwei oder mehr Mikroorganismus- Wirtsbakterienzellen, beispielsweise sowohl in Escherichia coli als auch in Saccharomyces cerevisiae, autonom wachsen können. Diese Vektoren werden in gewünschter Weise verdaut unter Verwendung der gleichen Restriktionsendonuclease wie diejenige, die zur Verdauung der oben erwähnten Lipasegen-spendenden Mikroorganismus- DNA verwendet wird.

Eine herkömmliche Ligationsmethode unter Verwendung einer DNA-Ligase kann eingesetzt werden, um die bakterielle DNA und das Vektorfragment zu vereinigen. Beispielsweise können das kohäsive Ende der bakteriellen DNA und das des Vektorfragments zunächst getempert (annealed) werden, und anschließend kann rekombinante DNA aus der bakteriellen DNA und dem Vektorfragment hergestellt werden unter der Wirkung einer geeigneten DNA-Ligase. Falls erforderlich, wird das getemperte, bakterielle DNA-Vektorfragment in den Wirts-Mikroorganismus eingeschleust, um die rekombinante DNA mit Hilfe einer in vivo-DNA-Ligase zu erzeugen.

Jeder beliebige Mikroorganismus, welcher eine autonome und stabile Replikation der rekombinanten DNA erlaubt und die Fähigkeit der Expression des Charakters der Fremd-DNA besitzt, kann als Wirts-Bakterium verwendet werden. Beispiele solcher Mikroorganismen umfassen solche, die zu Escherichia coli gehören, wie Escherichia coli DH1, Escherichia coli HB101, Escherichia coli W3110, Escherichia coli C600 und dergl.; solche, die zu Bacillus subtilis gehören, wie Bacillus subtilis 207-25 [Gene, 34, 1-8 (1985)], Bacillus subtilis 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87-93 (1984)], Bacillus subtilis BD170 [Nature, 293, 481-483 (1981)], Bacillus subtilis M (ATCC 6051) und dergl.; und solche, die zu Saccharomyces cerevisiae gehören, wie Saccharomyces cerevisiae AH-22 [Gene, 39, 117-120 (1985)], Saccharomyces cerevisiae BWG1-7A [Molecular & Cellular Biology, 6, 355-367 (1986)] und dergl.

Die Einschleusung der rekombinanten DNA in den Wirts- Mikroorganismus kann beispielsweise durchgeführt werden in Gegenwart von Calciumionen, wenn der Wirts-Mikroorganismus ein Bakterium der Gattung Escherichia ist. Falls ein Bakterium der Gattung Bacillus als Wirts-Mikroorganismus verwendet wird, kann man eine Kompetentzell- Methode oder eine Protoplast-Methode verwenden. Eine Mikro-Injektionsmethode kann ebenfalls angewendet werden. Falls das Wirts-Bakterium zur Gattung Saccharomyces gehört, kann man eine Protoplast-Methode oder eine Lithiumacetat-Methode anwenden.

Die Einschleusung der gewünschten DNA in den Wirts- Mikroorganismus kann mittels Screeningverfahren ermittelt werden unter Verwendung eines Drogenresistenzmarkers des Vektors und gleichzeitiger Feststellung der Lipase-Aktivität. Beispielsweise kann man diejenigen Bakterien selektieren, welche auf einem selektiven Kulturmedium, basierend auf dem Drogenresistenzmarker, wachsen und Lipase erzeugen.

Rekombinante DNA, die im Besitz des Lipasegens ist und einmal auf diese Weise selektiert wurde, kann aus dem Transformanten leicht extrahiert werden für die Einschleusung in ein anderes Wirts-Bakterium. Als alternatives Verfahren kann eine Lipasegen-DNA unter Verwendung einer Restriktionsendonuclease oder dergl. aus einer rekombinanten DNA, die ein Lipasegen besitzt, verdaut werden und mit einem Ende eines Vektorfragments verbunden werden, das auf ähnliche Weise erhalten wurde. Dieses kann anschließend in einen anderen Wirts-Mikroorganismus eingeschleust werden.

Bei der Herstellung eines Lipasemuteins, wobei es sich um eine Mutante handelt, erzeugt unter Verwendung von Genetic Engineering-Techniken aus dem erfindungsgemäßen Lipasegen mit wesentlicher Lipase-Aktivität, kann diese Mutante unter Anwendung verschiedener Genetic Engineering- Techniken hervorgebracht werden und schließlich mit einem Vektor vereinigt werden, um eine rekombinante DNA zu produzieren, welche dann in einen Wirts-Mikroorganismus eingeschleust wird, um das Lipasemutein zu produzieren.

Die Basensequenz der DNA der vorliegenden Erfindung, die nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, kann mittels der Didesoxy-Methode ermittelt werden [Science, 214, 1205-1210 (1981)]. Beispielsweise ist die Basensequenz eines Lipasegens in einem Plasmid, hergestellt unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Chromobacterium als Lipasegen-spendender Mikroorganismus und Escherichia coli als Wirts-Bakterium, wie folgt:

Bei der obigen Basensequenz kann das 5′-Ende, welches stromaufwärts bezüglich des GCG-Kodons liegt, welches die erste Ala an dem N-Ende codiert, ein beliebiges Kodon sein, sofern es für eine Aminosäure codiert. Zusätzlich kann das 5′-Ende ein oder mehrere Kodons aufweisen, die für eine Aminosäure codieren. Ein bevorzugtes Beispiel der Glieder am 5′-Ende ist ATG oder eine Polydesoxyribonucleinsäure, welche einem Signalpeptid entspricht. Das 3′-Ende, welches stromabwärts bezüglich GTG liegt, das für Val an dem C-Ende codiert, kann ein Translationsstoppkodon aufweisen oder ein beliebiges Kodon, das für eine Aminosäure codiert. Darüber hinaus können am 3′-Ende ein oder mehrere Kodons vorhanden sein, die für eine Aminosäure codieren, unter der Voraussetzung, daß es in diesem Fall wünschenswert ist, daß am 3′-Ende dieser Kodons ein Translationsstoppkodon vorliegt.

Die Aminosäuresequenz des durch die Expression der erfindungsgemäßen DNA erzeugten Polypeptids kann aus der Basensequenz der DNA vorausgesagt werden. Die Aminosäuresequenz des Abschnitts, welcher das N-Ende des Polypeptids aufbaut, kann bestimmt werden durch die nachstehend erläuterte Methode. Ein Lipasegen spendender Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Erzeugung von Lipase wird zunächst in einem Nährmedium kultiviert, um Lipase in den Zellen zu erzeugen und anzureichern. Die kultivierten Zellen werden aus der Brühe durch Filtration, Zentrifugieren oder ähnliche Maßnahmen gesammelt. Die gesammelten Zellen werden dann entweder durch mechanische Maßnahmen oder durch enzymatische Maßnahmen unter Verwendung von Lysozym oder dergl. zerstört. Zu dem Lysat wird EDTA und/oder ein geeignetes oberflächenaktives Mittel gegeben, sofern erforderlich, um Lipase zu solubilisieren und als wäßrige Lösung abzutrennen. Diese wäßrige Lösung von Lipase wird dann eingeengt oder, ohne eingeengt zu werden, der Ammoniumsulfat-Fraktionierung, Gelfiltration, Adsorptionschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie unterworfen, um in hohem Maße gereinigte Lipase zu erhalten. Die Aminosäuresequenz des Abschnitts, welcher das N-Ende des Lipasepeptids aufbaut, wird bei dieser hochreinen Lipase bestimmt unter Verwendung eines Geräts zur Bestimmung von Proteinsequenzen in flüssiger Phase (Beckman System 890ME, hergestellt von Beckman, Inc.). Auf diese Weise wird bestätigt, daß die Aminosäuresequenz zumindest dieses Abschnitts identisch ist mit der N-terminalen Aminosäuresequenz von Lipase, die durch eine Genetic Engineering- Technik erhalten wurde. Die Aminosäuresequenz. die auf diesem Wege aus der Basensequenz (II) bestimmt wurde, ist äquivalent zu der Aminosäuresequenz der Formel (I). Bei der Aminosäuresequenz der Formel (I) kann es sich bei dem Aminosäurerest an der stromaufwärts gelegenen Seite des N-terminalen Ala um eine oder mehrere Aminosäuren handeln. Bevorzugte Beispiele für diesen Aminosäurerest sind ein Wasserstoffatom, ein Met oder ein Signalpeptid. Das C-terminale Val kann als solches das Ende des Peptids aufbauen oder es kann an seiner stromabwärts gelegenen Seite eine Gruppe, wie ein Säureamid oder ein oder mehrere Aminosäurereste, aufweisen.

Der auf diese Weise erhaltene Transformant kann, wenn er in einem Nährstoffmedium kultiviert wird, große Mengen des Polypeptids mit Lipase-Aktivität in stabiler Weise erzeugen.

Die Kultivierung des Wirts-Mikroorganismus, der ein Transformat ist, erfolgt unter Bedingungen, welche festgelegt werden unter Berücksichtigung der Nährstoff-physiologischen Charakteristika des Wirts-Mikroorganismus. In den meisten Fällen wird eine Flüssig-Kultivierung angewandt. Für eine Produktion im industriellen Maßstab ist jedoch eine Kultivierung unter tiefen aeroben Rührbedingungen vorteilhafter. Eine große Vielzahl von Nährstoffen, wie sie herkömmlicherweise für Bakterienkulturen verwendet werden, kann zur Kultivierung des Wirts- Mikroorganismus verwendet werden. Speziell können beliebige, nutzbare Kohlenstoffverbindungen als Kohlenstoffquellen verwendet werden. Diese umfassen beispielsweise Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose, Fructose, Melassen und dergl. Als Stickstoffquellen können beliebige, verfügbare Stickstoffverbindungen eingesetzt werden, einschließlich Peptone, Fleischextrakte, Hefeextrakte, Caseinhydrolysate und dergl. Andere Bestandteile, einschließlich Salze, wie Phosphate, Carbonate und Sulfate, sowie Salze von Magnesium, Calcium, Kalium, Eisen, Mangan, Zink und dergl., sowie bestimmte Typen von Aminosäuren oder Vitaminen, können verwendet werden, sofern das zweckmäßig ist.

Die Kultivierungstemperatur kann in einem Bereich variiert werden, in dem die Bakterien wachsen und Lipase erzeugen können. Ein bevorzugter Temperaturbereich ist 20 bis 42°C für Escherichia coli; 30 bis 37°C für Bacillus subtilis; und 25 bis 35°C für Saccharomyces cerevisiae. Die Kultivierungsdauer kann in gewissem Ausmaß in Abhängigkeit von den Kultivierungsbedingungen variiert werden. Grundsätzlich wird die Kultivierung zu dem Zeitpunkt beendet, wenn die Ausbeute an Lipase ein Maximum erreicht. Bei der gewöhnlichen Praxis sind dazu etwa 12 bis 48 Stunden erforderlich, falls der Wirts- Mikroorganismus Escherichia coli ist; 18 bis 42 h, wenn der Wirts-Mikroorganismus Bacillus subtilis ist, und 24 bis 48 Stunden, wenn der Wirts-Mikroorganismus Saccharomyces cerevisiae ist. Man kann den pH der Kulturmedien in dem Bereich ändern, in dem die Bakterien wachsen und Lipase erzeugen können. Der speziell bevorzugte Bereich des pH-Wertes ist etwa 6 bis 8, wenn der Wirts- Mikroorganismus Escherichia coli ist; etwa 7 im Falle von Bacillus subtilis und etwa 5 bis 7 im Falle von Saccharomyces cerevisiae.

Lipase kann für die Weiterverwendung in Form einer Kulturbrühe mit einem Gehalt der Bakterien angeboten werden. In der Kulturbrühe enthaltene Lipase wird jedoch im allgemeinen verwendet, nachdem sie von den Zellen durch Filtration, Zentrifugieren oder ähnliche Maßnahmen entfernt wurde. Falls Lipase in den Zellen enthalten ist, werden die Zellen zunächst durch Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt und die gesammelten Zellen werden dann entweder durch mechanische Maßnahmen oder enzymatische Maßnahmen unter Verwendung von Lysozym oder dergl. zerstört. Zu der Suspension wird ein Chelatisiermittel, wie EDTA und/oder ein geeignetes Surfaktans, zugesetzt, sofern erforderlich, um die Lipase zu solubilisieren und auf diese Weise die Sammlung der Lipase als wäßrige Lösung zu ermöglichen.

Die so erhaltenen Lösungen mit einem Gehalt an Lipase werden dann durch Eindampfen im Vakuum oder unter Verwendung eines Filters eingeengt und einer Aussalzbehandlung mit Ammoniumsulfat, Natriumsulfat oder dergl. unterworfen oder einer fraktionierten Fällung unter Verwendung eines hydrophilen, organischen Lösungsmittels, wie Methanol, Ethanol, Aceton oder dergl. Das Präzipitat wird in Wasser aufgelöst und die Lösung wird durch eine semipermeable Membran dialysiert, um niedermolekulargewichtige Verunreinigungen zu eliminieren. Als alternatives Verfahren kann man das Präzipitat mittels Gelfiltration, Adsorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie oder dergl. raffinieren. Gereinigte Lipase wird aus der Lipase enthaltenden Lösung, die unter Verwendung dieser verschiedenen Maßnahmen erhalten wurde, durch Eindampfen im Vakuum, Gefriergetrocknung oder dergl. hergestellt.

Die Aktivität der auf diese Weise hergestellten Lipase wird nach der folgenden Methode bestimmt:

(Reaktionsmischung)
0,2 M Tris-hydrochlorid-Puffer (pH 7,5)	0,2 (ml)
27,5 mM Dilinoleoyl-glycerin (15% Triton X-100)	0,05
50 mM CaCl₂	0,01
200 mM ATP	0,005
100 mM CoASH	0,005
Acyl-CoA-Synthetase (50 E/ml)	0,01
Wasser	Rest
insgesamt	0,5 (ml)

Gib 0,5 ml der Reaktionsmischung mit der obigen Zusammensetzung in ein Reagenzglas und präinkubiere 2 bis 3 min bei 37°C. Gib 50 µl einer Enzymlösung (10 mM PIPES-NaOH-Puffer, enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin; pH 7,3) zu und inkubiere 10 min bei 37°C. Gib 0,5 ml 10 mM N-Ethylmaleimid und 0,5 ml eines Reagens (R-2) mit der untenstehenden Zusammensetzung zu und inkubiere weitere 5 min bei 37°C. Beende die Reaktion durch Zugabe von 1,5 ml 0,5%igem Natriumdodecylsulfat und miß die Absorption bei 550 nm. Die Aktivität der Substanz zur Erzeugung von 1 µMol Linolsäure/min wird als 1 Einheit (E) genommen.

[Reagens(R-2)-Zusammensetzung]
0,2 M PIPES-NaOH-Puffer (pH 7,3)	0,05 (ml)
0,3% 4-Aminoantipyrin	0,05
0,3% TOOS [N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl-m-toluidin)]	0,05
Peroxidase (45 e/ml)	0,05
Acyl-CoA-Oxidase (500 E/ml)	0,02
0,2 M ATP	0,01
Wasser	0,27

In der vorliegenden Beschreibung werden Aminosäuren, Peptide, Nucleinsäuren und Nucleinsäure-verwandte Verbindungen gemäß den üblichen Standards abgekürzt. Einige Beispiele der verwendeten Abkürzungen sind nachfolgend angegeben. Sämtliche Bezeichnungen für Aminosäuren bezeichnen die L-Isomeren.

DNA
= Desoxyribonucleinsäure
RNA	= Ribonucleinsäure
A	= Adenin
T	= Thymin
G	= Guanin
C	= Cytosin
Ala	= Alanin
Arg	= Arginin
Asn	= Asparagin
Asp	= Aspartat
Cys	= Cystein
Gln	=Glutamin
Glu	= Glutamat
Gly	= Glycin
His	= Histidin
Ile	= Isoleucin
Leu	= Leucin
Lys	= Lysin
Met	= Methionin
Phe	= Phenylalanin
Pro	= Prolin
Ser	= Serin
Thr	= Threonin
Trp	= Tryptophan
Tyr	= Tyrosin

Anhand der folgenden, beispielhaften Ausführungsformen, die zur Erläuterung der Erfindung dienen und keine Beschränkung darstellen sollen, werden weitere Merkmale der Erfindung noch deutlicher.

Beispiel 1 Herstellung von chromosomaler DNA

Eine chromosomale DNA wird hergestellt aus dem Stamm Chromobacterium viscosum varietas pararipoliticum (JP- OS 29 787/1971), und zwar gemäß dem folgenden Verfahren. Der Stamm wird unter Schütteln über Nacht bei 37°C in 150 ml eines Bouillonmediums, enthaltend 0,5% Natriumthiosulfat, kultiviert. Die kultivierte Brühe wird 10 min bei 3000 U/min zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Die Zellen werden in 5 ml einer Lösung suspendiert, enthaltend 10% Saccharose, 50 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure (pH 8,0) und 50 mM EDTA. Zu der Suspension gibt man 1 ml einer Lysozymlösung (10 mg/ml). Das Gemisch wird 15 min bei 37°C inkubiert und anschließend gibt man 1 ml 10%iges SDS (Natriumdodecylsulfat) zu. Zu der so erhaltenen Suspension gibt man ein gleiches Volumen eines gemischten Lösungsmittels von Chloroform und Phenol (1 : 1). Das Gemisch wird gerührt und 3 min bei 10 000 U/min zentrifugiert, um die Wasser- und Lösungsmittelschichten zu trennen. Zu der abgetrennten Wasserschicht gibt man langsam ein zweifaches Volumen Ethanol. Das Gemisch wird mit einem Glasstab langsam gerührt, um so zu bewirken, daß die DNA sich um den Stab wickelt. Die auf diese Weise abgetrennte DNA wird in 10 ml einer Lösung aufgelöst, enthaltend 10 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure (pH 8,0) und 1 mM EDTA (eine solche Lösung wird im folgenden als "TE" bezeichnet). Diese Lösung wird mit einem gleichen Volumen einer Chloroform-Phenol- Lösungsmittelmischung behandelt und erneut zentrifugiert, um die Wasserschicht abzutrennen. Zu dieser Wasserschicht gibt man ein 2faches Volumen Ethanol und trennt die DNA wiederum auf die oben beschriebene Weise aus dem Gemisch ab. Diese DNA wird dann in 2 ml TE gelöst.

Beispiel 2 Herstellung von pACYC184 Plasmid DNA

Escherichia coli pM191, welches pACYC184 trägt, [J. Bacteriol, 134, 1141 (1981); ATCC 37033] wird unter Schütteln in 1 l BHI-Medium (hergestellt von Difco Co.) kultiviert. Nachdem die Trübung der Brühe einen Wert von OD₆₆₀ = 1,0 erreicht hat, wird Spectinomycin bis zu einer Endkonzentration von 300 µg/ml zugesetzt. Das Schütteln der Brühe bei 37°C wird mindestens 16 h fortgesetzt. gesetzt. Nach Beendigung der Schüttelkultivierung wird die Brühe 10 min bei 3000 U/min zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Die Plasmid-DNA aus den gesammelten Zellen wird gemäß der Lysozym-SDS-Methode und der Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Methode hergestellt [Maniatis et al., Molecular Cloning, 86-94, Cold Spring Harbor (1982)].

Beispiel 3 Konstruktion von Plasmid pLIP1 mit Lipase-Gen

(1) 2 µl (etwa 0,5 µg) Chromobacterium viscosum var. pararipoliticum-chromosale DNA, hergestellt in Beispiel 1, 1 µl einer 10fachen Konzentration von H-Puffer [Maniatis et al., Molecular Cloning, 104, Cold Spring Harbor (1982)], 1 µl BglII (10 E/µl; hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) und 6 µl Wasser werden vermischt und 1 h bei 37°C zur Verdauung inkubiert. Plasmid pACYC184-DNA (etwa 0,3 µg), welche gesondert hergestellt wurde, wird unter Verwendung von BamHI gemäß der gleichen Methode verdaut. Dazu gibt man 0,6 E alkalische Phosphatase (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.; im folgenden auch als "BAP" bezeichnet) und inkubiert das Gemisch 1 h bei 65°C. Die auf diese Weise hergestellten beiden verdauten DNA-Lösungen werden miteinander vermischt. Zu dieser gemischten DNA-Lösung gibt man 0,1 Vol. 3M Natriumacetat. Anschließend wird die Lösung mit einer gleichen Volumenmenge einer Chloroform-Phenol- Lösungsmittelmischung behandelt und zur Abtrennung der Wasserschicht zentrifugiert. Zu der Wasserschicht gibt man ein 2faches Volumen Ethanol. Die präzipitierte DNA wird durch Zentrifugieren gesammelt und im Vakuum getrocknet. Die getrocknete DNA wird in 89 µl Wasser aufgelöst. Dazu gibt man 10 µl einer 10fachen Konzentration Ligationspuffer [0,5 M Tris-Chlorwasserstoffsäure (pH 7,6), 0,1 M MgCl₂, 0,1 M Dithiothreit, 10 mM Spermidin, 10 mM ATP] und 1 µl T4 DNA-Ligase (350 E; hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) und vermischt das Ganze. Man läßt das Gemisch über Nacht bei 4°C stehen. Diese DNA- Lösung wird mit einem Chloroform-Phenol-Gemisch behandelt und die DNA wird mit Ethanol gefällt, im Vakuum getrocknet und in 10 µl TE gelöst.
(2) Escherichia coli DH1 (Stamm Nr. ME7778, ATCC 27325; geliefert von National Genetic Research Institute) wird in 100 ml BHI-Medium (Hirn-Herz-Infusion; hergestellt von Difco Co.) kultiviert, während der logarithmischen Wachstumsphase durch Zentrifugieren gesammelt (10 000 U/min, 2 min) und in 40 ml einer eiskalten Lösung (pH 5,8) suspendiert, die 30 mM Kaliumacetat, 100 mM RbCl, 10 mM CaCl₂, 50 mM MnCl₂ und 15% Glycerin enthält. Man läßt die Suspension 5 min bei 0°C stehen. Anschließend wird die Suspension zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen. Die Zellen werden in 4 ml einer Lösung suspendiert, enthaltend 10 mM MOPS-Puffer (hergestellt von Dotite Co.), 75 mM CaCl₂, 10 mM RbCl und 15% Glycerin (pH 6,5), und die Suspension wird 15 min bei 0°C stehengelassen, um Kompetentzellen zu erhalten.
(3) Zu 200 µl der Escherichia coli-Zellsuspension gibt man 10 µl der in obiger Stufe (1) hergestellten DNA-Lösung. Nachdem die Mischung 30 min bei 0°C gestanden hat, gibt man 1 ml BHI-Medium zu und bewahrt die Mischung 90 min bei 37°C auf. Ein Aliquot der Mischung (100 ml) wird auf einer BHI-Agarplatte, enthaltend 25 µg/ml Chloramphenicol, ausgebreitet und über Nacht bei 37°C kultiviert, um Transformanten zu erzeugen. Diese Transformanten werden auf ein Crosslee-Agarmedium (hergestellt von Eiken Chemical Co., Ltd.) repliziert und weiter über Nacht bei 37°C kultiviert.

Etwa 50 000 Kolonien von Transformanten, die auf diese Weise erzeugt wurden, werden untersucht. Ein blau angefärbter Stamm wird erhalten. Dieser Stamm wird als Escherichia coli DHI pLIP1 bezeichnet.

Beispiel 4 Kartierung von pLIP1 und Bestimmung der Basensequenz des Lipase-Gens

Plasmid pLIP1 DNA wird aus Escherichia coli DH1 pLIP1 auf gleiche Weise wie bei der Herstellung von pACYC 184 erhalten.

Ein Spaltungsplan (cleavage map) der so erhaltenen pLIP1 DNA wird hergestellt unter Verwendung der Restriktionsendonucleasen BamHI, ClaI, EcoRV, SalI, MluI, PstI und XhoI (alle von Takara Shuzo Co., Ltd., hergestellt). Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt.

Beispiel 5

1 µl einer 10fachen Konzentration M-Puffer [Maniatis et al., Molecular Cloning, 104, Cold Spring Harbor (1982)] und 1 µl ClaI (10 E/µl, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) werden zu etwa 1,0 µg (8 µl) Plasmid pLIP1 DNA gegeben, die aus dem Stamm Escherichia coli DHI pLIP1 gemäß der in Beispiel 2 beschriebenen Methode hergestellt worden war, um die DNA 2 h bei 37°C zu verdauen. Etwa 3,2 kb der DNA-Fragmente werden durch Elektrophorese abgetrennt. Die DNA-Fragmente werden mit Phenol behandelt und in Ethanol gefällt. Dieses Präzipitat wird in 20 µl TE gelöst [enthaltend 10 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure und 1 mM EDTA (pH 8)]. Zu etwa 0,2 µg (1 µl) pBR322 Plamid DNA, die getrennt hergestellt und gemäß dem Verfahren des Beispiels 2 gereinigt wurde, gibt man 1 µl eines 10fachen M Puffers, 7 µl Wasser und 1 µl ClaI (10 E/µl, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.). Nach 2stündigem Verdauen der DNA bei 37°C gibt man 5 µl 1M Tris-Chlorwasserstoffsäure- Puffer (pH 8,0), 80 µl Wasser und 5 µl alkalische Phosphatase (0,5 E/µl; hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) zu und setzt das Ganze 2 h bei 65°C um. Nach der Umsetzung wird das resultierende Produkt dreimal mit einem gleichen Volumen einer Chloroform-Phenol-Lösungsmittelmischung behandelt und die DNA wird durch Ethanol- Fällung isoliert. Die so erhaltene DNA wird in 20 µl TE aufgelöst. Jeweils 5 µl von zwei Arten der DNA-Lösungen, die auf diese Weise hergestellt wurden, werden vermischt. Zu diesem Gemisch gibt man 2 µl einer 10fachen Konzentration Ligationspuffer, 7 µl Wasser und 1 µl T4 DNA-Ligase (175 E/µl; hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) und läßt das Gemisch über Nacht bei 4°C stehen. Diese DNA-Lösung wird mit einer Chloroform- Phenol-Mischung behandelt und die DNA wird mit Ethanol gefällt. Das Präzipitat wird in 10 µl TE aufgelöst und Escherichia coli DH1-Kompetentzellen, welche auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3(2) hergestellt wurden, werden transformiert. Die Transformanten werden auf einem Agarmedium ausgebreitet, enthaltend 50 µg/ml Ampicillin, und über Nacht bei 37°C kultiviert. Die erzeugten Kolonien werden auf ein Crosslee-Agarmedium auf gleiche Weise wie in Beispiel 3(3) repliziert, um ein Lipase erzeugendes Escherichia coli zu erhalten. Dieser Stamm wird als Escherichia coli DH1 pLIP10 bezeichnet und wurde bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt; Hinterlegungsnummer 2266, FERM BP-2266.

Dieser Stamm wird nach Reinigung in BHI-Medium über Nacht bei 37°C kultiviert. Die Lipase-erzeugende Fähigkeit des Stamms wird an den kultivierten Zellen bestimmt unter Verwendung der zuvor erwähnten Lipase assay-Methode. Dabei stellte man fest, daß der Stamm eine Aktivität von etwa 0,01 E/ml besitzt. Das von diesem Stamm gehaltene Plasmid wird gemäß Beispiel 2 abgetrennt. Das Plasmid enthält ein Lipase-Gen und ein Plasmid pBR322-Gen und wird als pLIP10 bezeichnet.

Beispiel 6 Kartierung von pLIP10 und Bestimmung der Basensequenz des Lipase-Gens pLIP10 Plasmid-DNA wird aus Escherichia coli DH1 pLIP10 auf gleiche Weise wie bei der Herstellung von pACYC 184 beschrieben erhalten.

Ein Spaltungsplan (cleavage map) der so erhaltenen pLIP10 DNA wird hergestellt unter Verwendung der Restruktionsendonucleasen BamHI, SalI, XhoI und PstI (alle von Takara Shuzo Co., Ltd.). Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt. Die Basensequenz der das Lipase-Gen codierenden DNA wird mittels der Didesoxy-Methode [Science, 214, 1205-1210 (1981)] unter Verwendung des M13-Phagen bestimmt. Die Basensequenz des Lipase-Gens und die Aminosäuresequenz sind als Formeln (I) und (II) angegeben.

Beispiel 7 Herstellung von Lipase

Escherichia coli DH1 pLIP10 wird 18 h bei 37°C in 20 l BHI-Medium (Difco Co.) unter Verwendung eines 30-l-Flaschenfermenters kultiviert. Die kultivierten Zellen werden durch Zentrifugieren bei 5000 U/min während 10 min gesammelt. Die Zellen werden mit 2 l physiologischer Salzlösung gewaschen und in 2 l 0,1 mM Phosphatalbuminpuffer (enthaltend 13,61 g KH₂PO₄, 3,92 g NaOH, 1 g Rinderfötusserumalbumin, 1 g NaN₃ und 1 l Wasser; pH 8,0) suspendiert. Zu der so hergestellten Suspension gibt man Lysozym, EDTA-2Na und Triton X-100 in einer Konzentration von 1 mg/ml bzw. 2mM bzw. 0,1%. Nach 30minütigem Inkubieren bei 37°C wird das Gemisch 10 min bei 5000 U/min zentrifugiert, um den resultierenden Überstand zu sammeln. 1,9 l dieses Überstands werden der Aceton (50-80%)-Präzipitation unterworfen. Das Präzipitat wird durch 30minütiges Zentrifugieren bei 5000 U/min gesammelt, in 100 ml Phosphatalbuminpuffer gelöst und dann der DEAE-Sephallose CL-6B- Ionenaustauschchromatographie unterworfen, wobei die aktive Fraktion gesammelt wird. Diese Fraktion wird entsalzt und gefriergetrocknet, wobei man ein pulveriges Produkt erhält. Bei dieser Enzymprobe stellt man eine Lipase-Aktivität von 350 E fest, wenn man die Lipase-Aktivitätsmessung nach der oben erwähnten Methode durchführt.

Die vorliegende Erfindung gewährleistet eine Herstellung in großem Maßstab von Polypeptid mit einem hohen Grad an Stabilität und mit hoher Lipase-Aktivität. Die Lipase ist brauchbar bei der Herstellung von Fettsäure aus Triglycerid, als Reagens für quantitative Analysen von Triglycerid sowie als Katalysator für Öl- und Fett- Reformierverfahren unter Verwendung der Esteraustauschreaktion.

Claims

1. DNA mit genetischer Information von Lipase und umfassend eine Basensequenz, welche die folgende Aminosäuresequenz (I) von der ersten Aminosäure (Ala) an der N-terminalen Seite bis einschließlich die 319. Aminosäure (Val) codiert:

2. DNA gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erwähnte Basensequenz 957 fortlaufende Basen umfaßt, die, beginnend vom 5′-Ende, durch die folgende Basensequenz (II) dargestellt sind:

3. Ein Vektor, umfassend die in Anspruch 1 definierte DNA.

4. Vektor gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Vektor um Plasmid pLIP1 oder pLIP10 handelt.

5. Ein Transformant mit DNA, die bezüglich des Wirts-Mikroorganismus fremd ist und wie in Anspruch 1 definiert ist.

6. Transformant gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirts-Mikroorganismus ein Mikroorganismus vom Stamm Escherichia coli ist.

7. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend
Kultivierung eines Transformanten, der DNA aufweist, die bezüglich des Wirts-Mikroorganismus fremd ist und in Anspruch 1 definiert ist, um zu bewirken, daß der Transformant genetische Information der erwähnten DNA ausdrückt, und
Sammlung des Polypeptids mit Lipase-Aktivität aus der Kulturbrühe.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirts-Mikroorganismus ein Mikroorganismus vom Stamm Escherichia coli ist.

9. Polypeptid mit der Aktivität von Lipase mit der folgenden Aminosäuresequenz (I) von der ersten Aminosäure (Ala) an der N-terminalen Seite bis einschließlich die 319. Aminosäure (Val):