DE3889918T2

DE3889918T2 - Nachweis einzelner moleküle.

Info

Publication number: DE3889918T2
Application number: DE3889918T
Authority: DE
Inventors: Edgar Shera
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1987-10-07
Filing date: 1988-09-16
Publication date: 1995-01-19
Anticipated expiration: 2008-09-17
Also published as: CA1326556C; US4793705A; DE3889918D1; JPH03500449A; WO1989003525A1; EP0381694B1; EP0381694A1; EP0381694A4

Description

Ausgangspunkt

Die Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf die Detektierung von mikroskopischen Partikeln und insbesondere auf die Detektierung und Identifizierung von einzelnen Molekülen. Diese Erfindung ist das Ergebnis eines Vertrages mit dem Department of Energy (Vertrag Nr. W-7405-Eng-36).
Die Fähigkeit zur Detektierung mikroskopischer Partikel hat sich in Richtung kleinerer Partikel fortentwickelt. Für viele Anwendungen ist es wesentlich, daß mikroskopische Partikel in einer Flüssigphasenumgebung detektiert werden. Existierende Techniken, die in einer Flüssigphasenumgebung verwendbar sind, basieren auf optischem Einfangen und einer Strömungstrennung unter Verwendung von hydrodynamisch fokussierten Strömungen. Die molukare Identifizierung durch laserinduzierte Fluoreszenz wurde verwendet mit hydrodynamisch fokussierten Strömungen, um die Detektierung von großen und stark fluoreszierenden Molekülen zu erlauben unter Verwendung von herkömmlichen Photomultiplizierröhren, um die Molekülfluoreszenz zu detektieren.
Das optische Einfangen und Manipulieren von Viren und Bakterien ist gelehrt in A. Ashkin et al., "Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria," Science 235, 1517 (1987). Partikel der Rayleigh- und Mie-Größe, d. h. mit einem Partikelgrößenbereich von ungefähr 10 um bis hinunter zu weniger Angström wurden eingefangen unter Verwendung von optischen Kräften zum Einschließen der Partikel. Das einzige Verfahren der Identifizierung, das durch Ashkin et al. gelehrt wird, scheint eine Größenbestimmung aus einem Streuvergleich mit einer Kugel einer bekannten Größe zu sein. Ferner werden eine große Anzahl von Partikeln eingefangen.
Ein hydrodynamisch fokussiertes Strömungssystem wird gelehrt durch D. C. Nguyen et al., "Ultrasensitive Laser- Induced Fluorescence Detection in Hydrodynamically Focused Flows," J. Opt. Soc. Am. B4, 138 (1987) und D. C. Nguyen et al. "Detection of Single Molecules of Phycoerythrin in Hydrodynamically Focused Flows by Laser induced Fluorescence," Anal. Chem. 59, 2158 (1987). Wie dort gezeigt wird, ergeben Verbesserungen der optischen Mittel und eine Verringerung in der Größe des Sondenvolumens eine Empfindlichkeit, die das Detektieren einer einzelnen Spezie bewirkt, die das fluoreszierende Äquivalent von acht Rhodamin-6G-Chromophoren sind. Die Detektierung von einzelnen Molekülen der stark fluoreszierenden Spezies Phycoerythrin wurde berichtet.
Unterschiedliche Modifikationen wurden berichtet zum Verbessern der Detektierungsempfindlichkeit der Vorrichtung, wobei die Verbesserungen auf die herkömmlichen optischen Mittel und die Strömungsdynamiken bezogen waren und mit einer Probenvolumenreduzierung von 11 pL auf 0,6 pL, was eine damit zusammenhängende Reduzierung der detektierten Hintergrundstrahlung erzeugte. Die berichteten Empfindlichkeiten ermöglichen der Vorrichtung jedoch nicht, individuelle Moleküle zu detektieren, die typischerweise von Interesse sein können, wie zum Beispiel fluorophor - oder fluorogen-markierte Versionen der Basismoleküle, die das DNA-Polymer bilden.
Somit sehen erhältliche Verfahren und Vorrichtungen zum Detektieren von Partikeln in einem Strömungsfluß nicht die Empfindlichkeit zum Detektieren individueller Moleküle vor, die typischerweise in Immunofluoreszenzproben, Strömungscytometrie, Flüssigkeitschromatographie und ähnlichen Anwendungen angetroffen werden. Eine Agglomeration oder Zusammenballung von Molekülen könnte detektiert werden, aber einzelne Moleküle könnten dann nicht identifiziert werden. Das Fehlen dieser Fähigkeiten beim Stand der Technik wird überwunden durch die vorliegende Erfindung und ein verbessertes Verfahren und eine Vorrichtung sind vorgesehen zum Detektieren eines einzelnen mäßig fluoreszierenden Moleküls. Demgemäß ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, verläßlich ein einzelnes fluoreszierendes Molekül zu detektieren.
Ein weiteres Ziel ist es, verläßlich einzelne fluoreszierende Moleküle mit einem Fluoreszenzäquivalent von fluoreszierend markierten Versionen der Basismoleküle, die das DNA-Polymer bilden, zu detektieren.
Ein weiteres Ziel ist das Vorsehen einer erhöhten Fähigkeit Hintergrundstrahlung abzustoßen.
Ein weiteres Ziel ist das Minimieren der Auflösungsbeschränkungen, die in herkömmlichen optischen Mitteln inhärent sind, während ein großes Sichtfeld beibehalten wird.

Die Erfindung

Um die vorhergenannten und weitere Ziele zu erreichen und gemäß den Zwecken der vorliegenden Erfindung, wie sie hier ausgeführt und grob beschrieben sind, kann die Vorrichtung der Erfindung ein Moleküldetektierungssystem aufweisen zum Identifizieren individueller molekularer charakteristischer Emissionen in einem Zug oder einer Reihe von Molekülen in einer Strömungszelle. Auch positionsansprechende Sensormittel sind angeordnet, um das Detektieren von Emissionen von Molekülen innerhalb der Strömungszelle zu bewirken und räumliche und seitliche Koordinaten für die detektierten Emissionen zuzuordnen.
Ein Computer sagt räumliche und zeitliche Koordinaten für ein Molekül in der Laminarströmung voraus, und zwar als eine Funktion der detektierten Koordinaten der detektierten Emissionen. Vergleichsmittel vergleichen dann nachfolgend detektierte räumliche und zeitliche Koordinaten mit den vorhergesagten räumlichen und zeitlichen Koordinaten, um festzustellen, ob die nachfolgend detektierten Emissionen von einem erregten Molekül in dem Zug oder der Reihe von Molekülen herkommt. Somit können molekulare Emissionen von Hintergrundemissionen unterschieden werden und mit einem bestimmten Molekül in der Sequenz identifiziert werden.
Bei einer anderen Charakterisierung der vorliegenden Erfindung ist ein Detektierverfahren vorgesehen zum Identifizieren individueller Moleküle innerhalb einer Strömungszelle, und zwar aus charakteristischen molekularen Emissionen. Molekulare Emissionen aus der Strömungszelle werden mit einem positionsansprechenden Sensor detektiert. Räumliche und zeitliche Koordinaten werden dann den detektierten Emissionen zugeordnet. Basierend auf bekannten Strömungscharakteristiken in der Strömungszelle werden räumliche und zeitliche Koordianten für ein Molekül in der Strömung vorausgesagt, und zwar als eine Funktion einer ersten detektierten Emission innerhalb der Strömungszelle. Die detektierten räumlichen und zeitlichen Koordinaten von nachfolgenden Emissionen werden dann mit den vorausgesagten räumlichen und zeitlichen Koordinaten verglichen, um festzustellen, ob eine detektierte Emission von einem Molekül in dem Zug oder der Reihe von Molekülen herkommt. Somit können molekulare Emissionen unterschieden werden von Hintergrundemissionen oder -ereignissen und ein einzelnes Molekül kann während des Durchlaufens durch die Strömungszelle identifiziert werden.

Figurenbeschreibung

Die Zeichnung, die in die Beschreibung aufgenommen ist, und einen Teil dieser bildet, zeigt ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung und zusammen mit der Beschreibung dient sie zum Erklären der Grundlagen der Erfindung. In der Zeichnung zeigt:
Fig. 1 ein Blockdiagramm der vorliegenden Erfindung;
Fig. 2 ein Detail der Strömungszelle des Systems in Bildform;
Fig. 3 ein Flußdiagramm zum Unterscheiden und Auswerten individueller Moleküle in der Strömungszelle.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung.

Gemäß Fig. 1 ist in einer Blockdiagrammschemaform ein Moleküldetektierungssystem gemäß der vorliegenden Erfindung gezeigt. Das Lasererregungssystem ist allgemein bekannt und in dem Nguyen et al.-Artikeln beschrieben, auf die oben Bezug genommen wurde. Laser 10 ist mit einer Wellenlänge ausgewählt, die das Fluoreszieren eines ausgewählten Fluorophors bewirkt zum Identifizieren des zu detektierenden Moleküls. Der Ausgang des Lasers 10 wird herkömmlicherweise durch eine Halbwellenplatte 12 und ein polarisierendes Prisma 14 hindurchgeschickt, indem die Ausgangsleistung des Lasers 10 durch das Variieren des Winkels der Platte 12 bezüglich des Prismas 14 eingestellt werden kann. Die Laserausgangsleistung und die Polarisierung kann eingestellt werden, um Hintergrundzählungen zu minimieren.
Ein Spiegel 16 lenkt den Laserstrahl durch eine Linse 18 zum Fokussieren innerhalb der Strömungszelle 22 zum Aktivieren von Fluorophoren, die an Molekülen in der Probenströmung haften. Wie in Fig. 2 gezeigt ist, ist die Probenströmung 42 senkrecht zu dem fokussierten Laserstrahl 46. Die Probenströmung 42 geht durch eine umgebende hydraulische Hülle 44 hindurch, um hydrodynamisches Fokussieren der Strömung innerhalb der Strömungs- zelle 22 vorzusehen.
Gemäß Fig. 1 ist der Ausgang der Strömungszelle 22 ein optisches Signal 20 mit einer Information über fluoreszierende Moleküle innerhalb der Strömungszelle 22. Das optische Signal 20 wird durch eine mikroskopische Objektivlinse 24 fokussiert und durch einen Spektralfilter 25 gefiltert, um Wellenlängen zu entfernen, die nicht von Interesse sind. Das optische Ausgangssignal wird an einen positionsansprechenden Sensor 26 geliefert. In einem Ausführungsbeispiel ist der positionsansprechende Detektor 26 aus einem positionsansprechenden Mikrokanalplattendetektor (MCP) bildet und der Betrieb wird nachfolgend unter Bezugnahme auf einen MCP beschrieben.
Ein positionsempfindlicher Detektor oder MCP 26 gibt ein Signal ab, das das Auftreten eines Photonenereignisses innerhalb der Strömungszelle 22 anzeigt und auch Ortsdaten, die funktionell in Beziehung stehen mit den räumlichen Koordinaten des Photonenereignisses. Räumliche Koordinaten werden an einen Digitalisierer 28 geliefert, und mit einer zeitlichen Eingabe von dem Timer oder Zeitnehmer 32 kombiniert, um mindestens eine dreidimensionale Stellung (Ort) (x, y, t) für das Photonenereignis vorzusehen. Die Photonenereigniskoordinaten werden von dem Digitalisierer 28 zum Speicher 34 abgegeben für nachfolgende Verarbeitung durch eine Computerstation 36. Unter Bezugnahme auf den positionsempfindlichen Sensor 26 ist es wünschenswert, eine Auflösung des Systems und eine damit in Beziehung stehende Positionsgenauigkeit zu besitzen, die durch die optischen Mittel des Systems anstatt durch einen MCP beschränkt sind. Herkömmliche MCP's können eine Positionsauflösung von 500 bis 1000 Pixel in jeder Dimension besitzen. Wenn zwei Pixel jedes Rayleigh-Limit abdecken, ist die Auflösung durch die optischen Mittel beschränkt und ein Sichtfeld von 100-200 Mikrometer im Durchmesser ist durch die Objektivlinse 24 vorgesehen. Bei einer Wellenlänge von 560 nm ist das Rayleight-Limit zum Beispiel bei ungefähr 0,4 um. Somit macht eine Positionsgenauigkeit von 1 um nur eine Genauigkeit von ± 2 Pixeln notwendig. Ein geeignetes MCP ist als Modell Nr. F4I46M von ITT Electro-Optical Products Division erhältlich.
Der Digitalisierer 28 sieht räumliche und zeitliche Koordinatendaten in einem Format vor, das geeignet ist zum direkten Speichern im Speicher 34 und er kann in Echtzeit arbeiten. Herkömmliche MCP-Positionsschaltungen digitalisieren in ungefähr 5 us. Dieses Digitalisierungsintervall kann auf ungefähr 1 us oder weniger reduziert werden mit einer (speziell hergestellten) Kundenschaltung, wenn ein hoher Datenratenbetrieb wünschenswert ist. Ein 1 us Digitalisierungsintervall würde eine maximale Photonendetektierrate von 1 MHz ermöglichen; oder zum Beispiel 170 Photonen während der Übertragungszeit, die durch Nguyen et al. für ein System, das mit der Strömungszelle 22 vergleichbar ist, vorhergesagt wurde. Wie nachfolgend beschrieben wird, kann die Detektierung von nur ein paar Photonen eine verläßliche Molekülidentifizierung vorsehen, sogar mit einem relativ unkomplizierten Datenreduktionsalgorithmus. Die Strömungsgeschwindigkeit und die Laserintensität können leicht eingestellt werden, um eine Datenrate und eine Beobachtungszeit vorzusehen, die für bestimmte Anwendungen geeignet sind. Es sei bemerkt, daß das obige System eine Positionsgenauigkeit vorsieht, die benötigt wird, um ein Photonenereignis innerhalb eines um oder kleiner zu identifizieren. Mit einer geeigneten Breite des Laserstrahls in der Längsrichtung, wie zum Beispiel durch die Beleuchtung mit abklingenden Wellen kann diese Genauigkeit somit ein effektives Probenvolumen von 10&supmin;¹&sup8; m³ oder 10&supmin;³ pL erzeugen, was eine Probenvolumenreduzierung von über 500 ist, gegenüber dem 0,6 pL-Wert, der in Nguyen et al. beschrieben ist. Das effektive Probenvolumen ermöglicht dem System gegenüber Photonenereignissen zu unterscheiden, die nicht von einem fluoreszierenden Molekül stammen, da nur ein paar Streuereignisse auftreten, die völlig frei bzw. zufällig innerhalb des effektiven Probenvolumens auftreten. Die Laminarströmung sieht bekannte Flugbahnen für Moleküle mit einer bekannten Geschwindigkeit vor. Detektierte Photonenereignisse können mit vorhergesagten Molekülkoordinaten verglichen werden und Photonenereignisse, die nicht mit vorhergesagten Koordinaten übereinstimmen, können unbeachtet bleiben. Diese Fähigkeit sieht effektiv ein sich bewegendes Probenvolumen bis zu 10&supmin;³ pL hinunter vor, in dem das Auftreten eines Moleküls verläßlich vorhergesagt werden kann.
Das System wurde oben beschrieben mit der Verwendung eines hydrodynamischen Strömungsregimes und eines fluoreszierenden Moleküls. Die funktionalen Grundlagen oder Prinzipien sind jedoch in gleicher Art und Weise anwendbar auf ein dynamisches System, das eine vorhersagbare Strömung von Molekülen oder kleinen Partikeln in einer Folge oder Reihe durch einen Detektor vorsehen kann. In gleicher Weise ist laserinduzierte Fluoreszenz eine geeignete Technik zum Markieren und Identifizieren von Molekülen. Was jedoch nur gebraucht wird, ist eine detektierbare Emission von dem Molekül oder Partikel. Alternativ können andere molekulare Emissionen, wie zum Beispiel Elektronen, Gamma-Strahlen und ähnliches durch geeignete positionsempfindliche Vorrichtungen detektiert werden. Die vorliegende Erfindung zieht im weiteren hydrodynamische und aerodynamische Strömungsregime sowie molekulare Emissionen jeder Art in Betracht.
Gemäß Fig. 3 ist ein Flußdiagramm einer Beispielssoftware zum Feststellen des Auftretens eines Moleküls in einem effektiven Probenvolumen gezeigt. Beim Auftreten eines Photonenereignisses 48 vom MCP 26 (Fig. 1) werden die Ereigniskoordinaten (xe, ye, te) eingegeben 52 und es wird eine Sortier- oder Sammelstelle bzw. ein Platz (bin) definiert 54 mit Koordinaten (xe, ye, tn), wobei tn normalisiert wird 53 auf die Zeit, zu der ein Molekül mit den räumlichen Koordinaten in das Sichtfeld, das durch die Objektivlinse 24 definiert wird, eingetreten wäre (Fig. 1). Der neu definierte Platz wird mit bestehenden Plätzen verglichen 56. Wenn der neue Platz nicht existiert, wird der neue Platz gespeichert 58, um ein Anfangsereignis darzustellen, und die Inhalte der Platzdatei 58 werden auf den neuesten Stand gebracht 62.
Wenn existierende Platzkoordinaten die definierten Ereignisplatzkoordinaten 54 aufnehmen, wird das Ereignis zu diesem bestimmten Platz zugeordnet 64. Plätze fahren fort, Ereignisse zu sammeln 64, bis die zeitlichen Koordinaten des Platzes anzeigen, daß sich der Platz nach außen aus dem Sichtfeld des Systems herausbewegt hat.
Der Timer oder Zeitgeber 66 bewirkt periodisch, daß die Plätze überprüft werden 68, um festzustellen, ob sich ein Platz immer noch im Sichtfeld befindet oder ob ein Molekül in dem Platz aufgetreten ist. Plätze, die eine große Anzahl von Ereignissen akkumulieren, besitzen eine größere Wahrscheinlichkeit, daß sie ein tatsächliches Molekül enthalten, als Plätze mit weniger Ereignissen. Das geringe effektive Probenvolumen, das gemäß der vorliegenden Erfindung vorgesehen ist, kann eine klare Trennung zwischen Plätzen erzeugen, die Moleküle enthalten und solche, die nur zufällige Hintergrundereignisse enthalten. Nachdem die Platzzählung verarbeitet wurde, wird der Platz zur Wiederverwendung geräumt 74. Wenn das Auftreten eines Moleküls angezeigt ist, können die Fluoreszenzdaten verarbeitet werden 72 für die bestimmte Bestimmung, die durch das System durchgeführt wird. Komplexere Datenreduzierungsalgorithmen können ferner Diffusion und andere Trennungen von Laminarströmung in Betracht ziehen, die in unterschiedlichen Anwendungen auftreten können.
Die Fähigkeit, ein individuelles Molekül zu lokalisieren oder zu orten und zu idendifizieren, sieht Anwendungen vor, die nicht möglich sind unter Verwendung von herkömmlichen Photomultiplizierröhren. In einer wichtigen Anwendung kann das System in der Lage sein, individuelle Basen, die eine DNA-Sequenz bilden, zu detektieren und zu identifizieren. Eine Vielzahl von Laserwellenlängen alleine oder in Kombination mit getrennten Filtern 25 und Detektoren 26 (Fig. 1) können verwendet werden, um individuelle Moleküle zu erregen, wenn sie durch die Probenströmungszelle 22 hindurchgehen, zum Identifizieren von fluoreszierenden basenspezifischen Markierungen, die an den Molekülen anhaften. Der Pfad oder die Stellung eines Moleküls wird abwechselnd erscheinen oder verschwinden, um Molekülidentifizierung während der Erregungssequenz zu ermöglichen. Mehrere Moleküle können simultan in der Strömungszelle 22 vorhanden sein und individuell zur Identifizierung geortet werden.
Während oben ein einzelnes MCP-System beschrieben wurde, kann es wünschenswert sein, zwei senkrecht plazierte MCP's vorzusehen, um die Anzahl von Photonen zu erhöhen, die während des Hindurchlaufens eines Moleküls durch die Strömungszelle 22 gesammelt werden und um zusätzliche räumliche Information vorzusehen. Detektierte Photonenereignisse würden korreliert, um vollständige dreidimensionale räumliche Koordinaten vorzusehen. Ein detektiertes Photon in jedem der zwei senkrecht plazierten Detektoren würde im Prinzip das Vorhersagen einer Flugbahn ermöglich, so daß das Auftreten eines dritten Photons auf der berechneten vierdimensionalen Flugbahn ein Beweis eines Moleküldurchgangs ist.
Es sei bemerkt, daß die Detektierung dieser paar Photonen in den erhältlichen Durchgangszeiten eine infinitesimale Wahrscheinlichkeit erzeugen, daß ein Molekül vollständig verfehlt wird. Beispielsweise kann bei einer 2 MCP-Geometrie und einer 170 us-Durchgangszeit die bei Nguyen et al. in Tabelle 3 gezeigt ist, geschätzt werden, so daß jeder Detektor 8 reale und 40 Hintergrundphotonen akkumuliert. Somit detektieren die zwei MCP's eine Durchschnittsanzahl von 16 Photonen, was eine Wahrscheinlichkeit von geringer als 10&supmin;&sup4; zum Detektieren von weniger als den vier Photonen, die für die Moleküldetektierung benötigt werden, vorsieht.
Die in Fig. 3 beschriebene Software kann für jedes MCP vorgesehen werden und die Plätze können während der Verarbeitung zusammengelegt werden. Eine Zusammenlegungsbestimmung könnte durchgeführt werden auf der Basis der erhältlichen, gemeinsamen Information, d. h. den Zeitkoordinaten. Plätze können untersucht werden, so daß sie nur dann zusammengelegt werden, nachdem eine minimale Anzahl von Ereignissen in dem Platz akkumuliert ist, wodurch sichergestellt wird, daß die Zeitkoordinaten von beiden Plätzen ausreichend gut bestimmt sind, um einen gültigen Vergleich für das Zusammenlegen zu bieten. Der Platz mit der größten Anzahl von gesammelten Ereignissen kann ausgewählt werden für den zusammengelegten Platz, wodurch alle nachfolgenden Photonenereignisse auf der Platzflugbahn zu einem einzelnen Platz zugeordnet werden können.
Die vorhergehende Beschreibung des bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung wurde zum Zwecke der Darstellung und Beschreibung gegeben. Es wurde nicht beabsichtigt, abschließend zu sein oder die Erfindung auf die genau offenbarte Form zu beschränken und natürlich sind viele Modifikationen und Veränderungen im Licht der obigen Lehre möglich. Das Ausführungsbeispiel wurde ausgewählt und beschrieben, um am besten die Grundlagen der Erfindung und ihre praktische Anwendung zu erklären und dadurch anderen Fachleuten zu ermöglichen, am besten die Erfindung in unterschiedlichen Ausführungsbeispielen und mit unterschiedlichen Modifikationen zu verwenden, wie sie für die besonders bedachte Verwendung geeignet sind. Es ist gewollt, daß der Umfang der Erfindung durch die folgenden Ansprüche definiert wird.

Claims

1. Moleküldetektiersystem, das folgendes aufweist:

eine Strömungszelle zum Hindurchlassen einer Folge oder Reihe von Molekülen in einer Laminarströmung;

Lasermittel zum Erregen der Moleküle zum Abgeben oder Emittieren von Photonen mit einer ausgewählten Wellenlänge;

positionsempfindliche Sensormittel, die wirksam sind zum Detektieren der Photonenemissionen innerhalb der Strömungszelle und den detektieren Photonen räumliche und zeitliche Koordinaten zuordnen;

Computermittel zum Vorhersagen räumlicher und zeitlicher Koordinaten für ein Molekül in der Laminarströmung als eine Funktion des detektierten Photons; und

Vergleichsmittel zum Vergleichen nachfolgender detektierter, räumlicher und zeitlicher Koordinaten mit den vorhergesagten räumlichen und zeitlichen Koordinaten zum Feststellen, ob ein nachfolgend detektiertes Photon von einem erregten Molekül in der Folge oder Reihe von Molekülen stammt.

2. Detektiersystem gemäß Anspruch 1, wobei die positionsempfindlichen Sensormittel mindestens einen Mikrokanalplattensensor zum Abgeben der räumlichen Koordinaten umfassen.

3. Detektiersystem nach Anspruch 1, wobei die positionsempfindlichen Sensormittel eine Positionsgenauigkeit besitzen, die wirksam ist für die Computermittel um aus den vorhergesagten Koordinaten ein sich bewegendes Probenvolumen zu erzeugen, was in effektiver Weise funktionell die Hintergrundsignale aus der Betrachtung eliminiert.

4. Detektiersystem zum Identifizieren individueller Moleküle mit charakteristischen Emissionen in einer Strömungsreihe oder Folge von Molekülen in einer Strömungszelle, das folgendes aufweist:

positionsempfindliche Sensormittel, die das Detektieren von Emissionen von den Molekülen innerhalb der Strömungszelle bewirken und räumliche und zeitliche Koordinaten für die detektierten Emissionen zuordnen;

Computermittel zum Vorhersagen räumlicher und zeitlicher Koordinaten für ein Molekül in der Strömungsreihe oder Folge als eine Funktion der detektierten Emissionen; und Vergleichsmittel zum Vergleichen nachfolgender detektierter, räumlicher und zeitlicher Koordinaten mit den vorhergesagten räumlichen und zeitlichen Koordinaten um festzustellen, ob die nachfolgend detektierten Emissionen von einem erregten Molekül in der Folge oder Reihe von Molekülen stammen.

5. Detektiersystem nach Anspruch 4, wobei die positionsempfindlichen Sensormittel mindestens einen Mikrokanalplattensensor umfassen zum Abgeben der räumlichen Koordinaten.

6. Detektiersystem nach Anspruch 4, wobei die positionsempfindlichen Sensormittel eine Positionsgenauigkeit besitzen, die wirksam ist für die Computermittel um aus den vorhergesagten Koordinaten ein sich bewegendes Probenvolumen zu erzeugen, was in effektiver Weise funktionell die Hintergrundsignale aus der Betrachtung eliminiert.

7. Detektierverfahren zum Indentifizieren individueller Moleküle mit einer charakteristischen Emission in einer Strömungsreihe oder Folge, das folgendes aufweist:

Detektieren von molekularen Emissionen innerhalb der Strömungsreihe und zwar in positionsempfindlichen Sensormitteln;

Zuordnen räumlicher und zeitlicher Koordinaten für die detektierten Emissionen;

Vorhersagen räumlicher und zeitlicher Koordinaten für ein Molekül als eine Funktion der ersten detektierten Emissionen; und

Vergleichen nachfolgender detektierter, räumlicher und zeitlicher Koordinaten mit den vorhergesagten räumlichen und zeitlichen Koordinaten um festzustellen, ob die nachfolgend detektierten Emissionen von einem Molekül in der Folge oder Reihe von Molekülen stammen.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Detektieren von Emissionen den Schritt des Fokusierens von Produkten der Emissionen auf mindestens einem Mikrokanalplattensensor umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Vorhersagen räumlicher und zeitlicher Koordinaten ferner das Definieren eines sich bewegenden Probenfensters für die Moleküldetektierung definiert zum effektiven Unterscheiden von Hintergrundemissionsereignissen von Molekülemissionsereignissen.

10. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Emissionsprodukte Photonen sind.

11. Verfahren nach Anspruch 10, das ferner den Schritt des Bestrahlens der Moleküle mit einem Laser umfaßt zum Induzieren einer Fluoreszenz zum Emittieren der Photonen.

12. Verfahren nach Anspruch 7, das ferner den Schritt des hydrodynamischen Fokusierens der Strömungsreihe oder Folge innerhalb einer Strömungszelle umfaßt.