DE3878922T2 - Mehrstufen-einkapselungs/ladeverfahren zur herstellung von lipophile heilmittel enthaltenden liposomen. - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft neue Liposom-verpackte lipophile Heilmittel-Zusammensetzungen, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als chemotherapeutische Agenzien, um die eingekapselten Heilmittel im Körper abzugeben, d.h. bei Mammalia, einschließlich bei Menschen.
• Die Erfindung betrifft insbesondere ein neues Mehrstufen-Kapselungs-/Einbringverfahren zum Einschließen von kationischen lipophilen Heilmitteln, die selektiv in eine Lipid- Doppelschicht übergehen können. Sie betrifft insbesondere ein anti-neoplastisches Anthracyclinmittel, das zur Behandlung von tumorhaften oder malignen Zuständen bei Mammalia, einschließlich Menschen, verwendet werden kann, wobei die Kapselung in micellenartigen Liposompartikeln, hergestellt als unilamellare Lipidvesikel, erfolgt. Das neue Kapselungs-/Einbringverfahren ermöglicht das Austreten von Heilmitteln aus der Lipidmembran in den wäßrigen Innenraum der Liposomen. Dadurch wird die Kapselungsleistung und damit auch die an den Körper abgebbare Heilmenge erhöht, bspw. die an den Tumorgeweben abgegebene Menge anti-neoplastischen Agens. bei den anti-neoplastischen Agenzien, d.h. bei der Therapie mit einem Liposom-verpackten antineoplastischen Anthracyclinmittel, bestehen weitere Vorteile in einer verbesserten in vivo Stabilität des Heilmittel-Abgabesystems, einer spezifischeren Heilmittel-Abgabe an der (den) Tumorgewebestelle(n), einer verminderten Kardiotoxizität sowie in der Möglichkeit, solche Heilmittel-Abgabesysteme in großem Maßstab herstellen und somit verabreichen zu können.
Hintergrund der Erfindung
• Seit annähernd 20 Jahren wird in der wissenschaftlichen Literatur - mit zunehmender Häufigkeit - die Verwendung von Liposomen als biodegradables Abgabesystem für die verschiedensten Heilmittel beschrieben. Dies betrifft auch deren Verwendung, um antineoplastische Anthracyclinmittel an ein Tumorgewebe zu dirigieren, um die Wirksamkeit des verabreichten Anthracyclin-Heilmittels zu erhöhen und dabei dessen Kardiotoxizität zu vermindern. Siehe beispielsweise hierzu folgende US-Patente: 3,993,754, erteilt am 23. Nov. 1976 an Rahman et al.; 4,217,344, erteilt am 12. Aug. 1980 an Vanlerberghe et al.; 4,235,871, erteilt am 25. Nov. 1980 an Papahadjopoulos et al.; 4,241,046, erteilt am 23. Dez. 1980 erteilt an Papahadjopoulos et al.; 4,263,428, erteilt am 21. Apr. 1981 an Apple et al.; 4,310,505, erteilt am 12. Jan. 1982 an Baldeschwieler et al.; 4,330,534, erteilt am 18. Mai 1982 an Sakurai et al.; 4,331,654,erteilt am 25. Mai 1982 an Morris; 4,356,167, erteilt am 26. Okt. 1982 an Kelly; 4,411,894, erteilt am 25. Okt. 1983 an Schrank et al.; 4,419,348, erteilt am 6. Dez. 1983 an Rahman et al., 4,427,649, erteilt am 24. Jan. 1984 an Dingle et al.; 4,438,052, erteilt am 20. März 1984 an Weder et al.; und 4,515,736, erteilt am 7. Mai 1985 an Deamer.
• Ferner die internationalen Anmeldungen Nr. PCT/US84/01431, veröffentlicht am 4. März 1985 (internationale Publikationsnummer WO 85/009689) mit Mayhew et al. als Erfinder; internationale Anmeldung Nr. PCT/US84/00855, veröffentlicht am 21. Nov. 1985 (internationale Publikationsnummer WO 85/05030) mit Janoff et al. als Erfinder; europäische Patentanmeldung Nr. 0,004,467, veröffentlicht am 3. Okt. 1979 mit Apple et al. als Erfinder; europäische Patentanmeldung Nr. 0,036,676, veröffentlicht am 30. September 1981 mit Hunt et al. als Erfinder; europäische Patentanmeldung Nr. 0,161,445, veröffentlicht am 21, Nov. 1985 mit Fukushima et al. als Erfinder; europäische Patentanmeldung Nr. 0,198,765, veröffentlicht am 22. Okt. 1986 mit Rahmen als Erfinder und britische Patentanmeldung Nr. GB 2,146,525A, veröffentlicht am 24. April 1985 mit Margalit als Erfinder. Siehe ferner: Ryman et al., "Possible Use of Liposomes in Drug Delivery", in "Optimization of Drug Delivery, Alfred Benzon Symposium 17", Hrsg. H. Bundgaard et al. (Copenhagen: Munksgaard, 1982); Forssen et el., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78(3), 1873-1877 (1981); Gabizon et el., Cancer Research, 42, 4734-1739 (1982) und Forssen et el., CancerResearch, 43, 548-550 (1983).
• Die bisherigen Verfahren zur Herstellung von Liposom/Heilmittel-Abgabesystemen besitzen iedoch allgemein den Nachteil, daß der damit erreichbare Grad der Liposomverpackung des Heilmittels (die "Einschlußeffizienz") bescheiden ist. Die internationalen Patentanmeldungen Nr. PCT/US85/01501 und PCT/US85/01502 (veröffentlicht: 27. Feb. 1986 als WO 86/01102 und WO 89/01103 mit Bally et el. als Erfinder) offenbaren Verfahren, wo die Einschlußeffizienzen höher sein sollen, wo annährend 100% Einschluß erreicht werden soll. Gleichzeitig soll die Geschwindigkeit, mit der das Heilmittel in den Liposomenträger eingebracht wird, größer sein. Bei diesen Verfahren wird über die Liposomenwände ein Transmembranpotential mittels eines lonenengradienten für ein oder mehrere Spezies - Na+/K+, Ca++ und H+ - errichtet. Der Konzentrationsgradient beruht, wie bereits der Name andeutet, auf Liposomen, die innerhalb ("in der inneren Phase") und außerhalb ("in der äußeren Phase") der Vesikel unterschiedliche Konzentrationen von geladenen Teilchen aufweisen. Vgl. hierzu Ostro, Hrsg., "Liposomes, from Biophysics to Therapeutics" (New York: Marcel Dekker, Inc., 1987), S. 60-65.
• Das US-Patent Nr 4,619,794 (erteilt am 28. Okt. 1986 an Hauser) offenbart die Zugabe von Säuren, Basen oder beidem zur Steuerung des pH während der Herstellung kleiner unuilemellarer Liposomen aus einer gegebenen Lipidmischung. Das Hauser-Petent offenbart jedoch kein Heilmittel-Einbringverfehren in vorab hergestellte Vesikel.
• Die EP-A-290296 ist für die vorliegende Anmeldung Stand der Technik gemäß Artikel 54(3) und (4) EPÜ. Sie beschreibt Liposomformulierungen, die nach folgendem Verfahren erhältlich sind: Es werden zunächst in einem wäßrigen Medium, vorzugsweise einem Puffer, Liposomen hergestellt. Denn wird des Medium angesäuert oder alkalisch gemacht und ein pH-Gredient errichtet. Die resultierenden sauren oder alkalischen Liposomen werden denn mit einem anti-neoplastischen Agens gemischt. Beschrieben werden folgende Säurelösungen: Essigsäurepuffer, Oxalsäurepuffer, Bernsteinsäurepuffer und Zitronensäurepuffer. Der pH der sauren Puffer liegt bei ca. 3,5 bis 4,5.
Zusammenfassung der Erfindung
• Es wurde nun gefunden, daß sich kationische, lipophile, in eine Lipiddoppelschicht übergehende Heilmittel in einem üblichen Liposom/Heilmittel-Abgabesystem verpacken und einbringen lassen - und zwar schnell und in hohen Konzentrationen - mit einem Verfahren, das umfaßt: Als erstes das Herstellen von Liposomen in einem wäßrigen Medium, des eine Säure enthält, die eine Pyrenosidylsäure oder Zitronensäure ist, wobei der pH des wäßrigen Mediums bei 2,0 bis 2,5 liegt.
• Das zu verpackende Heilmittel kann bei der Liposomherstellung anwesend sein. Es kann aber auch im sauren Liposom-haltigen wäßrigen Medium (der äußeren Phase) im Anschluß an die Liposom-Herstellung zugefügt werden. In beiden Fällen wird es aufgenommen, es kann aber nicht die Doppelschicht bei dieser Verfehrensstufe durchdringen.
• Es wird dann eine Base zugegben, die in den inneren und äußeren Phasen die Säuremoleküle zu ihren Anionen werden läßt. Die Base sollte eine sein, deren Kationen die Lipiddoppelschicht der Liposomvesikel nicht durchdringen können. Die spezielle Wehl der Base richtet sich auch nach dem jeweils zu verpackenden Heilmittel. Es wurde gefunden, daß bestimmte Basen nicht funktionieren oder weniger effizient sind als andere, d.h. zum Einschließen von bestimmten Heilmitteln, insbesondere von antineoplastischen Anthrecyclinmitteln.
• Die basischen Kationen neutralisieren denn die Ladungen der Säureanionen in der äußeren wäßrigen Phase. Da die Basenkationen jedoch nicht die Lipiddoppelschicht durchdringen können, werden die in der inneren wäßrigen Vesikelphase befindlichen Säureanionen nur ladungsneutralisiert, wenn sie sich mit dem ketionischen Heilmittel verbinden. Dadurch kann man des Heilmittel veranlassen, aus der Membrandoppelschicht in die innere wäßrige Phase überzugehen.
• Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein neues Mehrstufen-Kapselungs-/Einbringverfahren zum Herstellen von Liposom-verpackten kationischen lipophilen Heilmittel- Zusammensetzungen, wie Liposom-verpeckten anti-neoplestische Anthrecyclinmittel- Zusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, wobei der Übergang des Heilmittels aus der Lipidmembran in den inneren wäßrigen Raum der Liposomen erleichtert sein soll. Dadurch soll die Einschlußeffizienz und somit die an den gewünschten Stellen innerhalb des Körpers verebreichbere Heilmittelmenge vergrößert werden.
• Diese und weitere Ziele sowie der Charakter, Umfang und Gebrauch der Erfindung sind für den Fachmann aus der sich anschließenden Beschreibung sowie den beigefügten Ansprüchen sofort ersichtlich.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
• Kationische lipophile Heilmittel, die in eine Lipiddoppelschicht übergehen können und die sich somit für die Durchführung der Erfindung eignen, umfassen: Heilmittelklasse Beispiele Lokalanaesthetika Cholinergene Agenzien Antimaleria-Mittel Mittel gegen Parkinson Antagonisten für adrenerge Rezeptoren Antiprotazoate Anthistaminika Dibucein, Tetracain, Procain, Chlorpromazin Pilocarpin, Physostigmin, Neostigmin Chloroquin, Amodiaquin, Chloroguanid, Primaquin, Mefloquin, Chinin Piridinol, Prodipin, Benztropin-mesylat, Trihexyphenidyl-Hydrochlorid Propanolol, Timolol, Pindolol Pentamidin, Chinacrin Benadryl, Promethazin Biogene Amine Allgemeine Analgetika Anticholenergika Antidepressiva Anti-arrhytmische Mittel Antiemetika Dopamin, Seratonin, Epinephrin Codein, Meperidin, Methedon, Morphin Atropin, Decyclomin, Methixen, Propanthelin Imipramin, Amitriptylin, Doxepin, Desipremin Quinidin, Propanolol, Lidocain Chloropromazin, Promethazin, Perphenazin Ostro, e.a.O., Seite 64.
• Kationische Anthracyclin-Verbindungen mit anti-neoplastischer Wirkung gegen cancerogene Gewebe oder Zellen umfassen Daunorubicin (auch bekannt als Daunomycin), Doxorubicin (auch bekannt als Adriamycin), Aclacinomycin A, Vinblastin, Vincristin, Mitomycin C und dergleichen. Sie sind besonders bevorzugt für den Einschluß in liposomale micellare Partikel durch des neue Mehrstufen-Kapselungs- /Einbringverfahren gemäß der Erfindung. Diese Anthracyclin-Verbindungen enthalten strukturell ein hydrophobes Tetrecyclin-Ringsystem, das über eine glycosidische Bindung an einen Aminozucker gekoppelt ist.
• Biologische Lipide sind amphiphatische Moleküle, (d.h. einen hydrophoben und einen hydrophilen Teil enthaltende Moleküle), die sich spontan zu kleinen Kugelkörpern, Ellipsoiden oder langen Zylindern, oder zu Doppelschichten mit zwei oder mehreren parallelen Schichten aus amphiphatischen Molekülen aggregieren. Daraus können die für die Durchführung der Erfindung geeigneten Liposomdoppelschicht-Membranpartikel oder -vesikel hergestellt werden. in einem wäßrigen (polaren) Medium werden die polaren Köpfe der schichtbildenden amphpiphatischen Moleküle nach außen in des umgebende Medium zeigen, wobei die unpolaren Schwanzteile dieser Moleküle zueinander assoziiert bleiben. Dadurch kommt es in der Vesikelwend zu einer polaren Oberfläche und zu einem unpolaren Kern. Solche doppelschichtigen Micellen sind gewöhnlich als unilammellere (mit einer Doppelschicht) oder multilamellare (mit einer Anzahl von im wesentlichen konzentrischen Doppellschichten) Kugelvesikel, die ein wäßriges Innenkompartment aufweisen.
• Die für die Durchführung dieser Erfindung geeigneten Liposomdoppelschicht- Membranpartikel sind kleine (sie besitzen einen Durchmesser von beispielsweise ca. 30 bis 150 Nanometer (nm), vorzugsweise ca. 45 bis 60 nm; der Durchmesser wird beispielsweise mit Hilfe eines Lichtbrechungspartikelgrößenmessers bestimmt), neutrale (ungeladene oder mit ausgeglichener Ladung versehene, d.h. zwitterionische), unilamellare oder multilemellare Phosphorlipid-Vesikel oder Liposomen. Sie sind zugeschnitten auf ein maximales Kapseln/Aufnehmen des kationischen lipophilen Heilmittels nach dem erfindungsgemäßen Verfahren sowie auf das Hervorrufen einer Spezifität, einer Gewebs-/Zellspezifität, um so eine maximale Aufnahme aus dem geschaffenen Liposom/Heilmittel-Abgebesystem zu erreichen.
• Erfindungsgemäß geeignete Liposomen lassen sich mit Carbonsäurediestern der aliphatischen Triole und höheren Polyole, wie Glycerin, Sorbitol, Mannitol und dergleichen, herstellen. Dabei ist Glycerin bevorzugt. Sie sind auch herstellbar aus Sphingosin oder anderen Aminoelkoholen mit langen ungesättigten Kohlenwasserstoffketten, z.B. Dialkyl-Amphiphilen, wie Sphingomyelin und dergleichen. Die Esterhälften leiten sich hierbei ab von gesättigten oder ethylenisch ungesättigten (mit 1 bis 4, vorzugsweise 1 bis 2 ungesättigten Stellen pro Kette) aliphatischen Monocarbonsäuren (langen Fettsäuren) mit mindestens 14 bis ca. 30 C-Atomen, vorzugsweise mit ca. 18 bis 24 C-Atomen, wie Palmitinsäure, Stearinsäure, 10- Methylstearinsäure, Lignocerinsäure, Palmitoleinsäure, Oleinsäure, Linolensäure, Phythinsäure sowie Arachidonsäuren und dergleichen. Dabei können ein oder mehrere, vorzugsweise eine der Hydroxygruppen des Polyols mit einer Phosphatestergruppe substituiert sein. Diese kann selbst mit niederen aliphatischen di- oder höherfunktionellen Verbindungen, die Hydroxyl- oder Aminogruppen (einschließlich Aminogruppen, die beispielsweise mit niederen Alkylgruppen substituiert sind) oder beides aufweisen, wie beispielsweise Ethanolamin, Cholin, Serin, Inositol und dergleichen.
• Derartige Liposomdoppelschicht-Membranpartikel umfassen solche, die hergestellt sind aus: Dipalmitoyl-phosphatidylcholin, Distearoyl- phosphatidylcholin, Dioleoylphosphatidylethanolamin, Distearoyl-phosphatidylserin, Dilinoleoyl-phosphatidylnisotol, Distearoyl-phosphatidylglycerin und dergleichen sowie Mischungen davon. Umfaßt sind ferner Lipiddoppelschicht-Membranpartikel, die vollständig aus neutralen Phospholipiden, wie Distearoyl-phosphatidylcholin, hergestellt sind und vorzugsweise solche, die mit Cholesterin oder cholesterin-ähnlich wirkenden Substanzen stabilisiert sind (beispielsweise in einem molaren Verhältnis von Distearoyl-phosphatidylcholin zu Cholesterin von ca. 2:1) bzw. die Substanzen enthalten, von denen bekannt ist, daß sie sich besonders eignen im Hinblick auf ihre Spezifitätswirkung in Verbindung mit der Abgabe der anti-neoplastischen Anthracyclin-Agenzien.
• Die Liposomen werden im allgemeinen durch bekannte Techniken hergestellt, z.B. durch des von Mauk et al., Anal. Bioc., 94, 302-307(1979) beschriebene Beschallungsverfahren oder durch Mikroemulgioerung wie beschrieben in der parallelen US-Patentanmeldung Nr. 696,727, eingereicht am 31 Januar 1985 im Namen von R. Gamble, die gemeinsam mit dieser Anmeldung übertragen worden ist. Die Homogenisierung durch die Beschellungsvorrichtung erfolgt im allgemeinen mit ca. 30 Sekunden bis zu 1 Minute pro Milliliter Suspension. Nach der Homogenisierung wird die Suspension ca. 5 bis 20 Minuten, vorzugsweise ca. 10 Minuten, mit ca. 1000xg bis ca. 20000xg, vorzugsweise mit ca. 5000xg, bei Umgebungstemperetur (gewöhnlich ca. 22ºC) zentrifugiert und denn durch ein kleinporiges Sterilfilter, beispielsweise eine Filter mit 0,2-0,45 um Porendurchmesser gepreßt. Diese zwei Schritte (Zentrifugation und Filtration) entfernen großteilige Körper, wie unsuspendierte Lipide, große Vesikel und andere mögliche konteminierende Teilchen.
• Die Permeabilität oder das Austreten kann so gemessen werden, daß die Vesikel zunächst von jedem anderen ausgetretenen Material getrennt werden. Dies kann bspw. durch Gel-Permeationschromatographie, Dialyse, Ultrafiltration oder dergleichen erfolgen. Dann wird in bekannter Weise alles austretende Material bestimmt. Die Permeabilitäten betragen auf eine Zeitdauer von ca. 24 Stunden oder länger ca. 1 % bis ca. 10% des ursprünglich eingeschlossenen Materials. Derartige Permeabilitäten sind bei der Durchführung der Erfindung akzeptabel.
• Die für die Durchführung der Erfindung verwendeten Säuren sind Zitronensäure oder eine monofunktionale Pyranosidylsäure, wie Glucuronsäure, Gulonsäure, Gluconsäure, Galacturonsäure, Glucoheptansäure, Lactobionsäure und dergleichen; α- Hydroxypolycarbonsäuren, wie Zitronensäure, Iso-Zitronensäure, Hyaluronsäure, Carboxypolymethylene und dergleichen; Aminosäuren wie Glutaminsäure, Asparaginsäure, Carboxyasparaginsäure, Carboxyglutaminsäure.
• Es wurde gefunden, daß die Pyranosidylsäuren beim erfindungsgemäßen Einbringverfahren für das anti-neoplastische Anthracyclinmittel besonders wirksam sind. Für Doxorubicin wurde gefunden, daß sich dieses mit diesem Verfahren schwerer einbringen läßt als Daunorubicin. Es wird aber mit Lactobionsäure und Galacturonsäure, nicht aber durch Essigsäure, schnell eingebracht. Ferner wurde gefunden, daß Zitronensäure auch Doxorubicin einbringt, die resultierenden beladenen Vesikel aber überraschenderweise weit stärker toxisch sind als das freie Heilmittel. In nahezu allen Fällen, die aus der Literatur bekannt sind, war aber das in das Vesikel eingeschlossene Doxorubicin, die beladenen Vesikel, weniger toxisch als das freie Heilmittel.
• Die Base für die Umwandlung der Säuremoleküle in den inneren und äußeren wäßrigen Phasen in die entsprechenden Anionen sollte, wie oben erwähnt, eine sein, deren Kationen nicht durch die Lipiddoppelschichten der Vesikel gehen können. Solche Basen umfassen u.a. Alkali- und Erdalkalimetallhydroxide, Carbonate und ähnliche Vervbindungen, beispielsweise Natrium-, Kalium- , Lithium-, Calcium- und Magnesiumhydroxide und -carbonate; Amine wie N-Methylglucamin, Ethylendiamin, und TRIS-Base (auch bekennt als Astromethamin, 2-Amino-2hydroxymethyl-1,3-propandiol und tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan). Diese besitzen alle eine hohe Löslichkeit in Wasser, größer als 0,01 Mol/l, und sind wenig löslich, weniger als 0,01 Mol/l, oder unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Ethanol, Chloroform, Diethylether und Ethylacetat.
• Es ist gefunden worden, daß bestimmte Basen, die des Kriterium erfüllen - d.h. Kationen, die nicht durch die Lipiddoppelschichten der Vesikel gehen können - für das erfindungsgemäße Einbringen der anti-neoplastischen Anthracyclin-Agenzien wirksamer sind als andere. So wurde gefunden, daß Carbonate, wie Calciumcarbonat, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, und dergleichen, in allen Fällen funktionieren, auch bei dem schwer zu verpackenden Doxorubicin. Basische Hydroxide, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid und Calciumhydroxid, sowie Amine - einschließlich von Ethylendiamin, TRlS- und N-Methylglucamin - hingegen sind für ein erfindungsgemäßes Einbringen des Doxorubicins in die Vesikel nicht geeignet.
• Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Vesikel, d.h. die trockenen Pulver, wenn sie in dieser Form gelagert wurden, zunächst in einem wäßrigen Medium bei einer Temperatur von ca. 40ºC bis ca.80ºC, vorzugsweise von ca. 50ºC bis ca. 70ºC, bei einer Vesikelkonzentration von ca. 5 mg/ml bis ca. 100 mg/ml, vorzugsweise bei ca. 20 mg/ml bis ca. 40 mg/ml, dispergiert.
• Es kann reines Wasser verwendet werden, das vorzugsweise - aber nicht notwendigerweise - deionisiert ist (kleine Anionen, wie Chlorid, können leicht durch die Membrandoppelschicht hindurchgehen und das Kapselungs-/Einbringverfahren stören). Es können auch andere schwach ionische Medien, wie beispielsweise Zuckerlösungen verwendet werden. Dies ist in der parallelen US-Patentanmeldung Serial No. 787,535, eingereicht am 15. Oktober 1985 im Namen von Eric Forssen, die gemeinsam mit dieser Anmeldung übertragen wurde, offenbart (Anwaltsektenzeichen: 171/279).
• Es können auch, wie oben beschrieben, Cholesterin und wie Cholesterin wrkende Substanzen, wie andere Sterole, zwitterionische oder ungeladene Lipide und dergleichen, falls gewünscht, zur wäßrigen Vesikeldispersion gefügt werden, um so die Stabilität der anschließend erzeugten Heilmittel-beladenen Vesikel zu verbessern. Derartige Substanzen werden gewöhnlich in Mengen in Bereichen von ca. 0,1 bis ca. 50 Mol%, vorzugsweise von ca. 5 bis 33 Mol%, bezogen auf des Gesamtgewicht der Komponenten der Doppelschichtmembran, zugesetzt.
• Die für die Herstellung des Vesikel-haltigen wäßrigen Mediums ausgewählte Säure ist bei der Hydratation und Homogenisierung (d.h. bei der Beschallung) gegenwärtig und zwar noch vor der Zugabe des einzubringenden Heilmittels. Sie wird in Konzentrationen im Bereich von ca. 10 mMol/l (millimolar) bis ca. 300 mMol/l, vorzugsweise im Bereich von ca. 50 mmol/l bis ca. 200 mMol/l, zugesetzt. Die Suspension wird bei diesem Schritt bei einer Temperatur von ca. 30ºC bis ca. 70ºC, vorzugsweise von ca. 50ºC bis ca. 60ºC, gehalten.
• Des Heilmittel, d.h. das anti-neoplastische Anthracyclinmittel, wird dann zum sauren wäßrigen Vesikel-haltigen Medium, entweder als trockenes Pulver oder - vorzugsweise als konzentrierte Lösung in Wasser, zugegeben und zwar in einer Menge im Bereich von - ca. 1 mg/100 mg Lipid, um so soweit als möglich eine 100 %ige Kapselung zu erreichen. Die Temperatur, bei der das Heilmittel zugegeben wird, liegt im allgemeinen über der Phasenübergangstemperatur der Vesikel, z.B. bei einer Temperatur von ca. 40ºC bis ca. 80ºC, vorzugsweise von ca. 50ºC bis ca. 65ºC, um so die Diffusion des Heilmittels in die Vesikel zu erleichtern. Die heilmittelhaltige Suspension wird vorzugsweise bis zur Zugabe der Base bei dieser Temperatur gehalten.
• Die ausgewählte Base wird dann zur Heilmittel-haltigen sauren Vesikelsuspension zugegeben und zwar in einer Menge im Bereich von ca. 1/6 bis zu einem Moläquivalent, bezogen auf die Nettoionen der Säure und des gewünschten pH-Endwerts. Im Fall von anti-neoplastischen Anthracyclinmittel-haltigen Suspensionen wird üblicherweise ein pH im Bereich von ca. 4,5 bis ca. 6,0 angestrebt. Die Zugabe der Base erfolgt üblicherweise so, daß die Mischung weiter erwärmt wird, beispielsweise auf eine Temperatur von ca. 40ºC, und zwar für ca. 1 bis 10 Minuten, vorzugsweise unter Bewegen der Mischung, um schnell eine gründliche Mischung zu erhalten. Nach der Zugabe der Base erfolgt gewöhnlich ein Erhitzen für weitere 5 bis 20 Minuten, vorzugsweise für 10 Minuten.
• Die Zeitintervalle zwischen diesen Verfahrensschritten und im gesamten Einschluß- /Einbringverfahren sind jedoch nicht kritsch. Das Gesamtverfahren erfordert gewöhnlich ca. 30 bis ca. 120 Minuten, einschließlich der anschließenden Aufarbeitungen, um das Heilmittelabgabesystem z.B. für eine parenterale Verabreichung zuzubereiten, beispielsweise für eine intravenöse Injektion beim Menschen, oder zur Lagerung.
• Derartige Aufarbeitungsschritte umfassen zunächst das Entfernen der Säure und der weiteren Anionen aus der Umgebung der Liposomen und deren Ersatz durch beispielsweise eine wäßrige Zuckerlösung - beispielsweise durch eine Lösung, die ca. 5 bis ca. 20 Gew% eines biologisch akzeptablen Mono-, Di oder Trisaccharids, das mit den Heilmittel-gefüllten Vesikeln kompatibel ist, enthält; solche Zucker sind beispielsweise Lactose, Dextrose, Sucrose, Trehalose, Raffinose, Maltose oder dergleichen; oder durch eine Lösung eines Nicht-Saccharidpolyols, wie Glycerin, Inositol, Sorbitol, Mannitol oder dergleichen, die ferner von ca. 0,1 bis 2 Gew% eines Exzipienten enthalten kann, wie Glycin, Tromethamin, N-Methylglucamin, oder dergleichen, die als Puffer agieren. Das Entfernen der Säure oder der weiteren Anionen aus dem äußeren wäßrigen Medium kann auch durch Gel-Permeationschromatographie, Ultrafiltration, Vakuumdialyse, Tangentialfluß-Filtration, Hohlfaser-Filtration oder ähnliche Verfahren erreicht werden. Dabei ist die Gel-Permeationschromatographie für Produktvolumina von 100 ml oder weeniger bevorzugt, die Tangentialfluß-Filtration hingegen für Volumina von mehr als 100ml.
• Nach der Substitution der Säure erfolgt gewöhnlich eine Zentrifugation und Konzentration, wobei wiederum Vakuumdialyse, Ultrafiltration, Tangentialfluß-Filtration oder andere Verfahren verwendet werden können, um Wasser und wäßrige Lösungen zu entfernen und zugleich die Lipidvesikel und deren Inhalte zurückzuhalten.
• Es werden nun einige Beispiele gegeben, damit der Fachmann die Erfindung vollständig verstehen kann. Die Beispiele dienen nur zur Darstellung der Erfindung. Sie sind aber nicht so aufzufassen, deß sie die Grenzen der Erfindung beschreiben, sofern solche nicht auch in den beigefügten Ansprüchen beschrieben sind. Alle teil- und Prozentangaben sind, sofern nicht anders angegeben, auf das Gewicht bezogen.
Beispiel I
• Kapselung von Daunorubicin in Distearoyl-phophatidylcholin-Cholestrinvesikel unter Verwendung von Zitronensäure und Natriumhydroxid.
• Es wurde ein trockenes Pulver hergestellt, das eine homogene Mischung aus Cholesterin und Distearoyl-phospahtidylcholin im Molverhältnis 1:2 enthielt. Diese Dispersion wurde denn mit einer wäßrigen Lösung hydratisiert, die 41,2 % Lactose, (entsprechend 125 mMol/l) und 50 mMol Zitronensäure enthielt und einen pH von ca. 2,0 bis 2,5 (nicht eingestellt) besaß. Die Lipidkonzentration in der resultierenden Suspension betrug 20 mg/ml. Diese Mischung wurde auf 65ºC erhitzt und dann Daunorubicin als konzentrierte Lösung in Wasser zugesetzt. Die Menge an Daunorubicin war so gewählt, daß die Daunorubicin-Endkonzentration ca. 1,0 mg/ml betrug. Als nächstes wurde dann im Verlauf von 3 Minuten Natriumhydroxid zur Mischung zugesetzt wobei deren Menge 2 1/2 Moläquivelent pro Mol Zitronensäure entsprach. Die Mischung wurde dann heftig bewegt, um schnell eine gründliche Mischung zu erhalten.
• Nach Zugabe des Natriumhydroxids wurde für ca. 10 Minuten bei gleicher Temperatur inkubiert. Bei dieser Verfahrensstufe ging das Daunorubicin über die Membrandoppelschicht ins Innere der Vesikel über und bildete mit dem Citrat als Gegenion ein Salz. Nach der Inkubation wurde die Mischung auf Umgebungstemperatur gekühlt und wie vorstehend beschrieben zentrifugiert. Als nächstes wurde dann die Citrat- und Natriumionen enthaltende wäßrige Lösung aus 9 % Lactose und 50 mMol/l Glycin durch Gel-Permeationschromatographie ausgetauscht.
• Nach dem Austauschschritt erfolgte eine Tangetialfluß-Filtration des Heilmittels, wobei das Wasser und wäßrige Solute entfernt wurden. Die Lipidvesikel und deren lhelte hingegen wurden zurückgehalten. Des konzentrierte Produkt wurde dann durch Filtration sterilisiert, wobei Filter mit 0,45 um (Micron) Porendurchmesser verwendet wurden. Die fertige Lipidvesikel-Suspension mit dem verpackten Daunorubicin war dann gebrauchsfertig. Sie konnte aber auch für 4 oder mehrere Wochen eingefroren oder bei 4ºC gelagert werden.
Beispiel II
• Einkapselung von Doxorubicin mit Distrearoyl-phosphatidylcholin, Cholesterin, Lactobionsäure und Calciumcarbonat.
• Es wurde ein trockenes Pulver hergestellt, das eine homogene Dispersion aus Cholesterin und Distrearoyl-phosphatidylcholin im Molverhältnis 1:2 enthielt. Diese Dispersion wurde dann mit einer wäßrigen Lösung aus 200 mMol/l Lactobionsäure (71,66 g/l) und einem pH von 2,0 bis 2,5 (nicht eingestellt) hydratisiert. Die Lipidkonzentration in der resultierenden Suspension betrug ca. 20 mg/ml. Diese Mischung wurde denn auf 70ºC erhitzt. Die Zubereitung wurde dann homogenisiert, zentrifugiert und, wie in Beispiel I beschrieben, filtriert.
• Nach der Suspendierung der kleinen unilamellaren Vesikel in 200 mMol/l Lactobionsäure wurde die Suspension auf 65ºC erhitzt und Doxorubicin als konzentrierte Lösung in Wasser zugefügt und zwar in einer Menge, deß die Doxorubicin-Endkonzentrationca. 1,0 mg/ml betrug. Als nächstes wurde dann Calciumcarbonat als trockenes Pulver in einer Menge entsprechend ca. 20 g/l zugefügt. Dabei wurde die Mischung weiter erhitzt. Das Erhitzen wurde für weitere 10 Minuten fortgesetzt und in dieser Zeit die Zubereitung heftig bewegt. Als nächstes wurde die Mischung zentrifugiert, um überschüssiges Calciumcarbonat und anderes präzipitiertes Material zu entfernen. Die verbleibenden Verarbeitungsschritte waren wie vorstehend in Beispiel I.
• Es wurde eine Lipidvesikel-Suspension mit verpacktem Doxorubicin erhalten.
Beispiel III
• Es wurde des im obigen Beispiel II beschriebene Verfahren in jedem wesentlichen Detail wiederholt, ausgenommen, daß:
• - anstelle von Lactobionsäure Galacturonsäure verwendet wurde;
• - des Calciumcarbonat durch Natriumcarbonat ersetzt war.
• Es wurde wiederum eine Lipidvesikel-Suspension mit gekapseltem Doxorubicin erhalten.
Beispiel IV
• Es wurde in jedem wesentlichen Detail das in Beispiel II beschriebene Verfahren wiederholt, ausgenommen, daß für die Vesikel-Doppelschicht Distrearoylphosphatidylglycerin, Cholesterin und Distearoyl-15-phosphatidylcholin in einem Molverhältnis von 1,5:5:10 verwendet wurde.
• Es wurde wiederum eine Lipidvesikel-Suspension mit verpacktem Doxorubicin erhalten.
Beispiel V
• Es wurden Daunorubicin-Vesikel, die wie oben in Beispiel I hergestellt worden waren, wie folgt gelagert: gefroren, gekühlt bei 4ºC oder bei Raumtemperatur (22ºC). Nach 2 bis 4 Wochen wurden die Proben getestet und zwar auf: 1) chemische Stabilität des Heilmittels und der Lipidkomponenten; 2) Rückbehelt des Heilmittels in den Vesikeln; und 3) biologische Aktivität, die über die Antitumorwirkung (nur 2 Wochen) gemessen wurde. Es war innerhalb der 4 Wochen kein signifikanter Abbau festzustellen oder ein Verlust an Heilmittel oder Vesikellipiden. Es scheint auch so zu sein, daß nicht signifikant aus den eingefrorenen odr getauten Vesikeln das Heilmittel austritt, ausgenommen mögliche ca. 5 %. Die biologische Wirksamkeit war der von frisch zubereitetem freiem Daunorubicin überlegen und sie wer auch nur wenig geringer (bei 4ºC) als bei frisch zubereiteten Vesikeln.
Beispiel VI
• Antitumorwirkung von Daunorubicin-Vesikeln.
• Es wurden Daunorubicin-Vesikel - wie oben in Beispiel I hergestellte - getestet, und zwar gegen ein P-1798-Lymphsarkom und ein Mel6c-Brust-Adenokarzinom. Beides sind feste Maus-Tumore. Die Untersuchungen am Mal6c-Tumor dauern noch an; die Untersuchungen am P-1798-Tumor sind bereits abgeschlossen. Die Behandlung mit Dosen im Bereich von 10 mg/kg bis 50 mg/kg zeigten, daß die wie oben beschrieben formulierten Daunorubicin-Vesikel alle eine größere Antitumorwirkung und eine geringere Toxizität besaßen als das Ausgangs-Heilmittel. Dies wurde über die verlängerte Lebensdauer und die verminderte Tumorgröße festgestellt.
Beispiel VII
• Die biologisch Aktivität der Doxorubicin-Vesikel.
• Es wurden Doxorubicin-Vesikel - wie in den Beispielen II und III hergestellt - auf Toxizität und Antitumorwirkung getestet. Diese Untersuchungen dauern noch an, jedoch sind bereits einige Ergebnisse und Schlüsse offensichtlich.
• Die Behandlungen der CD2F1-Mäuse zeigten, daß die maximale Toleranzdosis (MTD, nicht-letal) einer einzelnen intravenösen Dosis des freien Heilmittels, Doxorubicin- Hydrochlorid, ca. 25 mg/kg ist. Dies steht im Vergleich zur MTD von 40 mg/kg (normalisiert auf das Hydrochlorid) für die, wie in Beispiel III beschrieben, hergestellten Doxorubicin-Vesikel. Im Gegensatz dazu wer die MTD für Doxorubicin-Vesikel, die wie in Beispiel II beschrieben hergestellt waren (mit der Ausnahme, daß anstelle der Citronensäure Lectobionsäure verwendet wurde), nur ca. 10 mg/kg und somit geringer als die MTD für das freie Heilmittel.
• Mit Lactobionsäure hergestellte Doxorubicin-Vesikel zeigten eine geringere Toxizität. Dies wurde über die Suppression der weißen Blutzellen und anhand des Überlebens bei höheren Dosen, verglichen zum freine Heilmittel, gezeigt.
• Es wurden die weißen Blutzellen (w.b.c.) gezählt, und zwar bei CD2F1-Mäusen, die Doxorubicin in Dosen von 40 mg/kg erhalten hatten (entsprechend der äquivalenten Menge Hydrochlorid). Mäuse, die freies Heilmittel erhielten litten unter einer erheblichen Verminderung der weißen Blutzellen. 4 Tage nach der Therapie betrug deren Zahl nur 8,5 % des Wertes vor der Therapie. Im Gegensatz dazu litten Mäuse, die mit erfindungsgemäß hergestellten Doxorubicin-Vesikeln (nach Beispiel II) behandelt wurden, bei gleicher Doxorubicin-Dosis nur unter einer modereten Verminderung der Zahl der weißen Blutzellen: 4 Tage nach der Therapie betrug hier die Zehl ca. 75 % des Wertes vor der Therapie.
• Es können auch Doxorubicin-Vesikel mit Zitronensäure hergestellt werden. Jedoch zeigten die intravenösen Tests an Mäusen, deß - obwohl eine Dosis freien Heilmittels von 20 mg/kg toleriert wurde - eine äquivalente Dosis des Doxorubicin-Citrats in Vesikeln bereits toxisch letal war.
• Die obige Diskussion der Erfindung ist hauptsächlich auf bevorzugte Ausführungsformen und Durchführungsverfehren gerichtet. Für den Fachmann ist sofort offensichtlich, daß weitere Änderungen und Modifikationen in der Tatsächlichen Ausführung des hier beschriebenen Konzepts leicht erfolgen können, ohne daß man dabei von der Erfindung, wie sie in den nachfolgenden Ansprüchen definiert ist, abweichen muß.

Claims (9)

1. Verfahren zur Herstellung einer in Phosholipid eingeschlossenen, kationischen, lipophilen Ärzneimittelzusammensetzung, das folgende Verfahrensschritte umfasst:

a) Erzeugen von Liposomen in einem wässrigen Medium, das eine monofunktionelle Pyranosidylsäure oder Zitronensäure enthält und wobei der pH des wässrigen Mediums von 2,0 bis 2,5 beträgt, um ein saures, liposomhaltiges wässriges Medium zu ergeben, bei dem die Säure in den internen und externen Liposomphasen vorliegt, wobei das Liposom aus Hydroxyaminoaliphat(niederer Kettenlänge)- substituierten Phosphatidylcarbonsäurediestern eines tri- oder höherfunktionellen aliphatischen Polyols hergestellt wird, dessen Esterfunktionen von einer gesättigten oder ethylenischungesättigten aliphatischen Monocarbonsäure mit wenigstens 14 Kohlestoffatomen stammen,

b) Zugeben eines kationischen, lipophilen Arzneimittels zu dem so erhaltenen sauren, liposomhaltigen wässrigen Medium, und

c) Zugeben einer Base, deren Kationen nicht die Lipiddoppelschicht der Liposomen durchdringen können, damit Säureanionen in der externen wässrigen Phase ladungsneutralisiert werden, wodurch der Übergang des kationischen, lipophilen Arzneimittels in die interne wässrige Phase der Liposomen induziert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1,

bei dem die monofunktionelle Pyranosidylsäure Glucarsäure, Gluconsäure, Gulonsäure, Galacturonsäure, Glucoheptonsäure oder Lactobionsäure ist.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Säure Lactobionsäure ist.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Base ein Alkali- oder Erdalkalimetall- Hydroxid oder -Carbonat ist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem nach der Zugabe der Base die Säure und andere Anionen aus der wässrigen Umgebung ausserhalb der Liposomen entfernt werden und durch eine wässrige Zuckerlösung ersetzt werden.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das kationische, lipophile Arzneimittel ein anti-neoplastisches Anthracyclinmittel ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Säure Zitronensäure, die Base Natriumhydroxid, der Diester Distearoyl-Phosphatidylcholin, das kationische, lipophile Arzneimittel Daunorubicin ist und in den Liposom- Doppelschichten Cholesterin als Stabilisator vorhanden ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Säure Lactobionsäure, die Base Natriumhydroxid, der Diester Distearoyl- Phosphatidylcholin, das kationische, lipophile Mittel Doxorubicin ist und in den Liposom-Doppelschichten Cholesterin als Stabilisator vorhanden ist.

9. In Phospholipid eingeschlossene, kationische, lipophile Arzneimittelzusammensetzung, hergestellt nach einem der in den vorhergehenden Ansprüchen beschriebenen Verfahren.