DE3874235T2

DE3874235T2 - Quantifizierung von chromatographischer information.

Info

Publication number: DE3874235T2
Application number: DE8888305609T
Authority: DE
Inventors: Michael W Hunkapiller
Original assignee: Applied Biosystems Inc
Current assignee: Applied Biosystems Inc
Priority date: 1987-06-19
Filing date: 1988-06-20
Publication date: 1993-04-15
Anticipated expiration: 2008-06-21
Also published as: EP0296781A3; US4837726A; EP0296781B1; DE3874235D1; EP0296781A2; JPH01212357A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung für den allgemeinen Einsatz zum Analysieren chromatographischer Informationen und sie bezieht sich insbesondere auf den Einsatz des Verfahrens und der Vorrichtung zur Analysierung chromatographischer Informationen, die sich auf die automatische Bestimmung von Peptidsequenzen beziehen.
Der chemische Vorgang, der bei Protein-/Peptid-Sequenzern eingesetzt wird, ist aus einem Verfahren hergeleitet worden, welches auf Pehr Edman in den 1950er Jahren für die sequenzielle Degradation von Peptid-Ketten zurückgeht (Edman, Acta Chem. Scand. 4, 283, 1950; Edman and Begg, Eur. J. Biochem. 1, 80, 1967) . Der erste Schritt bei dieser Degradation ist das wahlweise Koppeln einer Aminosäure am Arminoende der Peptid-Kette mit dem Edman-Reagenz, Phenylisothiozyanat (PITC), einer Reaktion, die durch eine organische Base katalysiert wird, die mit dem Kopplungsreagenz mitgeliefert wird. Die zweite Stufe ist das Abtrennen dieser derivatisierten Aminosäure von dem Rest des Peptids, einer Reaktion, die durch Behandlung des Peptids mit einer starken organischen Säure herbeigeführt wird. Jeder wiederholte Kopplungs/Trennungs-Zyklus wird an der neugebildeten Aminoend-Aminosäure durchgeführt, die von dem vorangehenden Zyklus übriggeblieben ist. Auf diese Art und Weise ermöglichen aufeinanderfolgende Zyklen das schrittweise Abtrennen der Aminosäuren, welche den Grundaufbau des Peptides bilden.
Der Sequenziervorgang wird durch die Edman-Degradation allein nicht vervollständigt. Wenn erst einmal die Aminosäuren von der Probe entfernt worden sind, müssen sie hinsichtlich ihrer Identität untersucht werden. Da das abgespaltene Aminosäurederivat, das Anilinthiazolinon (ATZ) für die Analyse im allgemeinen nicht geeignet ist, wird es die stabilere Phenylthiohydantoinform (PTH) umgewandelt, bevor die Analyse durchgeführt wird. In modernen Sequenzern wird diese Umwandlung (Wittmann-Liebold et al Anal. Biochem 75, 621, 1976; Hewick et al J. Biol. Chem. 256, 7990, 1981) automatisch in einem Reaktionsgefäß getrennt von demjenigen durchgeführt, in welchem die Edman-Degradation stattfindet. Das nach jedem Degradationszyklus erzeugte ATZ wird von dem Peptid mit Hilfe eines organischen Lösemittels extrahiert, in das Reaktionsgefäß gebracht und mit einer wässrigen Lösung einer starken organischen Säure behandelt, um die Umwandlung in PTH herbeizuführen. Die von jedem einzelnen Degradationszyklus erzeugten PTH-Teile können in Fraktionssammlerglasröhrchen übertragen werden, bis einige von ihnen von Hand gesammelt und zur Analyse vorbereitet worden sind. Als Alternative können die PTHs direkt und automatisch von dem Sequenzer-Konversionsgefäß zu einem Online-Analyse-System übertragen werden (Machleidt, W. und Hoffner, H., in Methods in Peptide und Protein Sequence- Analysis, pp 35-47, Birr, ed., Elsevier (1980); Wittmann- Liebold und Ashman, in Modern Methods in Protein Chemistry, pp 303-327, Tschesche, ed., de Gruyter (1985); Rodriguez, J. Chromotography 350, pp 217-225, (1985)).
Obgleich eine Vielzahl von analytischer Prozeduren verwendet worden ist, um die Aminosäuren zu identifizieren, die während der Edman-Degradation freigesetzt werden, werden gegenwärtig in weitem Maße nur sogenannte Hochleistungs- Flüssigchromatographie-Einrichtungen (HPLC) verwendet. In der Tat hat die HPLC an der reversen Phase mit auf Silica basierenden Packungen die Peptidsequenzierung revolutioniert. Sie sorgt für schnelle, genaue und quantitative Analysen der PTH-Aminosäuren und ist gegenwärtig das einzig verwendete Verfahren für die PTH- Analyse, das alle PTH-Aminosäuren in einem einzigen Chromatographendurchlauf zuverlässig auflösen kann. Darüber hinaus kann, weil quantitative Daten auf dem Picomol-Pegel erhalten werden, die HPLC-Chromatographie als das einzige analytische Verfahren für die Mikro-Sequenzierung durch automatische Edman-Sequenzer gegenwärtig eingesetzt werden.
In idealer Weise würde jedes Chromatogramm eine einfache qualitative Antwort geben, nämlich das Vorhandensein eines und lediglich eines PTH. In der Praxis ist dies jedoch niemals der Fall, jedes Chromatogramm enthält einige Anteile von allen PTHs, und es muß eine quantitative Beurteilung der relativen Anteile durchgeführt werden, um die Sequenzzuordnung durchzuführen. Verschiedene Faktoren geben Anlaß für dieses Problem. Erst einmal sind die Protein- oder Peptid-Proben mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht rein. Sie enthalten immer einige Anteile anderer Peptide oder freier Aminosäuren, die Anlaß für PTH-Signale während des Sequenzierens sind. Zweitens bewirkt die wiederholte Aussetzung der Probe der Trennsäure während des Edman- Verfahrens das Spalten der Peptid-Kette an anderen Stellen als dem Aminoende. Die neu freigelegten Aminoenden, die aus diesen inneren Trennungsvorgängen resultieren, erzeugen dann in den folgenden Kupplungs-Trennzyklen PTHs. Als Ergebnis hiervon bewirkt jede Art von Aminosäure im allgemeinen einen Hintergrund PTH-Pegel, der sich während des Sequenz- Durchlaufs langsam ändert, und zwar üblicherweise während der anfänglichen Zyklen ansteigt und danach in den weiteren Zyklen langsam abfällt. Die absoluten Pegel des Hintergrunds hängen von der Aminosäurenzusammensetzung des Peptids ab, den chemischen Edman-Randbedingungen und von dem Molekulargewicht des Peptids. Drittens ist das Abziehen einer aminoendseitigen Aminosäure in einem gegebenen Zyklus des Edman-Verfahrens unvollständig. Daher bleibt ein Teil der Aminosäure, die in jenem Zyklus freigegeben worden sein sollte, für den nächstfolgenden Kopplungs-Trenn-Zyklus erhalten und wird dann freigegeben. Dieser Übertrag oder diese Verschiebung ist kumulativ, mehrfaches Fehlverhalten an irgendeinem Peptid-Moleküls führt zu einer stetigen Erhöhung des Anteils an einer Population von Molekülen, die mit der erwarteten Freigabereihenfolge außerphasig ist. Das Zurückgewinnen der erwarteten PTH wird viertens leicht während des Durchlaufs durch Seitenreaktionen verringert, die die Aminosäureendgruppe blockieren, desgleichen physikalische Verluste an Peptid aus der Reaktionskammer, interne Kettenspaltungen und Verschiebungen. Diese Verringerung in dem Signal, welches als wiederkehrendes Zyklusergebnis gemessen wird, tritt gleichzeitig mit einer Erhöhung von Störungen oder Rauschen auf (zufolge der oben beschriebenen Faktoren) und macht eine genaue Aminosäurenidentifizierung sogar noch schwieriger, wenn die Sequenzierung weiter in das Peptid hinein fortschreitet. Als fünftes können die relativen Ausbeuten an den PTH- Aminosäuren aufgrund des Edman-Vorganges variieren. Einige von ihnen werden in ihrer Menge unverändert bestehen bleiben, während andere vor der Analyse in bemerkenswertem Maße zerstört worden sind oder sich zersetzen.
Trotz dieser Probleme haben konsequent durchgeführte Interpretationen der Chromatographiedaten von einem Sequenzer-Durchlauf als Maß für die Aminosäuresequenz weniger Aufmerksamkeit erhalten als die hier angewandte Chemie und die zugehörigen apparativen Einrichtungen. Viele, vielleicht sogar die meisten Sequenzen werden durch visuelle Inspektionen der Chromatogramme identifiziert, um eine spezifische Erhöhung in dem PTH-Pegel von einer Aminosäure in jedem Zyklus von dem allgemeinen Hintergrundpegel aller PTHs zu unterscheiden. Dieses Verfahren ist bemerkenswert einfach und wirksam, es hat jedoch Begrenzungen. Es beruht auf der Mustererkennungsfähigkeit des Wissenschaftlers, auf Erfahrungen, die im weiten Maße subjektiv sind, und ist auf den direkten Vergleich von lediglich zwei oder drei Chromatogrammen pro Zeit beschränkt.
Wegen dieser Begrenzungen verwendet eine zunehmende Anzahl von Wissenschaftlern HPLC-Spitzenwert-Integrations-Systemen, um Analog-Signale, die auf einem Aufzeichnungsgerät als Spuren dargestellt worden sind, in einen einfachen Satz digitaler Zahlen umzuwandeln. Dies ermöglicht den Anteil jeder PTH in jedem Zyklus in einer Grafik darzustellen, die klarer die speziellen Sequenzsignale wiedergibt, die auf den Hintergrund-Störpegeln superponiert sind Smithies et al. (vgl. Biochemistry 10, 4912, 1971), waren die ersten, die die Mathematik der Sequenz-Chemie mit Begriffen wie Anfangsausbeute oder -ertrag, wiederholter Ausbeute, Verschiebung (lag) und Aminosäurenhintergrund definierten und die quantitative Sequenzanalyse auf einer Spitzenwertintegration durchführten. Machleidt, W. und Hofner, F., (1981), in High Performance Chromotography in Protein & Peptide Chemistry, pp 245-258, Walter de Gruyter, Berlin haben auch zu diesem Verfahren Beiträge geleistet, jedoch basieren alle bisher bekannten Verfahren auf dem subjektiven Einordnen der integrierten Spitzenwerte durch erfahrene Wissenschaftler, die die Sequenzanalyse durchführen. Des Wissenschaftlers subjektive Interpretation der relativen Bedeutsamkeit eines erhöhten Pegels einer Aminosäure gegenüber einer anderen in einem gegebenen Zyklus ist immer noch erforderlich gewesen, um die endgültige Sequenzbestimmung durchzuführen.
Zusätzlich zu allen oben genannten Schwierigkeiten, die mit dem Hintergrund-PTH-Pegeln, kumulativer Verschiebung, Seitenreaktionen und dergleichen zu tun haben, sind andere bedeutsame Probleme den Chromatographiedaten selbst zugeordnet. Während der größte Teil der im Handel erhältlichen Chromatographie-Software mit idealen Daten gut funktioniert (d. h. mit großen, gut aufgelösten Spitzen), arbeitet sie weniger gut mit Daten der realen Welt. Im Hinblick auf die Analysen von Aminosäurederivaten sind solche nicht idealen Daten der Normalfall und nicht die Ausnahme. Für gewöhnlich sind Aminosäureanalysen mit Trennungen einer komplexen Mischung von eng miteinander in Beziehung stehenden Zusammensetzungen verbunden, häufig mit solchen minuziösen Pegeln, bei denen konventionelle Software versagt und nicht zu zufriedenstellenden Ergebnissen führt, es sei denn daß der Benutzer selbst intensive Handeingaben durchführt, um die Nachteile der Software zu beseitigen.
Im Prinzip sammeln HPLC-Datensysteme chromatographische Daten, indem der Ausgang des HPLC-Detektors periodisch abgefragt wird und sodann diese digitalisierten Daten verarbeitet werden. Eine Quantisierung wird dann durchgeführt, wobei die Spitzenwertingeration eingesetzt wird, was das Lokalisieren des Anfangs- und des Endpunktes einer Spitze, das Ausmessen des gesamten Signals zwischen diesen Punkten und das Abziehen aller Hintergrund-Signale erforderlich macht. Die Mittellage des Peaks bzw. der Spitze (d. h. ihre Retentionszeit) ist ebenfalls erforderlich, um diese als eine bekannte Komponente zu identifizieren, die auf Retentionszeiten basieren, die mit Standardwerten erhalten worden sind. Sodann wird der ausgemessene Bereich einer Probenspitze in einen molaren Betrag umgewandelt, der auf dem ausgemessenen Bereich des entsprechenden Standards basiert. Dieses vom Konzept her einfache Verfahren wird jedoch durch verschiedene Faktoren kompliziert, beispielsweise durch chromatographische Störungen, durch Spitzenüberlappungen und durch Retentionszeit-Driften.
Die chromatographischen Störungen (Rauschen) rühren von der Detektorelektronik, der unvollständigen Mischung der Lösemittel während der Gradienten-Chromatograhie, dem Durchgang von Gasblasen oder Teilchen durch den Detektor, von Veränderungen des Refraktionsindexes als Folge von Lösungsmittel- oder Temperaturgradienten und von der Elution des Lösemittels oder Säulenverunreinigungen her. Gegenwärtig werden konventionelle HPLC-Systeme höchst unvollkommen mit hoch- und niederfrequenten chromatographischen Störungen fertig. Die meisten Hochfrequenzfiltervorgänge beruhen auf Hardwareinstallationen und werden durch Analogfilter durchgeführt, die in den Detektorstromkreis eingebaut worden sind, und bei einigen HPLC-Systemen versucht man, die Niederfrequenzstörung (oft auch als Basislinien-Drift bezeichnet) durch punkteweise Subtraktion eines Leer- Chromatogramm von den Probedaten zu beseitigen. Dieses zuletzt genannte Verfahren ist ganz besonders mühsam, da zusätzliche Hochfrequenzstörungen eingebracht werden und weil die Grundlinie sich von Durchlauf zu Durchlauf wesentlich verändern kann. Ganz klar werden neue und weniger komplizierte Verfahren benötigt, um die chromatographischen Störungen zu verringern.
Spitzenüberlappungen, d. h. unvollständig aufgelöste Spitzen sind ganz besonders problematisch für die HPLC-Software. Kleine Spitzen, die teilweise mit stärkeren Spitzen überlappen, können durch die Grenzschwellwert-Routinen einfach übersehen werden und dies kann zu einer nicht korrekten Chromatogramm-Quantisierung führen. Wenn verschmolzene Spitzenwerte festgestellt werden, können verschiedene Verfahren zum Aufspalten des gesamten Bereichs eingesetzt werden, welche durch die Verfahren voneinander unterschieden werden können, durch welche die Basislinie unter den Spitzenkomponenten festgelegt wird. Diese Verfahren umfassen (i) eine lineare Extrapolation zwischen den Anfangs- und den Endpunkten der Vielfachspitzen mit einem linearen Abfall vom Tal zwischen den Spitzen zur Basislinie, (ii) eine ähnliche Extrapolation, um die Basislinie der Hauptkomponente mit einer Tangententrennlinie einzustellen, um die Basislinie einer kleineren Komponente einzustellen, und (iii) lineare Extrapolationen zwischen den Anfangs- und den Endpunkten jeder einzelnen Komponente. Das Verfahren, welches die genaueste Peak-Ausmessung ergibt, hängt sowohl von dem Grad der Auflösung zwischen den Spitzen als auch den relativen Spitzenhöhen ab. Es ist daher in höchstem Maße von der Probe abhängig und erfordert häufig Justierungen durch den Benutzer von Probe zu Probe in einem Satz von Chromatogrammen, in welchen diese Parameter nicht konstant sind.
Die Retentionszeit-Drift oder -Verschiebung ist auch ein besonderes Problem, da nämlich, wenn erst einmal die Spitzen lokalisiert und quantisiert worden sind, diese identifiziert werden müssen, indem ihre Retentionszeiten mit denen bekannter Standards verglichen werden. Dies ist ein einfacher Vorgang, falls die Veränderungen in den Retentionszeiten von Durchlauf zu Durchlauf immer kleiner als die Separationszeit zwischen eng nebeneinander auftretenden Spitzen innerhalb eines Durchlaufs sind. Üblicherweise werden Software-Routinen eingesetzt, um ein Elution-Zeitfenster zu finden, welches auf der Standard- Elutionszeit zentriert ist, um die beste Übereinstimmung einer unbekannten Spitze mit einem Standard herauszufinden. Bei komplexen Separationen, die im engen Abstand zueinander auftretende Spitzen erzeugen, geht dies nicht immer, da die Elutionszeit-Drift eine Spitze aus ihrem Fenster heraus bewegen kann und eine andere Spitze in das Fenster hineinbringen kann. Dieses Problem kann jedoch in seinen Wirkungen minimiert werden, indem leicht zu identifizierende Bezugsspitzen eingesetzt werden, um die Drift auszumessen und die Suchfenster für andere Spitzen empirisch zu korrigieren. Die Bezugsspitzen müssen von den benachbarten Spitzen in einem ausreichenden Abstand auftreten und in allen Chromatogrammen vorhanden sein, so daß ihre Suchfenster groß genug sein können, um die maximal beobachtbare Verschiebung zuzulassen.
Gesucht wird ein Verfahren, das die meisten dieser Probleme bei der Chromatogrammquantisierung löst und welches mit Hilfe eines Computers eingesetzt werden kann, um den Satz von HPLC-Daten zu beurteilen, der von einem Peptid-Sequenz- Durchlauf stammt, um zu einer eindeutigen Aussage über die Sequenzen zu gelangen, ohne sich dabei auf subjektive Interpretationen von ganz besonders geschulten Wissenschaftlern abstützen zu müssen.
Nach einem ersten Merkmal der Erfindung ist nunmehr ein Verfahren geschaffen worden, nämlich ein Verfahren zur Erzeugung eines grundlinienkorrigierten Chromatogramms unter Verwendung einer diskreten, linearen, translationsinvarianten Filterfunktion aα, wobei N ein Maß für die Filterfunktionsbandbreite und α ein Parameter ist, dessen Wert die Signal- Störungs-Charakteristik der Filterfunktion so festlegt, daß (i) wenn α einen Wert kleiner oder gleich einem Schwellwert ist, dann das Anlegen der Filterfunktion an ein Chromatogramm dem Ausfiltern hoher Störfrequenzen entspricht, und (ii) wenn α einen Wert größer als der Schwellwert hat, dann das Anlegen der Filterfunktion an ein Chromatogramm eine Vergrößerung der Auflösung bewirkt, wobei das Verfahren die folgenden Stufen aufweist:
Durchführen einer chromatographischen Analyse einer Probe, um ein erstes Chromatogramm zu erhalten;
Filtern des ersten Chromatogramms mit der Filterfunktion, bei welcher N auf die Breite der Peaks bzw. Spitzen annähernd eingestellt ist, die mit dem ersten Chromatogramm erhalten werden und α auf kleiner oder gleich dem Schwellwert eingestellt ist, um hochfrequente Störungen aus dem ersten Chromatogramm herauszufiltern, um ein zweites Chromatogramm mit einer ersten gefilterten Grundlinie zu erhalten;
Filtern des zweiten Chromatogramms mit der Filterfunktion, wobei N auf ungefähr die Breite der Peaks eingestellt ist, die mit dem ersten Chromatogramm erhalten wurden, und α auf größer als der Schwellwert eingestellt ist, um die Auflösung der Peaks in dem zweiten Chromatogramm zu erhöhen, um ein drittes Chromatogramm zu erhalten, dessen Grundlinie im wesentlichen die gleiche wie die zuerst gefilterte Grundlinie ist; und
Abziehen des zweiten Chromatogramms von dem dritten Chromatogramm, um ein viertes grundlienienkorrigiertes Chromatogramm zu erhalten.
Gemäß der Erfindung ist daher ein Verfahren und eine Vorrichtung geschaffen worden, um die Sequenz eines Peptids eindeutig festzustellen. Gemäß dem Verfahren wird das zu sequenzierende Peptid zyklisch zerlegt bis man zu einem Satz von Aminosäureresten für jeden Zyklus angelangt. Der Anteil jedes Aminosäurerestes wird quantitativ in jedem Satz ausgemessen, sodann wird ein Hintergrundpegel jedem Zyklus angepaßt, um einen angepaßten Hintergrund zu erhalten. Eine Messung der Dispersion wird dann für die Hintergrundanpassung berechnet und die gemessenen Beträge der Aminosäurereste in jedem Zyklus werden im Hinblick auf den Hintergrund normalisiert. Der größte normalisierte hintergrundkorrigierte Restbetrag in jedem Zyklus, ermöglicht dann eine Sequenzzuordnung, die für weitere Korrekturstufen verwendet werden kann, wenn dies gewünscht wird. Diese weiteren Stufen umfassen das Korrigieren von wenigstens einigen der normalisierten hintergrundkorrigierten Restbeträge für die Verschiebung in nachfolgende Zyklen, wodurch verschiebungskorrigierte, hintergrundkorrigierte Restbeträge für jeden Zyklus erhalten werden. Diese verzögerungs- und hintergrundkorrigierten Restbeträge können dann verwendet werden, um die Originalmessungen der Aminosäurereste in jedem Zyklus hinsichtlich von Unterschieden in der Injektionsquantität zwischen den Zyklen zu korrigieren, um dadurch einen injektionskorrigierten Restbetrag für jeden Zyklus zu erhalten. Die vorangehenden Stufen der Hintergrundkorrektur und der Verschiebungskorrektur werden dann an den injektionskorrigierten Restbeträgen durchgeführt. Dann wird der größte derartiger Beträge für den Zyklus ermittelt, um zu einer endgültigen Sequenzbestimmung für das Peptid zu gelangen.
In der bevorzugten Ausführungsform umfaßt die anfängliche Stufe des Ausmessens des Anteils des Aminosäurerestes in jedem Zyklus für gewöhnlich verschiedene Unterstufen. Insbesondere wird, wenn das Peptid zyklisch unter Verwendung eines Edman-Degradationsschemas verkürzt wird, eine chromatographische Analyse für jeden Zyklus durchgeführt, wobei die Rohdaten eine Bestimmung des Betrages der Aminosäure für jede Art ergeben, die in einem Zyklus ermittelt wird. Bei einer Ausführungsform werden die Resultate der Bestimmung dann einem Tiefpassfilter- und einem Hochpassfiltervorgang unterworfen, um Messungsstörungen zu beseitigen, was zu einem basislinienkorrigierten Chromatogramm führt. Dieses grundlinienkorrigierte Chromatogramm wird dann bei dem Hintergrundkorrekturvorgang eingesetzt.
Bei einer anderen Ausführungsform wird das grundlinienkorrigierte Chromatogramm unter Einsatz einer linearen Translationsinvarianten diskreten Filterfunktion aα erhalten, wobei N ein Maß für die Filterbreite ist und α die Auflösungsvergrößerungscharakteristik der Filterfunktion darstellt. Bei dieser Ausführungsform wird das Chromatogramm zunächst einmal mit der Filterfunktion geglättet, um Hochfrequenzstörungen zu unterdrücken, um dadurch ein zweites (gefiltertes) Chromatogramm mit einer ersten gefilterten Grundlinien zu erhalten. Sodann wird das zweite Chromatogramm mit dem Parameter α gefiltert, wobei dieser für die Spitzenwertauflösungsvergrößerung eingestellt ist, um ein drittes Chromatogramm zu erhalten, welches im wesentlichen die gleiche gefilterte Grundlinie aufweist. Das zweite Chromatogramm wird dann von dem dritten Chromatogramm abgezogen, was zu einem vierten Chromatogramm führt, bei welcher die Grundlinie entfernt worden ist. Das vierte (grundlinienkorrigierte) Chromatogramm wird dann bearbeitet, um quantitative Werte der PTHs zu erhalten, die bei dem Hintergrundkorrekturvorgang verwendet werden können.
Die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung weist ein Degradationselement zum zyklischen Verkleinern des Peptides auf, um einen Satz von Aminosäureresten für jeden Zyklus zu erhalten, ein Quantisierungselement zum Messen des Betrages jedes Aminosäurerestes für jeden Satz, und ein Computerelement auf, um das Degradationselement und das Quantisierungselement zu steuern. Das Computerelement dient darüber hinaus auch zur Anpassung an einen Hintergrundpegel für jeden Zyklus, zur Berechnung eines Maßes für die Dispersion für die Hintergrundanpasssung in Bezug auf die Meßwerte des Restwertes in jedem Satz, zur Normalisierung des Meßwertes für jeden Restwert in bezug auf die Dispersion, um normalisierte hintergrundkorrigierte Restbeträge für jeden Zyklus zu erhalten, und schließlich um den größten normalisierten hintergrundkorrigierten Restwert für jeden Zyklus zu identifizieren.
Die Erfindung wird nachfolgend unter Angabe weiterer Einzelheiten beispielsweise unter Bezugnahme auf die zugehörigen Zeichnungen erläutert, welche zeigen:
Fig. 1A ist ein Flußdiagramm für das Verfahren gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung.
Fig. 1B ist ein Diagramm für die Vorrichtung gemäß der Erfindung.
Fig. 2A und 2B zeigen die Stufen des Verfahrens zur Quantisierung von HPLC-Peaks bzw. Spitzenwerten.
Fig. 2C und 2D zeigen Stufen des Verfahrens zur Quantisierung von HPLC-Peaks gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung.
Fig. 3A (1) zeigt ein Rohchromatogramm für eine Standard-PTH-Mischung.
Fig. 3A (2) zeigt ein grundlinienkorrigiertes Chromatogramm, welches nach einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung für die Standardmischung mit dem Rohchromatogramm nach Fig. 3A (1) aufbereitet worden ist.
Fig. 3B (1) zeigt zwei Komponenten eines Hausfilters gemäß dem Verfahren nach der Erfindung.
Fig. 3B (2) zeigt das Hausfilter, welches durch Addieren der beiden Komponenten der Fig. 3B (1) gebildet worden ist.
Figuren 3C-3I zeigen die Ergebnisse der Anwendung von Filterungsverfahren gemäß der Erfindung an die Standard-PTH-Mischung der Fig. 3A (1).
Figuren 3C', 3D' und 3I' zeigen die Resultate, die in den Fig. 3C, 3D und 3I gezeigt worden sind, jedoch mit einem vergrößerten Maßstab.
Figuren 3J-3M zeigen die Ergebnisse von Filterungsverfahren gemäß der Erfindung an der Standard-PTH-Mischung.
Figuren 4A und 4B zeigen ein Flußdiagramm, welches das Verfahren zur Korrigierung der Hintergrundstörung in dem Betrag für jeden Aminosäurerest zeigt, der für jeden Zyklus gemessen worden ist.
Figuren 5A-5D zeigen Flußdiagramme des Verfahrens, welches eingesetzt wird, um die Verschiebung von Aminosäureresten in nachfolgende Zyklen zu korrigieren.
Fig. 6 zeigt ein Flußdiagramm, welches das Verfahren zeigt, welches eingesetzt wird, um Unterschiede in den Injektionsbeträgen unterschiedlicher Zyklen zu korrigieren.
Fig. 7A-7C zeigen die Ergebnisse des Verfahrens gemäß der Erfindung zu unterschiedlichen Stufen bei dem Korrekturvorgang für den 51zigsten Zyklus in der Degradation eines Proteines. Fig. 7A zeigt die injektionskorrigierten Rohdaten. Fig. 7B zeigt die Ergebnisse des Verfahrens nach der Durchführung der Hintergrundkorrektur an den injektionskorrigierten Rohdaten nach Fig. 7A. Fig. 7C zeigt die Ergebnisse des Durchführens der Verschiebungskorrektur nach der Durchführung der Hintergrundkorrektur, die in Fig. 7B erläutert worden ist.
Fig. 8A-8C zeigen die Ergebnisse des Verfahrens gemäß der Erfindung an unterschiedlichen Stufen des Korrekturvorganges für Glutaminsäure bei unterschiedlichen Zyklen in der Degradation eines Proteins. Fig. 8A zeigt die Rohdaten (injektionskorrigiert). Fig. 8B zeigt die Ergebnisse des Verfahrens nach Durchführung der Hintergrundkorrektur an den injektionskorrigierten Rohdaten der Fig. 8A. Fig. 8C zeigt die Ergebnisse des Durchführens der Verschiebungskorrektur nach der Durchführung der Hintergrundkorrektur, die in Fig. 8B erläutert worden ist.
Bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung entsprechend ist in Fig. 1A ein Flußdiagramm dargestellt, welches ein allgemeines Verfahren zur Bestimmung der Sequenz einer Peptid-Kette zeigt. Bei diesem Verfahren umfassen die verschiedenen Stufen sowohl direkte physikalische Messungen als auch Computerelemente, die auf diesen Messungen basieren. Da das Verfahren vollständig automatisch ausgeführt werden kann, wobei die verschiedenen physikalischen Messungen durch Instrumente unter Computersteuerung durchgeführt werden, ergibt die Sprache des Computerprogramms selbst eine Beschreibung der Erfindung. Um relativ nah an dieser Sprache daranzubleiben, wird nachfolgend jede Stufe des Verfahrens entweder als "Programmelement" oder "Subroutine" bezeichnet, anstatt das Wort "Stufe" zu verwenden, worum es sich tatsächlich handelt. Der Begriff "Subroutine" wird verwendet, um Computersubprogramme des Verfahrens zu beschreiben, welche bei der Durchführung von besonderen Computeraufgaben in sich selbst im wesentlichen vollständig sind. Der Begriff "Programmelement" wird freier verwendet, um eine oder mehrere einzelne Stufen eines speziellen Computerprogramms oder einen identifizierbaren Satz von Stufen zu bezeichnen, welche eine vollständige Aufgabe bilden, handelt es sich nun um eine physikalische Messung oder eine Berechnung, wobei es nicht eigentlich notwendigerweise um eine einzelne Subroutine geht.
Die physikalische Vorrichtung, die verwendet wird, ist in Fig. 1B erläutert und weist ein Sequenziersystem 51 zur Durchführung aufeinanderfolgender Edman-Degradationen, einen PTH-Analysierer 53, welcher eine Online-PTH-Analyse ausführt, und zwar unter Verwendung von HPLC für die durch das Sequenziersystem zur Verfügung gestellten Proben, und schließlich einen Computermodul 55 auf, welcher sowohl als Systemsteuergerät als auch als Analysiereinrichtung für das gesamte System dient, um die verschiedenen Stufen durchzuführen, um zu einer quantitativen Aussage über die Peptid-Sequenz zu gelangen. Als Systemsteuereinrichtung ist der Computermodul für die Zeitsteuerung und die fortschreitenden Degradationsereignisse in dem Sequenziersystem, für die Übertragung von Materialien zu dem PTH-Analysierer und für die Steuerung des PTH- Identifikationsprozesses verantwortlich. Als Analyseeinrichtung speichert der Computermodul die durch den PTH-Analyzer zur Verfügung gestellten Daten und führt verschiedene Arbeitsstufen durch, die nachfolgend beschrieben werden, um Störungen und systematische Fehler in den PTH-Rohdaten zu eliminieren, die durch den PTH- Analysierer gemessen worden sind, um den größten relativen PTH-Wert in jedem Zyklus zu identifizieren und um dadurch die Peptid-Sequenz festzustellen. In der bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Computermodul 55 um einen Applied-Biosystems-Computer, Modell 900A, welcher einen 16/8-bit-Mikroprozessor, beispielsweise den Intel 8088, einen separaten mathematischen Coprozessor, einen 640- kilobytes-RAM-Speicher, einen 10-megabyte-hard-disk-Antrieb, einen 360-kilobyte-floppy-disk-Antrieb, einen touchscreen CRT (Bildschirm) und einen Grafikdrucker umfaßt. In der Sequenziereinrichtung 51 wird bei der bevorzugten Ausführungsform ebenfalls ein Applied-Biosystems-Computer- Modell 470A-Sequenzer verwendet und der PTH-Analysierer 53 ist ebenfalls ein Computer vom Typ Applied-Biosystems-Modell 120A.
Um mit dem Verfahren zu beginnen, wird die zu analysierende Peptid-Sequenz zuerst einem automatischen Edeman- Degradations-Zyklus beim Programmelement 11 unterworfen und HPLC wird durch den PTH-Analysierer beim Programmelement 12 durchgeführt, um die freigegebene Aminosäure zu identifizieren. Für diesen Edman-Zyklus wird das Chromatogramm in digitaler Form durch den Computermodul aufgenommen und die Werte des Chromatogramms werden gespeichert. Beim Programmelement 13 wird die Zyklusnummer der gerade durchgeführten Degradation weitergeschaltet und der Vorgang wird wiederholt, bis die Degradation und die Chromatogramme für alle Aminosäuren in der Peptid-Kette durchgeführt worden sind, wobei jede Aminosäure einem Degradations-Zyklus entspricht. Bei der Subroutine 15 wird jedes Chromatogramm identifiziert und quantisiert, um den Betrag für jede PTH und für jeden Zyklus der Degradation festzustellen.
Wenn die Identifikation und Quantisierung vervollständigt worden sind, wird in der Subroutine 17 ein erster Durchgang zur Entfernung des PTH-Hintergrund-Störungs-Signals durchgeführt und eine vorläufige Sequenzbestimmung wird ausgeführt. Hierauf folgt eine Verschiebungskorrektur in der Subroutine 19. Die Verschiebungskorrektur wird durchgeführt, um der Tatsache Rechnung zu tragen, daß während der Edman- Degradation die Entnahme des Aminosäurerestes lediglich partiell durchgeführt wird, so daß ein Anteil der Aminosäure in den nachfolgenden Zyklen auftritt.
Nachdem die Verschiebungskorrektur durchgeführt worden ist, können die verbleibenden PTH-Werte für jeden Zyklus verwendet werden, um Veränderungen in der Probenmenge, die in den PTH-Analysierer für jeden Zyklus injiziert wird, zu korrigieren, falls dies gewünscht wird. Diese Injektionskorrektur wird in der Subroutine 23 durchgeführt. Nach Abschluß der Injektionskorrektur werden die Hintergrund- und Verschiebungskorrekturen wiederholt und die Aminosäurezuordnungen werden in dem Programmelement 25 auf dem größten korrigierten PTH-Signal für jeden Zyklus basierend durchgeführt. Der zweite Durchgang durch die Hintergrundkorrektur und die PTH-Verschiebungskorrektur kann in irgendeiner Anzahl von Arten durchgeführt werden. Der in Fig. 1A gezeigte Ansatz besteht darin, einen Programmzähler einzusetzen, um im Programmelement 21 eine Überprüfung durchzuführen, um festzustellen, ob die PTH- Injektionskorrektur durchgeführt worden ist und, falls sie durchgeführt worden ist, mit der Sequenzauswahl an der Programmstufe 25 fortzufahren. Falls sie nicht durchgeführt worden ist, werden die Hintergrund- und Verschiebungskorrekturen wiederholt. Irgendein von verschiedenen gleichwirkenden Programmzählern kann verwendet werden, um nachzuverfolgen, ob die PTH-Injektionskorrektur durchgeführt worden ist. Für das Programmelement 21 könnte man beispielsweise einen Zähler für die Hintergrundkorrektur-Subroutine 17, für die Verschiebungskorrektur-Subroutine 19 oder für die Injektionskorrektur-Subroutine 23 selbst einsetzen. Ein weiterer weniger praktischer, jedoch gleichwirkender Ansatz, welcher nicht dargestellt ist, besteht in der Vermeidung des Einsatz eines Programmzählers und einer Programmschleife überhaupt, und beruht darauf, daß die Hintergrundkorrektur-Subroutine 17 und, die PTH- Verschiebungskorrektur-Subroutine 19, nach der Injektionskorrektur-Subroutine 23, bevor die Sequenzauswahl getroffen wird, wiederholt werden.
Jeder der verschiedenen Subroutinen und Programmelemente wird nunmehr unter Angabe von Einzelheiten unter Bezugnahme auf die verschiedenen Figuren der Zeichnungen diskutiert.

Quantisierung der PTH-Ergebnisse:

In den Figuren 2A und 2B und in den Figuren 2C und 2D sind Flußdiagramme gezeigt, welche Einzelheiten einer ersten und einer zweiten Ausführungsform der Subroutine 15 zur Identifizierung und Quantisierung der HPLC-Peaks wiedergeben. Obgleich Standard HPLC-Integrationsroutinen erfolgreich zur Identifizierung und Quantisierung von HPLC- Peaks eingesetzt werden können, wenn der Betrag des Peptids, welches sequenziert wird, relativ groß ist (d. h. wenn der Pegel des HPLC-Signals zum Störsignal hoch ist), können moderne Edman-Sequenzer mit Probenpegeln arbeiten, die diese Routinen in genauer Weise überprüfen. HPL-Peaks können durch Hochfrequenzstörungen (typisch für die UV- Absorpzionsdetektoren, die verwendet werden, um die PTH- Elution aus den analytischen Säulen aufzuzeichnen) als auch von niederfrequenten Störungen (typisch für sowohl temperaturbedingte Detektor-Driften als auch Absorpzions- Refraktions-Index-Veränderungen, die während der Gradienten- HPLC-Elution auftreten) verdeckt werden oder verwischt sein. Demzufolge sollte der Spitzenwertanalyse die Filterung des Chromatogramms vorangehen, um die Einflüsse beider Störungsquellen auf ein Minimum herabzubringen.
Nach der ersten Ausführungsform wird, nachdem jedes Chromatogramm in digitalisierter Form durch den Computermodul 55 gespeichert worden ist, die niederfrequente Störung durch eine Anpassung an ein bekanntes Verfahren herausgefiltert (beschrieben durch Goehner, Anal. Chem. 50. 1233, 1978). Das gesamte Chromatogramm wird zuerst stückweise an eine Polynomkurve mit dem Grad N angepaßt oder angelegt. Dann werden alle Punkte, die über ausgewählte Beträge (in Standardabweichungseinheiten) oberhalb oder unterhalb der kalkulierten Kurve hinausgehen, zurückgewiesen und eine erneute Anpassung wird unter Verwendung der verbleibenden Punkte durchgeführt. Dieser Vorgang wird durchgeführt bis die Standardabweichung zwischen den tatsächlichen und den kalkulierten Punkten einen Minimumpegelsatz erreicht (d. h. daß die angepaßte Kurve auf die Basislinie des Chromatogramms konvergiert ist). Die Koeffizienten des Polynoms der kalkulierten Kurve werden dann verwendet, um einen Basis- oder Grundlinienpunkt für jeden Punkt in dem Originalchromatogramm zu berechnen, wobei die Unterschiede zwischen den beiden Sätzen der Werte das basislinienkorrgierte Chromatogramm darstellen.
In der Praxis überschreitet für gewöhnlich die Anzahl der Originalchromatogrammpunkte und die Anzahl der Grundlinienneigungveränderungen (welche den Grad N des Polynoms festlegen, das für die Anpassung verwendet wurde, die tatsächlich vorhandene Kapazität von Mikrocomputern. Demzufolge wird die Routine sequentiell an überlappenden Segmenten des Chromatogramms durchgeführt, wobei jede Runde der Anpassungsroutine verwendet wird, um den Hintergrund für einen Teil des gesamtes Chromatogramms festzulegen. Üblicherweise werden das erste 3/9 der Chromatogrammpunkte zunächst angepaßt und dann verwendet, um das erste 5/18 der Basislinienpunkte einzustellen. Sodann werden 3/9 der Punkte, beginnend mit der 2/9 Position vom Vorderende des Chromatogramms angepaßt und dazu verwendet, um die nächsten 4/18 der Basislinienpunkte einzustellen. Als nächstes werden 3/9 der Punkte, beginnend mit der 4/9 Position des Chromatogrammanfangs-angepaßt und verwendet, um die nächsten 4/18 der Grundlinienpunkte einzustellen. Schließlich werden die letzten 3/9 der Punkte angepaßt und verwendet, um die letzten 5/18 der Grundlinienpunkte einzustellen. Da, wo dies möglich ist, lediglich der Mittelabschnitt jeder kalkulierten Kurve verwendet wird, sind Diskontinuitäten in dem grundlinienkorrigierten Chromatogramm, wo sich die einzelnen angepaßten Kurven treffen, minimal.
Dieser Grundlinienberechnungsvorgang der ersten Ausführungsform ist in Einzelheiten in Fig. 2A und in der Fig. 2B wiedergegeben, wobei dieser Vorgang am Programmelement 211 beginnt, wo alle Programmzähler und Konstanten initialisiert werden. Insbesondere werden wenigstens drei Zähler verwendet, beispielsweise "i", "k" und "m". Ein Zähler "i" wird verwendet, um den speziellen Abschnitt des anzupassenden Chromatogramms zu indizieren, ein Zähler "k" wird verwendet, um den speziellen anzupassenden Edman-Zyklus zu identifizieren und ein Zähler "m" wird verwendet, um die Iterationszahl der Anpassung festzuhalten. In entsprechender Weise ist es notwendig, den Grad N des verwendeten Polynoms aufzunehmen, um die Chromatogramme anzupassen und um über die Nähe und Exaktheit der gewünschten Anpassung für die Hintergrundkalkulation zu entscheiden. Als praktische Maßnahme wird N im allgemeinen um 6 gewählt und die Annäherung der Anpassung wird im allgemeinen so festgelegt, daß die Standardabweichung der angepaßten Kurve zu den Hintergrundpunkten kleiner oder gleich einer Konstanten K ist (typischerweise das Doppelte des Hochfrequenzsignalpegels des Detektorausgangs). Wenn die Konstanten und Zähler initialisiert worden sind, schreitet das Verfahren zum Programmelement 213 fort, indem der i-te Abschnitt des gemessenen Chromatogramms C (t) angepaßt wird, welcher dem k-ten Edman-Zyklus entspricht. Beim ersten Durchgang i=k=1 wird einem Polynom Pki1 (t, N) (d. h. P¹¹&sub1; (t, N) an der ersten Iteration) des Grades N verwendet, um cko (t) anzupassen, wobei üblicherweise das Verfahren der kleinsten Fehlerquadrate verwendet wird. Beim Programmelement 215 wird die Standardabweichung kil(C) für die Anpassung berechnet, und eine Funktion δ( kil) wird festgelegt, welche der zugelassenen maximalen Punkt-zu-Punkt-Abweichung entspricht. Hierbei wird δ( kil) als 0,1 kil gewählt. Die Größe der Standardabweichung kil wird am Programmelement 217 überprüft, um zu sehen, ob diese kleiner oder gleich der gewählten Konstante K ist. Falls sie kleiner als K ist, wird Zähler i durch das Programmelement 223 weitergeschaltet. Der Zähler i wird dann überprüft, um festzustellen, ob er einen Zählwert größer als 4 aufweist, was bei dem Programmelement 225 durchgeführt wird. Falls er nicht größer als 4 ist, wird der nächste Teil des Chromatogramms des k-ten Zyklus im Programmelement 213 angepaßt usw.
Falls beim Programmelement 217 die Standardabweichung größer als K ist, schaltet das Programm den Iterationszähler m weiter zur Programmstufe 219. Sodann wird beim Programmelement 221 eine neue Funktion C kim (t) (beim ersten Durchgang ist dies C11l (t)) berechnet, wobei diese nachfolgend als reduziertes Chromatogramm bezeichnet wird, indem alle Punkte von dem Chromatogramm entfernt werden, für welche gilt
Dieses reduzierte Chromatrogramm hat die gleichen Werte wie das ursprünglich gemessene Chromatogramm, jedoch ist sein Bereich reduziert. Sodann wird wiederum beim Programmelement 213 begonnen, dieses reduzierte Chromatrogramm wird an ein neues Polynom angenähert, usf. und die Programmelemente 213 bis 215 werden durchlaufen, bis die reduzierten Chromatogramme für alle Abschnitte des Chromatogramms des k-th Zyklus in Übereinstimmung mit dem festgelegten Näherungskriterium angenähert worden sind.
Wenn erst einmal die Polynomanpassung bzw. -annäherung für jeden Teil i des Chromatogramms des k-th Zyklus durchgeführt worden ist, wird die Grundlinie des k-th Zyklus im Programmelement 227 berechnet, wobei die Werte des Näherungspolynoms P kil (t) verwendet werden, um die Grundlinienpunkte bk (t) für jeden Punkt in dem gemessenen Chromatogramm C ko (t) zu berechnen, wobei 1 = max. m (die letzte Iteration) für den i-th Teil ist. Ein grundlinienkorrigiertes Chromatogramm ko (t) wird dann beim Programmelement 229 berechnet, indem die Grundlinienpunkte bk (t) von dem gemessenen Chromatogramm Cko (t) abgezogen werden, welches dem Vorgang entspricht, daß die niedrigfrequenten Hintergrundkomponenten vom Chromatogramm entfernt worden sind. Für den Fachmann ist klar, daß der obige Ansatz zum Herausfiltern von niedrigfrequenten Störungen in dieser Ausführungsform lediglich einer Ausführungsform einer Vielzahl äquivalenter Formen entspricht. Beispielsweise kann irgend ein vollständiger Satz von Funktionen als Näherungsfunktion anstelle eines Polynoms verwendet werden.
Nachdem diese niederfrequenten Komponenten aus dem Chromatogramm herausgezogen worden sind, wird die Hochfrequenzstörung beim Programmelement 231 entfernt, indem ein schnelles Standard-Fourier-Transformationsfilter verwendet wird, wie dies in der Technik bekannt ist. Sodann werden die Spitzen in dem gefilterten Chromatogramm festgestellt und im Programmelement 232 quantifiziert. Verschiedene Verfahren können hier eingesetzt werden. Beispielsweise können Zeitfenster, die auf der Basis der beobachteten Elutionszeiten für jedes PTH in einer Standardmischung eingestellt worden sind, eingesetzt werden, um das gefilterte Chromatogramm (t) zu suchen, um den Anteil für jedes PTH festzulegen, das in dem Chromatogramm enthalten ist. Die Anteile können durch Standardverfahren für den ersten derivativen Spitzenwert und für die Spitzenwertintegration festgelegt werden, die in der Technik bekannt sind, oder aber durch Anpassung der Punkte in jedem Fenster an eine Gaussche Kurve und Berechnen des Bereiches unterhalb der Kurve ( vergl. Kent et al in Biotechniques 5, pp 314-321, 1978) oder noch einfacher, indem die Maximalpunktwerte in jedem Fenster als Spitzenwerte für das entsprechende PTH herangezogen werden. Der letzte Vorgang ist schneller, er erfordert jedoch eine gute Trennung der PTHs durch das HPLC-System.
Das Durchführen der Lokalisierung der Spitzen und der Quantisierung führt zu einem transformierten Chromatogramm PTH (k) für jeden Zyklus k, welcher dem Betrag an PTH der Aminosäure der Art j im Zyklus k entspricht. Das Programm überprüft dann die Zykluszahl im Programmelement 233 und wenn nicht alle Zyklen an der Probe durchgeführt worden sind, die erforderlich sind, um das Peptid zu degradieren, wird die Zykluszahl k beim Programmelement 235 weitergeschaltet und der Hintergrundkorrekturvorgang beginnt wiederum beim Element 213 für einen neuen Zyklus.
Die Figuren 3A(1) und 3A(2) zeigen die Ergebnisse des Einsatzes der in den Figuren 2A und 2B für diese Ausführungsform erläuterten Verfahren, um die Niederfrequenzstörung zu beseitigen. In Figur 3A (1) ist ein Rohchromatogramm Cko (t) mit vielen Spitzen als eine Funktion der Zeit für ein 5-pmol PTH-Standard gezeigt. Die angenäherte Grundlinie bk (t) ist als eine relativ glatte dunkle durchgezogene Linie am Grund der Kurve Cko (t) gezeigt. Fig. 3B(2) zeigt die ko (t), das grundlinienkorrigierte Chromogramm der Probe, so wie dieses durch das Verfahren gemäß der Erfindung in der Programmstufe 229 bestimmt worden ist.
Als eine alternativ bevorzugte Ausführungsform kann ein anderer Ansatz durchgeführt werden, um das Chromatogramm zu quantisieren, wobei das Verfahren der Digitalfilterung eingesetzt wird. Obgleich die Digitalfilterung zur Glättung und zur Erhöhung der Auflösung von Geräusch enthaltenden Spektren im allgemeinen gut bekannt ist und insbesondere für physikalische Messungen eingesetzt wird, die durch ENDOR (electron nuclear double resonance) erhalten werden, ist es offensichtlich nicht auf die Chromatogrammquantisierung angewendet worden. (Vergl. "Variable Filter for Digital Smoothing and Resolution Enhancement of Noisy Spectra" durch Bromba et al, Anal. Chem. (1984), 56, 2052-2058 und "Properties of a Variable Digital Filter for Smoothing and Resolution Enhancement" durch Biermann et al, Anal. Chem. (1986), 58, 536-539 als Beitrag zur allgemeinen Erörterung über Digitalfilterung zur Störungsverringerung). Das spezielle Verfahren, welches in diesen Veröffentlichungen geschildert worden ist, bezieht sich auf den Einsatz der Digitalfilterung, wobei es sich um einen diskreten, linearen, translationsinvarianten Abwicklungsvorgang handelt, der definiert ist durch
wobei A den Filteroperator, a(n) die Filterfunktion (Kernel), f das ungefilterte Spektrum und Af das gefilterte Spektrum sind. Insbesondere ist die Filterfunktion eine vertikal verschobene Dreiecksfilterfunktion, wobei
mit n ≤ N ist.
Zu Berechnungszwecken ist diese Filterfunktion typischerweise in zwei Teile aufgeteilt worden
a(n) = a1 (n) + a2(n)
wobei
ein Dreieckfilter und
ein Rechteckfilter ist. Nachfolgend wird diese Kombination ein Hausfilter genannt, weil diese Filterfunktionen a1(n) und a2(n), wenn sie auf einem einzigen Diagramm superponiert worden sind, das Aussehen eines Hauses haben. (Vergl. Fig. 3B(1) für ein Beispiel eines Dreieckfilters, welcher einem Rechteckfilter überlagert worden ist, und zwar unter Verwendung von α=1,N=9.(Fig. 3B(2) zeigt das resultierende Hausfilter).
In dieser Filterfunktion ist N die Filterbreite und α legt den Grad der Auflösungsverstärkung fest. Die Basis für die Auflösungsverstärkung bei diesem Filter ist eine Reduktion der Linienbreite, da das Frequenzansprechvermögen 1 für α> 1 bei niedrigen Frequenzen überschreitet. Bei höheren Frequenzen nimmt das Frequenzansprechverhalten rasch ab und stellt sicher, daß Hochfrequenzstörungen im Signal unterdrückt werden. Die Eigenschaften der Filter variieren selbstverständlich. was von α und N abhängt. Im allgemeinen wird α=1/2 als besonders gut für die Signal-zu-Störungs- Verstärkung von unbekannten spektrometrischen Funktionen angesehen und nähert sich einem angepaßten Filter und erzeugt auch die beste Hochfrequenzdämpfung. Für gewöhnlich ist α=1 der größte Wert, welcher ermöglicht, daß das Frequenzansprechverhalten nicht über 1 hinausgeht, so daß α =1 die Grenze zwischen Glättungsfiltern und Auflösungsverstärkungsfiltern markiert. Für α> 1 verringert sich das Frequenzansprechverhalten des Filters zur Frequenz f=0 hin und fällt dann rapide ab, so daß eine allgemeine Auflösungsverstärkung eintritt. Für α«1 nimmt die Auflösungsverstärkung monoton mit α zu, jedoch in gleicher Weise nimmt die Störungsverstärkung zu.
Obgleich diese Digitalfilterverfahren direkt auf das Chromatogrammquantisierungsproblem angewendet werden könnte, würde das Ergebnis immer noch Niederfrequente Reststörungen als Folge systematischer Fehler enthalten, die den chromatographischen Verfahren während der Zeit der Messung inhärent sind. Um dieses Problem zu vermeiden, wird ein alternatives Annäherungsverfahren eingesetzt, welches eine zweite Ausführungsform der Erfindung bildet. Diese zweite Ausführungsform ist in dem Flußdiagramm der Figuren 2C und 2D gezeigt.
Wie bei der vorangehend beschriebenen Ausführungsform beginnt die Berechnung durch die Initialisierung der Konstanten und der Zähler, diesmal beim Programmpunkt 238. Insbesondere der Zähler k, der der Edman-Zykluszahl entspricht, wird auf 1 eingestellt, so daß die Berechnung von Zyklus zu Zyklus fortschreiten kann. Beim Programmelement 240 ist der Filterparameter für gewöhnlich gleich der Zahl der Intervalle zwischen 1/2 und 1 eingestellt, und in der bevorzugten Ausführungsform ist er auf = 1 eingestellt. Die Filterbandbreite wird eingestellt, so daß sie mit der Chromatogrammspitzenbreite N1 übereinstimmt, so daß bei der bevorzugten Ausführungsform die Filterfunktion einem Savitzky-Golay-Filter sich nähert, was einem Glättungsvorgang ohne Auflösungsverstärkung entspricht. Bei Programmelement 242 wird das gemessene Chromatogramm für den Zyklus k, Cko (t), durch Hindurchschicken durch das Hausfilterkernel gefiltert. Dies erzeugt ein geglättetes Chromatogramm Ckf1 (t), d. h., daß Hochfrequenzstörungen herausgefiltert worden sind. Als nächstes wird α gleich einer Zahl > 1 für die Auflösungsverstärkung im Programmelement 244 eingestellt, wobei es sich bei der bevorzugten Ausführungsform in diesem Fall um die Einstellung auf 20 handelt. Beim Programmelement 246 wird das geglättete Chromatogramm Ckf1 (t) mit dem neuen Hauskernel bearbeitet, um ein verstärktes geglättetes Chromatogramm Ckf2 (t) zu erhalten. Dieses Chromatogramm hat üblicherweise im wesentlichen die gleiche Grundlinie wie das geglättene Chromatogramm Ckf1 (t), jedoch mit verstärkten Spitzen und negativen Seitenlappen, da die Hauskernelfilterfunktion den Bereich beibehält bzw. flächenkonform ist. Als Ergebnis erhält man durch Abziehen des geglätteten Chromatogramms Ckf1 (t) von dem verstärkten geglätteten Chromatogramm Ckf2(t) im Programmelement 248 ein Chromatogramm Ckf3 (t), welches lediglich den Spitzenwert und die Seitenanteile beibehält. Weiterhin ist die niedrigfrequente Grundlinienstörung vollständig eliminiert worden, wodurch eine bedeutsame Fehlerquelle beim Quantisieren von Chromagrammen beseitigt worden ist. Da die Peaks die einzigen Informationen von Interesse sind, werden die Seitenteile beim Programmelement 250 abgeschnitten, um ein neues Chromatogramm Ckf4 (t) zu erhalten. Dies wird üblicherweise dadurch herbeigeführt, indem diese Punkte unterhalb eines gegebenen Schwellwertes (typischerweise Null) entfernt werden. Beim Programmelement 252 werden die Bedingungen für eine neue Hauskernelfunktion durch Einstellen von α=1/2 und der Breite N=N1/2 eingestellt, um ein angepaßtes Filter für das Chromatogramm C(t) einzustellen. Ein neues Chromatogramm Ckf5 (t) wird dann unter Verwendung dieser neuen Kernelfunktion beim Programmelement 254 berechnet, welches im wesentlichen das abgeschnittene Chromatogramm Ckf4 (t) glättet. Bei Programmelement 256 werden die Spitzen des Chromatogramms Ckf5 (t) festgestellt und quantisiert, und beim Programmelement 258 werden diese Peaks mit bekannten Bezugspeaks für unterschiedliche Aminosäuren verglichen, um jeden dieser Peaks in dem speziellen Edman-Zyklus mit der speziellen Aminosärue zu korrelieren, um auf diese Art und Weise Werte PTH (k) zu erhalten. Beim Programmelement 260 wird die Zyklusnummer K überprüft, um festzustellen, ob diese größer oder gleich der Zahl der Aminosäuren in dem Peptid ist. Falls dies der Fall ist, fährt das Programm mit der Subroutine 17 fort. Falls nicht, wird die Zyklusnummer im Programmelement 261 weitergeschaltet und die Chromatogrammquantisierung beginnt wiederum beim Programmelement 240 für den neuen Zyklus. Die Bezugspeaks, die für den oben genannten Vergleich verwendet werden, werden dadurch erhalten, indem Chromatogramme von reinen Proben für jede Aminosäure erstellt und die Filterroutinen für jede von ihnen durchlaufen werden, um die gefilterten Bezugschromatogramme für den Vergleich mit den Probenchromatogrammen zu erhalten.
Fig. 3C bis 3H zeigen die Ergebnisse des Einsatzes der oben genannten Glättungs- und Grundliniensubtraktionsverfahren an der Standard PTH-Mischung, wobei Fig. 3A(1) das Rohchromatogramm darstellt. Fig. 3C zeigt das Rohchromatogramm der Fig. 3A(1) mit einem verringerten Maßstab. Die Fig. 3D zeigt die Ergebnisse der Filterung des Chromatogramms nach Fig. 3C unter Einsatz des Hausfilters mit N=3, α=1, um hochfrequente Störungen zu beseitigen. Fig. 3E zeigt das Ergebnis des erneuten Einsatzes des Hausfilters (d.h. das Anlegen des Hausfilters an das gefilterte Chromatogramm der Fig. 3E) , wobei dieses Mal N = 3 und α= 20 ist. Fig. 3F zeigt die Ergebnisse des Abziehens des Chromatogramms der Fig. 3D vom Chromatogramm nach Fig. 3E. Fog. 3G zeigt das Chromatogramm der Fig. 3F nach dem Abschneiden bei Null. Fig. 3H zeigt das Chromatogramm der Fig. 3G nach dem Glätten mit dem Hausfilter mit N = 2 und α = 1/2. Fig. 3I zeigt das Ergebnis der Skalierung des Chromatogramms nach Fig. 3H (Teilen durch einen willkürlichen Skalierungsfaktor von 3), um eine Peakhöhe zu erhalten, die besser vergleichbar zur Peakhöhe der Fig. 3C ist, um die beiden Kurven miteinander zu vergleichen. Um die Empfindlichkeit des Verfahrens zu erläutern, werden die erhaltenen Resultate in expandiertem Maßstab in den Fig. 3C', 3D' und 3I' gezeigt, welche den Figuren 3C, 3D und 3I jeweils entsprechen.
Um weiterhin die Empfindlichkeit des Verfahrens unter Einsatz des Hausfilters zu erläutern, werden die Ergebnisse gezeigt, in dem das Verfahren an ein 20 pmole PTH-Standard angewendet worden ist, und dies wird in den Fig. 3J bis 3M gezeigt. Fig. 3J zeigt das Rohchromatogramm für die Probe. Fig. 3K zeigt das Rohchromatogramm mit einem vergrößerten Zeitmaßstab in dem Zeitintervall zwischen 14,0 und 16,6 Minuten, welches klar und deutlich den beträchtlichen Hochfrequenzstörinhalt im gemessenen Chromatogramm freilegt. Fig. 3L zeigt die Ergebnisse des Einsatzes des Hausfilters, um die Hochfrequenzstörungen zu beseitigen, wobei N = 6 und α = 1 ist. Fig. 3M zeigt die Ergebnisse des Einsatzes des gesamten Digitalfilterverfahrens auf das Rohchromatogramm der Fig. 3J und demonstriert, daß das endgültige gefilterte Chromatogramm stark geglättet ist und Spitzen zeigt, die sehr gut aufgelöst sind. Die nachfolgend eingestellten Filterparameter sind N = 6 und α = 20 für die Auflösungsverstärkung und N = 3 und α = 1/2 für endgültige Glättung.

PTH-Hintergrund-Korrektur:

Die Verarbeitung aller Chromatogramme von der Sequenzierung mit den oben beschriebenen Routinen nach den Figuren 2A und 2B bzw. 2C und 2D erzeugt Datenanordnungen, die Rohwerte für alle PTHs von allen Zyklen ernthalten. Eine Darstellung von jedem einzelnen PHT über den Zyklus zeigt typischerweise einen Anstieg und/oder einen abfallenden Hintergrundpegel der PTH in einem oder mehreren Zyklen, wobei der PTH-Wert wesentlich höher ist als dieser Hintergrundpegel. Dieser Hintergrundpegel kann von den verbleibenden PTH-Ergebnissen durch eine Variation der rekursiven kleinsten Fehlerquadrate abgetrennt werden, welche an die Polynomroutine angepaßt sind, welche oben für die die niederfrequente Filterung der Chromatogramme eingesetzt wurde. Bei dieser Variation werden die Iterationen des Näherungsalgorithmus fortgeführt, bis das Verhältnis der Standardabweichung zwischen den tatsächlichen und den angepaßten Datenpunkten für aufeinanderfolgende Iterationen oberhalb eines festen Wertes ist, beispielsweise S. Wenn die Iterationen abgeschlossen worden sind, werden die berechneten Hintergrund-PTH-Werte von den Rohwerten abgezogen, um hintergrundkorrigierte PTH- Werte zu erhalten.
Als nächstes wird eine Abschätzung der Verteilung dieser hintergrundkorrigierten Daten durchgeführt, indem drei Iterationen mit der Polynomnäherungsroutine mit dem kleinsten Fehlerquadrat (wobei der Grad des Polynoms = 1 ist) durchgeführt werden. Die Standardabweichung der letzten Iteration ergibt sodann eine Abschätzung der Variation im Hintergrundpegel, wobei es sich um eine Abschätzung handelt, die eine Zuordnung mit einer Wahrscheinlichkeit ermöglicht, daß erhöhte Pegel an speziellen Zyklen in der Tat in einem statistisch relevanten Anteil hoch sind. Wenn die Iterationsvorgänge erst einmal vollendet sind, werden die berechneten hintergrundkorrigierten PTH-Werte durch die Standardabweichung des Hintergrundes geteilt, um normalisierte hintergrundkorrigierte PTH-Werte zu erhalten. Dieser Vorgang wird dann für jeden PTH-Wert so wiederholt, daß die verbleibenden PTH-Werte ebenfalls in Einheiten der Standardabweichungen oberhalb ( oder unterhalb) der von den angepaßten Hintergrundkurven berechneten Werte ausgedrückt werden. Zu diesem Zeitpunkt wird eine vorläufige Sequenzbestimmung für jeden Zyklus durchgeführt, indem die PTH-Werte herausgegriffen werden, deren hintergrundkorrigierter normalisierter Wert der statistisch höchste in dem Zyklus ist.
Dieser Vorgang wird unter Angabe weiterer Einzelheiten in dem Flußdiagramm der Figuren 4A und 4B erläutert. Hier beginnt das Verfahren beim Programmelement 411, welcher erfordert, daß die Konstanten und Programmzähler initialisiert werden. Ein Programmzähler "j" wird auf den Wert 1 eingestellt. Der Zähler j wird verwendet, um die PTH- Werte zu indizieren, die eine Aminosäure der Art j bezeichnen. Ein ganzzahliger Wert M wird gleich der Zahl der Zyklen geteilt durch 12 eingestellt (wobei auf die nächste ganze Zahl gerundet wird), welcher dem Grad des Polynoms entspricht, das verwendet wird, um eine Annäherung an die PTH-Werte zu erzielen. Ein Bereich j,-1wird gleich Null für all S = 1 bis 20 eingestellt. Zusätzlich wird der Wert S = 2 eingestellt, wobei S der Abschnittswert für das Verhältnis der Standardabweichung zwischen dem tatsächlichen und angepaßten Daten für aufeinanderfolgende Iterationen darstellt, um zu bestimmten, wann die Iterationen in dem Näherungsverfahren mit den kleinsten Fehlerquadraten beendet werden kann. Beim Programmelement 415 wird ein weiter Zähler "l" auf Null eingestellt, wobei der Zähler l der Iterationszahl in dem Anpassungsverfahren mit den kleinsten Fehlerquadraten entspricht. Beim Programmelement 417 wird PTHj,l (k) durch ein Polynom Qj,l+1 (M, k) des Grades M angenähert. Zu Anfang bedeutet dies daß PTHj,o (k) (die Gesamtheit der Werte für die Aminosäurezahl 1 als eine Funktion des Zyklus) einem Polynom Q1,1 (M, k) angenähert ist. Beim Programmelement 419 wird die Standardabweichung für die Annäherung für die j-te Aminosäure bei der l-ten Iteration berechnet und mit j,l , (d.h. j,o anfänglich) benannt, und ein Maß für die Anpassungsfunktion Δ( j,l) wird berechnet. Hierbei ist Δ( j,l) durch die Standardabweichung j,l für Punkte größer als die Rohdaten und gleich dem doppelten der Standardabweichung für Punkte unterhalb der Rohdaten definiert. Das Verhältnis von
TEXT FEHLT
zu
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wird dann im Programmelement 421 berechnet und falls das Verhältnis größer als S ist, berechnet das Programm die hintergrundkorrigierten normalisierten PTH-Beträge im Programmelement 425. Falls das Verhältnis kleiner als S ist, wird der Zähler 1 im Programmelement 422 fortgeschaltet und im Programmelement 423 wird ein neues PTHj,l (k) berechnet, indem diese Punkte (d.h. die Zyklen) entfernt werden, für die PTHj,l-1 (k)-Qj,l (k) > Δ( j,l) gilt. Hierbei ist PTH (k) = PTH (k) für alle Punkte k, die den Bereichen der beiden Funktionen gemeinsam sind. Wenn die Punkte entfernt worden sind, beginnt die Näherungsroutine wiederum beim Programmelement 417 und der Iterationsvorgang wird fortgesetzt durchgeführt, bis das Verhältnis j,l-1/ j,l größer als S ist. Ein Iterationszähler m wird dann bei 424 initialisiert und, wie bereits vorangehend angegeben worden ist, werden im Programmelement 425 die hintergrundkorrigierten Roh-PTH-Beträge, PTHj,o (k) für jeden Zyklus berechnet. Dies wird durch Abziehen des zuletzt angenäherten Wertes Qj,l (k) für das PTH der Aminiosäure j im Zyklus k von dem gemessenen PTH-Wert PTHj,o (k) durchgeführt. Beim Programmelement 429, wird der hintergrundkorrigierte Roh-PTH-Wert PTH'j,o (k) mit einem erstgradigen Polynom Zj,m+1 (k) (Zj,1 (k) für die erste Iteration angenähert. Die Standardabweichung für die Annäherung, 1jm,und ein Maß für die Näherungsfunktion
werden dann im Programmelement 431 berechnet. Hierbei wird
üblicherweise gleich der Standardabweichung für Punkte gewählt, die oberhalb der angepaßten Linie liegen und gleich dem 1,67-fachen der Standardabweichung für Punkte ausgewählt, die unterhalb der angepaßten Linie liegen. Das Programm prüft dann den Wert des Iterationszählers m im Programmelement 433 ,um die Iterationen bei 3 für diese spezielle Sequenz der Näherung anzuhalten. Der Iterationszähler wird dann durch das Programmelement 435 weitergeschaltet und beim Programmelement 437 wird ein neuer PTH'j,m (k) berechnet, indem diese Punkte von den hintergrundkorrigierten Rohwerten abgezogen werden, wobei die Differenz zwischen PTHs'j,o (k) und dem angepaßten Wert größer als das Maß für die Näherungsfunktion ist. Dieser Näherungsvorgang wird dann noch zwei weitere Male durchgeführt, d.h. für insgesamt drei Vorgänge und nach dem dritten Mal wird ein normalisierter hintergrundkorrigierter PTH-Betrag j,o (k) beim Programmelement 439 berechnet, indem die hintergrundkorrigierten Rohwerte durch die Standardabweichung geteilt werden, die durch die letzte Iteration berechnet worden sind. Wenn die hintergrundkorrigierten normalisierten PTH-Beträge für Aminosäure j berechnet werden, wird der Zähler j durch das Programmelement 441 weitergeschaltet und j wird überprüft, um festzustellen, ob er gleich oder kleiner als 20 ist, was im Programmelement 442 geschieht. Falls j kleiner oder gleich 20 ist, geht das Programm zurück durch die Hintergrundnäherungs- und Korrekturstufe, wobei wiederum mit Programmelement 415 begonnen wird. Falls j größer als 20 ist, geht das Verfahren zum Programmelement 443 weiter, wo eine vorläufige Sequenzbestimmung durchgeführt wird, indem der maximale normalisierte PTH-Betrag für jeden Zyklus herausgesucht wurde.
Für die Fachleute ist es selbstverständlich, daß es viele Wege gibt, um die Hintergrundkorrektur durchzuführen.
Beispielsweise können unterschiedliche Anpassungsfunktionen eingesetzt werden, und ein Maß für die Verteilung abweichend von der Standardabweichung kann für die Näherung herangezogen werden. Der bedeutsame Aspekt des Hintergrundkorrekturverfahrens ist es, eine normalisierte Sequenz der PTH-Beträge zu erhalten, so daß die Ergebnisse von Zyklus zu Zyklus quantitativ verglichen werden können.

Verschiebungskorrektur:

Nachdem die normalisierten hintergrundkorrigierten PTH- Beträge kalkuliert worden sind und eine vorläufige Sequenzzuordnung durchgeführt worden ist, wird die Verschiebungskorrektur durchgeführt. In jedem Zyklus, k, der Edman-Degradation wird der Aminosäurerest lediglich partiell entnommen, d.h. ein Bruchteil der Aminosäure erscheint in den nachfolgenden Zyklen k+1, k+2, ...k+i. Für jeden gegebenen Zyklus fügt die Kopplung und/oder die nichtauftretende Abtrennung typischerweise 1 bis 2% zu dem außerphasigen Signal hinzu bzw. eine Verschiebung tritt auf. Da diese Fehler kumulativ sind, wird die beobachtete Verschiebung progressiv stärker, wenn der Sequenzierungsvorgang fortschreitet und bei langen Durchläufen kann ein größeres Signal im Zyklus n + 1 als im Zyklus n auftreten. Demzufolge ist die Verschiebungskorrektur ganz besonders zur genauen Sequenzbestimmungen für spätere Zyklen von Bedeutung.
Falls man "Y " als das theoretische Anfangssingal, "b" als den Bruchteil des Reaktionsversagens und "Y1,j " als den Ertrag der Aminosäure 1, der im Zyklus j auftritt, bezeichnet und annimmt, daß kein Signal als Folge von Seitenreaktionen irreversibel verlorengeht, das die Edman- Degradation oder physikalische Extraktion von Peptiden verhindert, dann gilt
Y1,1 = 1 Yo (1-b)
Y1,2 = 1 Yo (1-b)b
Y1,3 = 1 Yo (1-b)b²
Y1,4 = 1 Yo (1-b)b³
In entsprechender Weise gilt für die Aminosäure 2 und 3:
Y2,2 = 1 Yo (1-b)²
Y2,3 = 2 Yo (1-b)² b
Y2,4 = 3 Yo (1-b)² b²
Y2,5 = 4 Yo (1-b)² b³
Y3,3 = 1 Yo (1-b)³
Y3,4 = 3 Yo (1-b)³b
Y3,5 = 6 Yo (1-b)³b²
Y3,6 = 10 Yo (1-b)³b³
Wenn die Verschiebungswerte als Verhältnis zu den beobachteten primären Zykluswerten bezeichnet werden, verringern sich diese Ausdrücke zu:
Y1,2 / Y1,1 = 1b
Y1,3 / Y1,1 = 1b²
Y1,4 / Y1,1 = 1b³
Y2,3 / Y2,2 = 2b
Y2,4 / Y2,2 = 3b²
Y2,5 / Y2,2 = 4b³
Y3,4 / Y3,3 = 3b
Y3,5 / Y3,3 = 6b²
Y3,6 / Y3,3 = 10b³
In allgemeinen Ausdrücken, falls Yk der primäre Zyklusertrag ist, (d.h. Ykk ) und Yk+i der Verschiebungsertrag (d.h.. Yk,k+i) ist, dann gilt:
Yk+1 /Yk = ( [k+0] /1) b
Yk+2 /Yk = ( [k+1] /2) ([k+0] /1) b²
Yk+3 /Yk = ( [k+2 ]/3) ( [k+1] /2) ( k+0 /1) b³ .....
Yk+i /Yk = ( [k+i-1] /i) ... ( [k+2 ]/3) ( [k+1] /2)([k+0]/1)bi
Dieser Ausdruck ist im strengen Sinne nicht korrekt, weil die Annahmen, daß irreversible Signalverluste nicht existieren und der Fehl-Anteil b für jeden Zyklus der gleich ist, nicht zutreffend sind. Die erstere Annahme jedoch führt einen relativ kleinen Fehler ein, solange die irreversiblen Verluste kleiner als 10% pro Zyklus sind, und daher beeinträchtigt diese Annahme nachfolgende Berechnungsvorgänge nicht signifikant. Der Einfluß der letzteren Annahme, welcher eindeutig inkorrekt ist, ist schwieriger abzuschätzen. Es scheint empirisch nicht so zu sein, daß diese Annahme störend ist, wenn b in jedem Zyklus als ein kumulativer Mittelverzögerungswert gemessen wird.
Das bevorzugte Verfahren der Verschiebungskorrektur ist in den Figuren 5A, 5B und 5C illustriert worden. Beim Programmelement 511 wird die vorläufige Sequenzbestimmung, die aus der Subroutine 17 getroffen worden ist, verwendet, um eine primäre Zyklusergebnisanordnung Yk zu definieren (d.h. Yk= MAX(PTHj (k)). Diese vorläufige Sequenzzuordnung wird dann verwendet, um einen Arbeitswert für die kumulative Verschiebung, kb, für jeden Zyklus zu berechnen. Diese Berechnung wird im Programm in den Elementen 513, 515 und 517 ausgeführt. Im Programmelement 513 wird Yk,k+1 gleich j(k+1) für alle Edman-Zyklen in der Probe gesetzt, wobei j so gewählt wird, daß es der Aminosäure entspricht, die in der vorläufigen Sequenzbestimmung für den Zyklus k ausgewählt worden ist. Ein Zykluszähler "n" wird dann in der Programmstufe 515 initialisiert, so daß jeder Zyklus für sich in der Zeiteinheit korrigiert wird, und die Arbeitswerte für die Verschiebungskoeffizienten werden für jeden verbleibenden Zyklus berechnet (d.h. wenn k≥n), und zwar im Programmelement 517 unter Verwendung der Formel Yk,k+1/Yk=kb(k). Im Programmelement 519 werden diese Arbeitswerte von kb(k) dann an eine Polynomkurve B(k) des Grades Z=N/15 (gerundet auf die nächste ganze Zahl) unter Verwendung der Methode der kleinsten Fehlerquadrate angepaßt. Dann werden die gemessenen Werte der Verschiebungskoeffizienten, die von den Näherungswerten um mehr als eine Standardabweichung abweichen, außer Betracht gelassen, und die verbleibenden Datenpunkte werden erneut einem Näherungsverfahren unterworfen. Um dies durchzuführen wird die Standardabweichung B der Näherungsfunktion B(k) aus den tatsächlichen Messungen Yk,k+1/Yk über den Bereich N aller Edman-Zyklen im Programmelement 521 berechnet. Im Programmelement 523 werden alle Punkte K, für welche der tatsächliche Wert Yk,k+1/Yk vom genäherten Wert B(k) um mehr als eine Standardabweichung B sich unterscheidet, aus dem Bereich N entfernt, wodurch ein neuer Bereich N' gebildet wird. Eine Annäherung mit Hilfe des Verfahrens der kleinsten Fehlerquadrate von kb(k) wird dann im Programmelement 525 unter Verwendung des neuen Bereichs durchgeführt. Im Programmelement 527 werden die revidierten angepaßten Verschiebungswerte B'(k) für alle Zyklen k=1 bis N erzeugt. Die Fehlfraktion b(n) wird für jeden Zyklus n beim Programmelement 529 berechnet, wobei die angepaßten Werte von B'(k) verwendet werden, und im Programmelement 531 wird b(n) verwendet, um die angepaßten Verschiebungsbeträge G(n, i, b) in den nächsten paar Zyklen zu erzeugen, unter Verwendung der Gleichung G(n,i,b)=([n+i-1] /i) ... ([n+2]/3) ([n+1]/2) ([n+0]/1) bi (n) für alle Zyklen i bis G(n,i,b) < 0.01, d.h. bis der Zyklus n+1 einen Wert hat, der kleiner als 1% des Wertes des Zyklus n ist. Durch das Programmelement 533 werden die normalisierten PTH-Werte für den Zyklus n sortiert, um die drei größten Werte zu ermitteln, nämlich Y1n , Y2n and Y3n und ihre entsprechenden Verschiebungen Yn,n+i,
Im Programmelement 535 wird der größte Wert festgestellt, um zu überprüfen, ob er kleiner als dreimal der Größe des nächsthöheren Wertes ist, und falls dies nicht der Fall ist, (d.h. er ist größer als oder gleich dem Dreifachen des nächsthöheren Wertes) beläßt das Programm die Aminosäurebestimmung so wie sie war, durch Einstellen von Yn gleich Y1n im Programmelement 537. Falls jedoch Y1n kleiner ist als das dreifache von Y2n werden jeder der drei größten Werte Y1n , Y2n, und Y3n hinsichtlich der Verschiebung in den Programmelementen 535 bis 557 korrigiert, indem die angepaßte Verschiebung verwendet wird, die auf der ursprünglichen Sequenzzuordnung basierte, um zu bestimmen, ob die Verschiebungskorrektur irgendeine Veränderung in der Sequenzbestimmung bewirken würde. Insbesondere wird jede der angepaßten Verschiebungen
als G(n,i,b)Yjn i/m Programmelement 543 berechnet, und falls der tatsächliche Wert Yjn, n+i größer ist als Null, wird der Betrag Yn hinsichtlich der Verschiebung im Zyklus n+1 korrigiert. Diese Korrektur wird durch Addieren von
zu Yjn, falls
oder durch Addieren von
bis Yjn im Programmelement 547 durchgeführt, falls
größer als
ist. Dieser Korrekturvorgang wird für die nächste paar Zyklen i nach der Zyklusnummer n fortgeführt, wobei das Kriterium für das Abschalten ist, daß die angepaßte Verschiebung kleiner als 1% des tatsächlichen Wertes ist, was im Programmelement 549 überprüft wird. Dieser Vorgang wird für jeden Zyklus i fortgeführt und jeder Wert Yjn bis zu jedem Yjn wird korrigiert, indem Yjn durch
ersetzt wird. Im Programmelement 553 wird jeder dieser Verschiebungskorrekturen überprüft, um den maximalen verschiebungskorrigierten Wert zu finden, und der Sequenzwert Yn wird gleich dem Maximum gesetzt, und der Aminosäureindex wird festgestellt, um die richtige Sequenzbestimmung für den Zyklus n auszuwählen. Wenn erst einmal die Sequenzaussage für den Zyklus n vervollständigt worden ist, entweder hinter dem Programmelement 537 oder dem Element 553, werden die angepaßten Verschiebungen für diese Sequenzzuordnung im Programmelement 559 für die nächsten paar Zyklen nach dem Zyklus n berechnet, indem wiederum das gleiche Beendigungskriterium wie vorher verwendet wird, d.h. bis die angepaßte Verschiebung kleiner als 1% der tatsächlichen Verschiebung ist. Der Zyklus n wird dann hinsichtlich der Verschiebung von den letzten Zyklen n+i korrigiert, die einen positiven Verschiebungswert haben, unter Verwendung des gleichen Beendigungskriteriums, wie zuvor beim Programmelement 561, indem der Wert des Zyklus n erhöht wird, und zwar um den kleineren Wert des berechneten Verzögerungsbetrages oder des tatsächlichen Zyklusbetrages. Als nächstes werden die Zyklen n+i hinsichtlich der Verschiebung vom Zyklus n korrigiert, indem der Verschiebungswert im Zyklus n+i durch den größeren Wert von Null oder der Differenz zwischen dem beobachteten Betrag Yn,n+i und dem kalkulierten Verschiebungsbetrag
beim Programmelement 563 für alle Zyklen i ersetzt wird, wobei der angepaßte Verzögerungskoeffizient kleiner als 1% ist.
An dieser Stelle ist der Zyklus n festgelegt und der Zyklus n+1 ist frei von einer Verschiebung aus dem Zyklus n, die mit der Sequenzzuordnung des Zyklus n+1 interferieren würde. Beim Programmelement 565 werden die Aminosäurefestlegungen korrigiert, basierend auf der berechneten Verschiebungskorrektur, und beim Programmelement 567 wird der Zykluszähler n weitergeschaltet, um die Verschiebung für den nächsten Zyklus zu berechnen. Der Zykluszähler wird beim Programmelement 569 überprüft, um zu sehen, ob alle Zyklen korrigiert worden sind. Falls dies nicht der Fall ist, kehrt das Verfahren zum Programmelement 517 zurück, um die empirischen Verschiebungskalkulationen festzulegen. Die polynomen Anpassungsroutinen 519 bis 525 werden auf den neuen Sequenzzuordnungen und den Verschiebungskoeffizienten basierend erneut wiederholt, und das Verfahren wird durchgeführt, bis die Verschiebung zum Zyklus n+1 korrigiert worden ist und die Verschiebung aus dem Zyklus n+1 heraus zu den nächsten nachfolgenden Zyklen entfernt worden ist. Dieses Verfahren wird fortgeführt bis alle Zyklen, jeweils eine pro Zeit bzw. nacheinander, hinsichtlich der Verschiebung korrigiert worden sind. Wenn die Verschiebungskorrekturen während jedes Durchganges durch das Verfahren durchgeführt werden, wird ein weiterer Zyklus frei von Verschiebungsinterferenzen hinsichtlich der Aminosäurebestimmung bis letztendlich alle Zyklen als unabhängig von Verschiebungseffekten bezeichnet werden können. Das Verfahren schreitet dann zur Injektionskorrektursubroutine 23 fort, oder die Ergebnisse der Sequenzfestlegung werden direkt ausgegeben, und zwar in Abhängigkeit davon, ob die Injektionskorrektur gemacht worden ist. Für den Fachmann ist es selbstverständlich, daß andere Näherungsverfahren eingesetzt werden können, um zu Verschiebungskorrekturen zu gelangen. Beispielsweise kann anstelle der Verwendung der höchsten drei Werte der normalisierten PTH's lediglich der höchste Wert verwendet werden, oder aber könnte man die beiden höchsten Werte verwenden, um zu sehen, ob sich die Sequenzbestimmung verändert, und falls dies der Fall ist, geht man zurück und prüft andere Sequenzmöglichkeiten. In entsprechender Weise könnte man mehr als die drei höchsten Werte auswählen, falls nach der Verschiebungskorrektur die Sequenzzuordnung immer noch mehrdeutig erscheint.

Injektionskorrektur:

Wenn die Hintergrund- und Verschiebungskorrekturen durchgeführt worden sind, können die verbleibenden PTH-Werte jedes Zyklus, falls dies erwünscht wird, verwendet werden, um diese hinsichtlich irgendeiner Änderung in der Menge der Probe die in den PTH-Analyzer für jeden Zyklus eingegeben wird, zu korrigieren. Für jeden Zyklus werden alle bis auf die beiden höchsten PTH-Werte gemittelt. Da die korrigierten PTH-Werte in Standardabweichungseinheiten vorliegen, würde dieser Mittelwert in der Nähe von Null liegen, falls die Injektion für jeden vorgegebenen Zyklus präzise ausgeführt worden ist. Falls irgendein von Null unterschiedlicher Mittelwert für einen Zyklus verwendet wird, um die Roh-PTH- Ergebnisdaten für diesen Zyklus zu korrigieren, indem von jedem Roh-PTH-Wert das Produkt aus dem korrigierten Zyklusmittelwertes und der PTHs-Standardabweichungseinheit (kalkuliert in der PTH-Hintergrundkorrekturroutine) abgezogen wird. Dieser Vorgang verwendet im Endeffekt den Satz von nicht zugeordneten Aminosäurewerten für jeden Zyklus als einen internen Probenstandard. Demzufolge können die Injektionskorrekturen in der Abwesenheit von irgendeinem internen HPLC-Standard durchgeführt werden.
In Fig. 6 ist ein Flußdiagramm gezeigt, welches die Injektionskorrektur zeigt. Zunächst wird beim Programmelement 611 ein Bereich {Zj,n} definiert, wobei das Element Zj,n den Wert des PTH-Betrages der Aminosäure der Art j im Edman-Zyklus n, kalkuliert aus der Verschiebungskorrektur-Subroutine 129 darstellt. Beim Programmelement 613 wird die Anordnung durch die Aminosäure sortiert, um die beiden größten Werte, beispielsweise
festzustellen. Der Bereich wird dann im Programmelement 615 für diejenigen Aminosäuren sortiert, die anders als die beiden höchsten sind, was zu einer Säulendarstellung führt, die als { n} führt. Ein injektionskorrigierter PTH-Wert wird dann im Programmelement 617 durch die Gleichung INJj,n=PTHj,o (n) - n j,l berechnet, wobei PTHj,o (n) der Roh-PTH-Wert ist, der in der Subroutine 17 bei der letzten Iteration 1 für die Aminosäure j gefunden wurde. Schließlich wird beim Programmelement 619 die Anordnung PTHj,n (n)= INJj,n eingestellt, um den Namen einzustellen, der für die PTH-Anordnung erforderlich ist, die in der Subroutine 17 eingesetzt wird.
Wenn alle Injektionskorrekturen an den Roh-PTH-Datensätzen durchgeführt worden sind, müssen die PTH-Hintergrund- und die Verschiebungskorrekturen unter Verwendung dieses justierten Datenwertes erneut kalkuliert werden. Wenn dies erst einmal ausgeführt worden ist, sollten die darauffolgenden Aminosäurezuordnungen aus den vorgegebenen Anfangschromatogrammen heraus soweit wie möglich fehlerfrei sein.
Der Anhang I zeigt eine Folge von Tabellen, die zu verschiedenen Stufen des Verfahrens die Ergebnisse der Reihen der oben beschriebenen Korrekturen erläutern. Tabelle 1 zeigt die Rohdaten, die aus einer Quantisierung von 60 Zyklen eines Edman-Sequenziervorganges einer 18 Kilodalton- Kette (d.h. durch das Programmelement 15) resultieren. Tabelle 2 zeigt die gleichen Rohdaten mit der ersten Spalte, Aspartat, und zwar hintergrundkorrigiert gemäß dem Programmelement 17. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der nächsten Schleife durch die Hintergrundkorrektur-Subroutine 17, um eine Hintergrundkorrektur in der zweiten Spalte, Asparagin durchzuführen. Wie vorangehend beschrieben wird dieser Hintergrundkorrekturvorgang wiederholt, bis die PTH- Anteile für jede Aminosäure hinsichtlich des Hintergrunds korrigiert worden sind. Sodann kann eine vorläufige Sequenzfestlegung durchgeführt werden. Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse der Hintergrundkorrektur.
Die eingekreisten Elemente in Tabelle 4 sind die maximalen PTH-Werte in jedem Zyklus und entsprechen einer ersten vorläufigen Sequenzzuordnung.
Unter Verwendung der vorläufigen Sequenzzuordnung wird sodann die Verschiebungskorrektur-Subroutine 19 durchgeführt, welcher die Injektionskorrektur-Subroutine 23 folgt. Wenn die Injektionskorrektur vollständig durchgeführt worden ist, wird sodann die injektionskorrigierte Sequenz der PTH's hinsichtlich des Hintergrundprogrammelements 17 korrigiert. Die Ergebnisse der Verschiebungskorrektur an den hinsichtlich der hintergrundkorrigierten Daten für die Zyklen 1 bis 37 sind in Tabelle 5 gezeigt. Zum Vergleich zeigt die Tabelle 6 die Ergebnisse der Verschiebungskorrektur an den hintergrundkorrigierten Daten für die Zyklen 1 bis 38. Tabelle 7 zeigt die Resultate der Verschiebungskorrektur für alle 60 Zyklen. Die Resultate der Injektionskorrektur für Zyklus 1 ist in der Tabelle 8 gezeigt. Die Tabelle 9 zeigt die Ergebnisse der Injektionskorrektur für die Zyklen 1 und 2. Diese Injektionskorrektur wird dann fortgeführt für jeden einzelnen Zyklus bis alle Zyklen hinsichtlich der Verschiebung korrigiert worden sind. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 11 zeigt die Ergebnisse der Hintergrundkorrektur an den injektionskorrigierten Daten der Tabelle 10. Tabelle 12 zeigt die Ergebnisse der Verschiebungskorrektur für alle Zyklen der hintergrundkorrigierten Daten der Tabelle 11. Wiederum entsprechen die Maximalwerte in jedem Zyklus der Sequenzzuordnung, welche sich als unterschiedlich zu der vorläufigen Sequenzzuordnung, wie sie in Tabelle 4 gezeigt ist, erweist, nachdem die Injektionskorrektur durchgeführt worden ist.
Dieser Unterschied in der Sequenzbestimmung kann klar in den Fig. 7A, 7B und 7C erkannt werden, welcher die Resultate der oben genannten Sequenz der Stufen für Zyklus 51 des 18 Kilodalton-Proteins zeigt. In Fig. 7A würde eine vorläufige Festlegung für diesen Zyklus Lysin ergeben. Wenn die Injektionskorrektur durchgeführt worden ist und der Hintergrund korrigiert worden ist, wie dies in Fig. 7B gezeigt ist, dann ist die Wahl für den Zyklus 51 nicht so klar und deutlich, scheint jedoch auf Histidin hinzuweisen sein. Diese Auswahl wird dann beim Durchführen der Verschiebungskorrektur, wie dies in Fig. 7C gezeigt ist, bestätigt. Die Ergebnisse des Korrekturvorganges können außerdem auch anhand einer speziellen Aminosäure betrachtet werden, wie dies aus den Figuren 8A, 8B und 8C hervorgeht, welche die Ergebnisse des Korrekturvorganges für Glutaminsäure durch den Zyklus zeigen. Fig. 8A zeigt die Rohdaten (injektionskorrigiert) für Glutaminsäure durch den Zyklus. Fig. 8B zeigt die Ergebnisse nach der Hintergrundkorrektur für die in Fig. 8A gezeigten Ergebnisse, und Fig. 8C zeigt die Ergebnisse nach der Hintergrund- und Verschiebungskorrektur.
Für den Fachmann ist ersichtlich, daß viele äquivalente Wege der Durchführung des oben genannten Verfahrens und unterschiedliche Kombinationen von Vorrichtungen verwendet werden können, um das Verfahren durchzuführen. Beispielsweise können viele der Computerprogrammelemente separat vom Computermodul eingesetzt werden, solange wie die Vorrichtung, die für diese Berechnungen verwendet wird, unter hinreichender Kontrolle des Computermoduls steht. Zusätzlich sei bemerkt, daß die speziellen Programmzähler und die gewählten Konstanten in der bevorzugten Ausführungsform variieren können, beispielsweise in Abhängigkeit von der Zahl der Degradationszyklen, hinsichtlich der gewünschten Genauigkeit der Berechnung und der gewünschten Zeit zur Vervollständigung der Sequenzanalyse des Peptids.

Claims

1. Verfahren zur Erzeugung eines grundlinienkorrigierten Chromatogramms unter Verwendung einer diskreten, linearen, translationsinvarianten Filterfunktion aα, wobei N ein Maß für die Filterfunktionsbandbreite und α ein Parameter ist, dessen Wert die Signal- Störungs- Charakteristik der Filterfunktion so festlegt, daß (i) wenn α einen Wert kleiner oder gleich einem Schwellwert ist, dann das Anlegen der Filterfunktion an ein Chromatogramm dem Ausfiltern hoher Störfrequenzen entspricht, und (ii) wenn α einen Wert größer als der Schwellwert hat, dann das Anlegen der Filterfunktion an ein Chromatogramm eine Vergrößerung der Auflösung bewirkt, wobei das Verfahren die folgenden Stufen aufweist:

Durchführen einer chromatographischen Analyse einer Probe, um ein erstes Chromatogramm zu erhalten;

Filtern des ersten Chromatogramms mit der Filterfunktion, bei welcher N auf die Breite der Peaks bzw. Spitzen annähernd eingestellt ist, die mit dem ersten Chromatogramm erhalten werden und α auf kleiner oder gleich dem Schwellwert eingestellt ist, um hochfrequente Störungen aus dem ersten Chromatogramm herauszufiltern, um ein zweites Chromatogramm mit einer ersten gefilterten Grundlinie zu erhalten;

Filtern des zweiten Chromatogramms mit der Filterfunktion, wobei N auf ungefähr die Breite der Peaks eingestellt ist, die mit dem ersten Chromatogramm erhalten wurden, und α auf größer als der Schwellwert eingestellt ist, um die Auflösung der Peaks in dem zweiten Chromatogramm zu erhöhen, um ein drittes Chromatogramm zu erhalten, dessen Grundlinie im wesentlichen die gleiche wie die zuerst gefilterte Grundlinie ist; und

Abziehen des zweiten Chromatogramms von dem dritten Chromatogramm, um ein viertes grundlienienkorrigiertes Chromatogramm zu erhalten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin gekennzeichnet durch

Abschneiden des vierten Chromatogramms für Werte unterhalb eines im voraus ausgewählten Schwellwerts, um ein fünftes Chromatogramm zu erhalten;

Filtern des fünften Chromatogramms mit der Filterfunktion, bei welcher α so eingestellt ist, um hochfrequente Störungen zu beseitigen, und N gleich der Breite der Peaks in dem fünften Chromatogramm eingestellt ist, um ein sechstes Chromatogramm zu erhalten;

Feststellen der Peaks in dem sechsten Chromatogramm; und

Ausmessen der Höhe der Peaks in dem sechsten Chromatogramm.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die in dem sechsten Chromatogramm festgestellten Peaks mit Peaks in einem Bezugschromatogramm verglichen werden, um die Probe zu identifizieren.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichet, daß die Filterfunktion eine verschobene trianguläre Filterfunktion ist, die proportional ist zu

wobei N eine ganze Zahl ist, so daß gilt -N≤n≤N.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe eine Mischung von Arminosäurederivaten aufweist.

6. Vorrichtung zur Erzeugung eines grundlinienkorrigierten Chromatogramms einer Probe mit einer Vielzahl von Komponenten, aufweisend:

eine Trenneinrichtung zur Trennung und Herauslösung der Komponenten zu unterschiedlichen Zeitpunkten;

eine Detektoreinrichtung zum Feststellen der gelösten Komponenten und zur Erzeugung eines Signals, welches den Retentionszeiten der Komponenten in der Trenneinrichtung entspricht, wobei dieses Signal nachfolgend als Rohchromatogramm bezeichnet wird;

Rechnereinrichtungen, die an den Detektor angeschlossen sind, um das Rohchromatogramm zu analysieren, wobei der Rechner aufweist:

eine Filtereinrichtung zum Filtern des Rohchromatogramms mit einer ersten Filterfunktion aα, wobei es sich um eine diskrete lineare translationinvariante Funktion handelt, und wobei N ein Maß für die Filterfunktionsbandbreite und α ein Parameter ist, dessen Wert die Signal-Störungs- Charakteristik der Filterfunktion so festlegt, daß (i) wenn α einen Wert kleiner oder gleich einem Schwellwert hat, das Anlegen der Filterfunktion an ein Chromatogramm dem Herausfiltern hochfrequenter Störungen entspricht, und (ii) wenn α einen Wert größer als der Schwellwert hat, das Anlegen der Filterfunktion an ein Chromatogramm dann eine Erhöhung der Auflösung bewirkt;

eine Steuereinrichtung zum Anlegen der Filterfunktion an das Rohchromatogramm, wobei N annähernd auf die Breite der Peaks eingestellt ist, die mit dem Rohchromatogramm erhalten werden, und α auf kleiner oder gleich dem Schwellwert eingestellt ist, um hochfrequente Störungen aus dem Rohchromatogramm herauszufiltern, um ein zweites Chromatogramm zu erhalten, welches eine erste gefilterte Grundlinie hat; wobei die Steuereinrichtung außerdem aufweist

eine Einrichtung, um die Filterfunktion an das zweite Chromatogramm anzulegen, wobei N so eingestellt ist, daß es der Breite der Peaks entspricht, die mit dem ersten Chromatogramm erhalten worden sind, und α auf größer als der Schwellwert eingestellt ist, um die Auflösung der Peaks in dem zweiten Chromatogramm zu erhöhen, um ein drittes Chromatogramm mit einer Grundlinie zu erhalten, welche im wesentlichen gleich der ersten gefilterten Grundlinie ist; wobei die Steuereinrichtung außerdem

eine Einrichtung zum Abziehen des zweiten Chromatogramms vom dritten Chromatogramm enthält, um ein viertes grundlinienkorrigiertes Chromatogramm zu erhalten.