DE3883439T2

DE3883439T2 - Bestimmung von Peptidsequenzen.

Info

Publication number: DE3883439T2
Application number: DE88305608T
Authority: DE
Inventors: Michael W Hunkapiller
Original assignee: Applied Biosystems Inc
Current assignee: Applied Biosystems Inc
Priority date: 1987-06-19
Filing date: 1988-06-20
Publication date: 1994-04-21
Anticipated expiration: 2008-06-21
Also published as: JPH01221664A; US4852017A; JP2701866B2; EP0295966A2; EP0295966A3; EP0295966B1; DE3883439D1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung der Peptidsequenzen, und insbesondere auf das automatische Sequenzieren durch das Verfahren und die Vorrichtung.
Das chemische Verfahren, welches bei Protein-Peptidsequenzern eingesetzt wird, wird von einem Verfahren abgeleitet) welches in den Fünfziger Jahren dieses Jahrhunderts durch Pehr Edman für die sequentielle Degradation von Peptidketten entwickelt wurde (Edman, Acta Chem. Scand. 4, 283, 1950; Edman und Begg, Eur. J. Biochem. 1, 80, 1967). Der erste Schritt in dieser Degradation ist die selektive Kopplung des Aminosäureendes eines Peptides mit dem Edman-Reagenz, Phenylisothiocyanat (PITC), einer Reaktion, die durch eine organische Base katalysiert wird, die mit dem Kopplungsreagenz zugeführt wird. Die zweite Stufe ist das Abtrennen dieser derivatisierten Aminosäure von dem verbleibenden Teil des Peptides, einer Reaktion, die durch Behandeln des Peptids mit einer starken organischen Säure durchgeführt wird. Jeder wiederholte Kopplungs-/Trennzyklus tritt an dem neugebildeten Aminosäureende auf, die von dem vorangehenden Zyklus verblieben ist. Auf diese Art und Weise ergeben wiederholte Zyklen die sequentielle Trennung der Aminosäuren, welche die primäre Struktur des Peptids bilden.
Der Sequenziervorgang wird nicht durch die Edman-Degradation allein vervollständigt. Wenn erst einmal die Aminosäuren von der Probe entfernt worden sind, müssen sie analysiert werden, um ihre Identität festzustellen. Da das abgetrennte Aminosäurederivat, das Anilinthioazolinon (ATZ), für eine Analyse im allgemeinen nicht geeignet ist, wird es in die stabilere Form des Phenylthiohydantoin (PTH) umgewandelt, bevor die Analyse durchgeführt wird. In modernen Sequenzern (Wittman- Liebold et al Anal. Biochem 75, 621, 1976; Hewick et al J. Biol. Chem. 256, 7990, 1981) wird diese Umwandlung automatisch in einem Reaktionsgefäß separat von demjenigen durchgeführt, in welchem die Edman-Degradation stattfindet. Das bei jedem Degradationszyklus erzeugte ATZ wird von dem Peptid mit einem organischen Lösungsmittel abgezogen, in das Reaktionsgefäß übertragen und mit einer wäßrigen Lösung einer starken organischen Säure behandelt, um die Umwandlung in PTH herbeizuführen. Die aus jedem Degradationszyklus erzeugten PTHs können in Fraktionssammlergefäße überführt werden, bis verschiedene von Ihnen von Hand gesammelt worden und zur Analyse aufbereitet worden sind. Als Alternative können die PTHs direkt und automatisch von dem Sequenzumwandlungsgefäß zu einem on-line angeschlossenen Analysensystem übertragen werden (Machleidt, W. und Hoffner, H., in "Methods in Peptide and Protein Sequence Analysis", Seiten 35-47, Birr Hrsg., Elsevier (1980); Wittmann-Liebold und Ashman, in "Modern Method in Protein Chemistry", Seiten 303-327, Tschescne, Hrsg., de Gruyter (1985); Rodriguez, J. Chromotography 350, Seiten 217-225, (1985))
Obgleich eine Vielzahl von analytischen Verfahren eingesetzt worden sind, um die Aminosäuren zu identifizieren, die während der Edman-Degradation freigegeben werden, wird gegenwärtig nur die Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) im weitesten Maße eingesetzt. In der Tat hat die HPLC-Chromatographie an der reversen Phase mit auf Silizium basierenden Umhüllungen das Peptidsequenzieren revolutioniert. Sie ergibt eine rasche, genaue und quantitative Analyse der PTH-Aminisäuren und ist gegenwärtig das einzige Verfahren, das für die PTH-Analyse verwendet wird, das zuverlässig alle PTH-Aminosäuren in einem einzigen Chromatograph-Durchlauf auflösen kann. Darüber hinaus ist, weil es quantitative Daten im Pikomol-Bereich ergibt, das HPLC-Chromatographieverfahren das einzige analytische Verfahren, das zum Mikrosequenzieren durch automatisierte Edman-Sequenzer gegenwärtig zweckmäßig ist.
In idealer Weise würde jedes Chromatogramm ein& einzige qualitative Antwort ergeben, nämlich über das Vorhandensein einer einzigen PTH. In der Praxis jedoch ist dies niemals der Fall, jedes Chromatogramm enthält einen gewissen Anteil aller PTHs und eine quantitative Bewertung der relativen Anteile muß durchgeführt werden, um die Zuordnung der Sequenz durchzuführen. Verschiedene Faktoren geben Anlaß für dieses Problem. Erstens sind Protein- oder Peptidproben mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht rein. Sie enthalten immer einen gewissen Anteil anderer Peptide oder freier Aminosäure, die während des Sequenzierens PTH-Signale erzeugen. Zweitens bewirkt das wiederholte Aussetzen der Probe der Trennsäure während des Edman-Verfahrens Aufspaltungen der Peptidkette an anderen Stellen als an dem Aminoende. Die neuerlich freigelegten Aminoenden, die aus diesen inneren Aufspaltungen resultieren, erzeugen nach nachfolgenden Kopplungs/Trennzyklen dann PTHs. Als Ergebnis ergibt jeder Typ der Aminosäuren im allgemeinen einen Hintergrund-PTH-Pegel, der sich während des Sequenzdurchlaufs langsam verändert, wobei dieser typischerweise in den ersten Zyklen ansteigt und während der letzteren langsam abfällt. Die absoluten Pegel des Hintergrunds sind von der Aminosäurezusammensetzung des Peptids abhängig, den Randbedingungen des Edman-Verfahrens und dem Molekulargewicht des Peptids. Drittens ist die Entfernung eines Aminosäureendes von einer Aminosäure in einem gegebenen Zyklus des Edman-Verfahrens unvollständig. Daher werden einige der Aminosäuren, die sich in dem entsprechenden Zyklus hätten lösen sollen, in dem nächsten Kopplungs/Trennungszyklus vorhanden sein und werden dann erst freigegeben. Dieser Übertrag oder verbliebende Teil ist kumulativ, mehrfache Fehler an einem einzigen Peptidmolekül führen zu einem stetig zunehmenden Anteil einer Population von Molekülen, die zu der erwarteten Reihenfolge der Freigabe außerphasig sind. Viertens wird die Erholung der erwarteten PTH während des Durchlaufes durch Nebenreaktionen, die die Amino-endgruppe blockieren, durch physikalische Verluste von Peptid aus der Reaktionskammer, durch interne Kettenbrüche und den Übertrag leicht verzögert. Diese Verringerung des Signals, welches an aufeinanderfolgenden Zyklusausbeuten gemessen wird, tritt gleichzeitig mit der Erhöhung von Störungen (zufolge der oben beschriebenen Faktoren) auf, und macht die korrekte Aminosäurezuordnung noch schwieriger, wenn die Sequenzierung in dem Peptid weiter fortgesetzt wird. Weiterhin können fünftens die relativen Ausbeuten der PTH-Aminosäuren aus dem Edman-Verfahren variieren. Einige werden fast quantitativ gewonnen, während andere im weitesten Maße vor der Analyse zerstört werden.
Ungeachtet dieser Probleme hat eine rigorose Interpretation der Chromatographiedaten aus einem Sequenzerdurchlauf hinsichtlich der Aminosäuresequenz nicht soviel Aufmerksamkeit erhalten, wie die Chemie und die Instrumentation, die dabei eingesetzt werden. Viele, vielleicht die meisten, Sequenzen werden durch visuelle Inspektion der Chromatogramme ermittelt, um den spezifischen Anstieg im PTH-Pegel einer Aminosäure in jedem Zyklus von dem allgemeinen Hintergrundsignal aller PTHs zu unterscheiden. Dieses Verfahren ist bemerkenswert einfach und wirksam, hat jedoch Beschränkungen. Es beruht auf den Fähigkeiten des Wissenschaftlers, Muster zu erkennen, Fähigkeiten, die im weitesten Maße subjektiv sind und auf den Vergleich von lediglich zwei oder drei Chromatogrammen zugleich beschränkt ist.
Wegen dieser Beschränkungen verwendet eine immer größer werdende Zahl von Wissenschaftlern HPL- Peakintergrationssysteme, um die analogen Signale, die auf einem Aufzeichnungsspurendiagramm wiedergegeben werden, in einen einfacheren Satz digitaler Zahlen umzuwandeln. Dies ermöglicht, daß die Gewinnung jeder PTH in jedem Zyklus in einer graphischen Darstellung, dargestellt wird, die deutlicher die spezifischen Sequenzsignale aufzeigt, die auf dem Hintergrundstörungspegeln superponiert sind.
Smithies et al. (Biochemistry 10, 4912, (1971)) waren die ersten, die die Mathematik der Sequenzchemie in Ausdrücken des Anfangsertrages, des sich wiederholenden Ertrages, des Übertrages und des Aminosäurehintergrunds ausdrückten und die quantitative Sequenzanalysen durchführten, die auf der Peakintegration beruhten. Machleidt W. und Hofner F. (1981) in "High Performance Chromatography in Protein & Peptide Chemistry Seiten 245-258, Walter de Gruyter, Berlin, haben auch zu diesem Prozeß mit beigetragen, jedoch beruhten alle bisherigen Verfahren auf der subjektiven Einordnung der integrierten Peakwerte durch den erfahrenen Wissenschaftler, der die Sequenzanalyse durchführt. Des Wissenschaftlers subjektive Interpretation der relativen Bedeutung eines erhöhten Pegels einer Aminsäure gegenüber dem einer anderen in einem gegebenen Zyklus ist immer noch für die endgültige Sequenzzuordnung erforderlich.
Zusätzlich zu all den oben genannten Schwierigkeiten, die mit Hintergrund PTH-Pegeln, kumulativem Übertrag, Seitenreaktionen und dergl. zu tun haben, stehen bedeutsame Probleme mit den chromatographischen Daten selbst in Verbindung. Während die meiste im Handel erhältlich Chromatographie-Software gut mit idealen Daten umgehen kann (d. h. mit großen gut aufgelösten Peaks), verhält sie sich weniger gut im Zusammenhang mit tatsächlich vorhandenen Daten. Im Hinblick auf Analysen der Aminosäurederivate sind derartige nicht ideale Daten die Regel anstatt die Ausnahme zu sein. Für gewöhnlich beziehen sich Aminosäureanalysen auf die Trennung einer komplexen Mischung von engverwandten Zusammensetzungen, häufig auf einem solch feinen Pegel, daß die konventionelle Software versagt, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen, es sei denn, daß der Benutzer außergewöhnlich viel Handeingaben macht, um die Mängel in der Software zu korrigieren.
Im Prinzip sammelt das HPLC-Datensystem chromatograptische Daten durch periodisches Abtasten des Ausganges des HPLC- Detektors und sodann werde diese digitalisierten Daten verarbeitet. Eine Quantisierung wird dann unter Verwendung einer Peak-Integration durchgeführt, was das Lokalisieren des Anfangs- und des Endpunktes einer Spitze oder eines Peaks das Messen des gesamten Signals zwischen diesen Punkten und das Abziehen von einem Hintergrund erfordert. Die Mittellage des Peaks (d. h. seine Retentionszeit) ist ebenfalls erforderlich, um diesen als eine bekannte Komponente zu identifizieren, die auf den Retentionszeiten basiert, die mit Standardwerten erhalten werden. Der ausgemessene Bereich eines Probepeaks kann dann in einen molaren Betrag umgewandelt werden, der auf dem Meßbereich des entsprechenden Standards basiert. Dieses vom Konzept her einfache Verfahren wird jedoch durch verschiedene Faktoren kompliziert, beispielsweise durch chromatographische Störungen, Peaküberlappung und Retentionszeitverschiebungen
Die chromatographische Störung resultiert aus der Elektronik des Detektors der unvollständigen Mischung der Lösemittel während der Gradienten-Chromatographie, dem Durchgang von Gasblasen oder Teilchen durch den Detektor, Veränderungen des Brechungsindexes infolge des Lösemittel- oder des Temperaturgradienten und der Lösung des Lösemittels oder von Verunreinigungen der Säule. Gegenwärtig beschäftigen sich konventionelle HPLC-Systeme ziemlich unvollständig mit chromatographischen Störungen bei hoher und bei niedriger Frequenz. Die meisten Hochfrequenzfilterverfahren beruhen auf Hardwaregeräten und werden mit Analogfiltern durchgeführt, die in dem Detektorstromkreis eingesetzt sind, und einige HPLC- Systeme versuchen, niederfrequente Störungen (häufig auch Grundlinienverschiebung oder -drift genannt) durch den Einsatz punktweiser Subtraktion eines Rohchromatogramms von den Probedaten zu entfernen. Dieses letztgenannte Verfahren ist insbesondere problematisch, da es zusätzliche Hochfrequenzstörungen mit sich bringt und weil die Grundlinien ich wesentlich von einem zum anderen Durchlauf verändern können. Neue und weniger schwierige Verfahren werden eindeutig für die Verringerung der chromatographischen Störung benötigt.
Peaküberlappungen, d. h. unvollständig aufgelöste Peaks sind ganz besonders problematisch im Zusammenhang mit der HPLC- Software. Kleine Spitzen, die größere teilweise überlappen, können durch die Schleifenschwellwertroutinen übersehen werden, und demzufolge zu einer unkorrekten Chromatogrammquantisierung führen. Wenn verschmolzene Spitzen oder Peaks festgestellt werden, können verschiedene Verfahren zum Aufspalten des gesamten Bereichs eingesetzt werden, welche sich voneinander durch das Verfahren unterscheiden, durch welche die Grundlinie unterhalb der Peakkomponenten festgelegt wird. Diese weisen (i) eine lineare Extrapolation zwischen dem Anfangs- und Endpunkt des Multiplets mit einem linearen Abfall vom Tal zwischen den Peaks zur Basislinie, (ii), eine ähnliche Extrapolation, um die Grundlinie einer Hauptkomponente mit einem Tangentenschnitt festzustellen, um die Grundlinie einer geringeren Komponente festzulegen, und (iii) lineare Extrapolationen zwischen dem Anfangs- und dem Endpunkt jeder separaten Komponente auf. Das Verfahren, welches die genauesten Peakausmessungen ergibt, hängt sowohl vom Grad der Auflösung zwischen den Peaks als auch er relativen Peakhöhe ab. Es ist daher im höchsten Maße von den Proben abhängig und erfordert häufig Einstellungen des Benutzers von einer Probe zu einer anderen in einem Satz von Chromatogrammen, in welchen diese Parameter nicht konstant sind.
Die Retentionszeitverschiebung stellt auch ein spezielles Problem dar, denn wenn erst einmal Peaks lokalisiert und quantifiziert worden sind, müssen sie identifiziert werden, indem ihre Retentionszeiten mit denen bekannter Standards ,verglichen werden. Dies ist einfach, falls die Veränderung der Retentionszeiten von einem Durchlauf zum anderen immer kleiner ist als die zeitliche Trennung zwischen eng miteinander verlaufenden Peaks innerhalb eines Durchlaufs. Üblicherweise werden Softwareroutinen eingesetzt, um ein Auflösungszeitfenster zu finden, welches auf der Standardelutionszeit zentriert ist, um die beste Übereinstimmung eines unbekannten Peaks mit dem Standard zu erzielen. Bei komplexen Separationen, die eng zueinander beabstandete Peaks erzeugen, geht dies nicht immer, da die Elutionszeitverschiebung einen Peak aus dem Fenster herausbewegen kann und einen anderen in das Fenster hineinbringen kann. Dieses Problem kann jedoch in seiner Auswirkung auf ein Minimum verringert werden, indem leicht identifizierte Bezugspeaks verwendet werden, um die Verschiebung zu messen und die Suchfenster für andere Peaks empirisch zu korrigieren. Die Bezugspeaks müssen gut voneinander von irgendwelchen benachbarten Peaks getrennt sein und in allen Chromatogrammen so vorhanden sein, daß ihre Suchfenster groß genug sein können, um die maxial beobachtbare Verschiebung zuzulassen.
Es wird ein Verfahren benötigt, das die meisten dieser Probleme bei der Chromatogrammquantisierung löst und weiches von einem Rechner eingesetzt werden kann, um den Satz von HPLC-Daten zu bewerten, der von einem Peptidsequenzdurchlauf erhalten worden ist, um automatisch eine eindeutige Zuweisung der Sequenzen zu erhalten, ohne sich auf subjektive Interpretationen von spezial ausgebildeten Fachleuten abzustützen.
Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist ein Verfahren und eine Vorrichtung offenbart worden, um die Sequenz eines Peptids eindeutig zu bestimmen. Dieses Verfahren weist die folgenden Stufen auf:
zyklisches Abbauen des Peptides, um für jeden Zyklus einen Satz von Aminosäureresten zu bilden;
Ausmessen des Betrages jedes Aminosäurerestes in jedem Satz;
Anpassen eines Hintergrundpegels an jeden Zyklus, um eine Hintergrundanpassung zu erhalten;
Berechnen eines Dispersionswertes für die Hintergrundanpassung im Vergleich zum ausgemessenen Betrag für jeden Rest in jedem Satz;
Normalisierung der Messung des Betrages jedes Restwertes in jedem Satz durch Korrigieren des gemessenen Betrages für jeden Rest für den Hintergrundpegel, um einen hintergrundkorrigierten Restwertbetrag zu erhalten und Teilen des hintergrundkorrigierten Restwertbetrages durch den Dispersionswert, um einen normalisierten hintergrundkorrigierten Restbetrag für jede Aminosäure in jedem Zyklus zu erhalten; und
Auffinden des größten normalisierten Hintergrund korrigierten Restbetrages in jedem Zyklus, um eine Sequenz ausgewählter Aminosäuren zu bestimmen, die der Peptidsequenz entspricht.
Weitere Korrekturstufen können, falls erforderlich, durchgeführt werden. Diese weiteren Stufen weisen das Korrigieren von wenigstens einigen der normalisierten hintergrundkorrigierten Restbeträge hinsichtlich des Übertrags in nachfolgenden Zyklen auf, um auf diese Art und Weise übertragskorrigierte, hintergrundkorrigierte Restwerte für jeden Zyklus zu erhalten. Diese übertragskorrigierten, hintergrundkorrigierten Restbeträge können dann verwendet werden, um die Originalmessungen der Aminosäurereste in jedem Zyklus hinsichtlich von Differenzen in der Injektionsmenge zwischen den Zyklen zu korrigieren, um auf diese Art und Weise injektionskorrigierte Restbeträge für jeden Zyklus zu erhalten. Die vorangehenden Stufen der Hintergrundkorrektur und der Übertragskorrektur werden dann an den injektionskorrigierten Restbeträgen durchgeführt und der größte dieser Betrage wird dann für jeden Zyklus bestimmt, um zu einer endgültigen Sequenzzuordnung für das Peptid zu kommen.
In der bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die anfängliche Stufe des Messens des Betrages des Aminosäurerestes in jedem Zyklus für gewöhnlich auf verschiedenen Unterstufen. Insbesondere wird, wenn das Peptid zyklisch unter Einfluß des Edman-Degradationsschemas abgebaut wird, eine chromatographische Analyse für jeden Zyklus durchgeführt, wobei die Rohdaten eine Bestimmung des Betrages der Aminosäure für jede Art ergeben, die in einem Zyklus gefunden wurde. In einer anderen Ausführungsform werden die Ergebnisse der Bestimmung dann einer Tiefpaßfilterung zugeführt und eine Hochpaßfilterung wird durchgeführt, um Störungen zu beseitigen, was zu einem grundlinienkorrigierten Chromatogramm führt. Dieses grundlinienkorrigierte Chromatogramm wird dann bei dem Hintergrundkorrekturverfahren eingesetzt.
In einer anderen Ausführungsform wird das grundlinienkorrigierte Chromatogramm unter Verwendung einer linearen translationsinvarianten diskreten Filterfunktion aα. erhalten, wobei N ein Maß für die Filterbreite ist und α die Auflösungsvergrößerungscharakteristik der Filterfunktion festlegt. In dieser Ausführungsform wird das Chromatogramm zuerst mit der Filterfunktion geglättet, um Hochfrequenzstörungen zu unterdrücken, um auf diese Art und Weise ein zweites (gefiltertes) Chromatogramm mit einer ersten gefilterten Grundlinie zu schaffen. Sodann wird das zweite Chromatogramm mit dem Parameter gefiltert, welches zur Peakauflösungsverstärkung eingestellt ist, um ein drittes Chromatogramm zu bilden, welches im wesentlichen die gleiche gefilterte Grundlinie aufweist. Das zweite Chromatogramm wird dann vom dritten Chromatogramm abgezogen, wodurch ein viert es Chromatogramm entsteht, bei welchem die Grundlinie entfernt worden ist. Das vierte (grundlinienkorrigierte) Chromatogramm wird dann bearbeitet, um quantitative Werte der PHT's zu erhalten, die bei dem Hintergrundkorrekturvorgang verwendet werden.
Die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung weist auf:
eine Abbau- oder Degradationseinrichtung, um das Peptid zyklisch abzubauen, um einen Satz von Aminosäureresten für jeden Zyklus zu bilden;
eine Quantisierungseinrichtung, die an die Degradationseinrichtung angeschlossen ist, um den Betrag jedes Aminosäurerestes in jedem Satz zu messen;
einen Rechner, der an die Degradations -und die Quantisierungseinrichtung angeschlossen ist, um die Degradations- und die Quantisierungseinrichtung zu steuern, um einen Hintergrundpegel an jeden Zyklus anzupassen, um einen hintergrundkorrigierten Restbetrag für jeden Rest zu erhalten, um ein Maß der Dispersion für die Hintergrundanpassung in bezug auf die Meßwerte der Reste in jedem Satz zu erhalten, um den ausgemessenen Betrag für jeden Rest durch Teilen des hintergrundkorrigierten Restbetrages durch das Maß der Dispersion zu normalisieren, um normalisierte, hintergrundkorrigierte Restbeträge für jeden Zyklus zu erhalten und um den größten normalisierten hintergrundkorrigierten Restbetrag in jedem Zyklus zu identifizieren.
Verschiedene Ausführungsformen der Erfindung werden nun mit mehr Einzelheiten unter -Bezugnahme auf die anhängenden Zeichnungen erläutert:
Fig. 1A ist ein Flußdiagramm für das Verfahren gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung.
Fig. 1B ist eine Darstellung der Vorrichtung der Erfindung.
Fig. 2A und 2B zeigen die Stufen des Verfahrens zur Quantisierung von HPLC-Peaks.
Fig. 2C und 2D zeigen die Stufen des Verfahrens zu Quantisierung von HPLC-Piks gemäß einer zweiten Ausführungsform gemäß der Erfindung.
Fig. 3A(1) zeigt ein Rohchromatogramm einer Standard-PTH- Mischung.
Fig. 3A(2) zeigt ein grundlinienkorrigiertes Chromatogramm, welches gemäß einem Verfahren der vorliegenden Erfindung für die Standardmischung durchgeführt worden ist, welche das Rohchromatogramm der Fig. 3A(1) aufweist.
Fig. 3B(1) zeigt zwei Komponenten eines Haus-Filters gemäß dem Verfahren der Erfindung.
Fig. 3B(2) zeigt das Haus-Filter, welches durch Addieren von zwei Komponenten aus der Fig. 3B(1) entstanden ist.
Fig. 3C-3I zeigen die Resultate des Anlegens eines Filterverfahrens gemäß der Erfindung an die Standard-PTH- Mischung der Fig. 3A(1).
Fig. 3C', 3D' und 3I' zeigen die in den Fig. 3C, 3D und 3I gezeigten Resultate, jedoch in einem vergrößerten Maßstab.
Fig. 3J-3M zeigen die Resultate des Anlegens des Filterverfahrens gemäß der Erfindung auf eine zweite Standard- PTH-Mischung.
Fig. 4A und 4B zeigen ein Flußdiagramm, welches das Verfahren zeigt, das verwendet wird, um den Hintergrundpegel in dem Betrag des für jeden Zyklus gemessenen Aminosäurerestes zu korrigieren.
Fig, 5A-5D sind ein Flußdiagramm des Verfahrens, welches verwendet wird, um den Übertrag für jeden Aminosäurerest in nachfolgende Zyklen zu korrigieren.
Fig. 6 ist ein Flußdiagramm, welches das Verfahren erläutert, welches eingesetzt wird, um Differenzen in der Injektionsmenge für unterschiedliche Zyklen zu korrigieren.
Fig. 7A-7C zeigen die Resultate des Verfahrens gemäß der Erfindung an unterschiedlichen Stufen des Korrekturverfahrens für den 51. Zyklus in der Degradation eines Proteins. Fig. 7A zeigt die injektionskorrigierten Rohdaten. Fig. 7B zeigt die resultate des Verfahrens nach der Durchführung der Hintergrundkorrektur an den injektionskorrigierten Rohdaten der Fig. 7A. Fig. 7C zeigt die Resultate des Durchführens einer Übertragskorrektur nach Durchführung der Hintergrundkorrektur, die in Fig. 7B erläutert worden ist.
Fig. 8A-8C' zeigen die Resultate des Verfahrens der Erfindung an unterschiedlichen Stufen des Korrekturvorgangs für Glutaminsäure bei unterschiedlichen Zyklen in der Degradation eines Proteins.
Fig. 8A zeigt die Rohdaten (injektionskorrigiert) . Fig. 8B zeigt die Resultate des Verfahrens nach dem Durchführen der Hintergrundkorrektur an den injektionskorrigierten Rohdaten der Fig. 8A. Fig. 8C zeigt die Ergebnisse nach der Durchführung einer Übertragskorrektur und nach der Durchführung der Hintergrundkorrektur, die in Fig. 8B erläutert worden ist.
Den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung entsprechend, die in Fig. 1A als Flußdiagramm illustriert worden ist, wird ein allgemeines Verfahren zur Bestimmung der Sequenz einer Peptidkette gezeigt. In diesem Verfahren umfassen die verschiedenen Stufen sowohl direkte physikalische Messungen als auch rechnerische Elemente, die auf diesen Messungen basieren. Da das Verfahren vollständig automatisch durchgeführt werden kann, wobei die verschiedenen physikalischen Messungen durch Instrumente unter Computersteuerung durchgeführt werden, führt die Sprache der Rechnerprogrammierung von selbst zu einer Beschreibung der Erfindung. Demzufolge wird, um Relativzusammenhänge mit dieser Sprache zu erhalten, nachfolgend jede Stufe des Verfahrens entweder als ein "Programmelement" oder als eine "Subroutine" anstatt als "Stufe" bezeichnet, was tatsächlich der Fall wäre. Der Begriff "Subroutine" wird verwendet, um Computerunterprogramme des Verfahrens zu beschreiben, welche bei der Durchführung einer speziell rechnerischen Aufgabe im wesentlichen in sich selbst vollständig sind. Der Begriff "Programmelement" wird legererweise verwendet, um eine oder mehrere einzelne Stufen eines speziellen Computerprogramms oder einen identifizierbaren Satz von Stufen zu beschreiben, welche eine vollständige Aufgabe durchführen können, sei es ein physikalischer Meßvorgang oder eine Berechnung, jedoch ist er in sich selbst nicht notwendigerweise eine einzelne Subroutine.
Die mechanische Vorrichtung, die verwendet wird, um das in Fig. 1B beschriebene Verfahren durchzuführen, weist ein Sequenziersystem 51 zur Durchführung sequenzieller Edman- Degradationen, ein PTH-Analysegerät 53, welches eine On-line- PTH-Analyse unter Verwendung von HPLC-Daten für die Proben durchführt, die durch die Sequenziereinrichtung geliefert werden, und einen Computermodul 55 auf, welcher sowohl als Steuersystem als auch als Analysevorrichtung für das gesamte System bei der Durchführung der verschiedenen Stufen dient, die verwendet werden, um eine quantitative Aussage über die Peptidsequenz zu erhalten. Als Systemsteuerung ist der Computermodul für die zeitliche Steuerung und die Weiterschaltung der Degradationsvorgänge in dem Sequenziersystem, für die Übertragung von Materialien zum PTH- Analysegerät und für die Steuerung des PTH-Identifizierungsvorganges verantwortlich. Als Analysiereinrichtung speichert der Computermodul die durch das PTH-Analysegerät gelieferten Daten und führt die unterschiedlichen Schritte durch, die nachfolgend beschrieben werden, um Störungen und systematische Fehler in den Roh-PTH-Daten zu beseitigen, die durch das PTH- Analysegerät ausgelesen werden, um den größten relativen PTH- Wert in jedem Zyklus zu identifizieren und um auf diese Weise die Peptidsequenz zu bestimmen. In der bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Computermodul 55 um ein Applied Biosystems Model 900A, welches einen 16/8 bit- Mikroprozessor, beispielsweise den Intel 8088, einen separaten mathematischen Co-Prozessor, einen 640 Kilobyte- RAM-Speicher, einen 10 Megabyte-Scheiben-Speicher, einen 360 Kilobyte Floppy- Disk-Antrieb, einen Touch-Screen-Bildschirm CRT und einen graphischen Drucker umfaßt. In der bevorzugten Ausführungsform ist das Sequenziersystem 51 ein Applied Biosystems Model 470A Sequenzer und das PTH-Analysegerät 53 ist ein Applied Biosystems Model 120A.
Um mit dem Verfahren zu beginnen, wird die Peptidsequenz, die analysiert werden soll, zuerst einem automatisierten Edman- Degradationszyklus beim Programmelement 11 ausgesetzt, und die HPLC-Stufe wird durch das PTH-Analysegerät beim Programmpunkt 12 durchgeführt, um die freigegebene Aminosäure zu identifizieren. Für diesen Edman-Zyklus wird das Chromatogramm in digitaler Form durch den Computermodul aufgenommen, und die Werte des Chromatogramms werden gespeichert. Beim Programmelement 13 wird die Zykluszahl der gerade durchgeführten Degradation weitergeschaltet und der Vorgang wird wiederholt, bis die Degradation und die Chromatogramme für alle Aminosäuren in der Peptidkette durchgeführt worden sind, wobei jeder Aminosäure einem Degradationszyklus entspricht. Als Subroutine 15 wird jedes Chromatogramm identifiziert und quantisiert, um den Betrag für jeden PTH-Wert für jeden Zyklus der Degradation zu bestimmen.
Wenn die Identifizierung und die Quantisierung durchgeführt worden ist, wird ein erster Durchlauf der PTH- Hintergrundstörungsbeseitigung in der Subroutine 17 durchgeführt, und eine vorläufige Sequenzzuordnung wird durchgeführt. Darauf erfolgt eine Übertragskorrektur in Subroutine 19. Die Übertragskorrektur wird durchgeführt, um der Tatsache Rechnung zu tragen, daß während der Edeman-Degradation die Entnahme des Aminosäurerestes lediglich teilweise stattfindet, so daß eine Fraktion der Aminosäure in den nachfolgenden Zyklen auftritt.
Wenn die Übertragskorrektur durchgeführt worden ist, können die verbleibenden PTH-Werte für jeden Zyklus verwendet werden, um irgendwelche Veränderungen in der Menge der Probe zu korrigieren, die in das PTH-Analysegerät bei jedem Zyklus injiziert wird, falls dies überhaupt erwünscht wird. Diese Injektionskorrektur wird in Subroutine 23 durchgeführt. Bei Vervollständigung der Injektionskorrektur werden die Hintergrund- und Übertragskorrekturen wiederholt und die Aminosäurezuordnungen werden im Programmelement 25 basierend auf dem größten korrigierten PTH-Signal für jeden Zyklus durchgeführt. Der zweite Durchgang durch die Hintergrundkorrektur und die PTH-Übertragskorrektur kann in irgendeiner Anzahl von Wegen durchgeführt werden. Der in Fig. 1A gezeigte Versuch beruht darauf, einen Programmzähler einzustellen, um im Programmelement 21 zu überprüfen, um zu bestimmen, ob die PTH-Injektionskorrektur durchgeführt worden ist und, falls sie durchgeführt worden sind, mit der Sequenzauswahl im Programmelement 25 weiterfortzufahren. Falls sie nicht durchgeführt worden sind, werden die Hintergrund- und Übertragskorrekturen wiederholt. Jeder der verschiedenen äquivalenten Programmzähler kann verwendet werden, um nachzuhalten, ob die PTH-Injektionskorrektur durchgeführt worden ist. Für das Programmelement 21 könnte man beispielsweise einen Zähler für die Hintergrundkorrektursubroutine 27, für die Hintergrundkorrektursubroutine 19 oder für die Injektionskorrektursubroutine 23 selbst einsetzen. Ein weiterer weniger praktischer jedoch äquivalenter Versuch ist, welcher nicht erläutert worden- ist, die Verwendung eines Programmzählers und einer Programmschleife überhaupt zu vermeiden und einfach die Hintergrundkorrektursubroutine 17 und die PTH-Übertragssubroutine 19 nach der Injektionskorrektursubroutine 23 zu wiederholen, bevor die Sequenzauswahl durchgeführt wird.
Jede der verschiedenen Subroutinen und Programmelemente wird nunmehr unter Angabe von Einzelheiten unter Bezugnahme auf die verschiedenen Figuren erläutert, die oben in der kurzen Wiedergabe der Beschreibung der Zeichnungen wiedergegeben worden sind. Zusätzlich werden weitere spezifische Einzelheiten für die Programmelemente 17-25 im Appendix I wiedergegeben, welcher ein spezielles Beispiel eines bevorzugten Quellcodes für die Durchführung dieser Programmelemente gibt.

Quantisierung der PTH-Erlebnisse:

In den Fig. 2A und 2B und 2C und 2D sind Flußdiagramme gezeigt, die Einzelheiten jeweils einer ersten und einer zweiten Ausführungsform der Subroutine 15 zur Identifizierung und Quantisierung der HPLC-Peaks zeigen. Obgleich Standard HPLC-Integrationsroutinen erfolgreich zur Identifizierung und Quantisierung von HPLC-Peaks eingesetzt werden können, wenn die Menge des Peptides, welches untersucht wird, relativ groß ist (nämlich wenn das Verhältnis von HPLC-Signal zum Störsignal hoch ist), können moderne Edman-Sequenzer mit Probenpegeln arbeiten, die diese Routinen ernsthaft in Frage stellen. HPLC- Peaks können sowohl durch Hochfrequenzstörungen (die typischerweise von UV-Absorptionsdetektoren stammen), die verwendet werden, um PTH-Elution von analytischen Säulen wiederzugeben) und durch Niederfrequenzstörungen verwischt werden (die typischerweise sowohl von temperaturbeeinflußten Detektor-Driften als auch von Veränderungen des Absorptions- und Reflektionsindexes stammen, die während der Gradienten- HPLC-Elution auftreten). Demzufolge sollte der Peakanalyse eine Chromatogrammfilterung vorangehen, um die Einflüsse beider Arten von Störungen auf ein Minimum zu verringern.
Nach der ersten Ausführungsform wird, nachdem jedes Chromatogramm in digitaler Form durch den Computermodul 55 aufgenommen worden ist, die Niederfrequenzstörung durch eine Adaption des durch Goehner beschriebenen Verfahrens herausgefiltert (Goehner Anal. Chem. 50. 1223 (1978)). Das gesamte Chromatogramm wird zuerst stückweise an ein Polynom vom Grad N angepaßt. Sodann werden alle Punkte, die mehr als um ausgewählte Beträge (in Standardabweichungseinheiten) oberhalb und unterhalb der berechneten Kurve zurückgewiesen und eine neue Anpassung unter Verwendung der verbleibenden Punkte wird durchgeführt. Dieses Verfahren wird fortgeführt, bis die Standardabweichung zwischen den tatsächlichen und den berechneten Punkten einen eingestellten Minimalpegel erreicht (d. h. die angepaßte Kurve konvergiert auf der Grundlinie des Chromatogramms) . Die Polynomkoeffizienten der berechneten Kurve werden dann verwendet, um einen Grundlinienpunkt für jeden Punkt in dem Originalchromatogramm zu berechnen, wobei der Unterschied zwischen den beiden Sätzen von Werten das grundlinienkorrigierte Chromatogramm darstellt.
In der Praxis überschreitet die Zahl der Original- Chromatogrammpunkte und die Zahl der Grundliniensteigungsänderungen (welche den Grad N des für die Anpassung verwendeten Polynoms definiert) im allgemeinen die praktische Rechenkapazität von Mikrocomputern. Demzufolge wird die Routine nacheinander an überlappenden Segmenten des Chromatogramms durchgeführt, wobei jede Runde der Anpassungsroutine verwendet wird, um den Hintergrund für einen Teil des gesamten Chromatogramms festzulegen. Üblicherweise werden zunächst 3/9 der Chromatogrammpunkte zuerst angepaßt und verwendet, um die ersten 5/18 der Grundlinienpunkte einzustellen. Sodann werden 3/9 der Punkte, beginnend mit der 2/9-Position vom Vorderende des Chromatogramms, angepaßt und verwendet, um die nächsten 4/18 der Grundlinienpunkte einzustellen. Als nächstes werden 3/9 der Punkte, beginnend mit der 4/9-Position des Chromatogrammanfanges angepaßt und verwendet, um die nächsten 4/18 der Grundlinienpunkte einzustellen. Schließlich werden die letzten 3/9 der Punkte angepaßt und verwendet, um die letzten 5/18 der Grundlinienpunkte einzustellen. Da, wenn dies möglich ist, lediglich der mittlere Abschnitt jeder berechneten Kurve verwendet wird, sind Diskontinuitäten in dem grundlinienkorrigierten Chromatogramm dort auf ein Minimum verringert worden, wo die einzelnen angepaßten Kurven sich treffen.
Dieser Grundlinienberechnungsvorgang der ersten Ausführungsform wird mit Einzelheiten in Fig. 2A und 2B beschrieben, wobei dieser Vorgang beim Programmelement 211 beginnt, wo alle Programmzähler und Konstanten initialisiert werden. Insbesondere werden wenigstens drei Zähler verwendet, nämlich "i", "k" und m . Ein Zähler "i" wird verwendet, um den speziellen Abschnitt des anzupassenden Chromatogramms weiterzuschalten, ein Zähler "k" ist erforderlich, um den speziellen Edman-Zyklus zu identifizieren, der gerade angepaßt werden soll, und ein Zähler "m" wird verwendet, um die Iterationszahl der Anpassung nachzuhalten. In entsprechender Weise ist es notwendig, den Grad N des Polynoms festzuhalten, das verwendet wird, um dies Chromatogramme anzupassen und um über den Grad der Annäherung zu entscheiden, der für die Hintergrundberechnung gewünscht wird. Praktisch wird N im allgemeinen um 6 gewählt, und die Anpassungsnäherung wird im allgemeinen so gewählt, daß die Standardabweichung der angepaßten Kurve zu den Hintergrundpunkten kleiner oder gleich einer Konstanten K ist (üblicherweise das zweifache des Hochfrequenzstörpegels des Detektorausgangs) . Wenn die Konstanten und Zähler initialisiert worden sind, fährt das Verfahren beim Programmelemente 213 fort, indem der i-te Teil eines ausgemessenen Chromatogramms C(t) angepaßt wird, der dem k-ten Edman-Zyklus entspricht. Beim ersten Durchgang ist i=k=1 und ein Poylnom P (t,N) (d. h. P ) (t,N) der ersten Iteration) des Grades N wird verwendet, um eine Annäherung C (t) üblicherweise unter Einsatz des Verfahrens der kleinsten Fehlerquadrate durchzuführen. Beim Programmelement 215 wird die Standardabweichung (C) für die Annäherung berechnet und eine Funktion δ( ) wird definiert, welche der maximal zugelassenen Punkt-zu-Punkt-Abweichung entspricht. Hier wird Δ( ) als 0,1 ausgewählt. Die Größe der Standardabweichung wird im Programmelement 217 überprüft, um zu sehen, ob sie kleiner oder gleich der gewählten Konstante K ist. Falls sie kleiner als K ist, wird der Zähler i im Programmelement 223 weitergeschaltet. Der Zählerstand i wird dann im Programmelement 215 überprüft, um zu sehen, ob er größer oder kleiner als 4 ist. Falls er nicht größer als 4 ist, wird der nächste Abschnitt des Chromatogramms des k-ten Zyklus im Programmelemente 213 angenähert usw. Falls beim Programmelemente 217 die Größe der Standardabweichung größer ist als K, schaltet das Programm den Iterationszähler m im Programmelement 219 weiter. Dann, beim Programmelement 221, wird eine neue Funktion C (t) (in diesem ersten Durchgang C (t)) berechnet, und nachfolgend als reduziertes Chromatogramm bezeichnet, in dem alle Punkte aus dem Chromatogramm entfernt
werden, für welche gilt
Das reduzierte Chromatogramm hat die gleichen Werte wie das ursprünglich gemessene Chromatogramm, jedoch ist sein Bereich verringert worden. Sodann, wobei wiederum beim Programmelemente 213 begonnen wird, wird dieses reduzierte Chromatogramm mit einem neuen Polynom angenähert usw., indem über die Programmelemente 213 bis 225 gegangen wird, bis die reduzierten Chromatogramme für alle Teile des Chromatogramms des k-ten Zyklus gemäß den festgelegten Anpassungskriterien angenähert worden sind.
Wenn die Polynomanpassungen für jeden Teil i des Chromatogramms des k-ten Zyklus angepaßt worden sind, wird die Grundlinie des k-ten Zyklus im Programmelement 227 berechnet, wobei die Werte der Anpassungspolynome P (t) verwendet werden, um die Grundlinienpunkte bk(t) für jeden Punkt in dem ausgemessenen Chromatogramm C (t) zu berechnen, wobei 1=Max. m (die letzte Iteration) für den i-ten Teil ist. Ein hintergrundkorrigiertes Chromatogramm (t) wird sodann beim Programmelement 229 berechnet, indem die berechneten Grundlinienpunkte bk(t) von dem gemessenen Chromatogramm (t) abgezogen werden, was bedeutet, daß die Niederfrequenzhintergrundkomponenten aus dem Chromatogramm entfernt worden sind. Fachleute verstehen, daß der oben beschriebene Vorgang des Ausfilterns der Niederfrequenzstörung in dieser Ausführungsform lediglich einer von vielen gleichwirkenden Möglichkeiten ist. Beispielsweise könnte irgendein vollständiger Satz von Funktionen- für die Anpassungsfunktion anstelle eines Polynoms verwendet werden.
Wenn erst einmal die Niederfrequenzkomponenten aus dem Chromatogramm entfernt worden sind, wird die Hochfrequenzstörung beim Programmelement 231 entfernt, wobei ein schnelles Standard-Fourier-Transformationsfilter, so wie dies in der Technik bekannt ist, verwendet wird. Sodann werden die Peaks in dem gefilterten Chromatogramm festgestellt und beim Programmelement 232 quantisiert. Verschiedene Lösungswege könnten hier gegangen werden. Beispielsweise könnten Zeitfenster auf der Basis der beobachteten Elutionszeiten für jeden PTH-Wert in einer Standardmischung verwendet werden, um das gefilterte Chromatogramm (t) zu untersuchen, um den Betrag für jeden PTH-Wert zu ermitteln, der in dem Chromatogramm vorhanden ist. Die Beträge können durch Standardverfahren zum Feststellen des ersten derivativen Peaks und durch bekannte Peakintegrationsverfahren oder durch Anpassung der Punkte in jedem Fenster an einer Gauß'schen Kurve und Berechnen der Fläche unter der Kurve bestimmt werden (vergl. Kent et al, in Biotechniques 5, Seiten 314-321 (1978)), oder noch einfacher kann der maximale Spitzenwert in jedem Fenster als die Peakhöhe für die entsprechende PTH genommen werden. Der letztgenannte Lösungsvorgang ist schneller, erfordert jedoch eine gute Trennung der PTHs durch das HPLC-System.
Das Durchführen der Peak-Lokalisierung und der Quantisierung ergibt ein transformiertes Chromatogramm PTH (k) für jeden Zyklus k, welches dem Betraf der PTH der Aminosäure der Art j in dem Zyklus k entspricht. Das Programm prüft dann die Zykluszahl im Programmelement 233 und falls alle Zyklen, die erforderlich sind, um das Peptid in der Probe zu zerlegen, nicht vollständig durchgeführt worden sind, wird die Zykluszahl k im Programmelement 235 weitergeschaltet, und der Hintergrundkorrekturvorgang beginnt wiederum beim Programmelement 213 für einen neuen Zyklus.
Die Fig. 3A(1) und 3A(2) zeigen die Ergebnisse, die beim Einsatz des in den Fig. 2A und 2B beschriebenen Verfahren für diese erste Ausführungsform erhalten werden, um die Niederfrequenzstörung zu entfernen. In Fig. 3A(1) ist ein Rohchromatogramm C (t) mit seine vielen Peaks als eine Funktion der Zeit für einen 5-pmol PTH-Standard gezeigt. Die angepaßte Grundlinie bk(t) ist als eine relativ glatte dunkle und ausgezogene Linie am Grund der Kurve C (t) gezeigt. Fig. 3A(2) zeigt C (t), das grundlinienkorrigierte Chromatogramm der Probe, so wie dies gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung beim Programmelement 229 bestimmt worden ist.
Als alternative bevorzugte Ausführungsform kann ein weiterer Ansatz gemacht werden, um das Chromatogramm zu quantisieren, wobei die Verfahren der digitalen Filterung eingesetzt werden. Wenngleich die digitale Filterung zur Glättung und Verstärkung der Auflösung von Störungen enthaltenen Spektren eingesetzt wird und insbesondere auf physikalische Messungen angewendet worden ist, die durch ENDOR (electron nuclear double resonance) erhalten werden, ist es offensichtlich nicht für die Chromatogrammquantisierung eingesetzt worden (vergl. "Variable Filter for Digital Smoothing and Resolution Enhancement of Noisy Spectra" von Bromba et al, Anal. Chem. (1984), 56, Seiten 2052-2058 und "Properties of a Variable Digital Filter for Smoothing and Resolution Enhancement" von Eierman et al, Anal. Chem. (1986), 58, Seiten 536-539) zur allgemeine Erläuterung der digitalen Filterung bei der Störunsverringerung). Der spezielle in diesen Dokumenten offenbarte Ansatz führt zum Einsatz der Digitalfilterung, wobei es sich um einen diskreten, linearen, translationsinvarianten Abwicklungsvorgang handelt, der definiert ist durch
wobei A den Filteroperator bezeichnet, a(n) die Filterfunktion (Kernel), f das ungefilterte Spektrum und Δf das gefilterte Spektrum ist. Insbesondere ist die Filterfunktion eine vertikal verschobene Dreieckfilterfunktion, wobei
a(n) = (2α+1)/2N+1 - 2α n /N(N+1) with n≤N.
Zu Berechnungszwecken wird diese Filterfunktion üblicherweise in zwei Teile zerlegt
a(n) = a1(n) + a2(n)
wobei a1(n) = (N + i - n ) 2α/N(N1) ein Dreieckfilter und
a2 (n) = - 2α(N+1) -N/N(2N+1)
ein Rechteckfilter ist. Nachfolgend wird diese Kombination als Haus-Filter bezeichnet, weil die Filterfunktionen a1(n) und a2(n), wenn sie superponiert werden, auf einem Diagramm das Aussehen eines Hauses haben. (Vergl. Fig. 3B(1) als Beispiel für eine Dreieckfilterfunktion, die einer Rechteckfilterfunktion überlagert wird, und zwar unter Verwendung von α =1, N=9. Fig. 3B(2) zeigt das sich ergebende Haus-Filter)
In dieser Filterfunktion ist N die Filterbreite und α legt den Grad der Auflösungsverstärkung fest. Die Basis für die Auflösungsverstärkung mit diesem Filter ist eine Verringerung in der Zeilenbreite, da das Frequenzansprechvermögen für a > 1 bei niedrigen Frequenzen 1 überschreitet. Bei höheren Frequenzen nimmt das Frequenzansprechvermögen rasch ab und stellt sicher, daß die Hochfrequenzstörungen in dem Signal unterdrückt werden. Die Eigenschaften des Filters verändern sich selbstverständlich in Abhängigkeit von α und N. Für gewöhnlich wird α = 1/2 als besonders gut an die Signal- Störungs-Verstärkung unbekannter spektrometrischer Funktionen angepaßt angesehen und nähert sich einem angepaßten Filter und erzeugt darüber hinaus die beste Hochfrequenzdämpfung. Allgemein ist α = 1 der größte Wert, welcher Frequenzansprechen ermöglicht, die 1 nicht überschreiten, so daß α = 1 die Grenze zwischen Glättungsfiltern und Auflösungsverstärkungsfiltern markiert. Für α> 1 wird das Frequenzansprechvermögen des Filters oberhalb der Frequenz f=0 verstärkt und fällt dann rapide ab, um eine allgemeine Auflösungsverstärkung zu bewirken. Für α»1 verringert sich die Auflösungsverstärkung um monoton mit α, genauso wie dies für die Störungsverstärkung der Fall ist.
Wenngleich diese digitalen Filtertechniken direkt auf das Chromatogrammquantisierungsproblem angewendet werden könnten, würde das Ergebnis immer noch niederfrequente Reststörungen enthalten, und zwar zufolge systematischer Fehler, die den chromatographischen Verfahren zum Zeitpunkt der Messung zueigen sind.
Um dieses Problem zu vermeiden, wird ein alternativer Lösungsversuch gemacht, welcher eine zweite Ausführungsform der Erfindung darstellt. Dieser zweite Ansatz wird in dem Flußdiagramm der Fig. 2C und 2D erläutert.
Wie bei der vorhergehenden Ausführungsform beginnt die Berechnung durch Initialisierung der Konstanten und Zähler, diesmal beim Programmpunkt 238. Insbesondere wird der Zähler k der Edman-Zyklus-Nummer entsprechend, auf 1 gestellt, so daß die Berechnung von Zyklus zu Zyklus weiterschreiten kann. Beim Programmelement 240 wird der Filterparameter im allgemeinen gleich einer Zahl in dem Intervall zwischen 1/2 und 1 eingestellt und in der bevorzugten Ausführungsform wird er auf 1 eingestellt.
Die Filterbreite wird so eingestellt, daß sie mit der Programmpeakbreite N1 übereinstimmt, so daß in der bevorzugten Ausführungsform die Filterfunktion sich einem Savitzky-Golay- Filter nähert was einer Glättung ohne Auflösungsverstärkung entspricht. Beim Programmelement 242 wird das gemessene Chromatogramm für den Zyklus- k, nämlich C (t) durch Bearbeitung mit dem Hausfilterkernel gefiltert. Dies erzeugt ein geglättetes Chromatogramm (t), d. h. ein Chromatogramm, aus welchem Hochfrequenzstörungen herausgefiltert worden sind. Als nächstes wird α gleich einer Zahl größer als Eins für die Auflösungsverstärkung beim Programmpunkt 244 eingestellt, wobei in der bevorzugten Ausführungsform in diesem Fall α = 20 eingestellt wird. Beim Programmelement 246 wird das Chromatogramm C (t) mit dem neuen Hausfilterkernel gefiltert, um ein weiterhin geglättetes Chromatogramm C (t) zu bilden. Dieses Chromatogramm hat üblicherweise im wesentlichen die gleiche Grundlinie, wie das geglättete Chromatogramm Cf1(t), jedoch mit verstärkten Peaks und negativen Seitenteilen, da die Haus-Kernel-Filterfunktion den Bereich beibehält. Puls Ergebnis hiervon erhält man durch Abziehen des geglätteten Chromatogramms C (t) von den weiterhin geglätteten Chromatogramms C (t) im Programmelement 248 ein Chromatogramm C (t), welches lediglich den Peak und die Seitenteildaten beibehält. Weiterhin ist die niederfrequente Grundlinienstörung vollständig entfernt worden, wodurch eine bedeutsame Fehlerquelle beim Quantisieren von Chromatogrammen beseitigt wird. Da die Peaks die einzige Information von Interesse sind, werden die Seitenbänder beim Programmelement 250 abgetrennt, um ein neues Chromatogramm C (t) zu erhalten. Üblicherweise wird dies dadurch durchgeführt, daß die Punkte unterhalb eines gegebenen Schwellenwertes (üblicherweise 0) abgetrennt werden. Beim Programmelement 252 werden die Bedingungen für eine neue Hauskernelfilterfunktion durch Einstellen von α = 1/2 und der Breite N = N1/2 eingestellt, um ein angepaßtes Filter für das Chromatogramm C (t) einzurichten. Ein neues Chromatogramm (t) wird dann unter Verwendung dieses neuen Kernels beim Programmelement 254 berechnet, welches im wesentlichen das abgetrennte Chromatogramm (t) nur glättet. Beim Programmelement 256 werden die Peaks des Chromatoqramms C (t) ermittelt und quantisiert, und beim Programmelement 258 werden diese Peaks mit bekannten Bezugspeaks für unterschiedliche Aminosäuren verglichen, um jeden Peak in dem speziellen Edman- Zyklus mit speziellen Aminosäuren zu korrelieren, um auf diese Art und Weise quantisierte Werte PTHj,o(k) zu erhalten. Beim Programmelement 260 wird die Zykluszahl k überprüft, um zu sehen, ob diese größer oder gleich der Zahl der Aminosäuren im Peptid ist. Falls dies der Fall ist, fährt das Programm mit der Subroutine 17 fort. Falls dies nicht der Fall ist, wird die Zykluszahl beim Programmelement 261 weitergeschaltet und die Chromatogrammquantisierung beginnt wiederum beim Programmelement 240 für den nächsten Zyklus. Die Bezugspeaks, die für den obigen Vergleich verwendet werden, werden durch Durchlaufen der Chromatogramme an reinen Proben für jede Aminosäure erhalten und durch Durchlaufen der Filterroutine für jede von ihnen, um die gefilterten Bezugschromatogramme für den Vergleich mit den Probenchromatogrammen zu erhalten.
Fig. 3C-3H zeigen die Ergebnisse des Ausführens der oben erläuterten Glättungs- und Grundliniensubtraktionsverfahren an der Standard-PTH-Mischung mit dem Rohchromatogramm der Fig. 3A(1). Fig. 3C zeigt das Rohchromatogramm der Fig. 3A(1) in einem verkleinerten Maßstab. Fig. 3D zeigt die Ergebnisse des Filterns des Chromatogramms nach Fig. 3C unter Verwendung eines Hausfilters mit N=3 und α=1, um Hochfrequenzstörungen zu beseitigen. Fig. 3E zeigt die Ergebnisse des erneuten Anlegens der Hausfilterfunktion (d. h. das Anwenden dieser Funktion auf das gefilterte Chromatogramm der Fig. 3D), und zwar diesmal mit N=3 und α = 20. Fig. 3F zeigt die Ergebnisse des Abziehens des Chromatogramms der Fig. 3D vom Chromatogramm der Fig. 3E. Fig. 3G zeigt das Chromatogramm der Fig. 3F nach dem Abschneiden bei Null. Fig. 3H zeigt das Chromatogramm der Fig. 3G nach dem Glätten mit Hilfe der Hausfilterfunktion mit N = 2 und α = 1/2. Fig. 3I zeigt die Ergebnisse des Skalierens des Chromatogramms nach Fig. 3H (Teilen durch einen willkürlichen Maßstabsfaktor von 3), um eine Spitzenhöhe zu erhalten, die besser vergleichbar mit der Spitzenhöhe der Fig. 3C ist, um die beiden Kurven miteinander zu vergleichen. Um die Genauigkeit des Verfahrens zu erläutern, sind diese Resultate unter Verwendung eines aufgeweiteten Maßstabes in den Fig. 3C', 3D' und 3I' wiedergegeben worden, welche den Fig. 3C, 3D und 3I jeweils entsprechen.
Um weiter die Empfindlichkeit des Verfahrens unter Einsatz des Hausfilters zu erläutern, werden die Ergebnisse der Anwendung des Verfahrens auf einen 20 pmol PTH-Standard in den Fig. 3J-3M gezeigt. Fig. 3J zeigt das Rohchromatogramm für die Probe. Fig. 3K zeigt das Rohchromatogramm in einem vergrößerten Zeitmaßstab in dem Zeitintervall zwischen 14.0 und 16.6 Minuten, was klar einen beträchtlichen Hochfrequenzstörungsgehalt in dem ausgemessen Chromatogramm zeigt. Fig. 3L zeigt die Ergebnisse der Anwendung des Hausfilters, um die Hochfrequenzstörung zu beseitigen, und zwar mit N = 6 und α = 1. Fig. 3M zeigt die Ergebnisse der Anwendung der gesamten Digitalfiltermethode an das Rohchromatogramms nach Fig. 3J und zeigt, daß das endgültig gefolterte chromatogramm sehr glatt ist und Spitzen zeigt, die sehr gut aufgelöst sind. Die nachfolgend eingesetzten Filterparameter sind N = 6, α = 20 für die Auflösungsverstärkung und N = 3, α = 1/2 für die endgültige Glättung.

PTH-Hintergrundkorrektur:

Die Verarbeitung aller Chromatogramme aus dem Sepuenzierungsdurchlauf mit den oben beschriebenen Routinen nach den Fig. 2A und 2B bzw. 2C und 2D erzeugt ein Datenfeld, welches Rohwerte für alle PTHs für alle Zyklen enthält. Eine Darstellung jedes einzelnen PTH-Wertes über den Zyklus zeigt typischerweise ein Ansteigen und/oder Abfallen des Hintergrundpegels der PTH mit einem oder mehreren Zyklen, wobei der PTH-Wert wesentlich höher ist, als der Hintergrundpegel. Dieser Hintergrundpegel kann durch eine Variation des Annäherungsverfahrens mit den rekursiven, kleinsten Fehlerquadraten an eine Polynomroutine aus den verbleibenden PTH-Feldern entfernt angepaßt, das weiter oben für die Niederfrequenzfilterung der Chromatogramme eingesetzt wurde. Bei dieser Variation werden die Iterationen des Anpassungsalgorythmus fortgeführt, bis das Verhältnis der Standardabweichung zwischen den tatsächlichen und den angepaßten Datenpunkten für aufeinanderfolgende Iterationen oberhalb eines eingestellten Wertes, beispielsweise S liegt. Wenn die Iterationen durchgeführt worden sind, werden die berechneten Hintergrund-PTH-Werte von den Rohwerten abgezogen, um hintergrundkorrigierte PTH-Werte zu erhalten.
Als nächstes wird eine Abschätzung der Streuung dieser hintergrundkorrigierten Daten durchgeführt, indem drei Iterationen der Polynomanpassungsroutine mit den kleinsten Fehlerquadraten durchgeführt werden (mit dem Grad des Polynoms =1) . Die Standardabweichung der letzten Iterationen ergibt dann eine Abschätzung der Variation im Hintergrundpegel, eine Schätzung, die eine Zuordnung mit einer Wahrscheinlichkeit erlaubt, daß nämlich erhöhte Pegel in einem bestimmten Zyklus in der Tat um einen statistischen relevanten Betrag hoch sind. Wenn die Iterationen vervollständigt worden sind, werden die berechneten hintergrundkorrigierten PTH-Werte durch die Standardabweichung der Hintergrundanpassung geteilt, um normalisierte hintergrundkorrigierte PTH-Werte zu erhalten. Dieser Vorgang wird dann für jeden PTH-Wert wiederholt, so daß die verbleibenden PTH-Werte ebenfalls in Einheiten der Standardabweichungen oberhalb (oder unterhalb) der Werte ausgedrückt werden, die aus den angepaßten Hintergrundkurven berechnet werden. An dieser Stelle wird eine vorläufige Sequenzzuordnung für jeden Zyklus durchgeführt, indem derjenige PTH-Wert herausgegriffen wird, dessen hintergrundkorrigierter normalisierter Wert der statistisch höchste in diesem Zyklus ist.
Dieses Verfahren ist unter Angaben weiterer Einzelheiten in dem Flußdiagramm der Fig. 4A und 4B erläutert worden. Hier beginnt das Verfahren mit dem Programmelement 411, wo erforderliche Konstanten und Programmzähler initialisiert werden. Ein Programmzähler "D wird anfänglich auf den Wert 1 gestellt. Der Zähler j wird verwendet, um die PTH-Werte zu indizieren, um eine Aminosäure der Art j zu bezeichnen. Eine ganze Zahl M wird gleich der Anzahl der Zyklen, dividiert durch 12 gesetzt (gerundet auf die nächste ganze Zahl), was dem Grad des Polynoms entspricht, welches zur Annäherung an die PTH- Werte verwendet wird. Auch wird ein Bereich σj,-1 auf 0 für alle s = 1 bis 20 eingestellt. Zusätzlich wird der Wert S = 2 eingestellt, wobei S der Abschneidewert des Verhältnisses der Standardabweichung zwischen den tatsächlichen und den angepaßten Daten für aufeinanderfolgende Iterationen ist, um zu bestimmen, wann die Iterationen mit Hilfe der Anpassungsroutine der kleinsten Fehlerquadrate beendet werden können. Beim Programmelement 415 wird ein weiterer Zähler "1" anfänglich auf 0 gestellt, der Zähler 1 entspricht der Iterationszahl in der Anpassungsroutine mit den kleinsten Fehlerquadraten. Beim Programmelement 417 wird PTHj,l(k) an ein Polynom Qj,l+1(M,k) vom Grad M angenähert. Anfänglich bedeutet dies, daß PTHj,0(k) (die Gesamtheit der Werte für die Aminosäurezahl 1 als eine Funktion des Zyklus) durch ein Polynom Q1,1(M,k) genähert wird. Beim Programmelement 419 wird die Standardabweichung der Anpassung für die j-te Aminosäure an der 1-ten Iteration berechnet und σj,l (d. h. σj,O anfänglich) berechnet und ein Maß für die Anpassungsfunktion Δ (σj,i) berechnet. Hierbei ist Δ (σj,l) als Standardabweichung σj,1 für Punkte definiert, die höher als die Rohdaten sind und das doppelte der Standardabweichung für Punkte unterhalb der Rohdaten sind. Das Verhältnis von σj,l-1 zu σj,l wird dann im Programmelement 421 berechnet und falls dieses Verhältnis größer als S ist, schreitet das Programm fort, die hintergrundkorrigierten normalisierten PTH-Beträge im Programmpunkt 425 zu berechnen. Falls das Verhältnis kleiner als S ist, wird der Zähler 1 im Programmelement 422 weitergeschaltet und beim Programmelement 423 wird ein neuer PTHj,l(k) berechnet, indem diejenigen Punkte (d. h. Zyklen) entfernt werden, für die gilt PTHj,l-ii(k)- Qj,l(k) > Δ(σj,l) . Hier ist PTHj,l(k)=PTHj,o(k) für alle Punkte k, die den Bereichen für beide Funktionen gemeinsam sind. Wenn diese Punkte entfernt worden sind, beginnt die Anpassungsroutine wiederum beim Programmelement 417 und der Iterationsvorgang wird fortgesetzt, bis das Verhältnis σj,l- 1/σj,l größer als S ist. Ein Iterationszähler m wird dann bei 424 initialisiert und, wie bereits vorangehend angezeigt, werden beim Programmelement 425 die hintergrundkorrigierten Roh-PTH-Beträge PTH'j,0(k) für jeden Zyklus berechnet. Dies wird durch Abziehen des zuletzt angepaßten Wertes Qj,l(k) für die PTH der Aminosäure j im Zyklus k von dem gemessenen PTH- Wert PTTj,0(k) durchgeführt. Beim Programmelement 429 wird der hintergrundkorrigierte Roh-PTH-Betrag PTH'j,0(k) an ein Polynom Zj,m+i(k) vom ersten Grad angepaßt (Zj,l(k) für die erste Iteration) . Die Standardabweichung dieser Anpassung σj,m und ein Maß der Anpassungsfunktion Δ' (σj',m) wird dann im Programmelement 431 berechnet. Hierbei wird Δ' (σj',m) üblicherweise als gleich der Standardabweichung für diejenigen Punkte gewählt, die oberhalb der angepaßten Linie liegen und gleich dem 1,67fachen der Standardabweichung für diejenigen Punkte gewählt, die unter die angepaßte Linie fallen. Das Programm überprüft dann den Wert des Iterationszählers m im Programmelement 433, um die Iterationen für diese spezielle Sequenz der Anpassungen bei 3 anzuhalten. Der Iterationszahler wird dann beim Programmelement 435 weitergeschaltet und beim Programmelement 437 wird ein neuer PTH'j,m(k) berechnet, indem diejenigen Punkte aus den hintergrundkorrigierten Rohwerten entfernt werden, wo die Differenz zwischen PTJ'j,0(k) und dem angepaßten Wert größer als das Maß der Annäherungsfunktion ist. Dieser Iterationsvorgang wird dann zweimal wiederholt, d. h. insgesamt dreimal durchgeführt und nach dem dritten Mal wird ein normalisierter hintergrundkorrigierter PTH-Betrag PTHj,o (k) beim Programmelement 439 berechnet, indem der hintergrundkorrigierte Rohwert durch die Standardabweichung beim letzten Iterationsvorgang berechnet wird. Wenn die hintergrundkorrigierten, normalisierten PTH-Werte für die Aminosäure j berechnet werden, wird der Zähler j beim Programmelement 441 weitergeschaltet und j wird überprüft, um zu sehen, ob er kleiner oder gleich 20 ist, und zwar im Programmelement 442. Falls j kleiner als oder gleich 20 ist, kehrt das Programm über die Schleife zurück zur Hintergrundanpassung und zu dem Korrekturverfahren, wobei wiederum mit dem Programmelement 415 begonnen wird. Falls j größer als 20 ist, schaltet das Verfahren dann zum Programmelement 443 weiter, wo eine vorläufige Sequenzzuordnung gemacht wird, indem der maximale, normalisierte PTH-Wert für jeden Zyklus bestimmt wird.
Die Fachleute wissen, daß viele Wege für die Durchführung der Hintergrundkorrektur zur Verfügung stehen. Beispielsweise können unterschiedliche Annäherungsfunktionen verwendet werden und ein daß der Streuung unterschiedlich von der der Standardabweichung kann für die Annäherung verwendet werden. Der bedeutsame Aspekt dieses Hintergrundkorrekturvorganges ist, zu einer normalisierten Sequenz der PTH-Werte zu gelangen, so daß die Resultate von Zyklus zu Zyklus quantitativ miteinander verglichen werden können.

Übertragkorrektur:

Nachdem die normalisierten hintergrundkorrigierten PTH-Werte berechnet worden sind und eine vorläufige Sequenzzuordnung durchgeführt worden ist, wird die Übertragskorrektur durchgeführt. Bei jedem Zyklus, k, der Edmandegradation wird der Aminosäurerest lediglich teilweise entfernt, d. h. ein Teil der Aminosäure erscheint in den nachfolgenden Zyklen k+1, k+2, . . . ,k+i. Für jeden gegebenen Zyklus führt eine Störung beim Koppeln und/oder Abt rennen üblicherweise zu einem 1 bis 2%igen außerphasigen Signal oder einem Übertrag. Diese Fehler sind kumulativ, der beobachtete Übertrag wird progressiv größer, wenn die Sequenz fortschreitet und in langen Durchläufen kann ein größeres Signal im Zyklus n+1 als im Zyklus n auftreten. Demzufolge ist die Übertragskorrektur insbesondere für die genaue Sequenzzuordnung für die letzten Zyklen bedeutend.
Falls man "Y&sub0;'' als das theoretische Anfangssignal definiert, "b" als den Anteil des Reaktionsfehlers und "Y1,j" als den Betrag der Aminosäure 1, die in dem Zyklus j erscheint und wenn man weiterhin annimmt, daß kein Signal als Folge von Seitenreaktion unwiederbringbar verloren geht, die die Edmandegradation oder die physikalische Extraktion des Peptids verhindern, dann gilt:
Y1,1 = 1Yo(1-b)
Y1,2 = 1Yo(1-b)b
Y1,3= 1Yo(1-b)b²
Y1,4 = 1Yo(1-b)b³
Entsprechend gilt für die Aminosäuren 2 und 3:
Y2,2 = 1Yo(1-b)²
Y2,3 = 2Yo(1-b)²b
Y2,4 = 3Yo(1-b)²b²
Y2,5 = 4Yo(1-b)²b³
Y3,2 = 1Yo(1-b)³
Y3,4 = 3Yo(1-b)³b
Y3,5 = 6Yo(1-b)³b²
Y3,6 = 10Yo(1-b)³b³
Falls die Übertragsbeträge als Verhältnis zu dem beobachteten primären Zyklusergebnis ausgedrückt werden, reduzieren sich diese Gleichungen zu:
Y1,2/Y1,1 = 1b
Y1,3/Y1,1 = 1b²
Y1,4/Y1,1 = 1b³
Y2,3/Y2,2 = 2b
Y2,4/Y2,2 = 3b²
Y2,5/Y2,2 = 4b³
Y3,4/Y3,3 = 3b
Y3,5/Y3,3 = 6b²
Y3,6/Y3,3 = 10b²
In allgemeinen Ausdrücken, falls Yk der primäre Zyklusertraq (nämlich Yk,k) und Yk+1 gleich dem Übertragswert (d. h. Yk k+i) ist, dann gilt:
Yk+1/Yk = ([k+0]/1)b Yk+2/Yk = ([k+1]/2) ([k+0]/1)b² Yk+3/Yk = ([k+2]/3) ([k+1]/2) ([k+0]/1)b³ . . . Yk+3/Yk = ([k+i-1]/i) . . . ([k+2]/3) ([k+1]/2) ([k+0]/1b¹i
Dieser Ausdruck ist nicht exakt genau, wegen der Annahmen, daß irreversible Signalverlüste nicht vorhanden seien und der Fehleranteil b der gleiche für jeden Zyklus sei. Die erste Annahme führt jedoch solange einen relativ kleinen Fehler ein, wie die irreversiblen Verluste kleiner als 10% pro Zyklus sind und daher stören sie die nachfolgenden Berechnungen nicht signifikant. Der Einfluß der letzteren Annahme, welcher klar unkorrekt ist, ist schwieriger zu bewerten. Empirisch scheint er nicht zu stören, wenn b für jeden Zyklus als ein kumulativer mittlerer Übertrag gemessen wird.
Das bevorzugte Verfahren der Übertragskorrektur wird in den Fig. 5A, 5B und 5C erläutert. Beim Programmelement 511 wird die vorläufige Sequenzzuordnung, die durch die Subroutine 17 bestimmt worden ist, verwendet, um den Primärzyklus- Ertragsbereich Yk (d. h. Yk = MAXI(PTHj(k)) zu definieren. Diese vorläufige Sequenzzuordnung wird dann verwendet, um einen Arbeitswert für den kumulativen Übertrag, kb, für jeden Zyklus zu berechnen. Diese Berechnung wird in den Programmelementen 513, 515 und 517 durchgeführt. Als erstes wird im Programmelement 513, Yk,k+1 gleich PTHj(k+1) für alle Edmanzyklen in der Probe gesetzt, wobei j so gewählt wird, daß es der Aminosäure entspricht, die in der vorläufigen Sequenzzuordnung für den Zyklus k ausgewählt wurde. Ein Zykluszähler "n" wird sodann beim Programmelement 515 so initialisiert, daß jeder Zyklus jeweils pro Zeiteinheit korrigiert wird, und die Arbeitswerte für die Verzögerungskoeffizienten für jeden verbleibenden Zyklus werden (d. h. wo k≥n) beim Programmelement 517 unter Verwendung der Formel Yk,k+1/Yk = kb(k) berechnet. Im Programmelement 519 werden diese Arbeitswerte von kb(k) dann an die Polynomkurve 3(k) des Grades Z=N/15 (gerundet auf die nächste ganze Zahl) angepaßt, und zwar unter Verwendung des Verfahrens der kleinsten Fehlerquadrate. Sodann werden die gemessenen Werte der Übertragskoeffizienten, die von den angepaßten Werten um mehr als eine Standardabweichung abweichen, verworfen, und die verbleibenden Datenpunkte werden erneut angepaßt. Um dies durchzuführen, wird die Standartabweichung, σb, der Anpassungsfunktion B(k) aus den tatsächlichen Messungen Yk,k+1/Yk über den Bereich N aller Edmanzyklen beim Programmelement 521 berechnet. Beim Programmelement 523 werden alle Punkte k, für welche der tatsächliche Wert Yk,k+1/Yk von B(k), dem angepaßten Wert, um mehr als eine Standardabweichung σb abweicht, aus dem Bereich N entfernt, so daß der neue Bereich N' entsteht. Eine Anpassung mit den kleinsten Fehlerquadraten von kb(k) wird dann bei Programmelement 525 unter Verwendung des neuen Bereiches durchgeführt. Beim Programmelement 527 werden die revidierten angenäherten Übertragswerte B' (k) für alle Zyklen k=1 bis N erzeugt. Der Fehleranteil b(n) wird für jeden Zyklus n beim Programmelement 529 unter Verwendung der angepaßten Werte von B' (k) berechnet und beim Programmelement 531 wird b(n) verwendet, um die angepaßten Verzögerungsbeträge G(n,i,b) in den nächsten paar Zyklen zu erzeugen, und zwar unter Verwendung der Gleichung (G(n,i,b)=([n+i+1]/i) . . . ([n+2]/3) ([n+1]/2) ([n+0]/1)bi(n) oder für alle Zyklen i bis G(n,i,b)< 0,01 ist, d. h. bis der Wert des Zyklus n+i kleiner ist als 1% des Wertes des Zyklus n. Im Programmelement 533 werden die normalisierten PTH-Werte für den Zyklus n sortiert, um die drei größten Werte zu ermitteln, Y , Y und Y und ihre entsprechenden Überträge Yn,n+j, Y ,n+i, Y ,n+j. Beim Programmelement 535 wird der größte Wert überprüft, um zu sehen, ob er kleiner als das dreifache des nächsthöheren Wertes ist und, falls dies nicht der Fall ist (d. h. er ist größer oder gleich dem Dreifachen des nächsthöheren Wertes), beläßt das Programm die Aminosäurezuordnung so, wie sie durch Einstellung von Yn gleich am Programmelement 537 vorgenommen wurde. Falls jedoch Y kleiner als das Dreifache von Y ist, wird jeder der drei größten Werte Y , Y und Y hinsichtlich des Übertrags in den Programmelementen 535 bis 557 korrigiert, und zwar unter Einsatz des angepaßten Übertrags, der auf der ursprünglichen Sequenzzuordnung basierte, um zu bestimmen, ob die Übertragskorrektur irgendwelche Veränderungen in der Sequenzzuordnung bringen würde. Insbesondere wird jede der angepaßten Überträge Y als G(n,i,b)Yjn im Programmelement 543 berechnet, und falls der tatsächliche Wert Y,n+i größer als 0 ist, wird der Betrag Yn hinsichtlich des Übertrags im Zyklus n+i korrigiert. Diese Korrektur wird durchgeführt, indem YFjn+i zu Yjn hinzugezählt wird oder indem Yjn,n+i im Programmelement 547 hinzugefügt wird, falls YF;n+i> Yjn,n+i ist. Dieser Korrekturvorgang wird für die nächsten paar Zyklen i fortgeführt, bis sie die Zykluszahl n erreicht, das Kriterium für das Abschneiden ist hierbei, daß der angepaßte Übertrag kleiner als 1% des tatsächlichen Wertes, so wie dies im Programmelement 549 überprüft wird. Dieser Vorgang wird für jeden Zyklus 1 und jeden Wert Yjn durchgeführt, bis jeder Wert Yjn durch Einsetzen von
korrigiert worden ist. Beim Programmelement 553 wird jede dieser Übertragskorrekturen überprüft, um das Maximum des übertragskorrigierten Wertes zu ermitteln und der Sequenzwert Yn wird gleich diesem Maximum gesetzt, und der Aminosäureindex wird bestimmt, um die richtige Sequenzauswahl für diesen Zyklus n auszuwählen. Wenn die Sequenzauswahl für den Zyklus n vervollständigt worden ist, entweder nach dem Programmelement 537 oder dem Programmelement 553, werden die angepaßten Überträge für diese Sequenzzuordnung beim Programmelement 559 für die nächsten paar Zyklen bis zum Zyklus n berechnet, wobei wiederum das gleiche Beendigungskriterium wie vorher verwendet wird, d. h. bis der angepaßte Übertrag kleiner als 1% des tatsächlichen Übertrags ist. Der Zyklus n wird dann hinsichtlich des Übertrags aus den späteren Zyklen n + i korrigiert, die positive Übertragswerte haben, und zwar unter Verwendung des gleichen Abschneidekriteriums, wie zuvor beim Programmelement 561, indem der Betrag des Zyklus n durch den geringeren Wert des berechneten Übertrags oder des tatsächlichen Zyklusbetrags erhöht wird. Die nächsten Zyklen n+i werden hinsichtlich des Übertrags aus dem Zyklus n durch Ersetzen des Übertragswertes beim Zyklus n + i durch den größeren Wert von 0 oder der Differenz zwischen dem beobachteten Wert Yn,n+i und dem berechneten Übertragswert Y im Programmelement 563 für alle Zyklen i korrigiert, wobei der angepaßte Übertragskoeffizient kleiner als 1% ist.
An dieser Stelle wird der Zyklus n fixiert und der Zyklus n+i ist frei von einem Übertrag aus dem Zyklus n, der mit der Sequenzzuordnung des Zyklus n+i interferieren würde. Beim Programmelement 565 werden die Aminosäurezuordnungen, die auf den berechneten Übertragskorrekturen basieren, korrigiert und beim Programmelement 567 wird der Zykluszähler n weitergeschaltet, um den Übertrag für den nächsten Zyklus zu berechnen. Der Zykluszähler wird beim Programmelement 569 überprüft, um zu sehen, ob alle Zyklen korrigiert worden sind. Falls sie nicht überprüft worden sind, kehrt das Verfahren zum Programmelement 517 zurück, um die empirischen Übertragsberechnungen zu bestimmen. Die Polynomanpassungsroutinen 519-525 werden auf den neuen Sequenzzuordnungen und Verzögerungskoeffizienten basierend wiederholt und der Vorgang wird fortgesetzt, bis der Übertrag für Zyklus n+i korrigiert worden ist und der Übertrag vom Zyklus n+l aus den nächsten paar Zyklen entfernt worden ist. Dieser Vorgang wird fortgesetzt, bis alle Zyklen nacheinander hinsichtlich des Übertrags korrigiert worden sind. Wenn die Übertragskorrekturen während jedes Durchlaufs durch das Verfahren durchgeführt werden, wird immer ein weiterer Zyklus frei von Übertragsstörungen mit seiner Aminosäurezuordnung gemacht, bis letzten Endes alle Zyklen unabhängig von Übertragseffekten zugeordnet werden können. Der Prozeß schreitet dann zur Injektionskorrektursubroutine 23 fort, oder aber die Resultate der Sequenzzuordnung werden direkt als Ausgang ausgegeben, was davon abhängt, ob die Injektionskorrektur durchgeführt worden ist. Die Fachleute wissen, daß andere Näherungsverfahren existieren, die eingesetzt werden können, um im Endeffekt zur Übertragskorrektur zu gelangen. Beispielsweise kann anstelle der Verwendung der höchsten drei Werte der normalisierten PTH'- Werte einzig und allein der höchste Wert herangezogen werden, oder man könnte die beiden höchsten Werte verwenden, um zu sehen, ob die Sequenzzuordnung sich ändert, und falls dies der Fall ist, kann man zurückkehren und andere Sequenzzuordnungen überprüfen. In entsprechender Weise könnte man mehr als die drei höchsten Werte auswählen, falls nach der Übertragskorrektur die Sequenzzuordnung immer noch nicht eindeutig erscheint.

Injektionskorrektur:

Wenn die Hintergrund- und die Übertragskorrekturen durchgeführt worden sind, können die verbleibenden PTH-Werte in jedem Zyklus, falls dies gewünscht wird, verwendet werden, um sie hinsichtlich irgendeiner Abänderung in der Menge der in das PTH-Analysegerät für jeden Zyklus eingegebenen Probe zu korrigieren. Für jeden Zyklus werden alle, bis auf die höchsten beiden Werte, gemittelt. Da die korrigierten PTH-Werte in Standardabweichungseinheiten vorliegen, würde dieser Mittelwert in der Nähe von 0 liegen, falls die Injektion für jeden gegebenen Zyklus präzise wäre. Ein Mittelwert abweichend von 0 für einen Zyklus wird verwendet, um die Roh-PTH-Ertragsdaten für diesen Zyklus zu korrigieren, indem von jedem Roh-PTH-Wert das Produkt des korrigierten Zyklusmittelwertes und der PTH- Standardabweichungseinheit abgezogen wird (berechnet in der PTH-Hintergrundkorrekturroutine). Dieser Vorgang verwendet im Endeffekt den Satz von nicht zugeordneten Aminosäurewerten für jeden Zyklus als einen internen Probenstandard. Demzufolge können die Injektionskorrekturen in der Abwesenheit von jedwedem zusätzlichen internen HPLC-Standard durchgeführt werden.
In Fig. 6 ist ein Flußdiagramm gezeigt, welches die Injektionskorrektur erläutert. Zuerst, beim Programmelement 611 wird eine Aufstellung {Zj,n} definiert, wobei das Element Zj,n den Wert des PTH-Betrages der Aminosäure der Art j im Edmanzyklus n darstellt, so wie dieser in der Übertragskorrektursubroutine 19 berechnet worden ist. Beim Programmelement 613 wird die Aufstellung hinsichtlich der Aminosäure sortiert, um die beiden größten Werte, namlich Zj',n und Zj'',n für jeden Zyklus zu ermitteln. Die Aufstellung wird dann im Programmelement 615 für diejenigen Aminosäuren mit Ausnahme der beiden höchsten ermittelt, wodurch sich eine Spaltenaufstellung ergibt, die als ( n) definiert wird. Ein injektionskorrigierter PTH-Wert wird dann im Programmelement 617 durch die Gleichung INJ;j,n=PTHj,0(n)- nσj,l berechnet, wobei PTJjo(n) der Roh-PTH-Wert ist, der in der Subroutine 17 bei der letzten Iteration 1 für die Aminosäure j ermittelt wurde. Schließlich wird beim Programmelement 619 die Aufstellung PTHj,0(n) gleich INJj,n eingestellt, um den Namen festzulegen, der für die PTH-Aufstellung erforderlich ist, die in der Subroutine 17 verwendet wird.
Wenn alle Injektionskorrekturen an den Roh-PTH-Datensätzen durchgeführt worden sind, müssen die PTH-Hintergrund- und Übertragskorrekturen erneut berechnet werden, indem die eingestellten Daten verwendet werden. Wenn dies getan worden ist, sollten die nachfolgenden Aminosäurezuordnungen so fehlerfrei wie möglich im Hinblick auf die gegebenen Anfangschromatogramme sein.
Appendix II zeigt eine Reihe von Tabellen, die verschiedene Stufen des Verfahrens erläutern, nämlich die Ergebnisse der einzelnen oben beschriebenen Korrekturvorgänge. Tabelle 1 zeigt die Rohdaten, die aus der Quantisierung von 60 Zyklen eines Edmansequenziervorganges einer 18-Kilodalton-Kette erhalten wurden (d. h. durch das Programmelement 15) . Tabelle 2 zeigt die gleichen Rohdaten, wobei die erste Spalte, Aspartat, gemäß dem Programmelement 17 hintergrundkorrigiert worden ist. Tabelle 3 zeigt Ergebnisse der nächsten Schleife durch die Hintergrundkorrektursubroutine 17, um die zweite Spalte hinsichtlich des Hintergrunds zu korrigieren, nämlich Asparagin. Wie vorangehend beschrieben, wird dieser Hintergrundkorrekturvorgang wiederholt, bis die PTH-Werte für jede Aminosäure hinsichtlich des Hintergrunds korrigiert sind.
Sodann kann eine vorläufige Sequenzzuordnung gemacht werden. Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse der Hintergrundkorrektur.
Die eingekreisten Elemente in Tabelle 4 sind die maximalen PTH- Werte in jedem Zyklus und entsprechen einer ersten vorläufigen Sequenzzuordnung.
Unter Verwendung der vorläufigen Sequenzzuordnung wird dann die Übertragskorrektursubroutine 19 durchgeführt, welcher die Injektionskorrektursubroutine 23 folgt. Wenn die Injektionskorrektur vervollständigt worden ist, wird sodann die injektionskorrigierte Sequenz der PTH-Werte hinsichtlich des Hintergrunds im Programmelement 17 korrigiert. Die Ergebnisse der Übertragskorrektur an den hintergrundkorrigierten Daten für die Zyklen 1 bis 37 sind ins Tabelle 5 gezeigt. Zum Vergleich zeigt die Tabelle 6 die Ergebnisse der Übertragskorrektur an den hintergrundkorrigierten Daten für die Zyklen 1 bis 38. Tabelle 7 zeigt die Ergebnisse der Übertragskorrektur für alle 60 Zyklen. Die Ergebnisse der Injektionskorrektur für den Zyklus 1 ist in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 9 zeigt die Ergebnisse der Injektionskorrektur für die Zyklen 1 und 2. Dieser Injektionskorrekturvorgang wird sodann für jeden Zyklus
durchgeführt, bis alle Zyklen hinsichtlich des Übertrags korrigiert worden sind. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 11 zeigt die Ergebnisse der Hintergrundkorrektur an den injektionskorrigierten Daten der Tabelle 10. Tabelle 12 zeigt die Ergebnisse der Übertragskorrektur für alle Zyklen der hintergrundkorrigierten Daten der Tabelle 11. Wiederum entsprechen die Maximalwerte in jedem Zyklus der Sequenzzuordnung, welche als unterschiedlich von der vorläufigen Sequenzzuordnung (Tabelle 4) zu erkennen ist, nachdem nunmehr die Injektionskorrektur durchgeführt worden ist.
Dieser Unterschied in der Sequenzzuordnung kann deutlicher in den Fig. 7A, 7B und 7C erkannt werden, welche die Ergebnisse des obigen Durchlaufs der Stufen für den Zyklus 51 des 18 Kilodaltonproteins zeigen. In Fig. 7A würde eine vorläufige Zuordnung Lysin für diesen Zyklus ergeben. Wenn die Injektionkorrektur durchgeführt worden ist und hinsichtlich des Hintergrunds korrigiert worden ist, wie dies in Fig. 7B gezeigt ist, ist die Auswahl für den Zyklus 51 nicht so klar, jedoch scheint Histidin zutreffend zu sein. Diese Auswahl wird dann bei der Durchführung der Übertragskorrektur, wie in Fig. 7C zu sehen, bestätigt. Die Einflüsse des Korrekturverfahrens können außerdem im Hinblick auf eine spezielle Aminosäure, wie in Fig. 8A, 8B und 8C gezeigt, dargestellt werden, welche die Ergebnisse des Korrekturverfahrens für Glutaminsäure durch den Zyklus zeigen. Fig. 8A zeigt die Rohdaten (injektionskorrigiert) für Glutaminsäure, dargestellt über die Zyklen. Fig. 8B zeigt die Ergebnisse der Hintergrundkorrektur der Daten der Fig. 8A, und Fig. 8C zeigt die Resultate, nach dem beide Korrekturen (Hintergrund und Verzögerung) durchgeführt worden sind.
Die Fachleute werden bemerken, daß viele gleichwirkende Wege der Realisierung des obigen Verfahrens und unterschiedliche Kombinationen von Vorrichtungen eingesetzt werden können, um das Verfahren auszuführen. Beispielsweise können viele rechnerische Programmelemente separat von dem Computermodul durchgeführt werden, solange, wie die für diese Berechnungen verwendete Vorrichtung unter der richtigen Steuerung des Computermoduls steht. Zusätzlich wird bemerkt, daß die speziellen Programmzähler und Kontanten, die in der bevorzugten Ausführungsform gewählt worden sind, variieren können, beispielsweise in Abhängigkeit von der Zahl der Degradationszyklen, von der gewünschten Genauigkeit der Berechnungen und der gewünschten Zeit, um die Sequenzzuordnung für das Peptid zu vervollständigen.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Sequenz eines Peptides, aufweisend die folgenden Stufen:

zyklisches Abbauen des Peptides, um für jeden Zyklus einen Satz von Aminosäureresten zu bilden;

Ausmessen des Betrages jedes Aminosäurerestes in jedem Satz;

Anpassen eines Hintergrundpegels an jeden Zyklus, um eine Hintergrundanpassung zu erhalten;

Berechnen eines Dispersionswertes für die Hintergrundanpassung im Vergleich zum ausgemessenen Maß für jeden Rest in jedem Satz;

Normalisierung der Messung des Betrages jedes Restwertes in jedem Satz durch Korrigieren des gemessenen Betrages für jeden Rest für den Hintergrundpegel, um einen hintergrundkorrigierten Restwertbetrag zu erhalten und Teilen des hintergrundkorrigierten Restwertbetrages durch den Dispersionswert, um einen normalisierten hintergrundkorrigierten Restbetrag für jede Aminosäure in jedem Zyklus zu erhalten; und

Auffinden des größten normalisierten hintergrundkorrigierten Restbetrages in jedem Zyklus, um eine Sequenz ausgewählter Aminosäuren zu bestimmen, die der Peptidsequenz entspricht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Maß für die Dispersion die Standardabweichung ist.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, gekennzeichnet durch die Stufe des Korrigierens wenigstens einiger der normalisierten, hintergrundkorrigierten Restbeträge hinsichtlich einer Verschiebung in nachfolgende Zyklen, um Verschiebungskorrigierte, hintergrundkorrigierte Restbeträge für jeden Zyklus zu erhalten.

4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe des Messens des Betrages jedes Aminosäurerestes in jedem Satz das Injizieren des aus dem Abbauen resultierenden Satzes der Aminosäurereste in jedem Zyklus in einen chromatografischen Apparat hinein umfaßt, um eine chromatografische Messung des Betrages für jeden Aminosäurerest in jedem Zyklus zu erhalten.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe des Messens des Betrages des Aminosäurerestes in jedem Satz weiterhin das Filtern der chromatografischen Messungen umfaßt, um hinsichtlich der Grundlinie korrigierte Beträge der Aminosäurereste in jedem Zyklus als gemessenen Betrag der Aminosäure in jedem Zyklus zu erhalten.

6. Verfahren nach Anspruch 4, weiterhin gekennzeichnet durch die Stufe des Korrigierens des in jedem Satz gemessenen Betrages jedes Aminosäurerestes hinsichtlich von Unterschieden in der Injektionsmenge zwischen den Zyklen, um injektionskorrigierte Restbeträge für jede Aminosäure in jedem Zyklus zu erhalten, welche der Stufe folgt, in der verchiebungskorrigierte, hintergrundkorrigierte Restwertbeträge für jeden Zyklus erhalten werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, weiter gekennzeichnet durch die Stufe des Korrigierens der injektionskorrigierten Beträge für jeden Rest in jedem Zyklus hinsichtlich des Hintergrundes, um einen hintergrundkorrigierten, injektionskorrigierten Restbetrag für jede Aminosäure in jedem Zyklus zu erhalten.

8. Verfahren nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch das Korrigieren wenigstens einiger der hintergrundkorrigierten, injektionskorrigierten Beträge der Reste in jedem Zyklus hinsichtlich der Verschiebung in nachfolgende Zyklen, um verschiebungskorrigierte, hintergrundkorrigierte, injetionskorrigierte Beträge der Aminosäuren in jedem Zyklus zu erhalten.

9. Verfahren nach Anspruch 8, ferner gekennzeichnet durch die Stufe der Bestimmung der größten verschiebungskorrigierten hintergrundkorrigierten, injektionskorrigierten Aminosäure in jedem Zyklus, um die der Aminosäurensequenz des Peptids zu erhalten.

10. Vorrichtung zur Bestimmung der Sequenz eines Peptides, aufweisend:

eine Abbau- oder Degradationseinrichtung, um das Peptid zyklisch abzubauen, um einen Satz von Aminosäureresten für jeden Zyklus zu bilden;

eine Quantisierungseinrichtung, die an die Degradationseinrichtung angeschlossen ist, um den Betrag jedes Aminosäurerestes in jedem Satz zu messen; und

einen Rechner, der an die Degradations- und die Quantisierungseinrichtung angeschlossen ist, um die Degradations- und die Quantisierungseinrichtung zu steuern, um einen Hintergrundpegel an jeden Zyklus anzupassen, um einen hintergrundkorrigierten Restbetrag für jeden Rest zu erhalten, um ein Maß der Dispersion für die Hintergrundanpassung in bezug auf die Meßwerte der Reste in jedem Satz zu erhalten, um den ausgemessenen Betrag für jeden Rest durch Teilen des hintergrundkorrigierten Restbetrages durch das Maß der Dispersion zu normalisieren, um normalisierte, hintergrundkorrigierte Restbeträge für jeden Zyklus zu erhalten und um den größten normalisierten hintergrundkorrigierten Restbetrag in jedem Zyklus zu identifizieren.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Rechner weiterhin eine Verschiebungseinrichtung aufweist, um wenigstens einige der normalisierten, hintergrundkorrigierten Restbeträge hinsichtlich der Verschiebung in nachfolgenden Zyklen zu korrigieren, um verschiebungskorrigierte, hintergrundkorrigierte Restbeträge für jeden Zyklus zu erhalten.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Quantisierungseinrichtung eine chromatografische Einrichtung und eine Injektionseinrichtung aufweist, um den Satz der Aminosäurereste in jedem Zyklus in die chromatografische Einrichtung zu injizieren.

13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Rechner weiterhin eine Injektionskorrektureinrichtungen zur Korrektur des Betrages jedes in jedem Satz gemessenen Aminosäurerestes im Hinblick auf Unterschiede in der Injektionsmenge zwischen den Zyklen umfaßt, welche auf den verschiebungskorrigierten, hintergrundkorrigierten Restbeträgen basiert, um einen injektionskorrigierten Restbetrag für jede Aminosäure in jedem Zyklus zu erhalten.