DE3854886T2

DE3854886T2 - Immunosensor

Info

Publication number: DE3854886T2
Application number: DE3854886T
Authority: DE
Inventors: Julian Gulbinski Iii; Mark A Malmros
Original assignee: Ohmicron Corp
Current assignee: Strategic Diagnostics Inc
Priority date: 1987-08-19
Filing date: 1988-08-12
Publication date: 1996-05-15
Anticipated expiration: 2008-08-13
Also published as: EP0311768B1; DE3854886D1; EP0311768A2; JPH01145560A; CA1336674C; EP0311768A3; US4916075A

Description

Zur Untersuchung auf geringe Mengen an Analyten in Fluiden, insbesondere Körperflüssigkeiten, sind verschiedene Testverfahren bekannt. Viele dieser Tests hängen von Grundprinzipien von Immunreaktionen ab, nämlich, daß ein Antigen sich an einen Antikörper, der eine spezifische oder allgemeine Affinität für dieses aufweist, bindet. Es ist gut bekannt, solche Antikörper an andere Mittel oder passive Trägerstoffe zu binden, an die bestimmte nachweisbare Mittel gebunden sein können, wodurch es möglich wird, daß leicht nachweisbare Rückmeldungen aufgrund der Anwesenheit von außerordentlich geringen Mengen an dem gesuchten Analyten erhalten werden. Unter derartigen Tests sind Hemagglutinationstests sowie der ELISA-Test gut bekannt.
Die U.S.-A-4 444 892 offenbart einen Sensor zur Durchführung von Immunoassays, der eine Folie eines halbleitenden Polymeren umfaßt, das mit einer Bindungssubstanz verbunden ist, die eine spezifische Affinität für den Analyten besitzt. Das Dokument lehrt, die Leitfähigkeit zu messen, um die quantitative Menge des Analyten zu bestimmen.
Ferner offenbart die EP-A-0 121 385 eine Vorrichtung zur Durchführung von konduktimetrischen Bioassays eines gegebenen Analyten in einer flüssigen Probe. Gemäß der bekannten Methode wird eine poröse Membran, auf der ein spezifischer Bindungspartner immobilisiert wurde, auf einer isolierenden Stütze angebracht, und die resultierende Leitfähigkeitsveränderung wird mittels in der Stütze eingebetteter Elektroden gemessen. Das Dokument lehrt, eine zweite inaktive Membran an der isolierenden Stütze über den Bezugselektroden anzubringen, um die Differenzmessung durchzuführen.
Aus der JP-A-60 09 5343 ist eine Vorrichtung zum Messen der Konzentration von Glukose bekannt. Die bekannte Vorrichtung umfaßt ein erstes und ein zweites Elektrodenpaar, das auf einer Grundplatte vorgesehen ist. An den Bodenenden eines jeden Elektrodenpaars sind zwei getrennte Folien gebildet, die aus halbleitenden hochpolymeren Verbindungen bestehen. Die Glukosekonzentration wird durch deren elektrischen Widerstand gemessen. Die Grundprobleme mit den Tests gemäß dem Stand der Technik sind zweifach. Entweder erfordern sie den Betrieb von vergleichenden Blindtests an getrennten Substratproben und/oder sie erfordern mehrfache Arbeitsgänge, einschließlich das Waschen des Testsubstrats zur Entfernung von nicht-umgesetzten Reagentien und der Reaktionsteilnehmer.
Bislang war es nicht möglich, ein System zur Verfügung zu stellen, bei dem die Reaktionsteilnehmer und Reagentien zusammen in eine einzige Testzelle oder einen einzigen Testbehälter eingefüllt, und qualitative oder quantitative Messungen mit den Substanzen in situ gemacht werden, ohne die Notwendigkeit getrennter Blindproben oder eines Waschens der Zelle vor Vornahme der Messung.
Ein Ziel vorliegender Erfindung ist die Bereitstellung eines Sensors, der das Messen mit hoher Genauigkeit ermöglicht, ohne die Notwendigkeit, den Analyten vom Substrat vor Durchführung der Messung abzuwaschen, sowie ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder der quantitativen Menge eines Analyten bereitzustellen, welches eine Messung mit hoher Genauigkeit ermöglicht.
Gemäß der Erfindung wird das Problem mit dem Merkmalen der Patentansprüche 1, 5 und 10 gelöst.
Es wurde gefunden, daß das Modifizierungsmittel vorzugsweise eher auf das Substrat als auf die umgebende Lösung einwirkt, wenn ein Mittel, das der Veränderung meßbarer und/oder nachweisbarer Eigenschaften eines Substrats fähig ist, an das Substrat gebunden ist, und dieser Aktivierungsmechanismus zum Funktionieren gebracht wird. Dieses Prinzip ist die Grundlage verschiedener Ausführungsformen des im vorliegenden offenbarten und beanspruchten Nachweissystems.
Die Modifizierung der elektrischen Eigenschaften, d.h. des spezifischen Widerstands oder der Leitfähigkeit bestimmter leitender oder halbleitender Polymeren durch deren Dotieren mit bestimmten Dotierungsmitteln ist gut bekannt. So bildet die bevorzugte Ein-führung eines Dotierungsmittels in ein derartiges Polymer mittels einer ein Dotierungsmittel erzeugenden Komponente, die an das Polymer gebunden ist, das Betriebsprinzip einer Ausführungsform gemäß vorliegender Erfindung.
Die in der Hauptausführungsform vorliegender Erfindung benutzten Sensoren umfassen ein Substrat, geeigneterweise eine Folie eines halbleitenden Polymeren, mit einer vorderen und einer rückseitigen Oberfläche. Auf der rückseitigen Oberfläche und in Kontakt damit ist eine gemeinsame elektroleitfähige Fläche und zumindest eine weitere elektroleitfähige Fläche, die in ähnlicher Weise im Kontakt fit der Rückseite steht, vorgesehen. Da die meisten Anwendungen vorliegender Erfindung auf die zumindest qualitative Bestimmung der Anwesenheit eines Analyten oder sogar auf eine quantitative Messung gerichtet ist, wird es bevorzugt, auf der Rückseite eine zweite weitere elektroleitfähige Fläche an unterschiedlicher Stelle vorzusehen. Ferner ist an der Vorderseite der Folie eine Vorrichtung zum Unterteilen der Vorderseite auf einem solchen Weg vorgesehen, daß der Teil der Folie, auf dem sich die erste weitere elektroleitfähige Fläche befindet, und ein Teil der gemeinsamen elektroleitfähigen Fläche auf einer Seite der Trennvorrichtung liegen, und die andere zweite weitere elektroleitfähige Fläche und der restliche Teil auf der anderen Seite liegen. Wie sich aus den folgenden Ausführungen ergibt, braucht diese Trennvorrichtung keine permanente Trennvorrichtung zu sein.
Bei der allgemeinen Betriebsart des Systems wird ein Bindungsmittel für den Analyten direkt oder indirekt an das Substrat gebunden. Ein Fluid, das unter dem Verdacht eines Gehaltes an dem Analyten steht, wird mit dem, das Bindungsmittel tragenden Substrat in Berührung gebracht, und unmittelbar danach wird ein das Substrat modifizierendes Mittel zugegeben, das zumindest eine erste, an einen weiteren Teil eines Bindungsmittels gebundene Komponente umfaßt, die entweder eine Affinität für den Analyten aufweist oder mit dem Analyten bezüglich des Anbindens an das Bindungsmittel auf dem Substrat konkurriert, und das zumindest eine zweite Komponente umfaßt, die mit der ersten Komponente reaktionsfähig ist, um einen Faktor zu erzeugen, der einer Veränderung der modifizierbaren Quantität des Substrats fähig ist. Es ist vorteilhaft, ferner ein Reinigungsmittel (scavenger) für diesen Modifizierungsfaktor vorzusehen.
Es wird bevorzugt, das System der vorliegenden Erfindung in einer Immunoassay-Zelle zu betreiben, welche den zuvor beschriebenen Sensor umfaßt. In dieser Zelle sind elektrische Anschlüsse an die elektroleitfähigen Flächen vorgesehen. Ein Probenbehälter mit seinem oberen und unteren Ende ist mit seinem unteren Ende mit der vorderen Oberfläche der Sensorfolie derart in Berührung gebracht, daß die Berührung zwischen diesem unteren Ende und dieser Folie gegenüber Flüssigkeiten dicht ist, und die offene Fläche groß genug ist, die gesamte vordere Oberfläche, die über den elektroleitfähigen Flächen auf der Rückseite liegt, zu umfassen, oder den größten Teil der vorderen Oberfläche.
Auch ist ein zweiteiliger Kammereinsatz vorgesehen, der so ausgebildet ist, daß er entfernbar in den Behälter paßt. Dieser Einsatz ist mit einem Trennteil oder einer zentralen Scheidewand versehen, welche, wenn sie an Ort und Stelle sind, die Vorrichtung zum Trennen des ersten Feldes von dem zweiten Feld der Vorderseite der Folie bilden. Die zentrale Scheidewand, und der untere Rand des Kammereinsatzes sind so ausgebildet, daß sie die vordere Oberfläche der Folie wiederum leckdicht berühren. Beim Betrieb des Systems wird in eine, als Probenseite bezeichnete Kammer eine Lösung eingefüllt, die ein Bindungsmittel und andere derartige Substanzen erhält, die zur Bindung des Bindungsmittels an das Substrat erforderlich sind. In die andere, als Bezugsseite bezeichnete Kammer wird entweder keine Lösung oder aber eine Lösung eingefüllt, die irgendwelche andere, an die Bezugseite zu bindende Substanzen enthält. Nach Abschluß der Bindungsstufe werden die Lösungen aus der Zelle gegossen. Gewünschtenfalls können die beiden Kammern ausgewaschen werden, was jedoch nicht unbedingt notwendig ist, und der zweiteilige Kammereinsatz wird entfernt.
Sodann werden in den Behälter- oder Probentopf der Analyt und die Lösung, welche das, das Substrat modifizierenden Mittel enthält, eingefüllt. Da die ersten Komponenten des, das Substrat modifizierenden Mittels üblicherweise ziemlich schnell mit der zweiten Komponente reagieren, ist es angezeigt, alle drei Komponenten nacheinander zuzugeben, wobei jedoch die Reihenfolge der Zugabe nicht wichtig ist. Gewünschtenfalls kann auch das Reinigungsmittel für den Modifizierungsfaktor zugegeben werden.
Die erste Komponente reagiert sodann mit der zweiten Komponente, wodurch der Modifizierungsfaktor gebildet wird. Wenn die Umstände des Tests derart sind, daß die erste Komponente an das Substrat gebunden wird, wird der Modifizierungsfaktor vorzugsweise zum Substrat gehen und dessen modifizierbare Eigenschaften verändern. Im Falle eines elektroleitfähigen Polymeren ist dies dessen Leitfähigkeit oder spezifischer Widerstand, die da gemessen werden können. Derjenige Teil des Modifizierungsfaktor, der durch die erste Komponente gebildet wird, der nicht durch das Substrat gebunden ist, wird in Lösung gehen und durch das Reinigungsmittel aufgefangen werden.
Fig. 1 ist eine nach unten gerichtete Draufsicht auf die Vorderseite eines Sensors gemäß vorliegender Erfindung.
Fig. 2 ist ein nach unten gerichtete Draufsicht auf die Vorderseite einer weiteren Ausführungsform eines Sensors gemäß vorliegender Erfindung.
Fig. 3 ist eine Querschnittsansicht im Aufriß und in auseinandergezogener Anordnung einer Elektrodenzelle gemäß der Erfindung.
Fig. 4 ist eine Darstellung der Lösungsphase, des Komplexes und des auf die Oberfläche begrenzten Komplexes der Wechselwirkungen zwischen den Komponenten der das Substrat modifizierenden Mittel, dem Reinigungsmittel, und dem Substrat in einer Ausführungsform der Erfindung.
Fig. 5 (A) bis (E) sind schematische Diagramme, welche die Wirkungsweise des gleichen, in Fig. 4 erläuterten, das Substrat modifizierenden Mittels zeigen, wenn es bei drei verschiedenen Tests angewandt wird, von denen zwei auf zwei Arten (A & B, C & D) erläutert sind.
Fig. 6 ist ein Schaltungs-Blockdiagramm eines Nachweissystems, das bei vorliegender Erfindung Anwendung findet, und
Fig. 7 ist eine Grafik, welche die Rückmeldung des Analyten und den Hintergrund bei einem besonderen Test zeigt.
Wenn auch die Prinzipien vorliegender Erfindung nicht hierauf begrenzt sind, so wird es doch bevorzugt, vorliegende Erfindung durchzuführen, indem man die Veränderungen der Leitfähigkeit oder des spezifischen Widerstands von leitenden oder halbleitenden Polymeren mißt. Unter den Polymeren, welche bei vorliegender Erfindung verwendet werden können, können ein Polyacetylen, Polypyrrol, Polyparaphenylen, Polythiophen und Polysulfon genannt werden. Ohne daß dies eine Begrenzung bedeuten soll, ist Polyacetylen besonders bevorzugt.
Die Polymeren können Folien oder verdichtete Pulverzusammensetzungen sein. Sie können als einzige Komponente, als leitende oder halbleitende Stoffgemische innerhalb der Klasse oder als Zusammensetzungen oder Blends mit nicht-leitenden Polymeren, wie z.B. Polyethyien oder Polystyrol, verwendet werden. Als brauchbar erwiesen sich Blends, bei denen das Polyacetylen in oder auf einem nicht-leitenden Substrat gebildet ist.
Diese Substrate können von Beginn an dotiert oder undotiert sein. Es wird bevorzugt, sie in der dotierten Form zu benutzen. Dotierungsmittel, welche Anwendung finden können, umfassen: insbesondere wenn Polyacetylen verwendet wird, ist Jod eines der bevorzugten Dotierungsmittel.
Die bei vorliegender Erfindung benutzten Sensoren, die geeigneterweise Polyacetylen enthalten, können gemäß den Verfahren vorzugsweise in der U.S.-P.S. 4 394 304 dargelegt sind. Das Dotierungsmittel wird eingeführt, um einen nominalen Widerstand von zwischen 0,001 und 100 Megaohm, vorzugsweise zwischen 0,1 und 10 Megaohm, am meisten geeignet, etwa 1 Megaohm, pro Zentimeter zu liefern. Das Dotieren wird ausgeführt, indem man die erforderliche Menge Jod in einem nicht-polaren organischen Lösungsmittel niedrigen Molekulargewichts, geeigneterweise einem niederen Alkan, wie z.B. Hexan, auflöst, die Folie darin zwischen 4 und 16 Stunden eintaucht, die Folie mit Lösungsmittel spült und unter vermindertem Druck trocknet. Um die elektroleitfähigen Flächen an der Rückseite der Folie bereitzustellen, wird durch Aufsprühen oder durch Siebdrucken durch eine Maske eines elektroleitfähigen Materials, geeigneterweise kolloidaler Grafitfarbe, ein dicker Film von Hybridelektrodenstruktur aufgebracht.
Bei einer Ausführungsform vorliegender Erfindung, wie veranschaulicht in Fig. 1, ist eine Scheibe 10 aus elektroleitfähigem Material, geeigneterweise aus einem Polyacetylenblend, das in geeigneter Weise mit einer zuvor festgelegten Menge an Jod dotiert ist, vorgesehen. Auf der Rückseite der Scheibe sind drei, zuvor festgelegte elektroleitfähige Flächen 11, 12 und 14 vorgesehen. Es wird bevorzugt, jedoch ist dies nicht kritisch, daß die Fläche 11 am Durchmesser liegt, geeigneterweise nahe bei, jedoch nicht an dem Außenumfang der Scheibe. Die Flächen 16 und 18 sind so vorgesehen, daß zumindest ein Teil beider Flächen über der elektroleitfähigen Fläche 11 liegt, und geeigneterweise die gesamte elektroleitfähige Fläche 14 unter dem Segment 16, und die elektroleitfähige Fläche 12 unter dem Segment 18 liegen. Es wird bevorzugt, ist jedoch nicht wesentlich, daß die elektroleitfähigen Flächen 12 und 14 auf einander gegenüberliegenden Seiten eines Durchmessers liegen, der durch die Fläche 11 verläuft, und daß die Flächen 12 und 14 sich im wesentlichen im gleichen Abstand von der Fläche 11 befinden.
Bei einer Modifizierung der in Fig. 2 gezeigten Vorrichtung ist wiederum eine Scheibe 101 vorgesehen. Abermals sind die elektroleitfähigen Flächen auf der Rückseite der Scheibe vorgesehen. Eine leitfähige Zentralfläche 111 ist entlang des gesamten Durchmessers BB vorgesehen, mit Rändern auf beiden Seiten des Durchmessers BB, und im Abstand von diesem. Die beiden anderen elektroleitfähigen Flächen 112 und 114 sind in dem Raum zwischen den Sehnen 113 und 115, in geeigneter, jedoch nicht kritischer Weise im gleichen Abstand von der Achse BB und parallel hierzu, und dem Umfang der Scheibe vorgesehen. Auf diese Weise sind zwei unbeschichtete Flächen auf der Vorderseite, 115 und 118, bereitgestellt, die zwischen der gemeinsamen Elektrode und den elektroleitfähigen Außenflächen liegen.
Fig. 3 veranschaulicht einen Sensor von Fig. 1 oder Fig. 2 in seiner Betriebsumgebung, d.h. einer Immunoassay-Sensorzelle. In dieser Zelle ist eine Grundbestückung 40 mit Kontrakten 41, 42 und 33, die darin angebracht sind, vorgesehen, wobei die oberen Enden dieser Kontakte mit den elektroleitfähigen Flächen auf der Rückseite der Sensorscheibe elektrisch kontaktierbar sind, und die anderen Enden derselben geeigneterweise als Elektrodenstifte ausgebildet sind, welche in eine Sockelhaltevorrichtung 60 einfügbar sind. Es ist ein Probentopf 30 vorgesehen, der einen Behälter 36 darin und ein unteres Ende 34 aufweist, das so ausgebildet ist, daß es die vordere Oberfläche des Sensors berührt und mit dieser eine flüssigkeitsdichte Dichtung bildet. Die Öffnung im unteren Ende 34 ist von ausreichender Größe, daß sie zumindest einen Teil, geeigneterweise einen Hauptteil der vorderen Oberfläche über den elektroleitfähigen Vorrichtungen auf der Rückseite der Scheibe umfaßt. Geeigneterweise ist auf der Außenseite des unteren Teils des Probentopfs 30 ein Schraubengewinde 33 vorgesehen, das so dimensioniert ist, daß es inein ähnliches Schraubengewinde an der Sockelhalteeinheit 60 paßt, so daß, wenn die Grundbestückung 40 in die Sockelhalteeinheit 60 eingefügt ist, der Sensor 1 (oder 101) auf der Bestückung 40 angeordnet ist, und der Probentopf 30 auf dem Sensor liegt und in die sockelhalteeinheit 60 eingeschraubt ist, die zuvor genannte flüssigkeitsdichte Dichtung sowie die elektrischen Kontakte gewährleistet sind.
Ferner ist eine Einsatzdoppelkammer 50 mit Leitwänden 53 an derInnenfläche der Kammer und einer zentralen Scheidewand 52, die entlang eines Innendurchmessers derselben vorgesehen ist, vorgesehen. Der Bodenrand 54 der Kammer 50 ist so ausgebildet, daß er die obere Oberfläche des Sensors 1 (oder 101) aufleckdichte Weise berührt.
Ferner ist die zentrale Scheidewand 52 von ausreichender Länge und weist einen unteren Rand auf, der, wenn der Doppelkammereinsatz in den Probentopf eingeführt, und eine Flüssigkeit auf eine Seite der Scheidewand gebracht sind, die Flüssigkeit nicht zur anderen Seite der Scheidewand durch die Oberfläche des Sensors austritt. Beim Betrieb des ersten Abschnitts der Vorrichtung wird die zentrale Scheidewand so ausgerichtet, daß sie an den Durchmessern AA oder BB am Sensor anliegt. Beim Betrieb der Zelle werden die wirksam werdenden Flächen, d.h. die Flächen 18, 118, 16 und 116 so behandelt, daß sie unterschiedliche Immunreaktionen liefern. So wird eine Fläche, geeigneterweise 16, 116, als Probenfläche festgelegt. Bei der Vorbereitung dieses Abschnitts der Vorrichtung wird ein gegenüber dem Analyten spezifisches Bindungsmittel in den Teil der Doppeleinsatzkammer gegossen, der über der Fläche 16, 116 liegt. Üblicherweise ist es nicht notwendig, die Oberfläche des Sensors zuvor vorzubereiten. Eine ausreichende Bindung an die Oberfläche des Sensors tritt durch bloßes Berühren der vorderen Oberfläche des Sensors mit einer wässerigen Lösung des Bindungsmittels ein.
Nach einer geeeigneten Berührungszeit wird das Bindungsmittel aus der Doppeleinsatzkammer ausgegossen, das behandelte Segment wird geeigneterweise mit Wasser gewaschen, und die Doppeleinsatzkammer wird entfernt. Die Zelle ist sodann zur Verwendung gemäß einer der analytischen Gestaltungen und einem der Protokolle, die in Fig. 5 dargelegt sind und nachfolgend im Detail erörtert werden, bereit. Dem Fachmann ist klar, daß diese Gestaltungen und Protokolle lediglich die gebräuchlichsten Arten der Ausführung einer derartigen Analyse sind.
Es wurde zweckmäßig gefunden, als das Substrat modifizierendes Mittel eine erste Komponente zu verwenden, welche die Kombination von Lactoperoxidase (LPO) mit Glucoseoxidase (GOX) umfaßt. In Anwesenheit einer wässerigen Lösung von Glucose (GLU) erzeugt Glucoseoxidase Wasserstoffperoxid, welches seinerseits bewirkt, daß Lactoseperoxidase das Iodonium- oder I³-Ion erzeugt. Dieses Ion ist fähig, die Leitfähigkeit von polymeren Substraten wesentlich zu verändern.
Um den Betrieb der Vorrichtung und die damit verbundenen analytischen Systeme zu veranschaulichen, wird das System LPO/GOS/GLU erörtert. Durch eine derartige Erörterung soll die Erfindung jedoch hierauf nicht begrenzt werden. Es können auch andere Systeme verwendet werden, von denen einige im vorliegenden erwähnt werden, und andere für den Fachmann auf der Hand liegen.
Dessenungeachtet wurde gefunden, daß das System LPO/GOX/GLU eine breite Anwendbarkeit als ein, einen Modifizierungsfaktor erzeugendes System besitzt und so als solches bei den verschiedensten Tests und Testprotokollen brauchbar ist.
Bei der in Fig. 5a veranschaulichten Modifikation, bekannt als der Sandwichtest, wird das zuvor festgelegte Bindungsmittel (beispielsweise Biotin), an die Probenoberfläche 16, 116 des Sensors gebunden. Ein weiterer Teil Bindungsmittel (B) wird an die Kombination LPO-BOS, (in der Zeichnung als KOMPLEX gezeigt) gebunden. Die Reaktionskomponenten, d.h. die den Analyten enthaltende Probe, eine Lösung von B-LPO-BOX; GLU, und ein Reinigungsmittel für I³&supmin;, d.h. Rinderserumalbumin (BSA), werden in den Probebehälter 36 eingefüllt. Die Reihenfolge der Einfüllung ist nicht wichtig. Zum Zweck dieser Erörterung wird angenommen, daß der Analyt selbst mehr als eine Bindungsstelle aufweist und fähig ist, an das Bindungsmittel B zu binden. So wird, wenn das Bindungsmittel B Biotin, und der Analyt Avidin sind, wie in dem oberen (Proben-)Segmentvon Fig. 5a veranschaulicht, Biotin sowohl an das Substrat als auch an das LPO (indem KOMPLEX) gebunden. Avidin reagiert so mit dem an das Substrat gebundenen Biotin und dem an LPO gebundenen Biotin. Die mit GOX reagierende GLU erzeugt Peroxid, welches seinerseits verursacht, daß LPO I³&supmin; erzeugt, das infolge der Bindung an das Substrat durch den Analyten vorzugsweise veranlaßt wird, von dem Substrat selbst absorbiert zu werden. Unnötig zu sagen, daß nicht das gesamte I³&supmin; derart absorbiert wird, Das nicht-absorbierte I&supmin;³ setzt sich mit dem Reinigungsmittel um und wird außer Funktion gesetzt.
Im Gegensatz hierzu ggibt es auf der Bezugseite der Zelle 18 (118) kein an die Oberfläche gebundenes Biotin. So bleibt das durch LPO erzeugte I³&supmin; in Lösung, wo es durch BSA abgefangen wird und die Leitfähigkeit des Substrats des Bezugssegments nicht beeinträchtigt.
Es wurde gefunden, daß die zuvor erörterte Modifizierungswirkung durch eine (nicht dargestellte) zusätzliche Absorption einer bestimmten Menge an LPO aus dem funktioniernden Substrat selbst verstärkt werden kann. So wirkt, wenn GOX das Peroxid erzeugt, es auf die LPO ein und erhöht die Ablesung der Basislinie. Unnötig zu sagen, daß die LPO an die Probe 16, 116 und die Bezugsflächen 18, 118 gebunden werden muß.
Eine weitere Modifikation dieser Vorgehensweise wird in dem umgekehrten Sandwich, der in Fig. 5b dargestellt ist, gefunden. Bei dieser Modifikation ist LPO sowohl an die Bezugs- als auch die Arbeitsoberfläche gebunden, jedoch ist das Bindungsmittel B zusätzlich an die LPO an der Arbeitsoberfläche gebunden. Der Betrieb der Vorrichtung ist demjenigen der Sandwichvorrichtung ähnlich. Im Test wird der Analyt sowohl an das Bindungsmittel an der oberflächengebundenen LPO als auch an das Bindungsmittel an der "schwimmenden" LPO-GOX in Lösung gebunden. So führt wieder das I&supmin;³, welches durch Einwirkung des Peroxids auf die LPO gebildet wird, zu höheren Graden auf der Probenseite, wo die Kombination B-LPO-GOX durch den Analyten an die LPO-bindende Mittelkombination auf dem Substrat gebunden ist, als auf der Bezugsseite, wo lediglich LPO an das Substrat gebunden ist.
Fig. 5c zeigt eine Ausführungsform der sogenannten Wettbewerbsmethode, welche hier durch ein Verfahren veranschaulicht wird, das zum Testen der Anwesenheit des Arzneimittels Secobarbital (SECO) angewandt wird. Bei dieser Ausführungsform werden ein gegenüber SECO spezifischer Antikörper an die Probensubstratfläche 16, 116, und ein unspezifischer Antikörper an die Bezugssubstratfläche 18, 118 gebunden. Der Bezugszelle 36 werden nacheinander eine Lösung, die unter dem Verdacht steht, den Analyten SECO zu enthalten, sowie Lösungen mit einem Gehalt an SECO, gebunden an GOX-LPO, zugefügt. Beim Betrieb der Vorrichtung stehen sowohl der Analyt SECO als auch LPO-BOX-SECO im Wettstreit bei der Reaktion mit dem gegenüber SECO spezifischen Antikörper. Andererseits reagiert das unspezifische Antigen auf der Bezugsseite in der Regel nicht mit irgend etwas. So ist aus den allgemeinen, in Fig. 5a und 5b gezeigten Bindungsreaktionen zu ersehen, daß das Ausmaß der Veränderung auf der Probenseite proportionel zu einer ansteigenden Menge des Analysten vermindert wird. Wiederum kann, falls erwünscht, das Basissignal verstärkt werden, indem man auf der Probenseite LPO, gebunden an spezifisches Anti-SECO-Antigen, und auf der Bezugsseite LPO, gebunden an das unspezifische Antigen, einbringt.
Eine andere Modifikation des homogenen Wettbewerbstests kann auf folgende, in Fig. 5d dargestellte Weise betrieben werden.
Auf der Probenseite 16, 116 wird wie zuvor ein spezifisches Anti-SECO-Antigen eingebracht. Auf der Bezugsseite wird ein allgemeines Bindungsmittel, wie z.B. Avidin, eingebracht. Mit der den Analyten enthaltenden Probe wird ein gleiches Gemisch von SECO- GOX-LPO und Biotin-BOX-LPO eingespeist. So bindet sich, wenn kein SECO vorliegt, SECO-GOX-LPO an Anti-SECO, und Biotin-GOX-LPO bindet sich an das Avidin, was zur Ablesung Null führt. Andererseits wird die Veränderung auf der Arbeitsseite vermindert werden, wenn SECO voriiegt und mit SECO-GOX-LPO hinsichtlich des Anti-SECO- Mittels Lm Wettstreit steht.
Wiederum kann die Signalhöhe verstärkt werden, indem man auf die Probenseite LPO, gebunden an spezifisches Anti-SECO, und auf der Bezugsseite LPO, gebunden an Avidin, einbringt.
Eine weitere Ausführungsform ist der sogenannte homogene Sandwich, der in Fig. 5e veranschaulicht ist. Dieser Test kann zum Nachweis von Analyten angewandt werden, welche zumindest zwei unterschiedliche und spezifisch identifizierbare Bindungsstellen aufweisen. Er kann zum Nachweis von Peptid enthaltenden Stoffen, wie Proteine benutzt werden. Bei dieser Vorgehensweise kann geeigneterweise Salmonella (S)-Toxin abgesondert und überwacht werden. Dies hängt von der Benutzung von zwei unterschiedlichen, jedoch spezifischen Antikörperstellen S¹ und S² am Analyten ab. So wird die Probenoberfläche 16, 116 mit 100-Anti-S¹-Antikörpern beschichtet, und der Anti-S²-Antikörper wird an die GOX-LPO gebunden. Auf ähnliche Weise wird die Bezugsseite 18, 118 mit LPO, gebunden an einen unspezifischen Antiprotein-Antikörper, versehen. Anti-S²-GOX-LPO und die Lösung, welche unter dem Verdacht steht Analyten zu enthalten, werden sodann der Zelle zugeführt (zusammen mit Glukose und dem Reinigungsmittel). Wenn der Analyt tatsächlich S enthält, dann bindet sich S an Anti-S¹, und Anti-S² bindet sich an S auf der Probenseite; auf diese Weise wird das System, welches dem GOX-LPO-modifizierenden Faktor erzeugt, an die Probenseite gebunden, wodurch die Leitfähigkeit auf dieser Seite verändert wird. Da für das Anti-S² nichts vorhanden ist, um sich an die Bezugsseite zu binden, tritt keine Veränderung auf der Bezugsseite auf.
Wiederum kann sich in ähnlicher Weise der Anti-S¹-Antikörper selbst an die Arbeitsseite binden, und ein unspezifisches Antigen an die Bezugsseite.

Beispiel 1

Herstellung von Polyacetylenfolien

a) Lösungsmittelblend-Kraton
Das Blend Polyacetylen/Kraton wird durch Polymerisation von Acetylengas unter Verwendung eines heterogenen Ziegler-Natt-Katalysators hergestellt. Die Katalysatorlösung wird als 4-Komponentensystem hergestellt, umfassend zwei aktive Komponenten, eine inerte Komponente und ein Lösungsmittel. Die Lösung wird in einem Handschuhkasten mit einer kontrollierten Atmosphäre (Stickstoff) hergestellt, um die aktiven Komponenten Triethylaluminium Al(C&sub2;H&sub5;)&sub3; (Ethyl Corporation) und Titantetrabutoxid (Ti(n-OBu)&sub4; (Alfa Products), vermischt im Molverhältnis von 4X1 auf eine Nominalkonzentration von 200 mm bezüglich Aluminium, zu umfassen. Die dritte Komponente ist das Triblockpolymer Polyetylen-Isoprinen-Polystyrol (Kraton, hergestellt durch Shell Chemical), welches zuvor in dem Lösungsmittel auf 10 Gew.% gelöst wurde. Die vierte Komponente oder das benutzte Lösungsmittel ist wasserfreies destilliertes Toluol.
Zur Herstellung eines Blatts aus Polyacetylenblendfolie werden annähernd 20 ml der Katalysatorlösung in eine Kulturschale (Reaktionskammer) eines Durchmessers von 110 mm und einer Höhe von 50 mm gegossen, und die Schale wird zwischen zwei 5" quadratische Platten von 9,53 mm (3/8") dicken Tafeln aus der Glasfaserverstärkten Epoxyzusammensetzung G10 geklemmt. Die obere Tafel ist mit einem Dichtungsring aus Kautschuk versehen, der im Eingriff mit dem Schalenrand steht, wodurch eine vakuumdichte Dichtung geschaffen wird. Diese obere Tafel ist auch mit Gaseinlaß- und Gasauslaßöffnungen, einem Druckmesser und einem Thermistor versehen. Die untere Tafel ist mit einer Peltier-Stufe versehen, durch die die Schale und deren Inhalt gekühlt werden.
Standardacetylen zum Schweißen wird zuerst durch Durchperlenlassen des Gases durch destilliertes Wasser oder konzentrierte Schwefelsäure zur Entfernung von Spuren von Aceton gereinigt, und sodann getrocknet, indem man das Gas über eine Säule mit wasserfreiem Calciumchlorid, wasserfreiem Calciumsulfat (Drierite) oder Phosphorpentoxid und sodann 2A-Molekularsiebe führt. Das gereinigte Gas wird sodann in die zuvor evakuierte Reaktionskammer über die Einlaßöffnung unter Drucken eingeführt, welche während der Synthese von wenigen cmHg bis zu 86 cmHg variieren.
Innerhalb weniger Sekunden nach Gaseintritt beginnt auf der ruhenden Katalysatorlösung eine kohäsive Folie aus Polyacetylenblend zu wachsen. Das Folienwachstum kann durch vernünftige Auswahl von Zeit, Temperatur und Gasdruck gesteuert werden.
Die erhaltene Folie ist leicht von der Katalysatoroberfläche entfernbar; sie wird wiederholt in wasserfreiem, destilliertem Toluol gewaschen, bis das Lösungsmittel von dem rückständigen tiefbraunen Katalysator frei ist. Die auf diese Weise hergestellten Polyacetylenblendfolien haben ein glänzendes Aussehen, sind flexibel und mechanisch widerstandsfähig. Das Material ist ein Blend von Polyacetylen und Kraton mit Foliendicken, die von 0,05-0,5 mm varrieren, je nach den angewandten Bedingungen von Zeit, Temperatur, Gasdruck und Katalysatorzusammensetzung.
b) Imprägnierung-Polyetylen
Eine 0,3 mm dicke, im Handel erhältliche Folie aus Polyetylen niederer Dichte (LDPE) wurde 24 Stunden in trockenem Toluol eingeweicht, um Additive zu entfernen, und in eine frisch zubereitete Lösung, die trockenes Toluol (60 ml), Ti(OBu)&sub4; (3,75 ml) und Et&sub3;Al (6m1) in einem Schlenk-Rohr enthielt, unter Argon eingetaucht. Zur Imprägnierung der Folie mit dem Katalysator wurde das Rohr auf etwa 70ºC unter einem langsamen Argonstrom etwa 1,5 Stunden erwärmt. Nach Abhkühlen auf Raumtemperatur wurde die Katalysatorlösung mit einer Spritze abgezogen, und die orangebraune LDPE-Folie wurde mit frischem Toluol gewaschen, um Katalysatorrückstände an der Oberfläche zu entfernen. Das Schlenk-Rohr wurde sodann mit einer Hochvakuumleitung verbunden, und das Toluol wurde abgepumpt. Sodann wurde die Folie mit Acetylengas (Anfangsdruck etwa 93,3 kPa oder 700 Torr) während verschiedenen Zeiträumen in Berührung gebracht. Die Polymerisationen wurden bei Temperaturen zwischen -78º und 110ºC durchgeführt. Die Hochtemperaturpolymerisation wurde bevorzugt, weil die Polymerisationsgeschwindigkeit ohne ein übermäßiges Schmelzen der Matrix maximiert wird. Während der Hochtemperaturpolymersationen schlug die Farbe der mit dem orangebraunen Katalysator imprägnierten LDPE-Folie von Blau nach Schwarz um, wenn das Acetylen in die Folie diffundiert und an den Katalysatorstellen polymerisiert. Proben mit einem Gehalt von mehr als etwa 5 Gew.% (CH)x hatten einen mattgoldenen Glanz. Die Menge an (CHx) in den Blends wurde durch Elementaranalyse der erhaltenen Stoffe bestimmt, welche typischerweise etwa 0,5 Gew.% bzw. 0,20 Gew.% an Ti bzw. Al enthalten. Die Ergebnisse von beiden Methoden standen in der Regel in guter Übereinstimmung.
c) Lösungsmittelblend - Polystyrol
Ein ähnliches Verfahren, jedoch mit Modifizierung, wurde zur Herstellung von Blendspolystyrol (CH)x angewandt. Da Polystyrol in der zuvor beschriebenen Katalysatorlösung löslich war, wurden imprägnierte Folien durch Abdampfen des Lösungsmittels hergestellt. Nach dem Acetylenaussetzen wurden schwarze Polystyrol/- (CH)x-Blends erhalten. Das Joddampfaussetzen führte zu Blends, welche im Bereich von etwa 10-¹&sup0; bis ungefähr 10¹ &supmin;¹cm&supmin;¹ leitend waren. Je nach Zusammensetzung der Blends erweichten sie oberhalb 100ºC.

Beispiel II

Dotieren von Polyacetylenfolien

a) Foliendotieren
Eine Polyacetylenfolie (hergestellt wie in Beispiel 1, a, b oder c) mit einem Durchmesser von 10 cm und einer Dicke von 0,5 mm wurde auf einen Nominalwiderstand von 1 Megaohm/cm unter Verwendung von 50 mg Jod, aufgelöst in 100 ml Hexan, dotiert, indem man die Folie in dieses Bad über Nacht eintauchte, wonach mit Hexan gespült und sodann unter Vakuum getrocknet wurde.
b) Kontaktherstellung
Ein dickes Folienhybridelektrodenmuster wird auf eine Seite der Polyacetylenfolie durch Aufsprühen durch eine Maske einer kolloidalen Graphitfarbe, aufgebracht die im Handel unter der Bezeichnung Elektrodag 114 oder als Äquivalent erhältlich ist (Acheson Colloids, Lake Huron, MI). Das Muster wird so angeordnet, daß drei oder mehrere "Elektrodenbereiche" durch die dicke Folienhybridgraphitfarbe definiert sind, indem man zwei oder mehrere Bereiche in Betracht zieht, denen entlang der Widerstand der halbleitenden Polyacetylenfolie gleichzeitig gemessen werden kann.
c) Widerstandsbestimmung
Der Oberflächenwiderstand wird mit einen Keithley-DMM-Digitalmultimeter, Modell 197, (Keithley Instruments, 28775 Aurora Road, Cleveland Ohio 44139) unter Verwendung der Ohmmeter-Einstellung und einer Zweipunkteprobehaltevorrichtung bestimmt. Die Widerstandsmessungen mit vorgenanntem Instrument erfolgten bei konstantem Strom mit einer Maximalspannung entlang der unbekannten von 4,0 Volt.

Beispiel III

Polyacetylen-Elektrodenzelle

Die mit Jod dotierte Polyacetylenblendfolie wird in Scheiben eines Durchmessers von 9 mm gestanzt, und auf der Rückseite werden gemäß dem Verfahren des Beispiels IIb Elektroden vorgesehen. Die Elektroden befinden sich in Form eines gleichschenkligen Dreiecks im Abstand voneinander (für zwei Elektrodenpaare mit drei unterschiedlichen Elektrodenbereichen und mit einem gemeinsamen Elektrodenbereich) und sie sind ausgefluchtet, um mit Stiften aus Inconel mit einem Durchmesser von 2,2 mm in Berührung zu kommen, die sich im unteren Teil der Delrinvorrichtung im gleichen Abstand voneinander befinden.
Um elektrische Messungen der Polyacetylenblendfolie vorzunehmen, während sie in Berührung mit verschiedenen wässerigen Lösungen steht, wird eine speziell ausgebildete und hergestellte Elektrodenzelle benutzt (Fig. 3). Die Zellen sind aus Delrin hergestellt und umfassen eine Gewindemutter, um die Elektroden am Boden der Folie (ausgefluchtet mit den betreffenden Elektrodenmustern aus kolloidalem Graphit) von der Flüssigkeit in dem Probentopf weg zu befestigen. Der Probentopf kann bis zu 500 ul Lösung aufnehmen.

Beispiel IV

Instrumentierung (Fig. 6)

Einfache Widerstandsmessungen von trockenen Proben in der Elektrodenzelle angebrachter Polyacetylenfolien werden mit der Ohmmeter-Einstellung auf dem Instrument Keithley 197 DMM vorgenommen. Wenn eine wässerige Elektrolytlösung, wie z.B. ein typischer biologischer Puffer (beispielsweise eine mit Natriumsulfat gepufferte Kochsalzlösung) zum Probentopf oberhalb der Polyacetylenfolie zugegeben wird, werden die Widerstandsmessungen durch einen kapazitiven Ladungstrennungseffekt kompliziert. Um genaue, übereinstimmende Widerstandsmessungen der hydratisierten Polyacetylenfolien zu erhalten, werden ein impulsgesteuerter Abtast-Haiteglied-Verstärker und sodann ein Operationsverstärker, ausgebildet als Strom-in-Spannung-Wandler, verwendet. Nominell wird ein Potential von 500 mV entlang der Elektroden unter Anwendung eines Impulses "genauer Periode" von 100 us oder 0,1 mS mit einer Wiederholungsrate von 10 mS bei einer Pflichtperiode (duty cycle) von 1% impulsbetätigt. Am Ende des Impulses von 100 us wird der Strom so abgetastet. Die Ausgangsleistung aus dem gefilterten (niedere Durchgangsfilterzeit-Konstante von 100 Millisekunden) Abtast-Halteglied-Verstärker wird in einen IBM- PC-XT unter Verwendung eines Datenumsetzung-A/D D/A-Interface Boards DT 2805 eingelesen. Sämtliche Datensammlungen, Analysen und Aufzeichnungen werden unter Verwendung einer ASYST Scientific Data Acquisition and Analysis Software (Macmillan Software) in Gang gehalten. Jedes Elektrodenpaar auf einer einzelnen Probe der Polyacetylenfolie wird mit einem getrennten Abtast-Halteglied- Verstärker verbunden, was zu einer Vorrichtung zum Messen von Leitfähigkeitsveränderungen zwischen jedem Elektrodenpaar entlang des entsprechenden Bereichs der leitenden Polymerfolie führt, oder zur Differentialmessung derartiger Veränderungen, wo eine, beiden Elektrodenpaarungen gemeinsame Veränderung ausgenullt wird, was ermöglicht, daß lediglich Veränderungen, die für einen Elektrodenpaarbereich eindeutig sind, aufgezeichnet werden.

Beispiel IV

Nach dem von Terynck und Averamean, Immunochemistry 14, 767-774 (1977) beschriebenen Grundverfahren wird unter Verwendung von p-Benzochinon ein bimolekularer Komplex der Enzyme Glucoseoxidase und Lactoperoxidase hergestellt.
Glucoseoxidase (GOOS, Sigma, Typ VII) wird in 0,15 M NaCl auf eine Konzentration von 10 mg/ml aufgelöst und über Nacht bei 4ºC gegen 0,15 M NaCl dialysiert. 4 mg der GOX-Lösung in 0,4 ml werden durch Zugabe von 0,05 ml einer 1m Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,0 auf den pH-Wert 6,0 gebracht. Es werden 0,1 ml einer frisch hergestellten p-Benzochinonlösung in Ethanol (30 mg/ml) zugegeben, danach vermischt und die Lösung eine Stunde bei Raumtemperatur (weniger als 22ºC) im Dunkeln gehalten wird.
Die Probe wird durch eine Sephadex G-25 Feinsäule (0,9 x 4 cm; ein Glaszylinder einer 5 ml INjektionsspritze zum einmaligen Gebrauch ist ideal), filtriert und mit 0,15M NaCl ins Gleichgewicht gebracht. Die erste, in etwa 1 ml Volumen eluierte, gefärbte Fraktion wird aufgefangen. 2 mg Lactoperoxidase (Sigma) in 100 ul der zuvor über Nacht gegen 0,15M NaCL dialysierten Lösung werden zugegeben, in der Regel bis zu annähernd 4 mg GOX. Ein Zehntel Volumen einer frisch zubereiteten 1M NaHCO&sub3;-Lösung wird sodann zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird 48 Stunden bei 4ºC gehalten. Ein Volumen einer 1M Lysinlösung in PBS wird zugegeben, und nach 4 Stunden bei 4ºC wird die Lösung über Nacht gegen PBS dialysiert. Die Lösung wird bei 7.000 G zentrifugiert und bei 4ºC gelagert.

Beispiel V

Sandwich-Test für "Avidin" (Fig. 5a)

Die Delrin-CPF-Zelle wird mit der Zweikanal-Abtast- und Haltegliedverstärker verbunden und bezüglich des Ausgangs verstärkt, von dem sie mit einem Arbeitsplatz-Rechner zur Datenerfassung und nachfolgenden Analyse verbunden ist. Die Zelle wird mit einem Volumen (typischerweise 200 ul) PBS, pH-Wert 6,2, mit 0,02M KI und 5 g/100 ml Glucose ins Gleichgwicht gebracht. Die den Analyten, in diesem Beispiel Avidin (ng/ml) in 100 nl enthaltende Probe wird zuerst zur Zelle zugegeben, unmittelbar gefolgt von 100 ml des biotinylierten Enzymkomplexes (B-GOX-LPO) (mg/ml) in einem 1% BSA/PBS-Puffer mit 1% Glucose.

Beispiel VI

"Umgekehrter" Sandwich-Enzymimmunoassay (Fig. 5b)

In der Delrin-Elektrodenzelle angebrachte Folien aus ioddotierter Polyacetylenzusammensetzung (CPF) werden durch direkte Adsorption mit biotinylierter Lactoperoxidase (Sigma) über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet, wobei 1 ug/ml in PBS vom PBS vom pH-Wert 7,2 verwendet wird, wonach man zumindest dreimal mit PBS wäscht. Unter Verwendung eines Einsatzes, der die Delrin-Elektrodenzelle in zwei Kammern über den Elektrodenpaarbereichen auf den CPF teilt, wird eine Seite mit der biotinylierten LPO (Probeseite) beschichtet, während die Bezugsseite mit nicht-derivatisierter LPO beschichtet wird. Nach dem Waschen wird der Einsatz entfernt. Zur unterschiedlichen Beschichtung eines spzeiellen Bindungsmakromoleküls auf dem Element CPF können andere Verfahren angewandt werden.

Beispiel VII

Homogener Wettbewerbtest für Secobarbitol (Fig. 5d)

Wie in Beispiel V wird ein CPF-Element in der Delrin-Zelle angebracht, in der ein geteilter Topfeinsatz (50) sorgfältig befestigt wird. Die Folie ist auf einer Seite der Zelle (Probenseite) mit einer Konzentration (typischerweise 500 ng Gesamtprotein in 500 Mikroliter PBS vom pH-Wert 7,2) eines Antisecobarbital-Antikörpers beschichtet, der nach dem in Beispiel VI beschriebenen Verfahren an das Enzym-Lactoperoxidase konjugiert ist. Eine vergleichbare Menge an Lactoperoxidase (unkonjugiert) wird in gleicher Weise auf die Bezugsseite der Zelle aufgebracht. Beide Seiten werden 3-16 Stunden beschichtet, der Einsatz wird entfernt, und überschüsiges, ungebundenes Protein wird dreimal mit PBS vom ph-Wert 7,2 ausgewaschen.
Der so hergestellte CPF-Sensor wird mit dem Zweikanal-Abtast- und Haltegliedverstärker verbunden, wie zuvor beschrieben. Eine typische Probe (Urin, das unter dem Verdacht steht, Secobarbital in einer Konzentration von mehr als 50 mg/ml zu enthalten) eines Volumens von 100 ul wird zugegeben, wobei unmittelbar danach 100 ul Lösung mit einem Gehalt an einer geeigneten titrierten Konzentration an Secobarbital-Glukose, in Beispiel IV beschrieben, zugefügt werden.
Danach werden weitere 100 ul 1% Glucose in einem BSA-PBS-KI-Puffer vom pH-Wert 7,2 zur Zelle zugegeben, um die kinetische Enzymrückmeldung einzuleiten.

Beispiel VIII

Homogener Wettbewerbstest für Secobarbitol (Fig. 5d)

Eine Vorausführungsforin des in Beispiel VII beschriebenen Tests kann gemacht werden, indem man die Bezugsseite der Zelle mit einem Konjugat von Lactoperoxidase und Avidin, zusammen mit dem LPO-Anti-Secobarbital-Konjugat auf der Probenseite beschichtet. In diesem Beispiel wird das Secobarbital-Komplex-Konjugat mit einer titrierten Konzentration eines Biotin-Komplex-Konjugats vermischt, so daß ein vergleichbares Ausmaß an Bindung der meßbaren Komplexaktivität ohne ein Verdrängen durch den Secobarbital-Analyten auftritt. Wenn eine Secobarbital enthaltene Probe getestet wird, wie zuvor beschrieben, wird die Probenrückmeldung meßbar und proportional geringer als diejenige der Bezugsseite werden, was eine positive Kontrolle liefert, gegen welche die verdrängte Rückmeldung quantitativ gemessen werden kann.

Beispiel IX

Homogener Sandwich-Test für Salmonella-Toxin (Fig. 5e)

Folien aus ioddotiertem Polyacetylenblend (CPF), in Delrin-Elektrodenzeilen mit dem geteilten Topfeinsatz angebracht, werden auf einer Seite (Probenseite) mit einem spezifischen Konjugat aus Lactoperoxidase-Antisalmonella-Antikörper (üblicherweise gegen das flaggelare Protein) beschichtet. Die Bezugsseite der Zelle wird auf ähnliche Weise mit Lactoperoxidase, die mit einem unspezifischen Antikörper konjugiert ist, beschichtet. Der Einsatz wird entfernt, und die überschüssigen, nicht adsorbierten Konjugate werden von der Zelle abgewaschen.
Die beschichtete CPF-Zelle wird mit dem Abtast- und -Halteglied- Verstärker, wie zuvor beschrieben, verbunden. Eine Probe mit einem Volumen von 100 ul, üblicherweise eine Kulturbrühe, die unter dem Verdacht steht, Salmonella (in einer Konzentration von 10&sup5;-Zellen/ml oder mehr) zu enthalten, wird angesäuert und zur Freisetzung des flagellaren Antigens wieder neutralisiert und der Zelle zugegeben, wonach ein Volumen von 100 ul eines Antisalmonella-Antikörper-Konjugats zum Lactoperoxidase-Glucoseoxidase- Komplex zugegeben wird. Der Antikörper für das komplexe Konjugat kann von der gleichen, im Wettstreit stehenden Epitopspezifität oder spezifisch für ein unterschiedliches, auf dem flagellaren Antigen qefundenes Epitop sein. Einige zeitliche Zwischenräume später wird die Messung durch Zugabe von 100 ul Substratlösung mit einem Gehalt an 3% Glucose in einem BSA-PBS-KI-Puffer vom pH-Wert 7,2 vorgenommen. Die Anwesenheit spezifischer Salmonella wird durch eine meßbare Rückantwort nachgewiesen, die größer als jede unspezifische Rückmeldung ist, welche an der Bezugsseite der CPF-Zelle beobachtet wird.
Auf ähnliche Weise ist die Auswahl von makromolekularen Bindungsreaktionen, die bei der Ausführung dieses Verfahrens benutzt werden können, nicht auf spezifische Antigen-Antikörper-Bindungsteile beschränkt, sondern umfaßt jegliche komplementäre makromolekulare Bindungsreaktionspaare, die bekannt sein oder ersonnen werden können, wie z.B.die spezifische Hybridisierung von komplementären Strängen von Polynucleinsäuren, wie z.B. DNA oder RNA usw., oder aber auch spezifische Bindungsproteinsysteme, wie z.B. Biotin-Avidin, Throxyanin und throxinbindendes Globulin (TBG), Riboflavin und riboflavinbindendes Schutzcortisol (RBP-Cortisol) und cortisolbindendendes Protein (CBG), Folat und folatbindendes Protein (FBP) sowie verwandte biomolekulare proteinbindende Systeme, die allgemein auf dem Fachgebiet bekannt sind.

Claims

1. Sensor zur Durchführung von Immunoassays, umfassend:

eine Folie (101) aus halbleitendem Polymeren mit einer vorderen und rückseitigen Oberfläche,

zumindest eine elektroleitfähige Fläche (12) auf der rückseitigen Oberfläche und in Berührung hiermit,

zumindest eine zweite elektroleitfähige Fläche (14), angebracht an einer unterschiedlichen Stelle auf der rückseitigen Oberfläche und in Berührung damit, gekennzeichnet durch

eine gemeinsame elektroleitfähige Fläche (11) aus dem gleichen elektroleitfähigen Material wie in der ersten oder zweiten elektroleitfähigen Fläche (12, 14) auf der Rückseite in Berührung damit und

eine Vorrichtung zur Unterteilung der Vorderseite der Folie (10) auf solche Weise, daß ein erstes Feld (18) über der ersten elektroleitfähigen Fläche (12), und ein zweites Feld (16 über der zweiten elektroleitfähigen Fläche (14) definiei-t sind, während ein Teil einjedes der Felder über der gemeinsamen elektroleitfähigen Fläche (11) liegt.

2. Sensor gemäß Anspruch 1, umfassend:

eine Folie (101) aus halbleitendem Polymeren mit einer vorderen und einer rückseitigen Oberfläche, einen schmalen, elektroleitfähigen Streifen (111) auf der rückseitigen Oberfläche in Berührung damit, wobei der Streifen die Folie in zwei Felder gleicher Fläche unterteilt,

zumindest eine weitere elektroleitfähige Fläche (112) aus dem gleichen elektroleitfähigen Material wie der Streifen (111), die auf der rückseitigen Oberfläche und in Berührung damit auf einem Feld angebracht ist,

zumindest eine zweite weitere elektroleitfähige Fläche (114), die auf dem restlichen Feld auf der rückseitigen Oberfläche und in Berührung damit derart angebracht ist, daß die elektroleitfähigen Flächen (112, 114) auf beiden Feldern gleich lang und in gleichem Abstand von dem Streifen (111) sind.

3. Eine Immunoassay-Sensorzelle umfassend einen Sensor gemäß Anspruch 1,

elektrische Verbindungselemente (41, 42, 44) zu den elektroleitfähigen Flächen (111, 112, 114),

einen Probebehälter (36) mit einem offenen oberen und unteren Ende (34) wobei der Teil des Behälters (36)f welcher das offene untere Ende umgibt, so ausgebildet ist, daß er die vordere Oberfläche der Folie (101) berührt und mit dieser eine Flüssigkeitsdichtung bildet, von einer Abmessung, die ausreicht, um zumindest die vordere Oberfläche über den elektroleitfähigen Flächen (111, 112, 114) auf der Rückseite zu umfassen,

einen Doppelkammereinsatz (50), der so ausgebildet ist, daß er entfernbar in den Behälter (36) paßt, mit einem offenen oberen und unteren Ende, wobei der Teil (54) des Einsatzes, welcher das offene untere Ende umrundet, so ausgebildet ist, daß ei die vordere Oberfläche der Folie (101 berührt und mit dieser eine flüssigkeitsdichte Dichtung bildet, und groß genug ist, um zumindest einen Teil der vorderen Oberfläche über den elektroleitfähigen Flächen (111, 112, 114) auf der Rückseite innerhalb des offenen unteren Endes (34) zu umfassen, mit einer zentralen Scheidewand (52), die auf ähnliche Weise ausgebildet ist, um die vordere Oberfläche der Folie (101) zu berühren und mit dieser eine flüssigkeitsdichte Dichtung zu bilden.

4. Eine Immunoassay-Sensorzelle gemäß Anspruch 1, worin

die gemeinsame elektroleitfähige Fläche ein schmaler elektroleitfähiger Streifen (111) auf der rückseitigen Oberfläche in Berührung hiermit ist, wobei der Streifen (111) die Folie (101) in zwei Felder gleicher Fläche unterteilt,

und die erste sowie die zweite andere elektrokonduktive Fläche sind:

zumindest eine weitere elektroleitfähige Fläche (112) aus dem gleichen elektroleitfähigen Material wie der auf der rückseitigen Oberfläche und in Kontakt mit dieser angebrachte Streifen (111) auf einem Feld, und

zumindest eine zweite weitere elektroleitfähige Fläche (114), die auf dem restlichen Feld auf der rückseitigen Oberfläche und in Berührung mit dieser derart angebracht ist, daß die elektroleitfähigen Flächen (112, 114) auf beiden Feldern gleich lang und in gleichem Abstand von dem Streifen (111) sind,

wodurch die zentrale Scheidewand (54) auf der Vorderseite der Folie (101) zwei Felder gleicher Fläche auf jeder Seite der Längsachse des Streifens (111) abgrenzt.

5. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder quantitativen Menge von einem Analysten mit zumindest einer bindbaren Stelle pro Molekül in einem Fluid, das in Verdacht steht, diesen Analyten zu enthalten, umfassend folgende Verfahrensschritte:

Zur-Verfügung-Stellen eines Substrats (10) mit zumindest einer modifizierbaren Eigenschaft, die nachweisbar oder nachweisbar und meßbar ist,

Binden eines ersten, zuvor festgelegten Teils (16) des Substrats (10) an ein für den Analyten spezifisches Bindungsmittel, während ein zweiter, zuvor festgelegter Teil (18) vom Bindungsmittel freigelassen wird,

In-Berührung-Bringen des so behandelten Substrats mit dem unter Verdacht stehenden Fluid und einem das Substrat modifizierenden Mittel, das zumindest eine erste, an einen weiteren Teil des Bindungsmittels gebundene Komponente und zumindest eine zweite Komponente umfaßt, die mit der ersten Komponente unter Bildung eines Faktors reagierbar ist, der in der Lage ist, die modifizierbare Eigenschaft des Substrats zu verändern, und

Beobachtung der Veränderung oder Nicht-Veränderung der Eigenschaft.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, bei dem das Substrat (10) ein halbleitendes Polymer, und die modifizierbare Eigenschaft die Leitfähigkeit des Substrats sind.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem das Polymer aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Polyacetylen, Polypyrrol, Polythiophen, Polyparaphenylen und Polysulfon besteht.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, ferner umfassend:

das direkte Binden eines Teils der ersten Komponente des, das Substrat modifizierenden Mittels an den ersten, zuvor festgelegten Teil (18) des Substrats (10), das In-Berührung-Bringen sowohl des ersten, zuvor festgelegten Teils (18) des Substrats (10) mit dem daran gebundenen Bindungsmittel als auch des zweiten, zuvor festgelegten Teils (16), an den kein Bindungsmittel gebunden ist, mit dem unter Verdacht stehenden Fluid, dem das Substrat modifizierenden Mittel und einem Abfangmittel für den Modifizierungsfaktor, wodurch, wenn die erste Komponente des Modifizierungsmittels über den an das Bindungsmittel am Substrat gebundenen Analyten gebunden wird, der hierdurch erzeugte Modifizierungsfaktor vorzugsweise das Substrat verändert, während der restliche Modifizierungsfaktor sich mit dem Abfangmittel umsetzt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem das Substrat (10) Polyacetylen, die erste Komponente des, das Substratmodifizierenden Mittels an Glukoseoxidase gebundene Laktoperoxidase, und die zweite Komponente des Mittels Glukosesind, und das Abfangmittel ein wasserlösliches Protein miteinem Gehalt an substituierbaren Ringarylgruppen ist.

10. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder der quantitativen Menge eines Analyten mit zumindest einer bindbaren Steile pro Molekül in einem Fluid, das unter dem Verdacht steht, den Analyten zu enthalten, umfassend folgende Stufen:

Bereitstellung eines Substrats (10) mit zumindest einer modifizierbaren Eigenschaft, die nachweisbar oder nachweisbar und meßbar ist,

Binden eines für den Analysten spezifischen Bindungsmittels an einen ersten, zuvor festgelegten Teil (16) des Substrats (10), während ein zweiter, zuvor festgelegter Teil (18) von dem Bindungsmittel freigehalten wird,

In-Berührung-Bringen des derart behandelten Substrats mit dem unter Verdacht stehenden Fluid und einem, das Substrat modifizierenden Mittel, umfassendzumindest eine erste, an einen Teil des Analysten gebundene Komponente und zumindest eine zweite Komponente, die mit der ersten Komponente unter Bildung eines Faktors reagierbar ist, der in der Lage ist, diese modifizierbare Eigenschaft des Substrats zu verändern, und Beobachten der Veränderung oder Nicht-Veränderung der Eigenschaft.