DE3850692T2

DE3850692T2 - Treponema hyodysenteriae-Antigen und seine Verwendungen.

Info

Publication number: DE3850692T2
Application number: DE3850692T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey D Gabe; Caman Michael Mc
Original assignee: ML Technology Ventures LP
Current assignee: ML Technology Ventures LP
Priority date: 1987-03-17
Filing date: 1988-03-15
Publication date: 1995-02-02
Anticipated expiration: 2008-03-16
Also published as: CN88101372A; DK142488A; EP0282965B1; ATE108663T1; DK142488D0; JPS63264531A; EP0282965A2; EP0282965A3; DE3850692D1; ES2056844T3; IE880778L; HU205863B; CA1336408C; HUT46236A; PT87001A; IE61531B1

Description

Diese Erfindung betrifft Treponema hyodysenteriae (manchmal hierin als "Th" bezeichnet)-Antigene und ihre Verwendung.
Schweinedysenterie (manchmal hierin als "SD" bezeichnet) ist eine schwere Infektionskrankheit, die in sämtlichen Hauptländern mit Schweinezucht auftritt. Die Symptome von Schweinedysenterie sind schwerer schleimig-blutiger Durchfall, Entwässerung und Gewichtsverlust.
Es hat sich gezeigt, daß SD durch Th, eine anaerobe, B- hämolytische Spirochäte hervorgerufen wird. SD rührt im allgemeinen aus der Aufnahme von Kot mit Th von akut infizierten oder symptomfreien Trägerschweinen oder durch von Bauernhof- Gerätschaften oder von den Landwirten verstreuten Fäkalien her.
Es gibt bereits zahlreiche Versuche zur Bereitstellung eines Impfstoffs gegen Th, bei denen im allgemeinen der gesamte Organismus miteinbezogen wurde.
"Microbiologica" 10 (Januar 1987), Seiten 1-8, beschreibt eine Kreuzreaktionsfähigkeit zwischen Human- und Schweinedarm- Treponema. Unter Verwendung von gegen Vollzellen "gezogenen" Antikörpern wurden Proteinbanden identifiziert.
Aus den EP-A-0155790 und EP-A-0009577 ist jeweils ein Impfstoff mit abgetöteten pathogenen Th-Zellen bekannt.
"Abstracts Annual Meeting American Society Microbiology" 87 (1987; Versammlungsdatum: 1.-6. März), Abstract Nr. E-85, Seite 117, beschreibt die Extraktion äußerer Membranantigene aus Th unter Verwendung von chaotropischen Mitteln. Die zum Schutz von Schweinen gegen SD interessierenden Antigene sollen ein Molekulargewicht von 14 kDa aufweisen.
"Chemical Abstracts" 106 (2. Februar 1987): 31066n und "Infection and Immunity" 54 (1986), Seiten 893-896, beschreiben die Identifizierung von Proteinen aus beschallten Th-Zellen. Ein 16 kDa-Antigen soll wahrscheinlich für den Schutz von Schweinen gegen SD verantwortlich sein.
Erfindungsgemäß umfaßt ein Impfstoff zum Schutz gegen SD ein Th-Antigen mit einem Molekulargewicht von 19-90 kDa oder ein aktives Fragment desselben, wobei der Impfstoff im wesentlichen von Th-Zellen frei ist. Ein solches im wesentlichen von Th-Zellen freies Antigen kann zur Herstellung eines Medikaments zum Schutz gegen SD verwendet werden. Gewünschtenfalls kann ein Gemisch der Antigene verwendet werden.
Das Molekulargewicht des Antigens beträgt vorzugsweise mindestens 25 kDa und vorzugsweise auch nicht mehr als 65 kDa. In besonders bevorzugter Weise wird das Antigen aus solchen von 29, 30, 31, 34, 36, 38, 39, 42, 44 oder 60 kDa und Gemischen derselben, beispielsweise aus solchen von 30, 36 oder 60 kDa oder aus solchen von 29, 31, 34, 38, 39, 42 oder 44 kDa, ausgewählt. Die charakteristischen Molekulargewichte erhält man durch diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese unter Verwendung des von Laemmli in "Nature" 227, 680-85 (London 1970) beschriebenen SD-Puffersystems bei einer Acrylamidkonzentration von 10-17% und einem Bisacrylamid/Acrylamid-Verhältnis von 1/29.
Die Antigene gehen in der Regel auch mit von Schweinen, die von SD genesen sind, gewonnenem Serum eine Immunreaktion ein.
Das Antigen läßt sich durch Löslichmachen eines Th-Organismus, beispielsweise der Oberflächen- oder Membranantigene des Th-Organismus, mit einem Detergens oder chaotropischen Mittel ohne Lyse oder Aufbrechen des Organismus, gewinnen. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das T. hyodysenteriae-Proteinantigen durch Behandeln des nicht der Lyse unterworfenen (aufgelösten) bzw. ganzen Organismus in Lösung gebracht. Man kann allerdings in einigen Fällen ein solches lösliches Oberflächenantigen auch aus einem einer Lyse unterworfenen (aufgelösten) oder beschallten Organismus gewinnen.
Das Löslichmachen erfolgt vorzugsweise mit Hilfe eines geeigneten Detergens und/oder eines chaotropischen Mittels, welches die antigenen Eigenschaften des T. hyodysenteriae-Proteinantigens nicht zerstört. Das Detergens oder oberflächenaktive Mittel kann aus einer beliebigen Detergensart einschließlich kationischer, nicht-ionischer und anionischer oberflächenaktiver Mittel bzw. Netzmittel, bestehen. Solche Netzmittel sind im allgemeinen bekannt. Hierzu gehören Kondensationsprodukte mit Ethylenoxid, die verschiedensten Alkalimetallsalze von Seifen, Sulfate oder sulfonierte Öle, die verschiedensten Amine, quaternären Salze und dergleichen. Bevorzugte Detergentien sind Alkalidodecylsulfat, Laurolyl* -Sarcosin, nicht-ionische Kondensationsprodukte von Ethylenoxid (beispielsweise Tween 20) und dergleichen.
Repräsentative Beispiele geeigneter chaotropischer Mittel sind Harnstoff, Lithiumchlorid, Guanidin·HCl und dergleichen.
Das löslichmachende Mittel wird, gleichgültig ob es ein Netzmittel oder chaotropisches Mittel ist, vorzugsweise in einer zum Löslichmachen des Antigens ohne Aufbrechen oder Lyse des Gesamtorganismus ausreichenden Menge eingesetzt. Das löslichmachende Mittel wird in einem Gewichtsverhältnis, löslichmachendes Mittel/Organismus, von 0,05/1 bis etwa 1,0/1, vorzugsweise von etwa 0,1/1 bis 0,5/1, verwendet.
Das Löslichmachen erfolgt bei einer Temperatur, die das Antigen nicht beeinträchtigt. Eine solche Temperatur liegt in der Regel in der Größenordnung von 15-25ºC. In ähnlicher Weise wird der pH-Wert im Hinblick auf einen Stabilitätserhalt gewählt. Im allgemeinen übersteigt er 7,0 nicht und liegt insbesondere im Bereich von 4,5-5,0.
Die Behandlung des Organismus erfolgt so lange, bis das Antigen in Lösung gebracht ist. Im allgemeinen liegt die Behandlungsdauer in der Größenordnung von 1-2 h, in einigen Fällen kann man sich jedoch einer längeren oder kürzeren Behandlung bedienen.
Die Wahl der optimalen Bedingungen zur Gewinnung des gewünschten Oberflächenantigens mit Hilfe einer Lösungstechnik dürfte für den Fachmann des einschlägigen Fachgebiets keinerlei Schwierigkeiten bereiten. Wie bereits ausgeführt, wird unter Bedingungen und mit einem löslichmachenden Mittel gearbeitet, unter bzw. mit denen die Antigene ohne Lyse oder
* wahrscheinlich Lauroyl
Aufbrechen der Vollzelle erhalten werden.
Ein Merkmal des Antigens oder der Antigene mit der Eignung zur erfindungsgemäßen Verwendung in einem Impfstoff ist, daß das T. hyodysenteriae-Antigen einem Antigen oder Antigenen, das bzw. die durch Behandeln des T. hyodysenteriae- Organismus mit einem Detergens auf eine Art und Weise, bei der keine Lyse oder ein Aufbrechen des Organismus erfolgt, in Lösung gebracht wurde(n) (selbst wenn das Antigen oder die Antigene nach einem von dem beschriebenen Lösungsverfahren verschiedenen Verfahren erhalten wurde(n)), entspricht.
Selbst wenn es eine Eigenschaft des hierin beschriebenen Antigens ist, daß es von dem Gesamtorganismus als lösliche Fraktion durch Behandeln des Gesamtorganismus mit einem Detergens unter Bedingungen, unter denen es nicht zu einem Aufbrechen oder einer Lyse des Organismus kommt, abgetrennt wurde, braucht (brauchen) selbstverständlich das Antigen bzw. die Antigene nach Gewinnung derselben nicht zwangsläufig bei Verwendung im Impfstoff oder vor der Zubereitung des Impfstoffs in löslicher Form vorzuliegen. Obwohl bei der Zubereitung des Impfstoffs verwendete(s) T. hyodysenteriae-Antigen(e) vorzugsweise aus der Membran des Organismus mit Hilfe eines löslichmachenden Mittels gewonnen wurde(n), dürfte es in ähnlicher Weise selbstverständlich sein, daß man (ein) solche(s) Antigen(e) auch durch andere Techniken oder aus anderen Teilen des Organismus mit Hilfe der beschriebenen Lösungstechnik gewinnen kann.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält der Impfstoff das 19Kda-Antigen oder ein Fragment desselben alleine oder in Kombination mit anderen Antigenen oder Fragmenten derselben (vgl. die vorhergehende Beschreibung). Obwohl das 19Kda-Antigen in der durch Behandeln des T. hyodysenteriae-Organismus mit einem Detergens und/oder chaotropischen Mittel ohne Lyse oder Aufbrechen des Organismus gewonnenen löslichen Fraktion enthalten ist, wurde der Hauptteil des 19Kda-Antigens nicht in Lösung gebracht und verbleibt beim Organismus (insbesondere in dessen Membran). Das 19Kda-Antigen kann aus dem Organismus nach auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannten Maßnahmen, beispielsweise durch Aufbrechen der Zellen und Einsatz der Elektrophorese vor oder nach der Extraktion der löslichen Antigenfraktion aus dem Organismus gewonnen werden.
In ähnlicher Weise kann man bei der Herstellung eines erfindungsgemäßen Impfstoffs anstelle von oder in Verbindung mit einem oder mehreren solcher Antigene ein Fragment eines oder mehrerer der zuvor beschriebenen Antigene verwenden. Der Ausdruck "Antigenfragment" bezeichnet hier und im folgenden ein Bruchstück des Antigens, das
1. ein Epitop enthält, welches einen ein solches Antigen erkennenden Antikörper produziert, und
2. eine Immunreaktion mit Serum von Schweinen, die von Schweinedysenterie genesen sind, eingeht.
Das Fragment weist ein niedrigeres Molekulargewicht auf als das beschriebene Antigen.
Somit wird (werden) gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Protein (Proteine), das (die) im wesentlichen von T. hyodysenteriae (T. hyo.)-Zellen frei ist (sind), bereitgestellt. Das (die) Protein(e) liefert (liefern) (einen) Antikörper, der (die) mindestens ein T. hyo.-Antigen mit einem Molekulargewicht von etwa 19 kda bis etwa 90 kda erkennt (erkennen). Vorzugsweise besitzt ein solches erkanntes T. hyo.-Antigen ein Molekulargewicht von mindestens 25 kda. Insbesondere überschreitet das Molekulargewicht 65 kda nicht. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform produziert (produzieren) (ein) solche(s) Protein(e) einen Antikörper, der eines oder mehrere der T. hyo.-Antigene mit folgenden Molekulargewichten: 19 kda; 29 kda; 30 kda; 31 kda; 34 kda; 36 kda; 38 kda; 39 kda; 42 kds; 44 kda und 60 kda erkennt. Wie bereits ausgeführt, geht (gehen) im allgemeinen (ein) solche(s) Protein(e) eine Immunreaktion mit Serum von Schweinen, die von Schweinedysenterie genesen sind, ein. Ein solches Protein kann aus dem entsprechenden T. hyo.-Antigen und/oder einem Fragment und/oder Derivat desselben bestehen. (Ein) solche(s) Protein(e) kann (können) - wie noch beschrieben werden wird - in Kombination mit einem physiologisch akzeptablen Träger als Impfstoff zum Schutz von Schweinen gegen Schweinedysenterie verwendet werden.
Das T. hyodysenteriae-Antigen und/oder Fragment in Verbindung mit einem physiologisch akzeptablen Träger wird als Impfstoff zum Schutz gegen Schweinedysenterie und insbesondere gegen durch T. hyodysenteriae hervorgerufene Schweinedysenterie verwendet. Das (die) T. hyodysenteriae-Proteinantigen(e) und/oder Fragment(e) desselben (derselben) wird (werden) in dem Impfstoff in einer Schutz gegen Schweinedysenterie bietenden Menge eingesetzt. In der Regel enthält jede Impfdosis mindestens 5 ug und vorzugsweise mindestens 100 ug an (einem) solchen Antigen(en) und/oder Fragmenten des Antigens. In den meisten Fällen enthält der Impfstoff (ein) solche(s) Antigen(e) und/oder Fragmente in einer 20 mg nicht übersteigenden Menge.
Der Ausdruck "Schutz" oder "Schützen" bedeutet im Zusammenhang mit dem beschriebenen Impfstoff gegen Schweinedysenterie, daß der Impfstoff Schweinedysenterie verhindert und/oder die Schwere der Schweinedysenterie vermindert.
Bei Gabe mehrerer Dosen übersteigen diese im allgemeinen 3 Dosen über sechs Wochen hinweg nicht.
Als Träger für das T. hyodysenteriae-Proteinantigen kann irgendeiner der verschiedensten Träger verwendet werden. Repräsentative Beispiele geeigneter Träger sind Mineralöl, Alaun, synthetische Polymerisate und dergleichen. Träger für Impfstoffe sind auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannt. Die Auswahl eines geeigneten Trägers liegt innerhalb des Fachwissens des Fachmanns auf dem einschlägigen Fachgebiet. Die Wahl eines geeigneten Trägers hängt ferner von der Verabreichungsart des Impfstoffs ab. Der Impfstoff kann in Form einer injizierbaren Dosis vorliegen und intramuskulär, intravenös oder subkutan verabreicht werden. Man kann den Impfstoff auch durch Vermischen der aktiven Komponenten mit Futter oder Wasser oder in Tablettenform u. dgl. oral verabreichen.
Andere Verabreichungsmöglichkeiten für den Impfstoff dürften sich dem Fachmann aus den Erläuterungen hierin eröffnen. Folglich ist der Umfang der Erfindung nicht auf eine spezielle Abgabeform beschränkt.
Der Impfstoff kann selbstverständlich zusätzlich zu dem (den) hierin bereits beschriebenen Antigen(en) oder dessen (deren) Fragmenten aktive Komponenten oder Hilfsstoffe enthalten.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen, jedoch in keiner Weise beschränken.

BEISPIELE

1. Herstellung von Impfmaterial:

Der Treponema hyodysenteriae-Stamm B204 wurde in einer wie folgt zubereiteten Brühkultur wachsengelassen. Hirn/Herz- Infusion (Difco) in einer Menge von 37 g/l destillierten Wassers wurde nach der Autoklavenbehandlung abkühlen gelassen und danach steril mit einer Glucoselösung (bis zu einer Endkonzentration von 5 g/l) und fötalem Kalbserum (bis zu einer Endkonzentration von 5% Vol/Vol) versetzt. Danach wurde das Medium durch 24-stündige Perfusion mit einem Gasstrom aus 90% Stickstoff und 10% Kohlendioxid vorreduziert (anaerob gemacht). Das vollständige Medium wurde dann mit einer 1-10 Vol.-% aktiv wachsenden T. hyo-Kultur beimpft. Die Temperatur wurde auf 37-39ºC gehalten. Der Kultur-pH-Wert wurde bei 6,8 gehalten. Die Kultur wurde kontinuierlich mit dem sauerstoffreien Gas (Strömungsgeschwindigkeit: 50 ml/min/l Kultur) perfundiert.
Nach Erreichen einer Dichte von 10&sup8;/ml oder mehr (gemessen durch mikroskopische Zählung) wurden Zellen aus der Zucht entfernt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren konzentriert, danach gewaschen und erneut zweimal in einem Puffer von 10 mM Kaliumacetat eines pH-Werts von 4,75 und 150 mM Kaliumchlorid zentrifugiert. Danach wurden die Zellen in 10 mM Kaliumacetat eines pH-Werts von 4,75 bis zum Erreichen einer optischen Dichte von 25-30 (bei 600 mM) (bestimmt an Lösungsverdünnungen), die in typischer Weise etwa 1/20 des ursprünglichen Kulturvolumens beträgt, resuspendiert.

Extraktionsverfahren 1:

Tween-20® (ein nicht-ionisches Detergens) wurde dann bis zu einer Endkonzentration von 0,2% zu der Zellensuspension gegeben. Nach 10-minütigem schwachen Rühren wurden die Zellen zentrifugiert (10 min bei 10 000 xg). Der Überstand wurde verworfen, die Zellen wurden in Acetatpuffer resuspendiert und danach mit 2,0% Tween-20® extrahiert. Nach dem Zentrifugieren wurde der 2%ige Tween-Überstand (durch das Detergens löslich gemachter Antigenpool) sichergestellt. Das Zellenpellet wurde mit Tween-20 aufeinanderfolgend bis zu fünf zusätzlichen Zyklen mit einer Konzentrationssteigerung über die Zyklen von etwa 2% bis zu etwa 10% resuspendiert und reextrahiert. Die durch das Detergens löslich gemachten Überstandfraktionen wurden vereint. Diese Extraktionsmaßnahme macht selektiv (jedoch nicht quantitativ) Oberflächenproteine des T. hyo ohne Lyse oder Aufbrechen der Bakterien löslich.
Zur Verminderung der Detergensmengen in dem Antigenpräparat bediente man sich zweier zusätzlicher Schritte. Zunächst wurde das Material 1,5 h lang ultrazentrifugiert (100 000 x g). Das gewonnene Pelletmaterial wurde in 25 mM Tris-Puffer eines pH-Werts von 6,8 resuspendiert und durch Beschallen dispergiert. Die gewonnene Überstandfraktion mit der Hauptmasse an Detergens wurde über eine DEAE-Sephacel® (Parmacia)- Säule, die in 10 mM Kaliumacetat eines pH-Werts von 4,75 ins Gleichgewicht gesetzt worden war, laufengelassen. Die Proteinkomponenten wurden an das Chromatographie-Harz gebunden, während das nicht-ionische Detergens durchgewaschen wurde. Die Proteine wurden durch Eluieren in einem hochkonzentrierten Salzpuffer (1,0M NaCl) freigesetzt und in 3 ml-Fraktionen gesammelt. Geeignete Fraktionen wurden vereint und dann in 25 mM Tris-Puffer eines pH-Werts von 6,8 dialysiert.
Die beiden an Detergens verarmten Antigenpoole wurde vereinigt und auf eine Proteinkonzentration von 10 mg/ml gebracht. Dieses Material bildet eine Gruppe von aus T. hyo-Zellen (sowohl löslichen als auch unlöslichen Formen) nach der Extraktion mit Tween-20® freigesetzten Proteinen.
Die Proteingruppe enthält T. hyo-Antigene mit folgenden Molekulargewichten: 29K; 30K; 31K; 34K; 36K; 38K; 39K; 42K; 44K und 60K. Darüber hinaus enthält die Proteingruppe etwas 19K-Antigen. Einige der Antigene wurden sequenziert. Die Sequenzdaten sind folgende: Sämtliche besitzen blockierte Aminotermini

Extraktionsverfahren 2:

Herstellung von SDS-löslichen Oberflächenproteinen.
In der geschilderten Weise wurden Zellen geerntet, gewaschen und resuspendiert, wobei jedoch der Resuspensionspuffer 0,9M Saccharose und 20 mM MgCl&sub2; enthielt. Eine Lösung (20 mM) des ionischen Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS) wurde langsam unter schwachem Rühren zugegeben, bis die Absorption bei 600 mM einer 50fachen Verdünnung der Zellensuspension um etwa 30% abgenommen hatte. Dies erfolgt in typischer Weise bei einer End-SDS-Konzentration von 15-20 mM. Unlysierte Zellen wurden von den durch das Detergens freigesetzten Proteinen durch 10-minütiges Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit (10 000 xg) abgetrennt. Dieser Proteinpool (auf 10 mg/ml verdünnt) enthält sowohl lösliche als auch unlösliche Komponenten, die durch Behandeln von T. hyo-Zellen mit SDS freigesetzt wurden.

Antigenreinigung

Das durch 1,5-stündiges Ultrazentrifugieren entsprechend Extraktionsmethode 1 gewonnene Hochgeschwindigkeitspellet (HSP) wurde in 25 mM Tris-HCl eines pH-Werts von 6,8 resuspendiert und durch Beschallen dispergiert. Das HSP wurde dann mit 15 Volumina Tris-HCl eines pH-Werts von 6,8 mit 6M Harnstoff, der durch ein 0,45 uM-Filter filtriert worden war, gemischt. Das Ganze wurde dann bei Raumtemperatur mehrere Stunden lang verrührt und anschließend bei 100 000 xg zentrifugiert. Der Überstand (US1) wurde beiseite gestellt. Die Pelletfraktion aus dieser Stufe (UP1) wurde resuspendiert und ein zweites Mal mit Harnstoff extrahiert. Dieses Material wurde in der zuvor geschilderten Weise zentrifugiert. Der Überstand (US2) und das Pellet (UP2) wurden gesammelt.
US1 wurde zur Isolierung der 29 kd, 34 kd, 42 kd und 44- 45 kd-Proteine verwendet. Dies geschah wie folgt:
US1 wurde auf ein 0,1%iges Volumen Trifluoressigsäure (TFA) angesäuert und direkt auf eine C4-Umkehrphasensäule, die mit 0,1% TFA ins Gleichgewicht gesetzt worden war, aufgegeben. Die Säule wurde mit einem Gradienten von 0-100% entwickelt (100% = Acetonitril + Isopropanol (2:1) + 0,1% TFA). Für die präparative Darstellung bediente man sich einer 25 mm · 250 mm-Säule einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 ml/min mit folgendem Gradienten:
0-40% in 10 min
40-52% in 65 min
54-100% in 14 min.
Die Sammelrate betrug 0,9 min/Fraktion.
Das Eluiermittel wurde kontinuierlich bei 214 nm überwacht.
Unter diesen Bedingungen wurden folgende Proteine eluiert: PEAK ANTIGEN % ACETONITRIL Vielfältige Proteine einschließlich 31 und 38 Kd
400 ml US1 in 0,1% TFA (160 mg Protein) lassen sich aufgeben und führen zu einer akzeptablen Trennung, obwohl es etwas Kreuzverunreinigung zwischen den Peaks 3 und 4 gibt.
Fraktionen mit den gewünschten Proteinen wurden gesammelt, mit einem gleichen Volumen destillierten Wassers verdünnt und lyophilisiert. Die lyophilisierten Fraktionen wurden in 25 mM Tris-HCl eines pH-Werts von 6,8 resuspendiert. Dieses Material wurde quantitifiziert, mit TFA löslich gemacht und auf Glasfilter zur Derivatisierung und anschließenden Aminosäureanalyse im Rahmen einer Hochdruckflüssigchromatographie nach Standardverfahren aufgegeben.
US2 diente zur Herstellung der 29 und 38 KDa-Antigene wie folgt:
Das Material wurde angesäuert und wie US1 auf eine C4- Säule aufgegeben. Es wurde folgender Gradient erstellt:
0-42% in 10 min
42-45% in 15 min
45-57% in 30 min
57-100% in 14 min.
Unter diesen Bedingungen wurden folgende Proteine eluiert: PEAK ANTIGEN % ACETONITRIL
600 ml US2 (65 mg Protein) waren aufgegeben worden.
Fraktionen wurden - wie oben beschrieben - gesammelt, verdünnt, lyophilisiert, resuspendiert und zur Aminosäuresequenzanalyse aufbereitet.
UP2 zeigte sich als Lieferant für das 39 KDa-Protein, das durch Elektroeluieren aus Acrylamidgelen gereinigt wurde.
Eine für ein HPLC-gereinigtes Peptidfragment aus einer proteolytischen Verdauung des 39 kDa-Proteins (der UP2-Zellenfraktion) unter Verwendung von Endoproteinase Lys-C bestimmte Aminosäuresequenz:
Das 39 kDa-Protein wurde zunächst mit Aceton gefällt und danach in eine Lösung von 4 M Harnstoff, 25 mM Tris eines pH- Werts von 6,8 resuspendiert. Ein Peptid wurde als ein Peak eines Materials, das aus einer C-4-Umkehrphasensäule beim Entwickeln mit einem Gradienten von Acetonitril, Isopropanol (2:1) in 0,1% Trifluoressigsäure eluierte, erhalten.
Das 39 kDa-Fragment besaß folgende Sequenz:
val gin his ser leu ala trp gly ala tyr ala glu leu tyr
val arg pro val gln asp leu glu glu tyr phe glu met asp
ile asn . . .
Für die Protease bestimmte Aminosäuresequenz:
Resistenter Anteil der 39 kDa-Komponente der UP2-Fraktion nach ihrer Verdauung mit Chymotrypsin (eine Suspension von 39 kDa-Protein in einer Menge von 2mg/ml wurde bei 37ºC 16 h mit 20 ug/ml Chymotrypsin in einem Puffer von 25 mM Tris eines pH- Werts von 6,8 mit 0,1% Zwittergent 3-12-Detergens inkubiert. Ein Protease resistentes 27 kDa-Produkt wurde durch elektroeluieren nach einer präparativen Gelelektrophorese isoliert und vor der Sequenzierung mit Methanol gefällt und extrahiert. Die Komponente besaß folgende Sequenz:

Beispiel 2

Durch Zugabe von 2 ml Antigen (20 mg Gesamtprotein) zu 0,65 ml Hilfsstoff (Gemisch aus gereinigtem Mineralöl und Paraffin), Emulgieren durch wiederholte Passage durch eine 18g- Nadel wurde jede Impfdosis hergestellt, worauf eine intramuskuläre Injektion in ein Versuchsschwein erfolgte. Die Antigene wurden nach einem der Extraktionsverfahren 1 oder 2 von Beispiel 1 gewonnen.
Acht Wochen alte Schweine (eines Gewichts von jeweils etwa 40 lbs (18,1 kg)) wurden in isolierten Ställen gehalten und mit einer proteinreichen, antibiotikumfreien Diät gefüttert. Sie wurden geimpft, indem sie alle 2 Wochen insgesamt drei Injektionen pro Versuchstier innerhalb von 6 Wochen erhielten.

Orales Provokationsverfahren:

Vier Wochen nach der letzten Impfung erhielt jedes Tier eine orale Provokations(gabe) von 5 · 10¹&sup0; virulenten Treponema hyodysenteriae innerhalb einer Periode von 4 Tagen. Etwa die Hälfte der Provokations(gabe) wurde als Brühekultur durch eine in jedes Tier eingeführte Magensonde verabreicht. Die andere Hälfte der Provokations(gabe) wurde als anaerob in Blutagar gewachsene T. hyo-Kultur in Mischung mit einer geringen Menge Futter angeboten und von jedem Schwein vollständig aufgefressen (sämtliche Tiere wurden 48 h lang vor der oralen Provokation hungern gelassen). Die Bedingungen für die T. hyo- Brühekultur waren im wesentlichen dieselben wie in Abschnitt 1 beschrieben, wobei jedoch die Hirn/Herz-Infusion durch Trypticose Soya-Brühe (TSB) (27,5 g/l) ersetzt wurde und die Kulturen anaerob unter Rühren, jedoch ohne Hindurchleiten eines kontinuierlichen Gasstroms wachsen durften.
Über den gesamten Versuch hinweg wurden Serumproben gesammelt. Durch Westernblot wurde ein Serumantikörper in den geimpften Tieren gegen T. hyo-Proteine festgestellt. Im Rahmen eines ELISA-Tests zeigte es sich, daß die Titerwerte größer waren als die bei natürlich immunisierten (genesenen) Schweinen gefundenen Titerwerte.
Rektale Abstriche wurden anaerob gezüchtet, um die Anwesenheit von T. hyo im Darmtrakt von den den Provokationstests unterworfenen Tieren zu zeigen.
Jedes Tier wurde täglich untersucht, um den allgemeinen Gesundheitszustand und die Kotkonsistenz zu bestimmen und um die Anwesenheit von Blut und Schleim im Kotmaterial zu prüfen.
Vier Tiere wurden in der beschriebenen Weise geimpft. Unter Benutzung desselben Protokolls wurden gleichzeitig vier nicht geimpfte, dem Provokationstest unterworfene Tiere im gleichen Stall wie die geimpften und dem Provokationstest unterworfenen Tiere gehalten.
31 Tage nach der Provokation zeigten sämtliche acht Tiere klinisch positive Zeichen einer Infektion mit T. hyo. Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, besaßen drei der vier Impflinge einen hohen Serumtiter vor der Provokation. Sämtliche drei zeigten eine signifikante Verzögerung (weitere 8-16 Tage) bis zum Einsetzen der Schweinedysenterie relativ zu dem einen niedrigen Titer aufweisenden Impfling oder zur Kontrollgruppe. Der Zustand der Impflinge I, II und IV während der klinischen Dysenterie war besser als der bei den Kontrolltieren während ihrer Dysenterieperiode beobachtete Zustand. Keiner der Impflinge ging nach der Provokation ein, dagegen gingen zwei der vier Kontrolltiere an der Infektion ein.
Somit verminderte eine intramuskuläre Impfung junger Schweine den klinischen Schweregrad einer anschließenden Schweinedysenterie-Infektion und verzögerte das Einsetzen eines solchen Ausbruchs. TABELLE 1
Tier Nr.
Maximaler Anti- T.hyo-Serumtiter
Verwendetes Antigen
Einsetzen der Schweinedysenterie (Tage nach der Provokation)
Durschnittlicher Zustand während der Dysenterieperiode (Tabelle 2)
Eingehen infolge Infektion Nein Ja
T = durch Tween löslich gemachte T. hyo-Proteine
S = durch SDS löslich gemachte T. hyo-Proteine TABELLE 2 Zusammenfassung der Bewertung der Schweine
Kotkonsistenz Kotzusammensetzung Zustand des jeweiligen Schweins
1 fest normal normal normal, munter
2 weich geringe Menge Schleim schwach finster, schwach rauher Haarbehang
3 sehr weich - lose große Menge Schleim, Blutflecken sehr finster, sehr rauhes Haar, matte Augen
4 sehr lose wäßrig extrem blutig eingegangen

Claims

1. Impfstoff zum Schutz gegen Schweinedysenterie, umfassend ein Treponema hyodysenteriae-Antigen eines Molekulargewichts von 19-90 kDa oder ein aktives

Fragment desselben, wobei der Impfstoff im wesentlichen von T. hyodysenteriae-Zellen frei ist.

2. Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das Antigen ein Molekulargewicht von mindestens 25 kDa aufweist.

3. Impfstoff nach Anspruch 2, wobei das Antigen ein Molekulargewicht von nicht größer als 65 kDa aufweist.

4. Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das Antigen aus solchen von 29, 30, 31, 34, 36, 38, 39, 42, 44 oder 60 kDa und Gemischen hiervon ausgewählt ist.

5. Impfstoff nach Anspruch 4, wobei das Antigen aus solchen von 30, 36 oder 60 kDa ausgewählt ist.

6. Impfstoff nach Anspruch 4, wobei das Antigen aus solchen von 29, 31, 34, 38, 39, 42 oder 44 kDa ausgewählt ist.

7. Impfstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche in Form einer Einheitsdosis mit mindestens 5 ug Antigen.

8. Impfstoff nach Anspruch 7, wobei die Einheitsdosis mindestens 100 ug des Antigens enthält.

9. Impfstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Antigen durch Löslichmachen eines T. hyodysenteriae-Organismus mit einem Detergens oder chaotropischen Mittel ohne Lyse oder Aufbrechen des Organismus erhalten wurde.

10. Verwendung eines Antigens oder aktiven Fragments desselben gemäß der Definition nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung eines Medikaments zum Schutz gegen Schweinedysenterie.