DE3827087A1 - Neue mit endoglycosidase h behandelte subtypen von rt-pa typ i und rt-pa typ ii, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendung als arzneistoffe - Google Patents

Description

Aus der DE-A-37 08 681 ist bereits ein Verfahren zum Entfernen der funktionellen Kohlenhydratstruktur am Aminosäurerest 117 des nativen rt-PA unter Verwendung einer Endoglycosidase wie Endoglycosidase H bekannt. Hierbei erhält man ein rt-PA, welches in Position 117 ein an Asn gebundenes N-Acetyl-glu­ cosamin enthält, ohne die komplexe Struktur an den Aminosäure­ resten 184 und 448 funktional zu beeinflussen.

Des weiteren ist bekannt, daß natives rt-PA sich mittels Affini­ tätschromatographie, z. B. über Lysin-Sepharose, in zwei Subtypen, die als rt-PA Typ I und rt-PA Typ II bezeichnet werden, aufgetrennt werden kann (siehe Thrombosis and Haemo­ stasis 54 (4), 778-791, 1985). Beide Subtypen, die sich durch eine bei Typ I vorhandene und bei Typ II fehlende Car­ bohydratseitenkette an Asparaginrest 184 unterscheiden, sind in dem durch Zellkulturfermentation gewonnen rt-PA etwa im Verhältnis 1 : 1 enthalten.

Überraschenderweise wird nun gefunden, daß der mit EndoH be­ handelte Typ I bzw. Typ II rt-PA verbesserte Eigenschaften, insbesondere verbesserte thrombolytische Aktivität bzw. Eli­ minationsrate, besitzt, im Vergleich zu dem nativen rt-PA oder Endoh behandelten nativen rt-PA.

Um die erfindungsgemäßen Substanzen herzustellen, kann man natives rt-PA Typ I oder natives rt-PA Typ II oder ein Ge­ misch hiervon jeweils mit einem geeigneten Enzym, vorzugs­ weise mit Endoglycosidase H, das beispielsweise unter der Bestellnummer 886 424 von Boehringer Mannheim Biochemica bezogen werden kann, behandeln, und anschließend das jeweils so gebildete rt-PA, das ohne Beeinflussung der komplexen Struktur an den Aminosäureresten 184 und 448 am Aminosäure­ rest 117 nur noch einen N-Acetyl-glucosaminorest enthält, nach üblichen Methoden isolieren oder isolieren und auf­ trennen. Diese neuen Subtypen wurden als EndoH rt-PA Typ I und EndoH rt-PA Typ II bezeichnet.

Die Deglycosylierung von nativem rt-PA Typ I und von nativem rt-PA Typ II wurde vorzugsweise während 24 Stunden bei 37°C in einem Arginin-Phosphat-Puffer pH 5,2, 0,2 M 0,1%igen Polysorbat 80 mit Endoglycosidase H, welches von Boehringer Mannheim Biochemica bezogen wurde, durchgeführt.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß die fibrinolytische Aktivität der auf diese Weise hergestellten beiden neuen Plasminogenaktivatoren jeweils größer ist als die des ent­ sprechenden nativen rt-PA Typ I und rt-PA Typ II. Die fi­ brinolytische Aktivität wurde entsprechend einer validierten in-vitro Clotlysemethode in Anlehnung einer in von P. J. Gaffney et al. in Thrombosis and Haemostasis 58, 1085-1087 (1987) beschriebenen Analysenmethode bestimmt. Das Prinzip des verwendeten analytischen Verfahrens sei im folgenden kurz beschrieben:
Durch Zugabe einer Lösung von humanem Thrombin zu einem Ge­ misch aus Plasminogen und Fibrinogen wird im Reagenzglas ein Fibringerinnsel gebildet, welches dann in Abhängigkeit von der ebenfalls zugesetzten rt-PA-Konzentration durch gebildetes Plasmin wieder aufgelöst wird. Die Auflösegeschwindigkeit des Fibringerinnsels, die beispielsweise über Trübungs­ messung bestimmt wird, befindet sich in einer linearen Ab­ hängigkeit zur eingesetzten rt-PA-Konzentration. Die Clot­ lyseaktivität von unbehandelten und von EndoH-behandeltem rt-PA Typ I und Typ II wurde relativ zu rt-PA Referenzmate­ rial bestimmt, das definitionsgemäß eine spezifische Aktivi­ tät von 1 Clotlyseeinheit pro mg Protein besitzt (1 U/mg).

Die Clotlyseaktivität von EndoH-behandeltem rt-PA war um 13% höher als die von nativem rt-PA. Die Aktivität von EndoH-behandeltem rt-PA Typ I war um 22% höher als die von unbehandeltem rt-PA Typ I. Die Clotlyseaktivität von rt-PA Typ II war etwa gleich hoch wie die von unbehandeltem Typ II.

Bei EndoH-behandeltem Typ I und Typ II rt-PA wurde zusätz­ lich eine verringerte Eliminationsrate (Clearance) in vivo im Vergleich zu Nativ-rt-PA gefunden. Weiterhin war bei EndoH rt-PA Typ I die Fläche unter der β-Phase der Plasmakon­ zentration-Zeitkurve (AUC _β) erhöht und die mittlere Ver­ weildauer im Plasma (mean residence time, MRT) verlängert. Folglich ist eine verbesserte Wirkung der erfindungsgemäßen Humanplasminogenaktivatoren bei der fibrinolytischen Thera­ pie zu erwarten.

Die verringerte Clearance von EndoH rt-PA Typ I und EndoH rt-PA Typ II bei gleicher oder verbesserter Clotlyse-Aktivi­ tät sind vorteilhaft, da die gleiche Wirkung wie Nativ-rt-PA bei entsprechend niedriger Gesamtdosierung erreicht werden kann. Weiterhin bietet die verlängerte mittlere Plasma-Ver­ weildauer (MRT) des EndoH rt-PA Typ I einen Vorteil für die schnelle intravenöse Injektion. Es sind keine komplizierten Verabfolgungsmaßnahmen, wie beispielsweise Dauerinfussion, not­ wendig, so daß die Möglichkeit der Verwendung von rt-PA an Orten mit beschränkter medizinischer Ausrüstung erhöht wird, z. B. in Notfall-Fahrzeugen ohne Vollmediziner in der Mann­ schaft. Eine verlängerte MRT des Human-Gewebeplasminogen­ aktivators könnte die thrombolytisch wirksame Plasmakonzentration über bis zu 45 Minuten oder länger nach einer schnellen intravenösen Injektion aufrechterhalten, und könnte auch für die Langzeittherapie mit geringen Dosen nützlich sein, die z. B. geboten sein kann, um eine Reokklusion nach erfolgreicher akuter Thrombolyse zu vermeiden, oder für eine längere Thrombolysebehandlung im Falle eines peripheren Gefäßver­ schlusses.

Die Eliminationsrate wurde wie folgt untersucht:
EndoH rt-PA Typ I, EndoH rt-PA Typ II sowie Nativ-rt-PA wurden in einer Dosis von 0,6 mg/kg als intravenöse Infusion über 30 Minuten in Gruppen von Kaninchen (Rasse Chinchilla, Körpergewicht 2,8-3,6 kg) verabreicht. Während und nach der Infusion wurden Blutproben entnommen und die rt-PA-Konzen­ trationen im Plasma mittels eines spezifischen Enzymimmuno­ assays bestimmt. Die Plasmakonzentrationen wurden an ein pharmakokinetisches 3-Kompartimentmodell mit Hilfe eines nichtlinearen Regressionsprogrammes angepaßt, und folgende Parameter wurden bestimmt:
gesamte Plasmaclearance CL,
Halbwertszeiten t _{1/2 α} , t _{1/2 β} ,
relative Flächenanteile der α- und β-Phasen AUC _α und AUC _β, mean residence time (mittlere Verweildauer in Plasma) MRT.
(Die γ-Phase des 3-Kompartimentmodells war von vernachlässig­ barer Bedeutung).

Die für EndoH rt-PA Typ I, EndoH rt-PA Typ II sowie Nativ- rt-PA erhaltenen Pharmakokineticparameter sind in der nach­ stehenden Tabelle aufgeführt:

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können nach bekannten Me­ thoden zu pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden, wobei der Human-Gewebeplasminogen-Aktivator mit geeig­ neten pharmazeutisch annehmbaren Trägern kombiniert wird. Geeignete Träger und ihre Formulierung, einschließlich von anderen Humanproteinen (wie Human-Serumalbumin), sind z. B. in Remington's Pharmaceutical Sciences von E. W. Martin be­ schrieben. Diese Zusammensetzungen enthalten eine wirksame Menge des erfindungsgemäßen Proteins zusammen mit einer ge­ eigneten Menge eines Trägers, die eine Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung an den Patienten ermöglicht.

Der Human-Gewebeplasminogen-Aktivator kann z. B. parenteral Patienten appliziert werden, die an cardiovaskulären Störungen oder Krankheiten leiden. dIe Dosierung und Dosisrate können ähnlich gewählt werden, wie sie derzeit bei klini­ schen Untersuchungen anderer cardiovaskulärer thrombolytischer Mittel angewandt werden, z. B. etwa 1 bis 2 mg/kg Körper­ gewicht als intravenöse oder intraarterielle Dosis über 1,5 bis 12 Stunden bei Patienten, die z. B. an Herzinfarkt oder Lungenembolie leiden.

Als Beispiel für eine geeignete Dosierungsform kann eine Ampulle angegeben werden, die 50 mg Human-Gewebeplasminogen- Aktivator, Arginin, Phosphorsäure und Polysorbat 80 enthält, mit 50 ml sterilem Wasser für die Injektion rekonstruiert und mit einem geeigneten Volumen 0,9% Natriumchloridlösung vermischt werden kann.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher er­ läutern ohne diese jedoch zu beschränken.

Beispiel A

Zellfreies, rt-PA enthaltendes Medium wurde durch Ultrafil­ tration aufkonzentriert und anschließend durch Diafiltration in einen für die Beladung der folgenden Affinitätschromato­ graphie geeigneten Puffer überführt (0,3 M Phosphat, 0,02 M TPS, 0,0005% Tween 80, mit Essigsäure auf pH 8,5). Die Affini­ tätschromatographie erfolgte über eine Lysin-Sepharose- Säule. Die Trennung von Typ I und Typ II erfolgte in zwei getrennten Peaks durch Elution mit einem Arginin-haltigen Elutionspuffer.

Die beiden so gereinigten Subtypen wurden über eine Sephadex G25-Säule (Pharmacia) in Formulierungspuffer (0,2 M L-Arginin, 0,01% Polysorbat 80, mit Phosphorsäure auf pH 5,2) überführt. Die Proteinkonzentration betrug 1 mg/ml.

Beispiel 1

Die Deglykosylierung von rt-PA vom Typ I bzw. vom Typ II wurde in Arginin-Phosphat-Puffer (0,2 M pH 5,2, 0,1% Poly­ sorbat) bei 37°C in 24 Stunden mit Endoglykosidase H (4000 : 1; w/w) durchgeführt. Verwendet wurde ein Enzym aus einem rekombinanten Streptomyces lividans-Stamm (EC 3.2.196, Boehringer Mannheim). Nach Enzymbehandlung wurde das Material eingefroren (-20°C). Das Enzym wurde nicht abgetrennt und nicht inaktiviert.

Beispiel 2 Lyophilisiertes Präparat mit 2 mg endoH rt-PA Typ II

Zusammensetzung
(1) endoH rt-PA Typ II|2,00 mg
(2) Arginin	0,20 Mol
(3) Tween 80	0,01%
(4) Phosphorsäure	ad pH 7,2
(5) Wasser für Injektionszwecke	ad 1,00 ml

Herstellung

Die Hilfsstoffe (2) bis (4) werden in 2/3 der erforderlichen Menge Wasser gelöst und anschließend die exakte Menge (1) zugegeben. Es wird auf das gegebene Endvolumen aufgefüllt und durch ein 0,22 µm-Filter filtriert. Es wird abgefüllt, lyophilisiert und verschlossen.

Claims (6)

1. EndoH rt-PA vom Typ I oder vom Typ II, dadurch gekenn­ zeichnet, daß rt-PA vom Typ I oder vom Typ II ohne Beein­ flussung der Struktur an den Aminosäureresten 184 und 448 am Aminosäurerest 117 nur noch einen N-Acetyl-glucosaminorest enthält.

2. EndoH rt-PA vom Typ II gemäß Anspruch 1

3. Arzneimittel, enthaltend ein EndoH-rt-PA gemäß Anspruch 1 oder 2 neben einem oder mehreren inerten Trägerstoffen.

4. Verwendung von einem EndoH rt-PA gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Arzneimittels, welches zur Lyse-Therapie geeignet ist.

5. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels gemäß An­ spruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein EndoH rt-PA gemäß Anspruch 1 oder 2 in einen oder mehrere inerte übliche Träger eingearbeitet wird.

6. Verfahren zur Herstellung von EndoH rt-PA gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß rt-PA vom Typ I oder vom Typ II oder ein Gemisch hiervon mit Endoglycosidase H behandelt wird und das so erhaltene endoH rt-PA nach üblichen Methoden aufgereinigt wird.