DE3779442T2 - Nebel-zellkultur. - Google Patents
Nebel-zellkultur.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft das Kultivieren von Zellen und insbesondere die Gewebevermehrung und Produktrückgewinnung unter axenischen Bedingungen.
- Die Zellkultivierung für metabolische und andere Erzeugnisse nimmt ständig an Bedeutung zu, da die Herstellung dieser Produkte in Laboratorien wirtschaftlich nicht mehr realisierbar bzw. technologisch nicht mehr durchführbar ist. Desweiteren ermöglichen DNA Kombinations- und ähnliche Techniken die Erzeugung von Zellarten, die zahlreiche Produkte in bisher unbekannten Mengen herstellen können. Somit ist die Zellkultivierung und das Erreichen von hoher Erträge ein Hauptziel einer wachsenden Anzahl von Herstellerfirmen.
- Herkömmliche Züchtungsmethoden beruhen auf der Versorgung von Pflanzengeweben mit Mineralien, Wachstumreglern und einer Kohlenstoffquelle, normalerweise Saccharose, durch Einlagerung dieser Bestandteile in ein erstarrtes Gel. Das Pflanzengewebe wird dabei auf die Oberfläche des Gels gebracht, und Nährstoffe werden aus dem Gel aufgenommen. Diese Züchtungsmethode zeigt jedoch einige Probleme, die einem optimalen Wachstum des Pflanzengewebes entgegenstehen. Viele anfängliche Explantationen und einige Kalluskulturen erzeugen und bringen Verbindungen ins Medium, die ein Wachstum der Pflanzengewebe hemmen, entweder durch Herabsetzen der Zellteilungsrate oder durch Zerstörung des Gewebes. Eine solche Ausbreitung verlangt häufiges Übertragen des Gewebes auf ein neues Medium, und dies erfordert wiederum sowohl die Nutzung eines zusätzlichen Mediums und seine Vorbereitung als auch Arbeit. Da das Pflanzengewebe notwendigerweise in engem Kontakt mit dem Medium wächst, ist die maximale Verfügbarkeit von Sauerstoff auf die Oberseite des Kallus oder des Gewebes beschränkt. Dadurch wird jedoch die Atmung auf der Unterseite des Kallus beeinträchtigt, und dies hat wieder häufig ein reduziertes Wachstum in diesem Bereich zur Folge. Sowohl differenziertes als auch undifferenziertes Pflanzengewebe erzeugt volatile Wachstumsregler, insbesondere Athylen, die die Form und die Wachstumsrate des Gewebes verändern. In herkömmlichen Züchtungsgefäßen, oft Petritellern oder anderen Kunststoff- oder Glasbehältern, können diese leicht flüchtigen Verbindungen ein zweckdienliches Wachstum des Gewebes fördern oder hindern. Da alle Nährstoffe, Wachstumsregler und Kohlenstoffquellen für das Wachstum des Pflanzengewebes durch das gelartige Medium hindurchtreten müssen, wird die Wachstumsrate des Gewebes durch diese Diffusionsrate begrenzt.
- Um zumindest einige der beschriebenen Probleme in der Pflanzenkultur zu beseitigen, wurden und werden häufig zur Züchtung vieler Zellarten Schwebezellkulturen benutzt. In der Pflanzenzellkultur wird die Keimbildung in Schwebekulturen durch Beeinflussung des Wachstumsreglers des verwendeten Mediums gefördert. Die Kulturen benötigen regelmässige Unterkulturen und können unter verminderter Nährstoffzufuhr bzw. unter giftigen Verbindungen im Medium leiden, wenn sie nicht regelmässig umgesetzt werden. Belüftung dieser Kulturen erfolgt normalerweise durch Schütteln der Behälter; somit wird nur eine geringfügige Kontrolle der wasserlöslichen volatilen Gase, wie z.B. Athylen, ausgeübt. Somit bleibt die Belüftung ein wesentliches Problem für Kultur aller Zellarten gemäß Schwebemethoden.
- Weitere Züchtungsmethoden umfassen Mehrplattensuspensionsvermehrer, Glasperlenvermehrer, und röhren- und spiralförmige Dünnschichten. Mehrplattenvermehrer weisen eine Anzahl von Trägerschichten innerhalb einer flüssigen Suspension auf. Dieses System hat jedoch dieselben Nachteile wie andere Schwebekultivatoren, insbesondere eine schlechte Gasdiffusion und eine Anhäufung von Schadstoffen innerhalb der Suspension. Glasperlenvermehrer umfassen mit Zellen bedeckte Glasperlen. Die Perlen stellen eine größere Haftfläche für die Zellen dar. Nicht nur, daß durch diese Methode das Problem der Gasdiffusion nicht beseitigt wird, sondern die Zellen werden überdies großem mechanischen Streß ausgesetzt und dies wirkt sich in hohen Zellverlusten und den damit verbundenen niedrigen Erträgen aus. Bei der Verwendung von röhren- und spiralförmigen Dünnschichten oder von hohlen durchlässigen Fasern, werden Zellen auf die Innenseite eines gasdurchlässigen Rohres geführt. Flüssiger Nährstoff wird durch die Innenseite dieses Rohres geleitet. Diese Methode ist ebenfalls mit den oben beschriebenen Diffusionsproblemen behaftet, indem innerhalb der äußeren Zellen liegende Zellen zunehmend geringeren Mengen von diffundierenden Gasen ausgesetzt sind.
- Es ist daher Ziel der Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Zell- und Gewebekultivierung zu schaffen. Desweiteren ist es Ziel der Erfindung, eine Kultivierung einer Zellenart unter axenischen Bedingungen vorzusehen.
- Ein weiteres Ziel ist es, eine bislang unerreicht hohe Gaszufuhr zu den Zellkulturen sowie eine unbegrenzte Zufuhr von gelösten Nährstoffen zu gewährleisten.
- Darüberhinaus ist es ein Ziel, für eine verbesserte Wachstumsrate der meisten Zellarten einschließlich Pflanzenzellen und Hybridzüchtungen, mit Hilfe einer einzigen Vorrichtung zu erzielen.
- Ein weiteres Ziel ist es, den Arbeitsaufwand bei der Kultivierung von Pflanzen und anderer Gewebearten zu reduzieren. Ferner sollen beständige wiederholbare Zellkulturen durch zweckdienliche und kostengünstige Vorrichtungen und Verfahren gewonnen werden. Ein damit verbundenes Ziel ist die Schaffung eines sich selbst ausgleichenden und durch einen Mikroprozessor steuerbaren Kultivierungssystems, bei dem die menschliche Tätigkeit auf ein Minimum reduziert ist und dennoch hohe Erträge erzielt werden.
- Die oben beschriebenen und hiermit in Verbindung stehenden Ziele werden erfindungsgemäß durch eine Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen in mit Nährstoff angereicherter feuchter Umgebung erzielt. Zellen werden mit leicht verfügbaren gasförmigen und flüssigen Nährstoffen versehen. Axenische Bedingungen sind vorgesehen, um die Züchtung von besonders ausgeprägten Zellarten zu ermöglichen.
- Nach einem Ausführungsbeispiel der Erfindung befindet sich eine Nebelabgabevorrichtung innerhalb einer abdichtbaren Kammer. Flüssiger Nährstoff wird von einem abdichtbaren Behälter an die Nebelabgabevorrichtung geleitet und die Zufuhr durch ein Pumpen oder durch ein unter Druck stehendes Gas ermöglicht. Die Nebelabgabevorrichtungen sind so gewählt, daß sie Nebeltröpfchen von 0,1 bis 100 um abgeben statt, wie dem Stand der Technik (siehe JP-A-5 945 879) entnehmbar, eines Sprühnebels mit typischen Tröpfchen im Bereich von 100 bis 5000 um. Es können Ergebnisse mit einer Tröpfchengröße von 10 bis 100 um erzielt werden, doch der niedere Bereich von 0,01 bis 10 um wird bevorzugt. Bei der Verwendung von Gas für die Zirkulation der Flüssigkeit, wird dieses vorzugsweise so gewählt, daß für die Zellen primäre metabolische Bedingungen herrschen. Für Aeroben, wird ein sauerstoffhältiges Gas gewählt, während für Anaeroben ein Gasersatz, wie Stickstoff, Verwendung findet.
- Die Zellen ruhen auf einem biologisch inerten Teil. Das Material wird ausgewählt, um widerstandfest gegen Fäulnis mit begleitender Einführung von Schmutzstoffen zu sein. So wurden rostfreier Stahl und Kunststoff, einschließlich TEFLON, einem Warenzeichen von DuPont, als geeignet befunden. In einem Ausführungsbeispiel sind ein oder mehrere Gitter vorgesehen, die die Zellen innerhalb der Kammer tragen.
- Verbundener Nährstoffdringt durch den Träger und wird zur Produktrückgewinnung und zur Wiederverwendung der Medien in einem Sammelbereich aufgefangen. In einem anderen Ausführungsbeispiel wird durch ein zusammengerolltes Gitter eines biologisch inerten Materials eine große Oberfläche gebildet, auf der haftende Organismen, wie z.B. Tierzellen, gezüchtet werden können.
- Nach einem weiteren Vorschlag der Erfindung wird eine Beschallungs-Nebelabgabevorrichtung verwendet, durch die das Medium beim Austritt aus der Nebelabgabevorrichtung am Schäumen gehindert wird. Es hat sich z.B. erwiesen, daß Medien mit hohen Proteinmengen, wie z.B. ein Serum, leicht schäumen, wenn sie von herkömmlichen Nebelabgabevorrichtungen abgegeben werden. Bei Beschallungsvorrichtungen oder Ultraschallvorrichtungen verteilen Schallwellen die Flüssigkeit innerhalb eines Bereichs kleiner Teilchen.
- Nach einem anderen Vorschlag der Erfindung ist eine metabolisch verwendbare Lichtquelle vorgesehen. Die Lichtquelle kann entweder innerhalb oder außerhalb der Kammer angebracht werden, abhängig von den Raum- und Absorptionsbedingungen.
- Nach noch einem zusätzlichen Aspekt der Erfindung findet eine Zentraleinheit, wie z.B. ein Computer-Mikroprozessor mit zugehöriger Hardware, Monitoren und Ablaufsteuerparameter Verwendung. Elektromagnete und Druckregler, die von außen einstellbar sind, werden zur Steuerung von flüssigen bzw. gasförmigen Nährstoffen verwendet. Die Zentraleinheit kann so programmiert werden, daß Häufigkeit und Dauer der Nebelabgabe, Feuchtigkeit, Temperatur und andere Ablaufparameter ständig den Bedürfnissen der zu züchtenden Organismen angepaßt werden können. Damit im Zusammenhang ist der Zellträger als Förderband zur Bewegung der Zellen innerhalb der Kammer ausgebildet. Dementsprechend ist das Zu- und Abführen der Zellen daher zusätzlich zu den oben beschriebenen Züchtungsparametern automatisierbar.
- Zu noch einem weiteren Ausführungsbeispiel können gas- oder flüssigkeitsdurchlässige Behälter innerhalb der erfindungsgemäßen Kammer vorgesehen sein, in denen die Zellen zur zweckdienlichen Handhabung und um eine zusätzliche Wachstumsfläche zu schaffen, vorgesehen sind.
- Weitere Aspekte der Erfindung ergeben sich aus den verschiedenen Darstellungen in Verbindung mit den Zeichnungen. Es zeigen:
- Figur 1 eine schematische Ansicht einer Zell-Kultivierungseinrichtung nach der Erfindung;
- Figur 2 eine schematische Ansicht einer Mehrträgervorrichtung nach der Erfindung;
- Figur 3 eine perspektische Ansicht einer alternativen Vorrichtung nach der Erfindung, zur Veranschaulichung eines intern angeordeten Förderers;
- Figur 4 eine schematische Ansicht einer alternativen Vorrichtung nach der Erfindung, zur Veranschaulichung eines gerollten netzartigen Trägers und einer im Inneren vorgesehenen Lichtquelle;
- Figur 5 einen durchlässigen kissenartigen Zellträger nach der Erfindung, der im Inneren der in Figur 1 dargestellten Vorrichtung vorgesehen ist.
- Wie sich unter Bezugnahme auf die Figuren ergibt, sieht die erfindungsgemäße Vorrichtung zum Kultivieren von Geweben eine nährstoffreiche Umgebung vor, während metabolische und Abfallprodukte ständig entfernt werden.
- Fig. 1 zeigt, daß die Vorrichtung 10 eine Wachskammer 12 aufweist, die abdichtbar ist, um axenische Bedingungen beizubehalten. Die Kammer 12 ist vorzugsweise aus Glas, Plexiglas oder aus einem anderen biologisch inerten durchsichtigen Material hergestellt. Wenn sterilisieren durch Hitze erforderlich ist, werden Materialien wie Glas, Polykarbonat, Polyamid und ähnliche Materialien bevorzugt. Ein Schirm 14 aus biologisch inertem Material weist eine Gitter- bzw. Porengröße auf, die zwar Zellen trägt, jedoch dennoch eine gute Entwässerung gewährleistet. In der Nähe des Schirmes 14 ist eine Zellen einfuhr- und -entnahmeöffnung 16 vorgesehen. Am Boden oder am unteren Ende der Kammer 12 befindet sich eine Säuberungs- und Sterilisierungs- Zutrittsöffnung 18.
- Die metabolischen Zellbedingungen werden in Form von Nährstoffsuspensionen und Gasen gewährleistet. Gaszylinder 20 und Regler 22 sorgen für eine optimale Mengenzufuhr der benötigten Gase, wie z.B. Luft, höhere Sauerstoff- oder Karbondioxydkonzentrationen, beispielsweise Stickstoff, im Falle von zu züchtenden Anaeroben. Durch einen Filter 24 werden Verschmutzungen und andere Organismen entfernt.
- Im Behälter 26 wird Nährstofflösung oder Medium im Behälter 26 aufbewahrt. Eine passende Abdeckung 28 sorgt für Sterilität im Behälter 26. Nötigenfalls kann eine Pumpe 30 Anwendung finden, um die Lösung zu Kammer 12 oder zur Nebelabgabevorrichtung 32 zu pumpen.
- Die Nebelabgabevorrichtung 32 gibt mittels unter Druck stehendem Gas oder durch eine Pumpe Lösungsnebel ab. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Tröpfchengröße im Bereich zwischen 1 und 100 um. Ist die Nährstofflösung proteinangereichert oder beinhaltet eine andere Substanz, die in herkömmlichen Nebelabgabevorrichtungen schäumen würde, sieht die Erfindung eine Beschallungs-Nebelabgabevorrichtung vor. Erfahrungsgemäß wird dadurch ein Durchblasen oder Schäumen der Lösung verhindert. Innerhalb der Kammer herrscht infolge ihrer Abdichtung ein Überdruck. Ein Austritt 34 für gefiltertes Gas ist vorgesehen, um den Druck zu mindern, obwohl es vorteilhaft ist, einen leichten Überdruck beizubehalten, um die axenischen Bedingungen aufrecht zu erhalten. Obwohl der Gaszylinder 20 nicht für alle Zellarten benötigt wird, wird er vorzugsweise für diesen Zweck verwendet.
- Eine Lichtquelle 36 ist für den Pflanzenzellmetabolismus vorgesehen. Als Alternative kann diese Lichtquelle 36 auch innerhalb der Kammer 12 angebracht sein.
- Sekundäre Metaboliten werden als Teil des verwendeten flüssigen Nährstoffausflusses im unteren Bereich der Kammer 12 gesammelt. Die Flüssigkeit fließt zu einem Produktsammelbehälter 38 und wird bei 40 verarbeitet. Während der Verarbeitung werden die gesammelten Zielprodukte getrennt, und Zelltoxine werden, so dies wirtschaftlich realisierbar ist, beseitigt. Wiederverwendbares Medium wird durch die Leitung 42 in den Sammelbehälter 26 zurückgeführt.
- In Figur 2 ist eine in sich abgeschlossene Vorrichtung 100 nach der Erfindung dargestellt. Eine Kammer 102 weist eine Vielzahl von Nebelabgabevorrichtungen 110 in einer Vielzahl von einzelnen Kammern 112 auf. Die Kammer 112a beinhaltet einen Nährstoffbehälter 26 und einen Gaszylinder 20 sowie entsprechende Teile, wie sie vorstehend beschrieben und analog gekennzeichnet sind. Die Vorrichtung 100 weist weiterhin ein elektronische Steuergerät 114 zur Fernsteuerung der Nährstoff- und Gaszufuhr durch einen Mikroprozessor auf. Entwässerungssammler 116 leiten die Flüssigkeit zu einem Sammelbehälter 118, wo die Materialien zurückgewonnen und entweder verarbeitet oder wieder verwendet werden.
- In Figur 3 ist eine Alternativ-Vorrichtung 200 nach der Erfindung dargestellt. Ein netzartiges Förderband 202 aus inertem Material läuft innerhalb einer Eingrenzung 204 um. Der Motor 206 und der Reduktionsgetriebe 208 treiben den Riemen 202 mit niedriger Geschwindigkeit an. Dabei werden neue Zellen über die Ladeöffnung 210 hinzugeführt und über die Abfuhröffnung 212 wieder entnommen. Wie vorstehend beschrieben, erfolgt die Nährstoffzufuhr durch Nebelöffnungen 214. Alternativ kann auch eine Anzahl von Ultraschall- Nebelabgabevorrichtungen zugeordnet sein.
- Figur 4 zeigt einen anderen praktischen Kultivator 300 für Organismen, die zum Waxhstum einen Festhalteträger benötigen. Ein zusammengerolltes Gitter 301 aus inertem Material, wie z.B. Nylon oder Polypropylen, dient als Zellenträger. Durch Hindurchführen durch eine die Zellen enthaltende Lösung wird das Gitter geimpft. Um die Halterung zu verbessern, wird ein biologisches "Klebemittel", wie z.B. Polylysin auf das Gitter gesprüht. Desweiteren ist es möglich, die Zellen kovalent mit dem Zelluloseträger zu verbinden. Die Zellen werden wiedergewonnen bzw. entfernt durch Schockieren mit einer der vielen bekannten Verbindungen, wie z.B. Trypsin für Hybridome, die ein Ablösen hervorrufen. Eine größere Zutrittsöffnung 302 erleichtert Aufnahme und Entfernung der zusammengerollten netzartigen Trägermatrize. Nebelabgabevorrichtungen 304 sind so angeordnet, daß eine Netzstörung minimal gehalten wird, während jedoch für eine optimale Nährstoffverteilung gesorgt ist. Die Lichtquelle 306 ist in der Kammer 12 angeordnet. In dem in Figur 4 dargestellten Ausführungsbeispiel kann das Gitter 301 um eine zentral angeordnete Lichtquelle gewickelt sein. Um das Einsetzen und Entnehmen des Netzes 301 zu erleichtern, ist die Lichtquelle 306 vorzugsweise entfernbar.
- Gemäß der Erfindung werden die Zellen und Gewebe so kultiviert, daß nützliche Erzeugnisse bei niederen Kosten und hohen Erträgen produziert werden. Die Zellen werden in einer feuchtigkeits- und nährstoffreichen Umgebung kultiviert. Um den sterile Bedingungen zu gewährleisten und die Kulturen von Gegnern und der Konkurrenz fern zu halten, sind die Ausführungsformen abgedichtet.
- Nach dem Stand der Technik werden, Pflanzengewebekulturen auf einem festen Nährstoffträger gezüchtet. Durch das Metabolisieren der Pflanzenzellen treten Giftstoffe auf, sodaß Medien ihre Wachstumsfähigkeit verlieren. Durch die Erfindung wird das notwendige Umpflanzen der Zellen auf einen neuen Medienträger umgangen, indem angesammelte Medien und Produkte ebenso wie Giftstoffe von den Zellen abgeleitet werden. Dies ermöglicht eine Kultivierung der Zellen bis zu dem gewünschten Stadium, z.B. bis sich kleine Pflanzen bilden, jedoch ohne mühevolles und überflüssiges wiederholtes Umpflanzen.
- Die Erfindung sieht die Züchtung aller Zellarten, einschließlich Anaeroben vor. Feinmaschige Gitter 14 können zum Festhalten und Freigeben von Zellen, einschließlich Hybridomen verwendet werden. Desweiteren kann die erfindungsgemäße Vorrichtung in Verbindung mit anderen Zellträgerstrukturen verwendet werden. Wie aus Fig. 5 entnehmbar, erlaubt eine kissenähnliche Vorrichtung 33 den Durchtritt von Gasen und Nährstoffen, verhindert jedoch ein Ausströmen von Zellen.
- Ein Hauptproblem in Zellschwebekulturen ist die Sauerstoff-Austauschrate zwischen der Schwebeflüssigkeit und der umgebenden Atmosphäre. Die Erfindung löst dieses Problem, indem die Zellen von einer hochnährstoffgesättigten Atmosphäre umgeben werden. Bei Durchführung der Erfindung ist es von größter Wichtigkeit, daß die Zellen nicht mit Nährstoff besprüht werden. Dieses Sprühen hätte die Bildung von Tröpfen zur Folge, groß genug, eine durchgehende Flüssigkeitszwischenschicht zu bilden, die als sauerstoffmindernde Barriere wirken würden. Nach der Erfindung dürfen sich Tröpfchen letztlich an verschiedenen Stellen bilden; die Zellen sind jedoch in einer hochgesättigten Atmosphäre, ohne den Nähstoff zu beschichten. Dadurch sind die Zellen ständig gut mit Sauerstoff versorgt. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß die Nährstoffe nicht durch einen festen Gelträger hindurch diffundieren müssen und dadurch im vollen Umfang zur Verfügung stehen, der durch die Zellen gefordert wird.
- Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist das leichte Entfernen der sekundären Metaboliten. Da die Zellen oberhalb des Wannenbereichs 17, 110, 216 getragen werden, kann der angesammelte Abfluß entweder ganz oder teilweise, in Abhängigkeit vom organischen Metabolismus, wieder zurückgeführt werden.
- Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist die enorme Arbeitsersparnis. Wie vorstehend bereits beschrieben, muß das Gewebe nicht umgepflanzt werden. Desweiteren sind alle Ablaufparameter leicht durch einem Mikroprozessor steuerbar, was den Arbeitsanfall weiter reduziert und den Bestand verbessert. Dazu wird eine Vorrichtung vorgesehen, die nur an einem Ende eines Förderers 202 eine Zellimpfung und die Entnahme des Produktes am anderen Ende vorsieht. Innerhalb der Kammer 204 kann eine Vielzahl von Förderern vorgesehen sein, um den Produktertrag zu steigern.
- In den Tabellen 1 und 2 sind die erreichten Testergebnisse von Zellen auf der Vorrichtung nach Figur 1 im Vergleich mit einem Pflanzengewebekallus auf herkömmlichen Agarplatten dargestellt. Die Keimfreihaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung wurde durch aufeinenderfolgendes Ausspülen der Vorrichtung mit einer Hypochloridlösung, Ethanol und sterilem destilliertem Wasser erreicht. Dann wurde die Einheit unter eine laminare Fließhaube gestellt und 8 Stunden getrocknet. Es wurde eine Standardvorratslösung eines M+S Mediums aus 0,1 ppm 2,4-D (2,4-Dichlorphenoxy-Essigsäure) vorbereitet, die in einem mittleren Tank angeordnet und sodann 20 Minuten unter einem Druck von 6,795 kg (15 lbs) autoklav behandelt wurde. Gleichmässige Karottenkallusabschnitte wurden von den vorhandenen Kulturen mit Hilfe eines sterilen Korksbohrers abgetrennt. Jedes Muster wurde für sich auf einer keimfreien Petrischale von bekannter Masse gewogen.
- Das Medium wurde in die Vorrichtung mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ml pro Stunde in einzelnen 5- Sekundenschüben eingebracht. Bei Beendung des Experimentes, das 3 Wochen dauerte, wurden die Kalli entfernt, einzeln gewogen und zur abschließenden Auswertung festgehalten. Die aufgrund des Wiegens erhaltenen Daten sind in Tabelle 1 aufgeführt.
- Insgesamt wurden 16 Karottenkalluskerne entnommen, einzeln gewogen und ausgesucht plaziert, entweder innerhalb der Vorrichtung oder auf einer Petrischale, die das gleiche Medium enthält. Die Gewichte und die relativen Plazierungen der Kerne wurden am Anfang des Tests festgehalten und sind in Tabelle 1 wiedergegeben.
- Das Gesamtresultat des Tests ist aus Tabelle 2 ersichtlich. Es zeigte sich ein lklares mittleres Wachstum von 28% bei dem in der Vorrichtung gezüchteten Kallus, verglichen mit einer mittlere Wachstumsrate von 8% der Muster auf dem Agar.
- Allgemein, wuchs der Kallus in der erfindungsgemäßen Vorrichtung 3,5 mal so stark wie der Vergleichskallus. Beim Beenden des Tests konnte man zusätzlich einen offensichtlichen Unterschied im Gesamteindruck der beiden Kallussätze feststellen. Der Kallus in der Vorrichtung zeigte ein knotiges und fast sphärisches Wachstum des neuen Gewebes. Im Gegensatz dazu zeigte die Agarzüchtung ein ziemlich unregelmäßiges, knorriges Wachstumsmuster. TABELLE 1 KALLUS WACHSTUM VORRICHTUNG AGAR MITTEL SD * * Probeverzögerung
- Tatsächliche numerische Ergebnisse und statistische Meßwerte eines jeden Kallus. Die unausgefüllten Stellen in der letzten Agarspalte stammen von zwei Kalli, die unvollständige Daten aufwiesen. Die Einheiten in den Tabellen 1 und 2 sind Gramm x 10&supmin;&sup4;. TABELLE 2 URSPRÜNGLICHES GEWICHT ./. ENDGEWICHT: GEWEBEKULTIVIERUNGSVORRICHTUNG NACH FIG. 1 (CX) AGARSCHALE NACH DEM STAND DER TECHNIK (AX) ENDGEWICHT URSPRÜNGLICHES GEWICHT
- Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich von Hydroponiken in einer Anzahl bedeutender Gesichtspunkte. Das Nir erteilte US-Patent 4 332 105 darf als repräsentatives Beispiel der Pflanzenkultivierung hydroponischer Art angesehen werden. Die hydroponischen Vorrichtungen sind entworfen, um unterschiedlichem Gewebe zu entsprechen, wobei ein ganzer Pflanzenorganismus Wurzeln und Blätter umfaßt, die jeweils auf unterschiedliche Weise behandelt werden. Die Erfindung kultiviert undifferenzierte Gewebe, die nicht nach hydroponischen Methoden kultiviert werden können, welche Wurzeln und andere derart differenzierte Strukturarten erfordern. Außerdem sehen hydroponische Vorrichtungen nicht die Sammlung von sekundären Metaboliten vor; ein bedeutender Vorteil, der durch die vorliegende Erfindung gegeben ist. Unter anderen Aspekten, die ihren Gebrauch bei der Kultivierung von Zellen oder undifferenziertem Gewebe verbieten, gewährleisten diese Vorrichtungen nach dem Stand der Technik nicht axenisches Wachstum: Gasselektion und -steuerung; genaue Temperatursteuerung; Nebelbildung, wo es der Umgebung an Sprayeinrichtungen oder bedeutenden Flüssigkeitslagern mangelt.
Claims (20)
1. Vorrichtung zum Kultivieren von Zellen, umfassend:
eine Zuführung für flüssigen Nährstoff;
eine Kammer;
mit der genannten Kammer kooperative Einrichtung zum
Emittieren eines Nebels aus Tröpfchen mit einem
Durchmesser von 0,1 bis 100 um;
einen Träger für die Zellen, der für den genannten
flüssigen Nährstoff durchlässig und innerhalb der
genannten Kammer angeordnet ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die genannte
Einrichtung zum Emittieren eines Nebels Ultraschallwellen
einsetzt.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die genannte
Einrichtung zum Emittieren eines Nebels umfaßt:
eine nebelemittierende Düse; und
eine Zuführung für Druckgas, um die genannte
Flüssigkeitszufuhrmenge durch die genannte Düse zu treiben.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, worin das genannte Gas eine
primäre Stoffwechselnotwendigkeit für die Zellen
darstellt.
5. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin der genannte Träger
ein biologisch inertes Gitter ist.
6. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin der genannte Träger
ein gefaltetes Sieb aus biologisch inertem Material ist.
7. Vorrichtung nach Anspruch 1, die des weiteren eine
Zuführung für metabolisch vewrwendbares Licht umfaßt.
8. Vorrichtung nach Anspruch 1, des weiteren umfassend:
einen elektronischen Prozeßsteurer;
worin Verfahrensparameter der Vorrichtung vom genannten
Prozeßsteurer überwacht und gesteuert werden.
9. Vorrichtung nach Anspruch 1, des weiteren umfassend:
zusätzliche Träger für die Zellen.
10. Vorrichtung nach Anspruch 1, des weiteren umfassend:
Einrichtungen zum Befördern des genannten Trägers
innerhalb der genannten Kammer.
11. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin der genannte Träger
gasdurchlässig ist.
12. Vorrichtung zum Kultivieren von Zellen, umfassend:
eine Zuführung für sterilen flüssigen Nährstoff;
eine Kammer, die eine Vielzahl von abdichtbaren Öffnungen
aufweist;
zumindest eine Einrichtung zum Emittieren eines Nebels,
die so funktioniert, daß Nebelpartikel mit einem
Durchmesser von zwischen 0,1 und 100 um innerhalb der
genannten Kammer abgegeben werden;
einen Träger zum Halten der Zellen innerhalb des durch
zumindest eine Einrichtung zum Emittieren eines Nebels
erzeugten Nebels;
worin innerhalb der genannten Kammer axenische
Bedingungen
beibehalten werden.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, worin die genannte
Einrichtung zum Emittieren eines Nebels:
zumindest eine Düse; und
eine Zuführung für Druckgas, die so funktioniert, daß die
genannte Zufuhrmenge an flüssigem Nährstoff durch die
genannte zumindest eine Düse getrieben wird,
umfaßt.
14. Vorrichtung nach Anspruch 12, worin die genannten
Einrichtungen zum Emittieren eines Nebels jeweils umfassen:
zumindest eine Ultraschall-Vernebelungsvorrichtung;
Einrichtungen zum Verteilen des Nebels über die genannte
Kammer.
15. Verfahren zum Kultivieren von Zellen, folgende Schritte
umfassend:
(a) Aufbringen der Zellen auf einen flüssigkeits- und
gasdurchlässigen Bauteil;
(b) Halten des Bauteils innerhalb eines abdichtbaren
Behälters;
(c) Vernebeln eines flüssigen Nährstoffes in Tröpfchen
mit einem Durchmesser von 0,1 bis 100 um in die
Kammer, um eine mit Nährstoff feuchte Umgebung zu
schaffen.
16. Verfahren nach Anspruch 15, des weiteren den Schritt des
(d) Einbringens eines Gases in den abdichtbaren Behälter
umfassend.
17. Verfahren nach Anspruch 16, des weiteren den Schritt
des
(e) Steuern des Eintretens von Gas und Nährstoffen mit
einem Verfahrenssteurer und zugehöriger Hardware
umfassend.
18. Verfahren nach Anspruch 15, worin in Schritt (c) die
Nebeltröpfchen im Bereich von 0,1 bis 10 um liegen.
19. Verfahren nach Anspruch 15, worin in Schritt (a) der
flüssigkeits- und gasdurchlässige Bauteil ein Gitter aus
biologisch inertem Material ist.
20. Verfahren nach Anspruch 15, worin in Schritt (a) der
flüssigkeits- und gasdurchlässige Bauteil ein gefaltetes
Sieb aus biologisch inertem Material ist.
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