DE3733453A1 - Verfahren und kultivierungsmedium zur kultivierung von hybridom- und myelomzellen - Google Patents
Verfahren und kultivierungsmedium zur kultivierung von hybridom- und myelomzellenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie ein protein
freies synthetisches Kultivierungsmedium zur Kultivierung
von Hybridom- und Myelomzellen.
Die durch die somatische Hybridisierung von Myelomzellen
und einen Antikörper synthetisierenden Lymphocyten zugäng
lichen Hybridome werden industriell zur Produktion mono
klonaler Antikörper herangezogen. Myelomzellen, in die mit
gentechnischen Methoden ein Gen für die Synthese eines
biologisch aktiven Eiweißstoffes, beispielsweise eines
Enzyms, eines Enzyminhibitors, eines Hormons oder eines
Immunregulators, eingeführt wurde, werden auch industriell
zur Produktion dieser Proteine herangezogen. Der wachsende
Bedarf an verschiedenen monoklonalen Antikörpern, insbe
sondere für therapeutische Zwecke und für die Immunoaffi
nitätschromatographie, wobei Kilogrammmengen erforderlich
sind, sowie der Bedarf an verschiedenen Regulatorproteinen
für therapeutische Anwendungszwecke führten zur Bemühung,
wirksamere und wirtschaftlich vorteilhaftere Verfahren zur
Herstellung dieser Stoffe zu finden.
Bis jetzt werden Hybridomzellen und Myelomzellen derart
kultiviert, daß die Zellen zunächst in Laborgefäßen, wie
Kunststoffschalen und Flaschen, vermehrt werden und die
Kultivierung sowie die Proteinproduktion in einem Indu
striefermenter beendet werden. Der monoklonale Antikörper
oder andere in das Kultivierungsmedium ausgeschiedene Pro
teinsubstanzen werden nach Abzentrifugieren oder Abfil
trieren der Zellen aus dem Kultivierungsmedium gewonnen.
Die Isolierung der produzierten Proteine ist umso schwie
riger und kostspieliger, je mehr Proteinsubstanzen das ur
sprüngliche Kultivierungsmedium enthielten.
Die Konzentration des produzierten Proteins, beispielswei
se eines monoklonalen Antikörpers, im Kultivierungsmedium
ist verhältnismäßig niedrig. Die synthetische Kultivie
rungsmedien enthalten Grundkomponenten zur Kultivierung
sowie ein Suplement.
Die Grundkomponenten des Kultivierungsmediums sind anorga
nische Salze, beispielsweise Natriumchlorid und Natrium
phosphat, Monosaccharide, beispielsweise Glucose und Ga
lactose, Aminosäuren, beispielsweise Tryptophan, Methio
nin, Threonin und Glutamin, Vitamine, beispielsweise
Thiamin und Nicotinamid, Puffersubstanzen, beispielsweise
N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure, gegebe
nenfalls Natriumpyruvat, Antibiotica und ein pH-Indikator.
Diese Grundkomponenten zur Kultivierung sind an sich für
die Kultivierung von Hybridom- und Myelomzellen ebenso wie
von anderen tierischen Zellen ungenügend und werden des
halb mit 10 Vol.-% Blutserum, beispielsweise Rinder-,
Pferde oder Kälberfetalserum ergänzt. Durch das Blutserum
werden allerdings in das Kultivierungsmedium unbekannte
Stoffe eingebracht, von denen einige das Zellwachstum för
dern und andere es hemmen können. Es ist deshalb notwen
dig, die Blutseren vor Gebrauch zu prüfen und geeignete
Chargen auszuwählen. Dadurch steigen die Kosten zur Her
stellung des Kultivierungsmediums. Aus diesem Grunde wur
den Rezepturen für sog. serumfreie Kultivierungsmedien
entwickelt, bei denen das Blutserum durch einige definierte
Proteinsubstanzen ersetzt ist, zumeist durch Transferrin,
Serumalbumin und Insulin, und die gegebenenfalls weitere
Stoffe, wie ungesättigte Fettsäuren, Amine und niedermole
kulare Hormone enthalten (Kov J., Frank F., Methods in
Enzymology 121 (1986) 277.
Sämtliche Proteine, die bis jetzt in Kultivierungsmedien
zur Kultivierung von Hybridom- oder Myelomzellen einge
setzt werden, müssen frei von toxischen Beimengungen sein,
was die Wirtschaftlichkeit des Herstellungsverfahrens be
einträchtigt. Einen weiteren Nachteil der bisherigen Kul
tivierungsmedien stellt die schwierige Isolierung der
Stoffwechselprodukte der Hybrodomzellen bzw. der Myelom
zellen aus dem Kultivierungsmedium dar, die auf einer
mehrstufigen Abtrennung der gewünschten Proteinprodukte
von in einem vielfachen Überschuß im Kultivierungsmedium
enthaltenen Proteinsubstanzen beruht.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
sowie ein Kultivierungsmedium zur Kultivierung von Hybri
dom- und Myelomzellen anzugeben, mit denen die Nachteile
des Standes der Technik vermieden werden und eine leichte
re Isolierung der angestrebten Proteine bzw. Stoffwechsel
produkte möglich wird.
Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst. Vorteilhafte Aus
führungsformen sind Gegenstand der Unteransprüche.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Verwendung
eines Kultiverungsmediums, das neben den Grundkomponen
ten, wie anorganischen Salzen in einer Konzentration von 5
bis 12 g/l, Monosacchariden in einer Konzentration von 0,3
bis 5 g/l, Aminosäuren in einer Konzentration von 0,2 bis
5 g/l, Vitaminen von einer Konzentration von 2 bis 100
mg/l, Puffersubstanzen in einer Konzentration von 0,2 bis
20 g/l, gegebenenfalls Natriumpyruvat, Antibiotica sowie
einem pH-Indikator ein Supplement enthält, das aus minde
stens einer wasserlöslichen Eisenverbindung in einer
Konzentration von 2 · 10-5 bis 10-2 mol pro Liter des Kulti
vierungsmediums besteht, vorzugsweise Eisen(III)-citrat,
Eisen(II)-sulfat, Eisen(III)-chlorid und/oder Kaliumhexa
cyanoferrat(III).
Es ist ferner vorteilhaft, wenn das Kultivierungsmedium in
Kombination mit dem Supplement noch Verbindungen biogener
Spurenelemente, insbesondere des Selens und Zinks, Ascor
binsäure, Steoridverbindungen, insbesondere Cortison bzw.
Hydrocortison und Amine, vorzugsweise Ethanolamin, ent
halten, deren Anwesenheit die Wirkungen des Supplements
steigert.
Es wurde festgestellt, daß die einzige wirklich unentbehr
liche Proteinkomponente serumfreier Kultivierungsmedien
das Transferrin darstellt (Kov J., Frank F., Methods in
Enzymology 121 (1986) 277. Da Transferrin als Überträger
von Eisen aus dem Kultivierungsmedium in die Zellen wirkt,
läßt sich die gleiche Wirkung durch Anwesenheit von
wasserlöslichen Eisenverbindungen erzielen, und zwar in
erhebliche höheren als bis jetzt in Kultivierungsmedien an
gewandten Konzentrationen. Mehrere Autoren (vgl. z. B.
Phillips P. D., Christofalo V. J., Exp. Cell Res. 134 (1981)
297; Perez-Infante V., Mather J. P., Exp. Cell Res. 142
(1982) 325; Taetle R., Rhyner K., Castagnola J., To D.,
Mendelsohn J., J. Clin. Invest. 75 (1985) 1061 verwendeten
als Ersatz für Transferrin wasserlösliche Eisenverbindun
gen in Konzentrationen von 106 bis 20 · 10-6 mol/l. Diese
Konzentrationen sind allerdings im Falle von Hybridom- und
Myelomzellen ungenügend. Es hat sich überraschenderweise
gezeigt, daß die Eisenverbindungen für Hybridom- und
Myelomzellen bis zu einer Konzentration von 10-2 mol/l
nicht toxisch sind, und ferner Konzentrationen von Eisen
verbindungen, die höher als 2 · 10-5 mol/l sind, das Wachs
tum von Hybridom- und Myelomzellen in einem proteinfreien
Kultivierungsmedium ermöglichen. Zu den Eisenverbindungen,
die das Transferrin ersetzen können, gehören beispielswei
se Eisen(III)-citrat, Eisen(II)-sulfat, Eisen(III)-chlorid
und Kaliumhexacyanoferrat(III). Die wirksamen Konzentra
tionen liegen im Bereich von 2 · 10-5 bis 10-2 mol/l.
Ein besonderer Vorteil des Kultivierungsmediums gemäß der
Erfindung liegt in der leichten Isolierung von den Zellen
ausgeschiedener Proteine, beispielsweise monoklonaler An
tikörper, da diese von den Zellen ausgeschiedenen Proteine
die einzigen nach der Kultivierung im Kultivierungsmedium
befindlichen Proteinsubstanzen sind.
Erfindungsgemäße Kultivierungsmedien und ihre Vorteile
gehen aus den nachfolgenden Beispielen hervor.
Zur Herstellung eines chemisch definierten proteinfreien
Kultivierungsmediums wurde ein Grundkultivierungsmedium
verwendet, das neben RPMI 1640-Medium noch L-Glutamin (300
µg/ml), Natriumpyruvat (110 µg/ml), N-2-Hydroxyethyl
piperazin-N'-2-ethansulfonsäure (1,5 · 102 mol/l, Penicil
lin (100 IE/ml), Streptomycin (100 µg/ml) und Gentamycin
(40 µg/ml) enthielt. Das proteinfreie Kultivierungsmedium
enthielt ferner als Serumersatz folgende Zusatzstoffe:
Ethanolamin (2 · 10-5 mol/l), Ascorbinsäure (2 · 10-5 mol/l),
Hydrocortison (5 · 10-9 mol/l), Cadmiumsulfat
(CdSO4 · 8/3H2O, 5 · 10-8 mol/l), Cobalt(II)-chlorid
(CoCl2 · 6H2O, 10-8 mol/l), Kupfer(II)-sulfat (CuSO4 · 5H2O,
10-8 mol/l), Ammoniummolybdat ((NH4)6Mo7O24 · 4H O, 5 · 10-10
mol/l), Mangan(II)-chlorid (MnCl2 · 4H2O, 5 · 10-10 mol/l),
Nickel(II)-sulfat (NiSO4 · 6H2O, 2,5 · 10-10 mol/l), Natrium
selenat(IV) (Na2SeO3, 4 · 10-8 mol/l), Natriumsilicat
(Na2 SiO3, 2 · 10-7 mol/l), Zinn(II)-chlorid (SnCl2 · 2H2O, 2,5
· 10-10 mol/l). Ammoniumvanadat(V) (NH4VO3, 2,5 · 10-9 mol/l),
Zinksulfat (ZnSO4 · 7H2O, 10-6 mol/l) und Eisen(III)-citrat
(5 · 10-4 mol/l).
In 6 ml des proteinfreien Kultivierungsmediums der angege
benen Zusammensetzung in einer Kunststoff-Petrischale
(Durchmesser 6 cm) wurden Zellen des Hybridoms PLV-Ol in
einer solchen Menge geimpft, daß die Zelldichte 50 · 103
Zellen/ml betrug. Nach 4 Tagen Kultivierung in einem Ther
mostaten in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 Vol.-%
Kohlendioxid in der Luft und bei einer Temperatur von 37
°C vermehrten sich die Zellen zu einer Zelldichte von
1,53 · 106 Zellen/ml. Die Zahl der Zellen stieg also während
der viertägigen Kultivierung ungefähr auf das Dreißigfa
che.
In einem analogen Versuch mit Zellen des Hybridoms CMH-02
vermehrten sich die Zellen aus einem Inokulum mit 25 · 103
Zellen/ml nach 4 Tagen zu einer Zelldichte von 1,36 · 106
Zellen/ml. Die Zahl der Zellen stieg bei diesem Versuch
während der viertägigen Kultivierung ungefähr auf das
Fünfzigfache.
Zellen des Myeloms FO und der Hybridome PLV-01, CMH-02 und
T3-03 werden getrennt in je 1 ml des proteinfreien Kulti
vierungsmediums der angegebenen Zusammensetzung in Vertie
fungen einer Kunststoffkulturplatte mit 24 Vertiefungen
geimpft. Nach einem Tag Kultivierung unter den oben ange
führten Bedingungen wurde die Zahl der Zellen in einer
Vertiefung bestimmt; nach weiteren 24 Stunden wurde die
Zahl der Zellen wiederum bestimmt. Auf diese Weise wurde
für jede der angegebenen Zellarten die mittlere Verdoppe
lungszeit in der Exponentialphase bestimmt. Die mittlere
Verdoppelungszeit betrug für das Myelom FO 15,6 h, für das
Hybridom PLV-01 14,8 h, für das Hybridom CMH-02 14,6 h und
für das Hybridom T3-03 11,8 h.
Zellen der Hybridome PLV-01 und PGG-05 wurden getrennt in
einer Menge von 6 · 104 Zellen in je 1 ml des proteinfreien
Kultivierungsmediums der angegebenen Zusammensetzung in
Vertiefungen einer Kunststoffkulturplatte mit 24 Vertie
fungen geimpft. Zum Vergleich wurden Zellen derselben
Hybridome in ein serumfreies Kultivierungsmedium geimpft,
das 5 mg/l Transferrin und 10 mg/l Insulin (SFH-Medium
ohne Linolsäure und Albumin, J. Kov und F. Frank,
Methods in Enzymol. 121 (1986) 277 enthielt. Nach 4 Tagen
Kultivierung unter den oben angeführten Bedingungen wurden
die Zahl der Zellen und die Konzentration des monoklonalen
Antikörpers im Kultivierungsmedium bestimmt, und zwar
unter Anwendung des enzym-immunologischen Tests, der auf
der Bestimmung der Peroxidaseaktivität beruht. Beim Wachs
tum des Hybridoms PLV-01 in einem proteinfreien Medium aus
einem Inokulum von 6 · 104 Zellen auf 8,19 · 105 Zellen wies
die in relativen Einheiten des Absorptionsvermögens ausge
drückten Konzentration des monoklonalen Antikörpers einen
Wert von A490 = 0,298 auf. In einem Vergleichsversuch mit
SFH-Medium wurden Werte von 7,06 · 105 Zellen und von A490 =
0,310 erzielt. Beim Wachstum des Hybridoms PGG-05 in einem
proteinfreien Kultivierungsmedium auf 6,75 · 105 Zellen wies
die in relativen Einheiten des Absorptionsvermögens ausge
drückte Konzentration des monoklonalen Antikörpers einen
Wert von A 490 = 1,32 auf. In einem Vergleichsversuch mit
SFH-Medium wurden Werte von 7,31 · 105 Zellen und von A490 =
1,26 erzielt.
Zellen des Hybridoms PLV-01 wurden in einer Menge von 104
Zellen in 0,1 ml des proteinfreien Kultivierungsmediums
der in Beispiel 1 angeführten Zusammensetzung in Näpfen
einer Kunststoffkulturplatte mit 96 Vertiefungen geimpft.
Zum Vergleich wurden in analoger Weise Zellen dieses
Hybridoms in ein proteinfreies Kultivierungsmedium ge
impft, worin das Eisen(III)-citrat durch Eisen(III)-chlo
rid in einer Konzentration von 5 · 10-4 mol/l ersetzt wurde.
Nach 3 Tagen Kultivierung unter den im Beispiel 1 angege
benen Bedingungen vermehrten sich die Hybridomzellen auf
1,31 · 105 Zellen im Kultivierungsmedium mit Eisen(III)-
citrat und auf 8,2 · 104 Zellen im Kultivierungsmedium mit
Eisen(III)-chlorid.
Zellen des Hybridoms PLV-01 wurden in einer Menge von 104
Zellen in 0,1 ml der in Beispiel 1 angeführten Grundkompo
nenten geimpft. Als Zusatzstoff wurde in das Kultivie
rungsmedium 5 · 10-4 mol/l Kaliumhexacyanoferrat(III) gege
ben. Nach 3 Tagen Kultivierung bei einer Temperatur von
37°C und mit 4,5 Vol.-% Kohlendioxid in einer befeuchte
ten Atmosphäre bei einem pH-Wert des Mediums von 7,4 ver
mehrten sich die Zellen auf eine Zellzahl von 6,2 · 104
Zellen.
Zellen des Hybridoms PLV-01 wurden in einer Menge von 104
Zellen in 0,1 ml der in Beispiel 1 angeführten Grundkompo
nenten geimpft. Als Zusatzstoff wurde in das Kultivie
rungsmedium Eisen(II)-sulfat in einer Menge von 10-4 mol/l
zugegeben. Nach 3 Tagen Kultivierung bei einer Temperatur
von 37°C und mit 4,5 Vol.-% Kohlendioxid in einer be
feuchteten Atmosphäre bei einem pH-Wert des Mediums von
7,4 vermehrten sich die Zellen auf eine Zellzahl von
2,5 · 104 Zellen.
Zellen des Hybridoms PLV-01 wurden in einer Menge von 104
Zellen in 0,1 ml des proteinfreien Kultivierungsmediums
mit der in Beispiel 1 angeführten Zusammensetzung geimpft,
das sich in Vertiefungen einer Kunststoffkultivierungs
platte mit 96 Vertiefungen befand, geimpft. Zum Vergleich
wurden in analoger Weise Zellen dieses Hybridoms in ein
proteinfreies Kultivierungsmedium geimpft, das neben dem
Grundmedium wie in Beispiel 1 lediglich Eisen(III)-citrat
(5 · 10-4 mol/l) enthielt. Nach 3 Tagen Kultivierung unter
den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen vermehrten sich
die Hybridomzellen im kompletten proteinfreien Kultivie
rungsmedium auf 1,18 · 105 Zellen und auf 1,03 · 105 Zellen in
einem proteinfreien Kultivierungsmedium, das lediglich
Eisen(III)-citrat enthielt.
Claims (18)
1. Verfahren zur Kultivierung von Hybridomzellen und
Myelomzellen in Kultivierungsmedien, die anorganische
Salze in einer Konzentration von 5 bis 12 g/l, Mono
saccharide in einer Konzentration von 0,3 bis 5 g/l,
Aminosäuren in einer Konzentration von 0,3 bis 5 g/l,
Vitamine in einer Konzentration von 2 bis 100 mg/l,
Puffersubstanzen in einer Konzentration von 0,2 bis 20
g/l, gegebenenfalls Natriumpyruvat, Antibiotica, einen
pH-Indikator sowie ein Supplement enthalten,
dadurch gekennzeichnet,
daß dem Kultivierungsmedium als Supplement mindestens
eine wasserlösliche Eisenverbindung in einer Konzentra
tion von 2 · 10-5 bis 10-2 mol/l zugesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
dem Kultivierungsmedium als wasserlösliche Eisenverbin
dung Eisen(II)-sulfat, Eisen(III)-citrat, Eisen(III)-
chlorid und/oder Kaliumhexacyanoferrat(III) zugesetzt
werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich
net, daß dem Kultivierungsmedium Verbindungen biogener
Spurenelemente in einer Konzentration von 0,002 bis 2
mg/l zugesetzt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß
dem Kultivierungsmedium als Verbindungen biogener Spu
renelemente Verbindungen von Selen und/oder Zink
zugesetzt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge
kennzeichnet, daß dem Kultivierungsmedium Ascorbinsäure
in einer Konzentration von 1 bis 100 mg/l zugesetzt
wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge
kennzeichnet, daß dem Kultivierungsmedium Steroidver
bindungen in einer Konzentration von 0,0001 bis 0,01
mg/l zugesetzt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß
dem Kultivierungsmedium als Steroidverbindungen Corti
son und/oder Hydrocortison zugesetzt werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch ge
kennzeichnet, daß dem Kultivierungsmedium Amine in
einer Konzentration von 0,1 bis 15 mg/l zugesetzt wer
den.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß
dem Kultivierungsmedium als Amin Ethanolamin zugesetzt
wird.
10. Kultivierungsmedium zur Kultivierung von Hybridomen
und Myelonzellen, das anorganische Salze in einer
Konzentration von 5 bis 12 g/l, Monosaccharide in
einer Konzentration von 0,3 bis 5 g/l, Aminosäuren in
einer Konzentration von 0,2 bis 5 g/l, Vitamine in
einer Konzentration von 2 bis 100 mg/l, Puffersubstan
zen in einer Konzentration von 0,2 bis 20 g/l, gegebe
nenfalls Natriumpyruvat, Antibiotica, einen pH-Indika
tor sowie ein Supplement enthält, dadurch gekennzeich
net, daß es als Supplement mindestens eine wasserlös
liche Eisenverbindung in einer Konzentration von
2 · 10-5 bis 10-2 mol/l enthält.
11. Kultivierungsmedium nach Anspruch 10, dadurch gekenn
zeichnet, daß es als wasserlösliche Eisenverbindungen
Eisen(II)-sulfat, Eisen(III)-citrat, Eisen(III)-chlo
rid und/oder Kaliumhexacyanoferrat(III) enthält.
12. Kultivierungsmedium nach Anspruch 10 oder 11, dadurch
gekennzeichnet, daß es Verbindungen biogener Spuren
elemente in einer Konzentration von 0,002 bis 2 mg/l
enthält.
13. Kultivierungsmedium nach Anspruch 12, dadurch gekenn
zeichnet, daß es als Verbindungen biogener Spurenele
mente Verbindungen von Selen und/oder von Zink ent
hält.
14. Kultivierungsmedium nach einem der Ansprüche 10 bis
13, dadurch gekennzeichnet, daß es Ascorbinsäure in
einer Konzentration von 1 bis 100 mg/l enthält.
15. Kultivierungsmedium nach einem der Ansprüche 10 bis
14, dadurch gekennzeichnet, daß es Steroidverbindungen
in einer Konzentration von 0,0001 bis 0,01 mg/l ent
hält.
16. Kultivierungsmedium nach Anspruch 15, dadurch gekenn
zeichnet, daß es als Steroidverbindungen Cortison und/
oder Hydrocortison enthält.
17. Kultivierungsmedium nach einem der Ansprüche 10 bis
16, dadurch gekennzeichnet, daß es Amine in einer
Konzentration von 0,1 bis 15 mg/l enthält.
18. Kultivierungsmedium nach Anspruch 17, dadurch gekenn
zeichnet, daß es als Amin Ethanolamin enthält.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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CS867158A CS262822B1 (en) | 1986-10-03 | 1986-10-03 | Synthetic medium for the cultivation of myelomic cells |
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DE19873733453 Withdrawn DE3733453A1 (de) | 1986-10-03 | 1987-10-02 | Verfahren und kultivierungsmedium zur kultivierung von hybridom- und myelomzellen |
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