DE3733453A1 - Verfahren und kultivierungsmedium zur kultivierung von hybridom- und myelomzellen - Google Patents

Verfahren und kultivierungsmedium zur kultivierung von hybridom- und myelomzellen

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie ein protein­ freies synthetisches Kultivierungsmedium zur Kultivierung von Hybridom- und Myelomzellen.
Die durch die somatische Hybridisierung von Myelomzellen und einen Antikörper synthetisierenden Lymphocyten zugäng­ lichen Hybridome werden industriell zur Produktion mono­ klonaler Antikörper herangezogen. Myelomzellen, in die mit gentechnischen Methoden ein Gen für die Synthese eines biologisch aktiven Eiweißstoffes, beispielsweise eines Enzyms, eines Enzyminhibitors, eines Hormons oder eines Immunregulators, eingeführt wurde, werden auch industriell zur Produktion dieser Proteine herangezogen. Der wachsende Bedarf an verschiedenen monoklonalen Antikörpern, insbe­ sondere für therapeutische Zwecke und für die Immunoaffi­ nitätschromatographie, wobei Kilogrammmengen erforderlich sind, sowie der Bedarf an verschiedenen Regulatorproteinen für therapeutische Anwendungszwecke führten zur Bemühung, wirksamere und wirtschaftlich vorteilhaftere Verfahren zur Herstellung dieser Stoffe zu finden.
Bis jetzt werden Hybridomzellen und Myelomzellen derart kultiviert, daß die Zellen zunächst in Laborgefäßen, wie Kunststoffschalen und Flaschen, vermehrt werden und die Kultivierung sowie die Proteinproduktion in einem Indu­ striefermenter beendet werden. Der monoklonale Antikörper oder andere in das Kultivierungsmedium ausgeschiedene Pro­ teinsubstanzen werden nach Abzentrifugieren oder Abfil­ trieren der Zellen aus dem Kultivierungsmedium gewonnen. Die Isolierung der produzierten Proteine ist umso schwie­ riger und kostspieliger, je mehr Proteinsubstanzen das ur­ sprüngliche Kultivierungsmedium enthielten.
Die Konzentration des produzierten Proteins, beispielswei­ se eines monoklonalen Antikörpers, im Kultivierungsmedium ist verhältnismäßig niedrig. Die synthetische Kultivie­ rungsmedien enthalten Grundkomponenten zur Kultivierung sowie ein Suplement.
Die Grundkomponenten des Kultivierungsmediums sind anorga­ nische Salze, beispielsweise Natriumchlorid und Natrium­ phosphat, Monosaccharide, beispielsweise Glucose und Ga­ lactose, Aminosäuren, beispielsweise Tryptophan, Methio­ nin, Threonin und Glutamin, Vitamine, beispielsweise Thiamin und Nicotinamid, Puffersubstanzen, beispielsweise N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure, gegebe­ nenfalls Natriumpyruvat, Antibiotica und ein pH-Indikator. Diese Grundkomponenten zur Kultivierung sind an sich für die Kultivierung von Hybridom- und Myelomzellen ebenso wie von anderen tierischen Zellen ungenügend und werden des­ halb mit 10 Vol.-% Blutserum, beispielsweise Rinder-, Pferde oder Kälberfetalserum ergänzt. Durch das Blutserum werden allerdings in das Kultivierungsmedium unbekannte Stoffe eingebracht, von denen einige das Zellwachstum för­ dern und andere es hemmen können. Es ist deshalb notwen­ dig, die Blutseren vor Gebrauch zu prüfen und geeignete Chargen auszuwählen. Dadurch steigen die Kosten zur Her­ stellung des Kultivierungsmediums. Aus diesem Grunde wur­ den Rezepturen für sog. serumfreie Kultivierungsmedien entwickelt, bei denen das Blutserum durch einige definierte Proteinsubstanzen ersetzt ist, zumeist durch Transferrin, Serumalbumin und Insulin, und die gegebenenfalls weitere Stoffe, wie ungesättigte Fettsäuren, Amine und niedermole­ kulare Hormone enthalten (Kov J., Frank F., Methods in Enzymology 121 (1986) 277.
Sämtliche Proteine, die bis jetzt in Kultivierungsmedien zur Kultivierung von Hybridom- oder Myelomzellen einge­ setzt werden, müssen frei von toxischen Beimengungen sein, was die Wirtschaftlichkeit des Herstellungsverfahrens be­ einträchtigt. Einen weiteren Nachteil der bisherigen Kul­ tivierungsmedien stellt die schwierige Isolierung der Stoffwechselprodukte der Hybrodomzellen bzw. der Myelom­ zellen aus dem Kultivierungsmedium dar, die auf einer mehrstufigen Abtrennung der gewünschten Proteinprodukte von in einem vielfachen Überschuß im Kultivierungsmedium enthaltenen Proteinsubstanzen beruht.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren sowie ein Kultivierungsmedium zur Kultivierung von Hybri­ dom- und Myelomzellen anzugeben, mit denen die Nachteile des Standes der Technik vermieden werden und eine leichte­ re Isolierung der angestrebten Proteine bzw. Stoffwechsel­ produkte möglich wird.
Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst. Vorteilhafte Aus­ führungsformen sind Gegenstand der Unteransprüche.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Verwendung eines Kultiverungsmediums, das neben den Grundkomponen­ ten, wie anorganischen Salzen in einer Konzentration von 5 bis 12 g/l, Monosacchariden in einer Konzentration von 0,3 bis 5 g/l, Aminosäuren in einer Konzentration von 0,2 bis 5 g/l, Vitaminen von einer Konzentration von 2 bis 100 mg/l, Puffersubstanzen in einer Konzentration von 0,2 bis 20 g/l, gegebenenfalls Natriumpyruvat, Antibiotica sowie einem pH-Indikator ein Supplement enthält, das aus minde­ stens einer wasserlöslichen Eisenverbindung in einer Konzentration von 2 · 10-5 bis 10-2 mol pro Liter des Kulti­ vierungsmediums besteht, vorzugsweise Eisen(III)-citrat, Eisen(II)-sulfat, Eisen(III)-chlorid und/oder Kaliumhexa­ cyanoferrat(III).
Es ist ferner vorteilhaft, wenn das Kultivierungsmedium in Kombination mit dem Supplement noch Verbindungen biogener Spurenelemente, insbesondere des Selens und Zinks, Ascor­ binsäure, Steoridverbindungen, insbesondere Cortison bzw. Hydrocortison und Amine, vorzugsweise Ethanolamin, ent­ halten, deren Anwesenheit die Wirkungen des Supplements steigert.
Es wurde festgestellt, daß die einzige wirklich unentbehr­ liche Proteinkomponente serumfreier Kultivierungsmedien das Transferrin darstellt (Kov J., Frank F., Methods in Enzymology 121 (1986) 277. Da Transferrin als Überträger von Eisen aus dem Kultivierungsmedium in die Zellen wirkt, läßt sich die gleiche Wirkung durch Anwesenheit von wasserlöslichen Eisenverbindungen erzielen, und zwar in erhebliche höheren als bis jetzt in Kultivierungsmedien an­ gewandten Konzentrationen. Mehrere Autoren (vgl. z. B. Phillips P. D., Christofalo V. J., Exp. Cell Res. 134 (1981) 297; Perez-Infante V., Mather J. P., Exp. Cell Res. 142 (1982) 325; Taetle R., Rhyner K., Castagnola J., To D., Mendelsohn J., J. Clin. Invest. 75 (1985) 1061 verwendeten als Ersatz für Transferrin wasserlösliche Eisenverbindun­ gen in Konzentrationen von 106 bis 20 · 10-6 mol/l. Diese Konzentrationen sind allerdings im Falle von Hybridom- und Myelomzellen ungenügend. Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß die Eisenverbindungen für Hybridom- und Myelomzellen bis zu einer Konzentration von 10-2 mol/l nicht toxisch sind, und ferner Konzentrationen von Eisen­ verbindungen, die höher als 2 · 10-5 mol/l sind, das Wachs­ tum von Hybridom- und Myelomzellen in einem proteinfreien Kultivierungsmedium ermöglichen. Zu den Eisenverbindungen, die das Transferrin ersetzen können, gehören beispielswei­ se Eisen(III)-citrat, Eisen(II)-sulfat, Eisen(III)-chlorid und Kaliumhexacyanoferrat(III). Die wirksamen Konzentra­ tionen liegen im Bereich von 2 · 10-5 bis 10-2 mol/l.
Ein besonderer Vorteil des Kultivierungsmediums gemäß der Erfindung liegt in der leichten Isolierung von den Zellen ausgeschiedener Proteine, beispielsweise monoklonaler An­ tikörper, da diese von den Zellen ausgeschiedenen Proteine die einzigen nach der Kultivierung im Kultivierungsmedium befindlichen Proteinsubstanzen sind.
Erfindungsgemäße Kultivierungsmedien und ihre Vorteile gehen aus den nachfolgenden Beispielen hervor.
Beispiel 1
Zur Herstellung eines chemisch definierten proteinfreien Kultivierungsmediums wurde ein Grundkultivierungsmedium verwendet, das neben RPMI 1640-Medium noch L-Glutamin (300 µg/ml), Natriumpyruvat (110 µg/ml), N-2-Hydroxyethyl­ piperazin-N'-2-ethansulfonsäure (1,5 · 102 mol/l, Penicil­ lin (100 IE/ml), Streptomycin (100 µg/ml) und Gentamycin (40 µg/ml) enthielt. Das proteinfreie Kultivierungsmedium enthielt ferner als Serumersatz folgende Zusatzstoffe:
Ethanolamin (2 · 10-5 mol/l), Ascorbinsäure (2 · 10-5 mol/l), Hydrocortison (5 · 10-9 mol/l), Cadmiumsulfat (CdSO4 · 8/3H2O, 5 · 10-8 mol/l), Cobalt(II)-chlorid (CoCl2 · 6H2O, 10-8 mol/l), Kupfer(II)-sulfat (CuSO4 · 5H2O, 10-8 mol/l), Ammoniummolybdat ((NH4)6Mo7O24 · 4H O, 5 · 10-10 mol/l), Mangan(II)-chlorid (MnCl2 · 4H2O, 5 · 10-10 mol/l), Nickel(II)-sulfat (NiSO4 · 6H2O, 2,5 · 10-10 mol/l), Natrium­ selenat(IV) (Na2SeO3, 4 · 10-8 mol/l), Natriumsilicat (Na2 SiO3, 2 · 10-7 mol/l), Zinn(II)-chlorid (SnCl2 · 2H2O, 2,5 · 10-10 mol/l). Ammoniumvanadat(V) (NH4VO3, 2,5 · 10-9 mol/l), Zinksulfat (ZnSO4 · 7H2O, 10-6 mol/l) und Eisen(III)-citrat (5 · 10-4 mol/l).
In 6 ml des proteinfreien Kultivierungsmediums der angege­ benen Zusammensetzung in einer Kunststoff-Petrischale (Durchmesser 6 cm) wurden Zellen des Hybridoms PLV-Ol in einer solchen Menge geimpft, daß die Zelldichte 50 · 103 Zellen/ml betrug. Nach 4 Tagen Kultivierung in einem Ther­ mostaten in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 Vol.-% Kohlendioxid in der Luft und bei einer Temperatur von 37 °C vermehrten sich die Zellen zu einer Zelldichte von 1,53 · 106 Zellen/ml. Die Zahl der Zellen stieg also während der viertägigen Kultivierung ungefähr auf das Dreißigfa­ che.
In einem analogen Versuch mit Zellen des Hybridoms CMH-02 vermehrten sich die Zellen aus einem Inokulum mit 25 · 103 Zellen/ml nach 4 Tagen zu einer Zelldichte von 1,36 · 106 Zellen/ml. Die Zahl der Zellen stieg bei diesem Versuch während der viertägigen Kultivierung ungefähr auf das Fünfzigfache.
Zellen des Myeloms FO und der Hybridome PLV-01, CMH-02 und T3-03 werden getrennt in je 1 ml des proteinfreien Kulti­ vierungsmediums der angegebenen Zusammensetzung in Vertie­ fungen einer Kunststoffkulturplatte mit 24 Vertiefungen geimpft. Nach einem Tag Kultivierung unter den oben ange­ führten Bedingungen wurde die Zahl der Zellen in einer Vertiefung bestimmt; nach weiteren 24 Stunden wurde die Zahl der Zellen wiederum bestimmt. Auf diese Weise wurde für jede der angegebenen Zellarten die mittlere Verdoppe­ lungszeit in der Exponentialphase bestimmt. Die mittlere Verdoppelungszeit betrug für das Myelom FO 15,6 h, für das Hybridom PLV-01 14,8 h, für das Hybridom CMH-02 14,6 h und für das Hybridom T3-03 11,8 h.
Zellen der Hybridome PLV-01 und PGG-05 wurden getrennt in einer Menge von 6 · 104 Zellen in je 1 ml des proteinfreien Kultivierungsmediums der angegebenen Zusammensetzung in Vertiefungen einer Kunststoffkulturplatte mit 24 Vertie­ fungen geimpft. Zum Vergleich wurden Zellen derselben Hybridome in ein serumfreies Kultivierungsmedium geimpft, das 5 mg/l Transferrin und 10 mg/l Insulin (SFH-Medium ohne Linolsäure und Albumin, J. Kov und F. Frank, Methods in Enzymol. 121 (1986) 277 enthielt. Nach 4 Tagen Kultivierung unter den oben angeführten Bedingungen wurden die Zahl der Zellen und die Konzentration des monoklonalen Antikörpers im Kultivierungsmedium bestimmt, und zwar unter Anwendung des enzym-immunologischen Tests, der auf der Bestimmung der Peroxidaseaktivität beruht. Beim Wachs­ tum des Hybridoms PLV-01 in einem proteinfreien Medium aus einem Inokulum von 6 · 104 Zellen auf 8,19 · 105 Zellen wies die in relativen Einheiten des Absorptionsvermögens ausge­ drückten Konzentration des monoklonalen Antikörpers einen Wert von A490 = 0,298 auf. In einem Vergleichsversuch mit SFH-Medium wurden Werte von 7,06 · 105 Zellen und von A490 = 0,310 erzielt. Beim Wachstum des Hybridoms PGG-05 in einem proteinfreien Kultivierungsmedium auf 6,75 · 105 Zellen wies die in relativen Einheiten des Absorptionsvermögens ausge­ drückte Konzentration des monoklonalen Antikörpers einen Wert von A 490 = 1,32 auf. In einem Vergleichsversuch mit SFH-Medium wurden Werte von 7,31 · 105 Zellen und von A490 = 1,26 erzielt.
Beispiel 2
Zellen des Hybridoms PLV-01 wurden in einer Menge von 104 Zellen in 0,1 ml des proteinfreien Kultivierungsmediums der in Beispiel 1 angeführten Zusammensetzung in Näpfen einer Kunststoffkulturplatte mit 96 Vertiefungen geimpft. Zum Vergleich wurden in analoger Weise Zellen dieses Hybridoms in ein proteinfreies Kultivierungsmedium ge­ impft, worin das Eisen(III)-citrat durch Eisen(III)-chlo­ rid in einer Konzentration von 5 · 10-4 mol/l ersetzt wurde. Nach 3 Tagen Kultivierung unter den im Beispiel 1 angege­ benen Bedingungen vermehrten sich die Hybridomzellen auf 1,31 · 105 Zellen im Kultivierungsmedium mit Eisen(III)- citrat und auf 8,2 · 104 Zellen im Kultivierungsmedium mit Eisen(III)-chlorid.
Beispiel 3
Zellen des Hybridoms PLV-01 wurden in einer Menge von 104 Zellen in 0,1 ml der in Beispiel 1 angeführten Grundkompo­ nenten geimpft. Als Zusatzstoff wurde in das Kultivie­ rungsmedium 5 · 10-4 mol/l Kaliumhexacyanoferrat(III) gege­ ben. Nach 3 Tagen Kultivierung bei einer Temperatur von 37°C und mit 4,5 Vol.-% Kohlendioxid in einer befeuchte­ ten Atmosphäre bei einem pH-Wert des Mediums von 7,4 ver­ mehrten sich die Zellen auf eine Zellzahl von 6,2 · 104 Zellen.
Beispiel 4
Zellen des Hybridoms PLV-01 wurden in einer Menge von 104 Zellen in 0,1 ml der in Beispiel 1 angeführten Grundkompo­ nenten geimpft. Als Zusatzstoff wurde in das Kultivie­ rungsmedium Eisen(II)-sulfat in einer Menge von 10-4 mol/l zugegeben. Nach 3 Tagen Kultivierung bei einer Temperatur von 37°C und mit 4,5 Vol.-% Kohlendioxid in einer be­ feuchteten Atmosphäre bei einem pH-Wert des Mediums von 7,4 vermehrten sich die Zellen auf eine Zellzahl von 2,5 · 104 Zellen.
Beispiel 5
Zellen des Hybridoms PLV-01 wurden in einer Menge von 104 Zellen in 0,1 ml des proteinfreien Kultivierungsmediums mit der in Beispiel 1 angeführten Zusammensetzung geimpft, das sich in Vertiefungen einer Kunststoffkultivierungs­ platte mit 96 Vertiefungen befand, geimpft. Zum Vergleich wurden in analoger Weise Zellen dieses Hybridoms in ein proteinfreies Kultivierungsmedium geimpft, das neben dem Grundmedium wie in Beispiel 1 lediglich Eisen(III)-citrat (5 · 10-4 mol/l) enthielt. Nach 3 Tagen Kultivierung unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen vermehrten sich die Hybridomzellen im kompletten proteinfreien Kultivie­ rungsmedium auf 1,18 · 105 Zellen und auf 1,03 · 105 Zellen in einem proteinfreien Kultivierungsmedium, das lediglich Eisen(III)-citrat enthielt.

Claims (18)

1. Verfahren zur Kultivierung von Hybridomzellen und Myelomzellen in Kultivierungsmedien, die anorganische Salze in einer Konzentration von 5 bis 12 g/l, Mono­ saccharide in einer Konzentration von 0,3 bis 5 g/l, Aminosäuren in einer Konzentration von 0,3 bis 5 g/l, Vitamine in einer Konzentration von 2 bis 100 mg/l, Puffersubstanzen in einer Konzentration von 0,2 bis 20 g/l, gegebenenfalls Natriumpyruvat, Antibiotica, einen pH-Indikator sowie ein Supplement enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kultivierungsmedium als Supplement mindestens eine wasserlösliche Eisenverbindung in einer Konzentra­ tion von 2 · 10-5 bis 10-2 mol/l zugesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kultivierungsmedium als wasserlösliche Eisenverbin­ dung Eisen(II)-sulfat, Eisen(III)-citrat, Eisen(III)- chlorid und/oder Kaliumhexacyanoferrat(III) zugesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich­ net, daß dem Kultivierungsmedium Verbindungen biogener Spurenelemente in einer Konzentration von 0,002 bis 2 mg/l zugesetzt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kultivierungsmedium als Verbindungen biogener Spu­ renelemente Verbindungen von Selen und/oder Zink zugesetzt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge­ kennzeichnet, daß dem Kultivierungsmedium Ascorbinsäure in einer Konzentration von 1 bis 100 mg/l zugesetzt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß dem Kultivierungsmedium Steroidver­ bindungen in einer Konzentration von 0,0001 bis 0,01 mg/l zugesetzt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kultivierungsmedium als Steroidverbindungen Corti­ son und/oder Hydrocortison zugesetzt werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch ge­ kennzeichnet, daß dem Kultivierungsmedium Amine in einer Konzentration von 0,1 bis 15 mg/l zugesetzt wer­ den.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kultivierungsmedium als Amin Ethanolamin zugesetzt wird.
10. Kultivierungsmedium zur Kultivierung von Hybridomen und Myelonzellen, das anorganische Salze in einer Konzentration von 5 bis 12 g/l, Monosaccharide in einer Konzentration von 0,3 bis 5 g/l, Aminosäuren in einer Konzentration von 0,2 bis 5 g/l, Vitamine in einer Konzentration von 2 bis 100 mg/l, Puffersubstan­ zen in einer Konzentration von 0,2 bis 20 g/l, gegebe­ nenfalls Natriumpyruvat, Antibiotica, einen pH-Indika­ tor sowie ein Supplement enthält, dadurch gekennzeich­ net, daß es als Supplement mindestens eine wasserlös­ liche Eisenverbindung in einer Konzentration von 2 · 10-5 bis 10-2 mol/l enthält.
11. Kultivierungsmedium nach Anspruch 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es als wasserlösliche Eisenverbindungen Eisen(II)-sulfat, Eisen(III)-citrat, Eisen(III)-chlo­ rid und/oder Kaliumhexacyanoferrat(III) enthält.
12. Kultivierungsmedium nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß es Verbindungen biogener Spuren­ elemente in einer Konzentration von 0,002 bis 2 mg/l enthält.
13. Kultivierungsmedium nach Anspruch 12, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es als Verbindungen biogener Spurenele­ mente Verbindungen von Selen und/oder von Zink ent­ hält.
14. Kultivierungsmedium nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es Ascorbinsäure in einer Konzentration von 1 bis 100 mg/l enthält.
15. Kultivierungsmedium nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es Steroidverbindungen in einer Konzentration von 0,0001 bis 0,01 mg/l ent­ hält.
16. Kultivierungsmedium nach Anspruch 15, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es als Steroidverbindungen Cortison und/ oder Hydrocortison enthält.
17. Kultivierungsmedium nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß es Amine in einer Konzentration von 0,1 bis 15 mg/l enthält.
18. Kultivierungsmedium nach Anspruch 17, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es als Amin Ethanolamin enthält.
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