DE3721206A1 - Melatonin-derivate, ihre herstellung und sie enthaltende arzneimittel - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft neue Derivate von Melatonin (5-Methoxy- N-acetyl-tryptamin), ihre Herstellung, markierte Formen dieser Verbindungen und Arzneimittel sowie veterinärmedizinische Zubereitungen, die ein solches Derivat als Wirkstoff enthalten. Die neuen Derivate sind starke Melatonin-Antagonisten und können zur Geburtenregelung bei Wirbeltieren für medizinische Zwecke verwendet werden. Die radioaktiv markierten Derivate sind wertvolle Sonden zur Verwendung in der biochemischen und medizinischen Forschung und können zum Studium der Melatonin-Rezeptoren verwendet werden.

Die biochemische Rolle von Melatonin wird in Chem. Eng. News, 1. Mai 1967, S. 40 beschrieben. Melatonin ist eines der Haupthormone, die von der Zirbeldrüse aller Wirbeltiere sekretiert wird. Diese Drüse hat einen offenen Rhythmus der Melatonin- Produktion, der zu nächtlicher Synthese und Sekretion von Melatonin in das Blut führt. Der Melatonin-Rhythmus schafft ein Signal, das die Änderung des Lichtzyklus in der Umgebung im Organismus wiederspiegelt. Es gibt viele Hinweise darauf, daß Melatonin in die Koordinierung von zeitabhängigen physiologischen Prozessen eingreift. Dies zeigt sich bei der jahreszeitabhängigen Fruchtbarkeit von beispielsweise Hamstern und Schafen; die photoperiodische Regulation der Vermehrung läßt sich als starker Einfluß von Melatonin auf die Geschlechtsdrüsenaktivität feststellen, vgl. Tomarkin und Mitarb., Science Bd. 227 (1985), S. 714. Es wurde nachgewiesen, daß Melatonin die stimmulierte Freisetzung von Dopamin aus dem Hypothalamus der Ratte inhibiert; vgl. Zisapel und Mitarb., Res. Comm. Bd. 104 (1982) und Brain Research Bd. 246 (1983) S. 161. Dies schafft die Möglichkeit zur in vitro-Prüfung von vermutlichen Melatonin-Antagonisten.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Derivate von 5-Methoxytryptamin bereitzustellen, die Melatonin-Antagonisten darstellen. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung sind somit Derivate von 5-Methoxytryptamin der allgemeinen Formel I

in der X eine Nitro- oder Azidogruppe und Y ein Wasserstoff- oder Jodatom bedeuten, und radioaktiv markierte Formen dieser Verbindungen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind radioaktiv markierte Sondenmoleküle, die sich zur Erforschung der Aktivität der Melatonin-Rezeptoren sowie als Affinitätsmarker für ihre Identifikation und Isolierung eignen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Arzneimittel, die die Melatonin- Antagonisten der Erfindung als Wirkstoff enthalten. Derartige Arzneimittel eignen sich z. B. bei der Zucht von Tieren zur Regelung der Reproduktion von Fischen, Reptilien, Nutzvieh und Vögeln, wobei sie im Organismus einen Zustand von langandauernden Lichtperioden vortäuschen, der auf das Reproduktionssystem wirkt.

Die Verbindungen der Erfindung besitzen auch Wert in der Humanmedizin zur Behandlung von bestimmten mentalen Erkrankungen und endokrinen Störungen. Sie eignen sich beispielsweise zur Behandlung des "Jet-lag" (Störung des Tag-Nacht-Rhythmus bei Fernreisen) von manischen Depressionszuständen, Cluster-Kopfschmerzen, Sterilität, Bluthochdruck von Blinden, Störungen bei Schichtarbeitern und ähnlichen Erscheinungen, die auf Funktionsstörungen des Zeitgefühls im Organismus (biologische Uhr) zurückzuführen sind.

Die radioaktiv markierten Derivate der Verbindungen der Erfindung können zur Untersuchung der Melatonin-Rezeptoren und zu ihrer Isolierung verwendet werden. Sie können ferner zur Untersuchung von mechanistischen Phänomenen der Melatonin- Wirkung in zeitabhängigen physiologischen Verfahren dienen.

Die bevorzugten radioaktiv markierten Verbindungen der Erfindung sind die ³H- und ¹²⁵I-markierten Derivate der Dinitrophenyl- Verbindungen.

Zur Herstellung der Verbindungen der Erfindung wird Fluordinitrobenzol oder eine entsprechende Verbindung mit einem primären Amin, wie 5-Methoxytryptamin oder einem funktionellen Derivat davon umgesetzt. Das Jodderivat wird durch Umsetzung des Dinitro-Derivates mit KI in Gegenwart von Jodo-Gen (1,3,4,6-Tetrachlor-3a,6a-diphenylglycoluril) hergestellt. Das Azido-Derivat wird durch Umsetzung von 5-Methoxytryptamin mit 4-Fluor-2-nitroazidobenzol erhalten.

Die Verbindungen der Erfindung können oral verabreicht und als solche in der Tierzucht dem Futter oder Trinkwasser der Tiere zugesetzt werden. Die Tagesdosis kann etwa 0,2-2,0 mg/kg/Tag betragen.

Von den verschiedenen beobachteten Wirkungen der Verbindungen werden nachstehend beispielhaft erwähnt:

• 1. Langzeitgabe von Melatonin (über das Trinkwasser oder durch intraperitoneale Injektion) an vorpubertäre männliche Ratten führt zu einer Verzögerung der Entwicklung des Nebenhoden-Geschlechtsorgans.
  Orale Gabe von ML-23 in Gegenwart von Melatonin hebt die unterdrückenden Wirkungen von Melatonin auf das Wachstum von Prostata und Samenvesikel und auf die Serumtestosteronspiegel vollständig auf.
• 2. Die Verabreichung von Melatonin an ausgewachsenen weiblichen Ratten am Nachmittag der Vorbrunst blockiert die phasische Sekretion des luteinisierenden Hormons und die Ovulation. Gabe von ML-23 an weibliche Ratten über das Trinkwasser hebt die Wirkung von Melatonin auf, so daß normale Ovulation eintritt.
• 3. Weibliche Ratten, die unter ständiger Beleuchtung gehalten werden, werden acyclisch und zeigen bleibende Brunstkennzeichen. Tägliche Melatonin-Injektionen stellen den Menstruationscyclus bei diesen Ratten wieder her, nicht aber bei Ratten, die oral mit ML-23 behandelt werden.
• 4. Die Langzeitgabe von ML-23 allein an vorpubertäre männliche Ratten erhöht die Testosteronspiegel im Blut der Tiere.

Die Prüfung der Toxität der Verbindungen der Erfindung zeigte, daß sie im wesentlichen für Säuger nicht toxisch sind. Außerdem war das Körpergewicht sowie das Gewicht von Hoden und Eierstock von Ratten, die mit der Dinitroverbindung 4 Wochen in einer Dosierung von 800 µg/Tag behandelt wurden, unverändert.

Die Verbindungen der Erfindung sind zur Überwindung der Blut- Gehirn-Barriere in der Lage. Die Derivate erreichen das Gehirn in inaktiver Form, wie durch TLC der markierten, aus dem Gehirn von Ratten extrahierten Verbindungen gezeigt wird, denen die ³H- bzw. ¹²⁵I-markierten Derivate 30 bis 60 Minuten vor dem Schlachten injiziert wurden.

Die zur Herstellung der Verbindungen der Erfindung notwendigen Ausgangsstoffe sind billig; die Synthese ist einfach; die Ausbeuten sind hoch und reine Produkte werden leicht erhalten.

Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung von Verbindungen der Erfindung.

Beispiel 1 N-2,4-Dinitrophenyl-5-methoxytryptamin (ML-23)

1 Mol 5-Methoxytryptamin wird in 10 Liter Wasser gelöst und der pH-Wert mit 2,5 Mol Natriumbicarbonat auf 8,3 eingestellt. Dann wird eine 1,5% Lösung von Fluor-2,4-dinitrobenzol in 20 Liter Äthanol zugegeben und das Gemisch 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das gewünschte Produkt fällt aus, wird gewaschen und getrocknet. Das Produkt wird in 90% Ausbeute erhalten und das TLC (Chloroform, Kieselgelplatten) zeigt einen gelben Fleck (R _f = 0,6) der von den Ausgangsverbindungen unter den gleichen Bedingungen deutlich getrennt ist.

Beispiel 2 N-2,4-Dinitrophenyl-5-methoxy-2-jodtryptamin

Das Produkt des vorangehenden Beispiels wird durch Umsetzung mit Kaliumjodid in Gegenwart von Jodo-Gen jodiert. Das Haupt-Reaktionsprodukt 2-Jod-ML-23 wird von nicht substituiertem Material abgetrennt und durch Dünnschichtchromatographie (Chloroform auf Kieselgelplatten) nach dem von Vakkuri und Mitarb. (1984) für die Jodierung von Melatonin beschriebenen Verfahren gereinigt (R _f von MLI-23 = 0,5, 60% Ausbeute).

In ähnlicher Weise werden die radioaktiven Analoga von ML-23 und MLI-23 unter Verwendung von ³H-Fluordinitrobenzol und trägerfreiem Na¹²⁵I hergestellt.

Das Azido-ML-23 wird aus 5-Methoxytryptamin (0,15 Mol) durch Umsetzung mit 4-Fluor-2-nitroazidobenzol (0,3 Mol) in 1 Liter 0,23 M Natriumcarbonat hergestellt. Das Gemisch wird über Nacht im Dunkeln unter Stickstoff bei 37°C gerührt. Das Hauptprodukt (R _f = 0,5) wird von Nebenprodukten und nicht umgesetzten Stoffen durch Dünnschichtchromatographie (Chloroform- Methanol 1 : 1 auf Kieselgelplatten) abgetrennt, mit Na¹²⁵I in Gegenwart von Jodo-Gen jodiert und durch Dünnschichtchromatographie (R _f = 0,8) in Chloroform auf Kieselgelplatten gewonnen.

Beispiel 3 Melatonin-Rezeptor-Assay unter Verwendung von 2-¹²⁵I-Jod-ML-23 (¹²⁵I-MLI-23)

Gewebeschnitte oder isolierte Zellen werden in 10 ml/g eisgekühlte 0,32 M Sucroselösung suspendiert und in einem Teflon- Glas-Homogenisator homogenisiert. Das Homogenisat wird zentrifugiert (10 000 × g-min), das Pellet verworfen und der Überstand zentrifugiert (68 000 × g-min). Das rohe Membran- Pellet wird in 2 Volumina 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4 mit einem Gehalt von 4 mM CaCl₂ suspendiert. 2-¹²⁵I-Jod-ML-23 wird durch Jodierung von ML-23 mit Na¹²⁵I (20 Ci/mMol; Amersham) in Gegenwart von Jodo-Gen hergestellt. Das Haupt-Jodierungsprodukt, 2-¹²⁵I-Jod-ML-23 (¹²⁵I-MLI-23) wird von nicht-umgesetztem ML-23 nach der Beschreibung in Beispiel 2 abgetrennt. Mengenanteile der Membran-Zubereitungen (200 µg Protein/20 µl) werden mit 40 µl Tris-Puffer mit einem Gehalt von 20 bis 100 nM ¹²⁵I-MLI-23 30 Minuten bei 37°C unter Schütteln im Wasserbad in Gegenwart oder Abwesenheit von nicht-markiertem Melatonin (50 µM) inkubiert. Dann werden die Membranen durch Vakuumfiltration unter Verwendung von Glasfaserfiltern GF/C gesammelt und mit 3 × 4 ml Puffer bei 4°C gewaschen. Die gebundenes ¹²⁵I-ML-23 enthaltenden Filter werden mit einem Packard-Gamma- Zähler auf Radioaktivität geprüft. Die spezifische Bindung wird als diejenige bezeichnet, die durch 50 µm nicht-radioaktives Melatonin ersetzt wird. Sie reicht von 50 bis 60% der gesamten Bindung an 50 nM¹²⁵I-MLI-23.

Die Gleichgewichts-Bindungswerte können durch nicht-lineare Regression an ein einziges Bindungsstellenmodell gemäß folgender Gleichung angepaßt werden: B = Bmax/(1 + Kd/L), in der B und Bmax die spezifische Bindung bei unterschiedlichen ¹²⁵I-MLI-23- Konzentrationen (L) bzw. bei Sättigung bedeuten und Kd die Bindungs-Dissoziationskonstante ist.

Die Verteilung der Melatonin-Bindungsstellen in sechs einzelnen Bereichen des Gehirns von weiblichen Ratten im Brunst- Stadium und die Wirkungen einer Eierstockexstirpation und anschließenden Behandlung mit 17p-Östradiol auf diese Stellen werden unter Anwendung dieses Verfahrens geprüft. Es wird spezifische Bindung von ¹²⁵I-MLI-23 im Hypothalmus, Medullapons, Hippocampus, Cerebellum, Striatum und in der Scheitelrinde von weiblichen Ratten festgestellt. Eierstockexstirpation erzeugt eine große, Östradiol-reversible Abnahme der Bindung von ¹²⁵I-MLI-23 im Medulla-pons und Hypothalmus. Im Gegensatz dazu sind die ¹²⁵I-MLI-23-Bindungsstellen in den anderen Gehirnregionen im allgemeinen unbeeinflußt von Eierstockexstirpation oder Östradiol. Die durch Östradiol regulierten Änderungen der Melatonin-Bindung im Hypothalmus und Medullapons können die Rolle einer spezifischen Östradiol-Melatonin- Wechselwirkung bei der Koordinierung der neuroendokrinen Reproduktionsachse wiedergeben.

Claims (8)

1. Derivate von 5-Methoxytryptamin der allgemeinen Formel I in der X eine Nitro- oder Azidogruppe und Y ein Wasserstoff- oder Jodatom bedeuten, und radioaktiv markierte Formen dieser Verbindungen.

2. Derivat nach Anspruch 1, in der ³H- oder ¹²⁵I-markierten Form.

3. N-2,4-Dinitrophenyl-5-methoxytryptamin und seine radioaktiv markierten Formen.

4. N-2,4-Dinitrophenyl-5-methoxy-2-jodtryptamin und seine radioaktiv markierten Formen.

5. Verfahren zur Herstellung der Derivate von 5-Methoxytryptamin der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 5-Methoxytryptamin oder ein funktionelles Derivat davon mit Fluordinitrobenzol oder mit Fluornitroazidobenzol umsetzt und das erhaltene Produkt gegebenenfalls mit einem Jodid in Gegenwart von Jodo-Gen behandelt.

6. Derivate von 5-Methoxytryptamin der allgemeinen Formel I nach Anspruch 1 und ihre radioaktiv markierten Formen zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung oder einem Diagnostizierverfahren.

7. Pharmazeutische oder veterinärmedizinische Zusammensetzung, enthaltend als Wirkstoff eine wirksame Menge einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 (in der nicht markierten Form).

8. Verwendung einer radioaktiv markierten Form einer Verbindung der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 1 zur Untersuchung der Melatonin-Rezeptoren.