DE3709282A1

DE3709282A1 - Lipidzusatz fuer naehrmedien fuer zell- und gewebekulturen

Info

Publication number: DE3709282A1
Application number: DE19873709282
Authority: DE
Inventors: Sabine Daehn-Siegel
Original assignee: DAEHN SIEGEL SABINE
Current assignee: DAEHN SIEGEL SABINE
Priority date: 1987-03-20
Filing date: 1987-03-20
Publication date: 1988-10-20

Description

Diese Erfindung betrifft einen Zusatz zum Nährmedium für Zell- und Gewebekulturen. Die Herstellung chemisch exakt definierter Nährmedien, bei denen Zusätze tierischen Ursprungs, wie foetales Kälberserum oder Neugeborenen-Kälberserum (weitgehend) eliminiert sind, ist gegenwärtig Gegenstand intensiver Untersuchungen. Siehe Barnes DW, Sirbasku DA, Sato GH (1984): Methods for preparation of media, supplements, and substrata for serum-free animal cell culture, Vol. 1, pp 3-88 als allgemeine Übersicht zu diesem Thema.

Lipiden als Baustein der Zellmembran kommt in diesem Zusammenhang besondere Bedeutung im Hinblick auf die Förderung des Zellwachstums in vitro zu. Siehe hierzu: Barnes DW, Sirbasku DA, Sato GH (1984): Methods for preparation of media, supplements, and substrata for serum-free animal cell culture, Vol. 3, pp 249-264.

Aufgrund der Tatsache, daß sich Lipide in wäßrigen Lösungen, wie sie Nährmedien darstellen, nicht lösen, werden sie an Rinder- Serum-Albumin (BSA) als sogn. "carrier" gekoppelt.

Nachteilig ist hierbei, daß die Lipide an das chemisch nicht exakt definierte BSA, welches noch Begleitproteine und Hormonoe enthalten kann, gekoppelt wird.

Somit liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, Lipide für den Zusatz zu Nährmedien an chemisch definierten Substanzen zu binden, wobei die derart erfindungsgemäß gebundenen und dem Nährmedium zugesetzten Lipide ihrerseits den Zellen nach enzymatischer Hydrolyse durch noch im Nährmedium vorhandener Enzyme als Nahrungsbausteine zur Verfügung gestellt werden.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß man die Lipide kovalent an wasserlösliche Substanzen mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 1 000 000 Dalton bindet und die derart gebundenen Lipide dem Zellkulturnährmedium zusetzt.

Als wasserlösliche Substanzen mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 1 000 000 Dalton dienen beispielsweise natürliche Polymere wie Stärke, Agarose, Dextrane, Proteine. Als synthetische wasserlösliche Substanzen seien Polyvinylalkohole, Polyvinyläther und Polyäthylenglykole beispielsweise genannt. All diese Substanzen zeichnen sich durch das Vorhandensein einer Vielzahl von hydratisierten funktionellen Gruppen, wie z. B. Hydroxylgruppen aus. Diese hydratisierten funktionellen Gruppen sind zum einen Voraussetzung dafür, daß sich diese Substanzen in wäßrigen Lösungen lösen, zum anderen, da aliphatische Lipide über deren hydrophilen Molekülanteil mit diesen funktionellen Gruppen kovalente Bindungen eingehen können.

Bei den an wasserlösliche Substanzen mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 1 000 000 Dalton kovalent gebundenen Lipiden handelt es sich um natürliche oder synthetische Lipide. Natürliche Lipide können problemlos nach bekannten Methoden aus tierischen und/oder pflanzlichen Geweben extrahiert werden und umfassen je nach Aufarbeitung und Ausgangsmaterial unterschiedliche Mengen an Glycerinphosphatiden, Sphingolipoiden, Glykosphingolipoiden, Lipoproteinen und Cholesterol. Sie werden entweder als Gesamtlipidextrakt oder je nach Aufgabenstellung als mengenmäßig definierte Reinsubstanzen an die wasserlöslichen Polymere gebunden. Da es sich hierbei um natürliche Bestandteile von Zellmembranen handelt, wird die de novo Syntheseleistung von in Zellkulturen wachsenden Zellen hinsichtlich der Synthese von Membranbausteinen wesentlich geringer sein als ohne Lipidzusatz.

Obwohl auch in der Natur vorkommend, werden unter dem Begriff synthetische Lipide, chemisch definierte, kommerziell leicht erhältliche gesättigte und/oder ungesättigte aliphatische Verbindungen, wie aliphatische Alkohole, Amine, Thiole, Carbamine und Alkyhalogenide mit einer zwischen 4 und 24 liegenden C-Atomzahl ebenso verstanden wie organische aliphatische Siliziumverbindungen. Letztere können leicht durch Umsetzung von z. B. Alkyltrichlorsilan mit den oben erwähnten gesättigten und/oder ungesättigten aliphatischen Verbindungen in einer Vielzahl von unterschiedlichen Derivaten erhalten werden. So erhält man bei Umsetzung von z. B. Octadecyltrichlorsilan mit z. B. Butanol das Tributoxyderivat des Ausgangssilans, welches seinerseits leicht kovalent an die erwähnten wasserlöslichen Polymere gebunden werden kann. Selbstverständlich können anstatt des Butanols andere (längerkettige), gesättigte oder ungesättigte, reaktive Aliphaten (C-Atomzahl zwischen 4 und 24), eingesetzt werden.

Es versteht sich, daß die Auswahl und Zusammensetzung der eingesetzten und an wasserlösliche Polymere kovalent gebundenen Lipide von den zu kultivierenden Zellen abhängt und jeweils experimentell ermittelt werden muß.

Die kovalente Bindung von Lipiden an die wasserlöslichen Polymere geschieht durch Umsetzung der Substanzen bei geeigneten, bekannten Reaktionsbedingungen und stellt keine Problem dar.

Beispiel

Als Lipid wurde Octadecyltrichlorsilan eingesetzt. 1 ml Octadecyltrichlorsilan wird zunächst in 30 ml abs. Äthanol gelöst und danach unter ständigem Rühren ca. 1 g Dextran (Molekulargewicht 40 000 Dalton, Fa. Fluka, Ulm) langsam zugegeben und bei 37 Grad Celsius über ca. 48 Stunden inkubiert. Anschließend wurde mittels physikalischer Methoden eine Trennung von an Dextran gebundenen und ungebundenen Octadecyltriäthoxysilan vorgenommen. Die dextanhaltige Fraktion wurde bis zur Trockene eingeengt, danach mit 10 ml Nährmedium versetzt, homogenisiert, dampfsterilisiert und dann den dem Nährmedium zugesetzt.

Typisches Beispiel ist der Zusatz von 50 mg an Dextran gebundenen Lipid zu 10 ml Dulbeccos′s Modified Eagle Medium (DMEM) mit jeweils 5% foetalem Kälberserum (FCS) bzw. 5% neugeborenen Kälberserum (NCS).

Claims

1. Lipidzusatz für Nährmedien für Zell- und Gewebekulturen, dadurch gekennzeichnet, daß natürliche und/oder synthetische Lipide, welche ihrerseits als Reinsubstanzen und/oder mengenmäßig definierte Mischungen an wasserlösliche natürliche und/oder synthetische Substanzen mit einem zwischen 1000 und 1 000 000 Dalton liegenden Molekulargewicht Dextrane und/oder Agar(ose) und/oder Proteine und/oder Pectine und/oder Stärke und/oder Polyäthylenglykol und/oder Polyvinyläther und/oder Polyvinylalkohole etc. eingesetzt werden.

3. Lipidzusatz für Nährmedien für Zell- und Gewebekulturen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als synthetische Lipide organische aliphatische Siliziumverbindungen eingesetzt werden.

4. Lipidzusatz für Nährmedien für Zell- und Gewebekulturen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als organische aliphatische Siliziumverbindungen die Umsetzungsprodukte eines Alkyltrichlorsilan mit reaktiven aliphatischen Verbindungen kovalent an wasserlösliche natürliche und/oder synthetische Substanzen mit einem zwischen 1000 und 1 000 000 Dalton liegenden Molekulargewicht gebunden ist.