DE3689020T2 - Fermentationsausbeute an exprimiertem Protein. - Google Patents
Fermentationsausbeute an exprimiertem Protein.Info
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Description
- Die Verwendung von transformierten eucaryotischen Wirtszellen, um ein erwünschtes fremdes Protein zu exprimieren, ist in der Technik auch durch die Verwendung von DNA- Rekombinationstechniken bekannt. Die transformierten Zellen, die einen Vektor enthalten mit DNA, die für das gewünschte fremde Protein codiert, werden dann in Zellkultur unter Verwendung üblicher Techniken vermehrt, und das fremde Protein, wenn es durch die transformierte Wirtszelle abgegeben wird, wird aus den Zellkulturflüssigkeiten isoliert, oder, wenn es nicht abgegeben wird, durch Aufbrechen der Zellen isoliert.
- Eine Modifikation der Fermentationstechniken ist, einen Vektor zu verwenden, welcher das gewünschte fremde Protein nicht produziert, bis ein spezifischer Nährstoff zum Kulturmedium hinzugefügt wird. Galactose ist ein solches Nährmedium, welches verwendet werden kann, um Expression des gewünschten fremden Proteins unter Verwendung von in der Technik bekannten Techniken zu induzieren (Stepien et al., Gene 24; 289-298, 1983). Während das Galactose-Induktionssystem sehr gut arbeitet, um Expression des gewünschten fremden Proteins zu initiieren, wäre es wünschenswert, das gewünschte Protein in höherer Ausbeute zu erhalten.
- Die frühere europäische Patentanmeldung EP-A-0 201 239 (veröffentlicht am 12.11.86) offenbart ein Verfahren, worin Galactose-induzierbare Hefezellen, die transformiert werden, um ein fremdes Protein zu produzieren, zuerst in einem galactosefreien Medium vermehrt werden. Wenn die Zellen in einer späten stationären Phase vorliegen, wird das Kulturmedium entfernt und die gewaschenen Zellen werden in einem frischen Medium, das Galactose enthält, kultiviert.
- Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Erhalten eines gewünschten fremden Proteins, nämlich HBsAg, in erhöhter Ausbeute in einem mit Galactose induzierten Fermentationsverfahren zur Verfügung zu stellen.
- Ein mit Galactose regulierter Hefestamm exprimiert HBsAg in verbesserter Ausbeute durch Vermehren der transformierten Hefezellen in Kultur und Ersetzen des Kulturmediums durch frisches Medium bevor die Galactose hinzugefügt wird, um Expression des Fremdproteins zu induzieren.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung werden eucaryotische Zellen transformiert durch Insertion eines DNA-haltigen Vektors, konstruiert um HBsAg zu exprimieren, wenn durch Galactose induziert. Der Vektor enthält auch DNA, welche für die Herstellung eines essentiellen Nährstoffes codiert, d. h. Leucin, Uracil oder Tryptophan, welches nicht durch nichttransformierte Wirtszellen hergestellt wird. Dies stellt sicher, daß nur Wirtszellen, die den rekombinanten Plasmidvektor zurückhalten, reproduziert werden, so wie, daß alle Zellen, die das Plasmid verlieren, absterben. Die rekombinanten eucaryotischen Zellen, d. h. Saccaromyces cerevisiae, werden verwendet, um ein Leucin- und Galactose-Mangelkulturmedium, z. B. einem Schrägagar, zu impfen.
- Die Wirtszellen werden dann in Kultur vermehrt, gemäß Techniken, die zum Kultivieren bestimmter Zellen, ausgewählt, um das gewünschte Endprodukt zu exprimieren, geeignet sind. Wenn die Zelldichte an oder etwa bei ihrem Maximum ist und die Zellen sich in einer späten log-/frühen stationären Phase befinden, werden die Zellen in ein frisches Zellkulturmedium gestellt, das Galactose enthält, um Expression zu induzieren. Die Zellen werden dann für 2 bis 3 Zellverdoppelungen inkubiert, um maximale Expression des Produktes sicherzustellen. Gegebenenfalls, aber bevorzugt werden die Zellen gewaschen, bevor sie in das frische Zellkulturmedium gegeben werden. Waschen kann mit Kochsalzlösung, mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder anderen physiologisch annehmbaren Lösungen durchgeführt werden.
- Das gewünschte Protein kann in das Medium abgesondert werden, in dessen Fall ein synthetisches Kulturmedium verwendet wird, um die Rückgewinnung des gewünschten Proteins zu erleichtern. Wenn das gewünschte Protein nicht in das Medium abgesondert wird, wird es durch Brechen der Zellen bei Temperaturen von etwa 20 bis etwa 8ºC und Isolieren des gewünschten Proteins durch beliebige, geeignete Mittel erhalten.
- Während die vorliegende Erfindung in der folgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf einen spezifischen Hefestamm als Beispiel angegeben wird, ist es so zu verstehen, daß die Erfindung entsprechend genauso mit anderen Hefestämmen durchgeführt werden kann.
- Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne sie jedoch auf diese zu beschränken.
- Die Ga14-Regulationsregion zwischen den Ga11- und Ga110-Genen der Hefe Saccharomyces cerevisiae wurde als ein 370-pb-Xhol- Sau3A-Fragment aus dem Plasmid p1GSD5, Guarente et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 79: 7410-7414 (1982), isoliert. Dieses Fragment wurde durch Standardtechniken in ein -370-bp-BamH1- Sall-Fragment umgewandelt und als eine BamH1-Sa11-Substitution in den Hefeexpressionsvektor pC1/1 kloniert, Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 81: 4642-4646 (1984), um Plasmid pC1/1GAL4/370 zu ergeben. Die -1,6-kb-Expressionskassette, die 376 bp der GAPDH-Promotorseguenz enthielt, Holland et al., J.
- Biol. Chem. 254 : 9839-9845 (1979) und Travis et al., J. Biol. Chem. 260: 4384-4389 (1985), die Sequenz für den gesamten Codierbereich des reifen Hepatitis-B-Oberflächenantigens und 128 bp der 3' untranslatierten Sequenz, Valenzuela et al., in Fields, Jaenisch und Fox (eds.), Animal Virus Genetics, Academic Press, New York, 1980 sowie der Terminator 350 bp ADH1, Bennetzen et at., J. Biol. Chem. 257: 3018-3025, (1982) wurden als ein Sall-Fragment konstruiert und in die SalI-Stelle von pc1/1GAL4/370 kloniert. Ein Plasmid, pHBSGAP8oGAL370/2 wurde erhalten welches die Expressionskassette in der gewünschten Orientierung relativ zum GAL-Regulationsbereich hatte. Die Restriktionskarte dieses Plasmids ist wie folgt:
- Hefestamm 2150-2-3 (Mata, leu2, ades, nib6&spplus; [cirº], erhalten aus einer genetischen Kreuzung zwischen dem Stamm Y379-5-D cyh2 nibl (rho&supmin;), Livingston, Genetics 86: 73 (1977), und DC 04, ein Adel, Adex, leu2-04 (cirº), Broach, Cell 21: 501 (1980) wurde mit pHBSGAP80GAL370/2 transformiert, im wesentlichen gemäß Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 75: 1919-1933 (1978), um transformierten Hefestamm p5 zu ergeben. Leu&spplus;-Transformanten wurden ausgewählt und in einem synthetischen Vollmedium, dem Leucin fehlte (SC-leu), gehalten. Das SC-leu-Medium enthielt 0.67% Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren; 1% Succinsäure; 0,6% NaOH; 2% Glucose; 100 ug/ml Adenin; jeweils 30 ug/ml Uridin, Tyrosin und Lysin; jeweils 20 ug/ml Tryptophan, Histidin, Arginin und Methionin; und 200 ug/ml Threonin.
- A. Ein Schrägagar, dem Leucin und Galactose fehlt, wurde mit 1 ml neu zusammengesetzten, lyophylisierten, rekombinanten Saccharomyces cerevisiae-Zellen, Stamm PS, welcher das HBsAg-Gen exprimiert, wenn es mit Galactose induziert wird, geimpft. Nach 4 Tagen bei 28ºC wurde das Schrägagar erneut in 5 ml Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YEPD) -Medium suspendiert, und ein 250-ml-Kolben, der 46 ml nichtgeimpftes YEPD-Medium enthielt, wurde mit 4 ml der Zellsuspension geimpft. Der Kolben wurde bei 28ºC in einem Schüttler-Inkubator bei 350 upm 7,5 Stunden inkubiert. Die Inhalte des 250-ml-Kolbens wurden in einen zwei- Liter-Kolben, der 450 ml ungeimpftes YEPD-Medium enthielt, überführt, und die Inkubation wurde für 19 Stunden fortgesetzt.
- Diese 500-ml-Hefekultur (O.D. 7,5 bei 660 nm) wurde in einen 16- 1-New-Brunswick-Fermenter gegeben, der 5,0 l ungeimpftes YEPD- Medium enthielt. Die Fermentation wurde bei 28ºC fortgesetzt, anfangs mit 300 upm gerührt und mit Luft mit einer Geschwindigkeit von 3 l/Minute gesprengt. Während der Fermentation gelöster Sauerstoff wurde auf etwa 10% Sättigung und einen pH bei 5,0 kontrolliert. Nachdem das Zellwachstum zu steigen begann, wurde YEPD-Medium in den Fermenter von der 18. bis zur 52. Fermentationsstunde mit den folgenden Geschwindigkeiten gepumpt:
- Stunden Geschwindigkeiten (ml /Stunde)
- 18-27 60
- 27-29,5 130
- 29,5-52 180
- Bei Stunde 52 war die Zelldichte am Maximum, und die Zellen befanden sich in der späten log-/frühen stationären Phase.
- B. Etwa 1,0 l der Hefekultur wurde nach 52 Stunden entfernt. Die Hälfte der Zellbrühe (500 ml) wurde in einen 2-l-Kolben gegeben; Galactose wurde auf eine Endkonzentration von 0 2% (Gew./Vol.) hinzugefügt. Der Kolben wurde bei 28ºC in einem schüttler/Inkubator mit 350 upm für 20 Stunden inkubiert.
- Das Zellwachstum der Kultur wurde durch Bestimmung der O.D. bei 660 nm durch Messen des Trockengewichtes bestimmt. Die O.D. war 36, und das Trockengewicht war 34,2 g/l. Die Zellen wurden dann bei 4ºC durch Scheren mit Glaskugeln gebrochen. Die HBsAg- Konzentration war weniger als 0,0001 mg/l durch AUSRIA.
- C. Die anderen 500 ml der Fermenterkultur wurden bei 10000·g 20 Minuten zentrifugiert. Die pelletierten Hefezellen wurden dann erneut in 400 ml Phospat-gepufferter Kochsalzlösung (PSB) suspendiert und wieder bei 10000·g für 20 Minuten zentrifugiert, um die mitgeschleppten Komponenten des Mediums zu entfernen. Die pelletierten Hefezellen wurden dann erneut in 400 ml PSB suspendiert und dreimal bei 10000·g für 20 Minuten zentrifugiert. Die pelletierten Hefezellen wurden dann erneut in 500 ml Hefeextrakt-Pepton suspendiert, Galactose wurde auf eine Endkonzentration von 2% (Gew./Vol.) hinzugefügt, und die Kultur wurde bei 28ºC in einem schüttler/Inkubator bei 350 upm für 20 Stunden inkubiert.
- Zellwachstum der Kultur wurde durch Bestimmen der O.D. bei 660 nm und durch Messen des Trockengewichtes bestimmt. Die O.D. war 44, und das Trockengewicht war 35,1 g/l. Die Zellen wurden dann bei 4ºC durch Scheren mit Glaskugeln gebrochen. Die HBsAg- Konzentration war 0,15 mg/l durch AUSRIA.
- Das Verfahren aus Teil A von Beispiel 1 wird wiederholt. Ein Liter der Hefekultur wird dann entnommen und unter Verwendung eines 0,45-u-Filters filtriert. Die Hefezellen werden dann erneut in 1,0 l Hefeextrakt-Pepton suspendiert, und Galactose wird auf eine Endkonzentration von 2% (Gew./Vol.) hinzugefügt. Die Kultur wird dann bei 28ºC in einem Schüttler/Inkubator bei 350 upm für 20 Stunden inkubiert. HBsAg wird in einer ähnlichen Konzentration wie die in Beispiel 1 erhalten.
- Das Verfahren aus Teil A aus Beispiel 1 wird wiederholt. Ein Liter der Hefekultur wird dann entnommen und gegen PBS diafiltriert. Die Hefezellen werden dann erneut in 1,0 l Hefeextrakt-Pepton suspendiert, und Galactose wird auf eine Endkonzentration von 2% (Gew./Vol.) hinzugefügt. Die Kultur wird dann bei 28ºC in einem Schüttler/Inkubator bei 350 upm für 20 Stunden inkubiert. HBsAg wird in einer ähnlichen Konzentration wie die in Beispiel 1 erhalten.
Claims (6)
1. Verfahren zur Herstellung von rekombinierter HBsAg durch
Hefezellen, welches umfaßt:
a) Transformieren von Hefezellen mit DNA kodierend HBsAg
unter Transkriptionskontrolle eines mit Galactose
induzierbaren Promotors,
b) Kultivieren der transformierten Hefezellen in einem
im wesentlichen Galactose-freiem Medium,
c) Entfernen im wesentlichen des gesamten Kulturmediums
aus den Hefezellen, wenn die Zelldichte an oder bei
ihrem Maximum ist und die Zellen in einer späten
Log/frühen stationären Phase sind,
d) Zufügen von frischem Kulturmedium zu den kultivierten
Hefezellen, und
e) Kultivieren der Hefezellen in Gegenwart von
Galactose, um HBsAg-Expression zu induzieren.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Galactose im frischen
Kulturmedium aus Schritt (d) vorliegt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, worin im wesentlichen das
gesamte Kulturmedium aus den Hefezellen in Schritt (c) vor dem
Zugeben des frischen Kulturmediums entfernt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das
verbrauchte Medium durch Zentrifugieren entfernt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das
verbrauchte Medium durch Filtration entfernt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das
verbrauchte Medium durch Diafiltration entfernt wird.
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|---|---|---|---|
| US76200085A | 1985-08-02 | 1985-08-02 |
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|---|---|---|---|
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