DE3687054T3

DE3687054T3 - Verfahren zum Nachweis eines Analytteiles mittels Signallokalisierung.

Info

Publication number: DE3687054T3
Application number: DE3687054T
Authority: DE
Inventors: Elazar Rabbani
Original assignee: Enzo Biochem Inc
Current assignee: Enzo Biochem Inc
Priority date: 1985-08-29
Filing date: 1986-08-28
Publication date: 2002-03-14
Anticipated expiration: 2006-08-29
Also published as: ATE82073T1; DE3687054T2; EP0212670A3; EP0212670B1; EP0212670A2; DE3687054D1; EP0212670B2; CA1281283C

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Lokalisierung eines Signals, wodurch der Nachweis einer Analyteinheit erleichtert wird. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Lokalisierung eines Signals durch Erzeugen des Signals in einem Medium, das ein Material umfaßt, das die Ausbreitung des Signals vom Ursprung des Signals aus einschränkt.
Tests zur Bestimmung des Vorhandenseins von Analyteinheiten mit Hilfe von analytspezifischen Einheiten sind auf dem Fachgebiet bekannt. Die Verfahren umfassen im allgemeinen das Anheften der in einer Probe vorliegenden Analyteinheiten an einen Träger, die Blockierung von denjenigen Bereichen des Trägers mit einem Blockierungsmittel, an die keine Analyteinheiten angeheftet sind, sowie Inkontaktbringen der Probe mit den analytspezifischen Einheiten zur Bildung von Komplexen aus Analyteinheit und analytspezifischer Einheit. Die analytspezifischen Einheiten weisen im allgemeinen daran gebundene Signaleinheiten auf. Die nichtgebundenen analytspezifischen Einheiten werden von den gebundenen beispielsweise durch Waschen abgetrennt, der Träger wird sodann mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die eine Vorstufe enthält, die durch die Signaleinheiten in ein Signal umgewandelt werden kann. Die Erzeugung des Signals (üblicherweise ein chromogenes oder fluoreszierendes Produkt) zeigt das Vorhandensein der Analyteinheiten an. Die Erzeugung des Signals kann mit Hilfe eines fällbaren oder löslichen Tests vor sich gehen.
Bei einem fällbaren Test wird das Signal an der Stelle der Erzeugung angereichert, ein Ergebnis, das diesen Test für den in situ-Nachweis besonders vorteilhaft macht, da er eine Sichtbarmachung des Signals im Bezug auf die Zellstruktur erlaubt. Ein solcher Test wird jedoch dadurch eingeschränkt, daß Niederschläge möglicherweise nicht gebildet werden, sofern die Menge des gebildeten Signals nicht die maximale Löslichkeit des Signals im Lösungsvolumen übersteigt (wodurch ein falsch negatives Ergebnis erhalten wird), und daß Niederschläge nicht leicht quantifizierbar sind. Ferner wird vermutet, daß der Enzymumsatz durch die Bildung des Niederschlages an der Stelle der Signalerzeugung signifikant reduziert wird (da der Niederschlag das aktive Zentrum des Enzyms blockiert), wodurch die effektive Halbwertszeit des Enzyms vermindert wird.
Ein löslicher Test erzeugt ein Signal, das beispielsweise durch spektrophotometrische oder colorimetrische Verfahren quantifiziert werden kann. Dieser Test wird dadurch eingeschränkt, daß das Signal dem Nachweis entgehen kann, sofern es nur langsam erzeugt wird und sich ausbreitet (sich in einem bestimmten Volumen verteilt), bevor es nachgewiesen werden kann.
Die Ausbreitung von Molekülen von einem Bereich einer Lösung über die ganze Lösung beruht hauptsächlich auf Konvektion und Diffusion. Im allgemeinen ist die Ausbreitung vor allem auf Konvektion zurückzuführen, die als die zirkulierende Bewegung definiert ist, die in einer Flüssigkeit bei nicht einheitlicher Temperatur infolge von Dichteschwankungen und Schwerkraft vorsichgeht. Die Konvektion beschleunigt die Ausbreitung von Molekülen, indem sie Massenbewegungen der Bereiche der Lösung bewirkt, welche die Moleküle enthalten. Da die Konvektion eine Massenbewegung umfaßt, verteilen sich die Moleküle in einer Lösung aufgrund von Konvektion rascher als aufgrund von Diffusion. Daher beruht die verminderte Nachweisempfindlichkeit sowohl beim fällbaren als auch beim löslichen Test hauptsächlich auf der Ausbreitung des Signals durch Konvektion.
Die Ausbreitung ist zum Teil auch auf Diffusion zurückzuführen. Diffusion ist als der Nettofluß eines Bereiches mit hoher Konzentration zu einem Bereich mit niedriger Konzentration definiert, wobei keine treibende Kraft vorliegt. Diffusion ist die Wanderung von Molekülen durch ungeordnete Bewegung.
Ein Parameter, der die Diffusion in einer Lösung stark beeinträchtigt, ist die Viskosität der Lösung. Viskosität ist als die Wirkung definiert, die durch Reibung erzeugt wird, die durch Behinderung der Bewegung einer Flüssigkeit an einer Fläche entsteht.
Der Zusatz von bestimmten gelösten Molekülen zu einem Lösungsmittel mit Viskosität n&sub0; ergibt eine Lösung mit der höheren Viskosität n. Man kann annehmen, daß dies durch die erhöhte Reibung zwischen benachbarten monomolekularen Schichten in der Flüssigkeit zustandekommt, die durch die Tatsache bewirkt wird, daß die bestimmten gelösten Moleküle größer sind als die Lösungsmittelmoleküle und sich daher über mehrere dieser hypothetischen Ebenen erstrecken. Die Fähigkeit eines gelösten Moleküls, die Viskosität des Lösungsmittels zu verändern, hängt von verschiedenen Parametern ab, nämlich dem Volumen der betreffenden Lösung, dem Verhältnis von Länge zu Breite des Moleküls und der Steifigkeit des Moleküls. Viskosität wird häufig als die spezifische Viskosität, nsp, ausgedrückt, die als die relative Änderung der Viskosität definiert ist, die durch Zusatz der gelösten Moleküle erhalten wird:
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Lokalisierung eines Signals. Das Signal wird in einem Test erzeugt, der zum Nachweis des Vorhandenseins einer Analyteinheit durchgeführt wird.
Das Signal bleibt im wesentlichen lokalisiert, da es in einem Medium erzeugt wird, das ein Material umfaßt, das die Ausbreitung des Signals vom Ursprung des Signals aus einschränkt. Die Medien, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt sind, werden hier als spezifische, anzeigende, viskose oder dicke Medien bezeichnet. Das spezifische Medium umfaßt eine Lösung, ein Netzwerk und eine Signalvorstufe. Das anzeigende Medium umfaßt eine Lösung, ein Netzwerk und eine Signaleinheit. Das viskose Medium umfaßt eine Lösung, eine Komponente, die dem Medium die gewünschte Viskosität verleiht (nachstehend als die spezifische Komponente bezeichnet), und eine Signalvorstufe. Das dicke Medium umfaßt eine Lösung, eine spezifische Komponente und eine Signaleinheit. Das Netzwerk und die spezifische Komponente begrenzen die Ausbreitung des Signals vom Ursprung des Signals aus. Das Netzwerk ist in der Lösung suspendiert oder gelöst, die spezifische Komponente ist in der Lösung gelöst. Das Signal ist im allgemeinen eine fluoreszierende oder chromogene Verbindung.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins einer Analyteinheit, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Anheften einer ersten Analyteinheit oder einer ersten analytspezifischen Einheit an einen Träger;
(b) Bildung eines Komplexes, umfassend:
(1) die erste Analyteinheit und eine zweite analytspezifische Einheit oder
(2) die erste analytspezifische Einheit und eine zweite Analyteinheit, wobei sowohl die zweite analytspezifische Einheit als auch die erste analytspezifische Einheit eine direkt oder indirekt gebundene Signaleinheit aufweisen, die fähig ist, ein Signal zu erzeugen;
(c) Bildung eines spezifischen oder viskosen Mediums auf dem Träger, wobei das spezifische Medium (1) eine Lösung, (2) ein Polymernetzwerk und (3) eine Signalvorstufe umfaßt, und wobei das viskose Medium (1) eine Lösung, (2) eine spezifische Komponente, die dem viskosen Medium die gewünschte Viskosität verleiht, und (3) eine Signalvorstufe umfaßt; und
(d) Erzeugen eines Signals mit Hilfe der Signaleinheit.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins einer Analyteinheit in einer Probe, wobei die Analyteinheit eine Signaleinheit oder eine Signalvorstufe ist oder umfaßt, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Bildung entweder
(1) eines spezifischen oder viskosen Mediums auf einem Träger, wenn die Analyteinheit eine Signaleinheit ist oder umfaßt, die zur direkten oder indirekten Erzeugung eines Signals fähig ist, wobei das spezifische Medium (a) eine Lösung, (b) ein Polymernetzwerk und (c) eine Signalvorstufe umfaßt, und wobei das viskose Medium (a) eine Lösung, (b) eine spezifische Komponente und (c) eine Signalvorstufe umfaßt, oder
(2) eines anzeigenden oder dicken Mediums auf einem Träger, wenn die Analyteinheit eine Signalvorstufe ist oder umfaßt, wobei das anzeigende Medium (a) eine Lösung, (b) ein Polymernetzwerk und (c) eine Signaleinheit umfaßt, und wobei das dicke Medium (a) eine Lösung, (b) eine spezifische Komponente und (c) eine Signaleinheit umfaßt;
(b) Inkontaktbringen der Medien mit der Analyteinheit; und
(c) Erzeugen eines Signals mit Hilfe der Signaleinheit.

I. Verwendung eines spezifischen oder anzeigenden Mediums

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer Analyteinheit mit Hilfe eines Signals, das in einem spezifischen Medium erzeugt wird. Das spezifische Medium umfaßt mindestens drei Komponenten: ein Netzwerk, eine Lösung und eine Signalvorstufe. Der Begriff Netzwerk bezieht sich auf eine dreidimensional geformte Struktur, die das Medium durchdringt. Der Begriff Lösung bezieht sich auf die im Medium vorliegende Flüssigkeit. Der Begriff Signalvorstufe bezieht sich auf die Verbindung, die in ein Signal umgewandelt wird. Eine Abänderung dieser Ausführungsform betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer Analyteinheit in einem anzeigenden Medium. Das anzeigende Medium umfaßt ein Netzwerk, eine Lösung und eine Signaleinheit.
Das Netzwerk entsteht aus Polymeren, die in der Lösung vorliegen. Das Netzwerk kann zusammenhängend oder unterbrochen sein. Ein zusammenhängendes Netzwerk liegt vor, wenn das Netzwerk aus einem ganzheitlichen Polymer besteht. Ein unterbrochenes Netzwerk liegt vor, wenn das Netzwerk aus mehr als einem ganzheitlichen Polymer besteht. In jedem ganzheitlichen Polymer sind die Monomere kovalent gebunden.
Die Polymere, die ein Netzwerk bereitstellen, können aus organischen Monomeren, anorganischen Monomeren oder einer Kombination aus organischen und anorganischen Monomeren bestehen. Das Polymer kann linear oder verzweigt sein. Große Polymere können zu einer beliebigen Form gemahlen werden, wobei jedoch eine Perlenform bevorzugt ist. Die Perle kann kugelförmig sein, ferner kann sie porös oder nicht-porös sein. Besonders bevorzugt ist die kugelförmige poröse Perle. Das Polymer kann in der Lösung suspendiert oder gelöst sein.
Netzwerke, welche die Polymere umfassen, die organische Monomere enthalten, die im allgemeinen in der Lösung suspendiert sind, umfassen beispielsweise Kohlenhydrate, Polysaccharide, Stärken, Liposaccharide, Dextrane, Methylcellulosen, Pflanzenschleime, Pflanzengummen, Cellulosen, Agarosen, Sepharosen®, Polyacrylamide und flüssige Kristalle. Bevorzugt sind die Agarose-, Sepharose®- und Dextran-Polymere. Polymere, die anorganische Monomere enthalten, die im allgemeinen in der Lösung suspendiert sind, umfassen beispielsweise Zeolite, Silikate, Phosphate, Sulfate und Aluminate. Bevorzugt sind die Silika- und Aluminiumoxid-Polymere.
Netzwerke, welche die Polymere umfassen, die organische Monomere enthalten, die im allgemeinen in der Lösung gelöst sind, umfassen beispielsweise Carboxymethylcellulose, Polyvinylalkohol, Polyglycole, Glycole, Proteine, Polypeptide, Pectine, Mucine, Lipoproteine, DNA, RNA und Polynucleotide. Bevorzugte Polymere sind die Carboxymethylcellulosen, Polyglycole, Proteine, Polypeptide, DNA, RNA, Polynucleotide, Mucine und Pectine.
Polymere, die organische und anorganische Monomere enthalten, die im allgemeinen in der Lösung gelöst sind, schließen beispielsweise Polymere ein, die bifunktionelle organische Monomere umfassen, die durch zweiwertige Metalle vernetzt sind. Die bifunktionellen Gruppen umfassen z. B. Aldehyde, Ketone, Alkohole, Carbonsäuren, Amine, Amide und Thiole.
Die Erfinder vermuten, ohne sich an eine Theorie binden zu wollen, daß das Netzwerk die Massenbewegung der Lösungsanteile des Mediums herabsetzt und auf diese Weise die Konvektion im Medium reduziert. Die Reduktion der Konvektion vermindert die Ausbreitungsgeschwindigkeit des Signals, was dazu führt, daß das Signal im wesentlichen lokalisiert bleibt. Durch diese Signallokalisierung wird ein Test mit erhöhter Empfindlichkeit bereitgestellt.
Wenn das Netzwerk ein Polymer umfaßt, das als Feststoff in der Lösung suspendiert ist, bildet das Feststoff-Netzwerk die Barriere, welche die Massenbewegung der Lösung reduziert. Wenn das Netzwerk ein Polymer umfaßt, das in der Lösung gelöst ist, entsteht das Netzwerk, das die Barriere zur Reduzierung der Massenbewegung der Lösung bereitstellt, durch nicht-kovalente Anlagerung, Wechselwirkung, Verbindung und Bindung der gelösten Polymere aneinander. Eine nicht-kovalente Wechselwirkung kann beispielsweise durch Wasserstoffbindung, Ionenpaarung oder Ionenanziehung erfolgen.
Es wird vermutet, daß eine noch stärkere Lokalisierung des Signals erreicht werden kann, wenn das Netzwerk mit dem Signal in Wechselwirkung tritt. Die Wechselwirkung kann kovalent oder nicht-kovalent sein. Eine nicht-kovalente Wechselwirkung kommt im allgemeinen durch elektrostatische Wechselwirkung zustande, umfassend beispielsweise Wasserstoffbindung, Ionenpaarung, Dipol-Dipol-Wechselwirkung und Van-der-Waals-Anziehung. Eine kovalente Wechselwirkung kommt durch Ausbildung einer Bindung zwischen dem Netzwerk und dem Signal zustande.
Netzwerke, die mit dem Signal in nicht-kovalente Wechselwirkung treten können, umfassen die verschiedenen Polymere, die funktionelle Gruppen enthalten, oder die Polymere, die mit einer Verbindung beschichtet sind, die funktionelle Gruppen enthält. Diese umfassen z. B. diejenigen, die für die Normalphasen-Chromatographie verwendet werden, wie z. B. Aluminiumoxid, Kieselgel und Kohlenhydrate, diejenigen, die für die Umkehrphasen-Chromatographie verwendet werden, wie z. B. Kieselgel mit daran gebundenen Octadecyl- und Phenylgruppen, und diejenigen, die für die Gaschromatographie verwendet werden, wie z. B. Kieselgur, das mit Siliconöl oder Polyethylenglykolestern beschichtet ist. Ein Beispiel einer nicht-kovalenten Wechselwirkung zwischen dem Netzwerk und dem Signal ist das Netzwerk, das Kieselgel mit daran gebundenen Octadecylgruppen umfaßt, und das Signal, das ein Phenylendiamin darstellt. Die organischen Octadecylgruppen binden nicht-kovalent an das organische o-Phenylendiamin-Molekül, wodurch eine weitere Signallokalisierung bereitgestellt wird.
Netzwerke, die mit dem Signal in kovalente Wechselwirkung treten können, umfassen beispielsweise diejenigen Netzwerke, die eine Funktionalität enthalten, die mit einem Signal reagieren kann, z. B. durch Bildung einer Schiffschen Base. Eine kovalente Wechselwirkung zwischen dem Netzwerk und dem Signal kommt beispielsweise zustande, wenn die in einem Test verwendete Vorstufe ein aromatischer Farbstoff, umfassend ein alpha-diphosphoryliertes gem-Diol, das Netzwerk im Medium ein Polymer, umfassend eine primäre Aminogruppe, und die an die analytspezifische Einheit gebundene Signaleinheit alkalische Phosphatase ist. Die Abspaltung der Phosphatgruppen aus dem gem-Diol durch das Enzym eliminiert ein Wassermolekül und erzeugt ein fluoreszierendes Signal, das eine Aldehydgruppe enthält. Die Aldehydgruppe auf dem Signal kann mit der Aminogruppe auf dem Netzwerk unter Bildung einer Schiffsche Base reagieren, wodurch das Signal an das Netzwerk immobilisiert und eine weitere Signallokalisierung bereitgestellt wird.
Diese Erfindung betrifft auch signalerzeugende Tests in einem Medium auf einem Träger, wobei der Träger mit dem Signal in Wechselwirkung tritt und dadurch eine weitere Signallokalisierung bereitgestellt wird. Die Wechselwirkung kann kovalent oder nicht-kovalent sein, wie vorstehend beschrieben, wobei das Netzwerk mit dem Signal in Wechselwirkung tritt.
Die Lösungskomponente des Mediums kann eine beliebige Flüssigkeit sein, die mit dem jeweiligen Test und dem Netzwerk kompatibel ist. Für Signaleinheiten, die Katalysatoren, z. B. Enzyme, sind, können wässerige oder organische Lösungen verwendet werden. Bevorzugt sind die wässerigen Lösungen. Vgl. "Enzymatic Catalysis in Organic Media at 100ºC", A. Zaks und A. M. Klibanov, Science 224 (1984), 1249-1251, und "Preparative Production of Optically Active Esters and Alcohols Using Esterase-Catalyzed Stereospecific Transesterification in Organic Media" von B. Cambuv und A. M. Klibanov, J. Amer. Chem. Soc. 106 (1984), 2687-2692.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich auf fällbare und lösliche Tests anwenden. Bei fällbaren Tests führt die Verminderung der Ausbreitung durch das Netzwerk dazu, daß das Signal in einem kleinen Volumen angereichert wird, d. h. es kommt zur Signallokalisierung, auf diese Weise wird die Löslichkeit des Signals in der Lösung erhöht, wodurch ein sichtbarer Niederschlag gebildet wird. Bei löslichen Tests führt die Verminderung der Ausbreitung durch das Netzwerk dazu, daß die Signalmoleküle angereichert bleiben, wodurch das Signal, z. B. Fluoreszenz, Lumineszenz oder Chromogen, leichter beobachtet werden kann.
Das spezifische Medium der vorliegenden Erfindung wird hergestellt, indem das das Netzwerk bildende Polymer in einer wässerigen oder organischen Lösung suspendiert oder gelöst wird. Zur Sicherstellung einer gleichmäßigen Netzwerkverteilung kann es erforderlich sein, das Medium erst zu erhitzen und anschließend abzukühlen. Das spezifische Medium kann außerdem gegebenenfalls einen Puffer umfassen.
Bei Suspendierung des Netzwerkes im Medium entsteht ein Zweiphasensystem. Bei Lösung des Netzwerkes im Medium entsteht ein Einphasensystem. Im allgemeinen umfaßt ein Zweiphasensystem eine feste und eine flüssige Phase. Die flüssige Phase ist in und zwischen dem Netzwerk dispergiert. Ein Zweiphasensystem kann jedoch auch zwei flüssige Phasen umfassen, wenn nämlich eine erste flüssige Phase in einer zweiten flüssigen Phase emulgiert ist. Die Einheiten, die das Netzwerk bilden, sind dann mit Hilfe der ersten flüssigen Phase dispergiert.
Die erfindungsgemäß erforderliche Konzentration des Netzwerkes in der Lösung hängt von dem jeweiligen Netzwerk und der jeweiligen Lösung ab. Bei polymeren Netzwerken, die in der Lösung suspendiert sind, wird die Menge der vorliegenden Lösung beispielsweise durch die Größe, Form und Quellung des Polymers bestimmt. Die Quellung des Polymers wird im allgemeinen durch das prozentuale Ausmaß der Vernetzung kontrolliert, wobei die Quellung umgekehrt proportional zum prozentualen Ausmaß der Vernetzung ist. Bei hochvernetzten Polymeren ist das Verhältnis von Netzwerk zu Lösung im Vergleich zu wenig vernetzten Polymeren groß, sie erzeugen deshalb feste Perlen. Festere Perlen sind bei der Verminderung der Ausbreitung eines Signals möglicherweise bevorzugt, da sie eine dichte Netzwerkschicht bereitstellen. Bei wenig vernetzten Polymeren ist das Verhältnis von Lösung zu Netzwerk im Vergleich zu hochvernetzten Polymeren niedrig, sie erzeugen weiche Perlen, die bevorzugt sind, wenn große Lösungsmengen erwünscht sind, z. B. wenn die Vorstufe in der Lösung relativ unlöslich ist. Bevorzugte suspendierte Netzwerke sind Gele. Tabellen zur Bestimmung der Korrelation zwischen Vernetzung und Quellung des Polymers sind ohne weiteres verfügbar. Vgl. die Schriften "Ion-Exchange Chromatography" und "Gel Filtration Chromatographie" von Pharmacia Chemical Company, Piscataway, New Jersey.
Bei polymeren Netzwerken, die in der Lösung gelöst sind, sollte das Polymer im allgemeinen etwa ein bis etwa fünfzig Prozent, vorzugsweise etwa zwei bis etwa dreißig Prozent, und insbesondere etwa fünf bis zwanzig Prozent (Gew./Vol.) der Lösung umfassen. Hohe Polymerkonzentrationen stellen ein sehr ausgefeiltes Netzwerk bereit und können die Ausbreitung des Signals im Vergleich zu niedrigen Polymerkonzentrationen signifikant vermindern. Hohe Polymerkonzentrationen können jedoch dazu führen, daß das Medium sehr viskos wird, dadurch entstehen Schwierigkeiten beim Gießen und Aufbringen des Mediums auf einen Träger. Daher hängt die optimale Polymerkonzentration in der Lösung von der Art des durchzuführenden Testes ab. Sie wird am besten durch vorausgehende Kontrollexperimente bestimmt, die von einem Fachmann einfach ausgeführt werden können.
Ein Medium, bei dem das Netzwerk durch ein gelöstes Polymer gebildet wird, liegt beispielsweise vor, wenn 2% Carboxymethylcellulose (CMC) (Gew./Vol.) in Wasser auf etwa 50ºC erhitzt wird, wobei ein klares Medium gebildet wird, und man das Medium sodann abkühlen läßt. Das Medium bleibt klar und das lösliche Netzwerk ist gleichmäßig im Medium dispergiert. Ein Medium, bei dem das Netzwerk durch ein suspendiertes Polymer gebildet wird, liegt beispielsweise vor, wenn 2% Agarose in Wasser auf etwa 60ºC erhitzt wird, wobei ein klares Medium gebildet wird, und man das Medium sodann abkühlen läßt. Bei Abkühlung trennt sich die gequollene Agarose und setzt sich aus dem Wasser als Perlen ab. Die gequollenen Perlen und das in und zwischen den Perlen eingeschlossene Wasser bilden ein Medium, das ein unlösliches Netzwerk umfaßt.

II. Verwendung eines viskosen oder dicken Mediums

Eine zweite Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer Analyteinheit mit Hilfe eines Signals, das in einem viskosen Medium erzeugt wird. Das viskose Medium umfaßt mindestens drei Komponenten: eine spezifische Komponente, eine Lösung und eine Signalvorstufe. Der Begriff spezifische Komponente bezieht sich auf das Material, das dem Medium eine Viskosität von mindestens 1,5 mPa·s (Centipoise (cp)) verleiht. Der Begriff Lösung bezieht sich auf das Lösungsmittel und andere Flüssigkeiten im Medium. Der Begriff Signalvorstufe bezieht sich auf die Substanz, die mit Hilfe der Signaleinheit in ein Signal umgewandelt wird. Eine Abänderung dieser Ausführungsform betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer Analyteinheit in einem dicken Medium. Das dicke Medium umfaßt eine spezifische Komponente, eine Lösung und eine Signaleinheit.
Die Erfinder vermuten, ohne sich an eine Theorie binden zu wollen, daß Lösungen mit hoher Viskosität eine Barriere gegen die Diffusion von Molekülen bilden. Im allgemeinen wird die Diffusionsbarriere desto größer sein, je höher die Viskosität der Lösung ist. Die Bestimmung des Vorhandenseins einer Analyteinheit hängt häufig von der Bestimmung des Vorhandenseins eines Signals ab. Wenn das Signal eine chromogene oder fluoreszierende Verbindung ist, führt die Verminderung der Diffusion dieses Signals durch Erhöhung der Viskosität der Lösung zur Lokalisierung des Signals an einer bestimmten Stelle, wodurch der Nachweis durch visuelle Methoden oder durch Verfahren anhand von Intrumenten erleichtert wird.
Die spezifische Komponente kann ein beliebiges Molekül sein, das in der Lösung löslich ist und fähig ist, die Viskosität des Mediums zu erhöhen. Ein erfindungsgemäßes viskoses oder dickes Medium ist als ein Medium definiert, das eine Viskosität von mindestens 1,5 mPa·s (cp) aufweist. Die Viskosität des Mediums kann jedoch im Bereich von etwa 1,5 mPa·s (cp) bis etwa 1000 mPa·s (cp) liegen. Die Diffusion eines Signals wird in einem Medium, dessen Viskosität unter etwa 1,5 mPa·s (cp) liegt, nicht signifikant gehemmt. Ein Medium, dessen Viskosität über etwa 1000 mPa·s (cp) liegt, verhindert möglicherweise die Diffusion der Vorstufe und ist möglicherweise nicht geeignet, auf einen Träger aufgebracht oder gegossen zu werden. Jedoch können auch Medien mit einer Viskosität über 1000 mPa·s (cp) verwendet werden, falls das Medium auf den Träger aufgebracht werden kann und die Vorstufe zur Signaleinheit diffundieren kann. Wie durch die vorstehende Gleichung gezeigt wird, hängt die Viskosität von der Temperatur ab. Man muß beachten, daß die Viskosität des erfindungsgemäßen Mediums zu dem Zeitpunkt bestimmt wird, wenn das Signal im Medium erzeugt wird. Ob der Test also bei Raumtemperatur, 37ºC, 0ºC oder einer anderen Temperatur durchgeführt wird, hängt davon ab, bei welcher Temperatur die Viskosität des Mediums mindestens etwa 1,5 mPa·s (cp) und vorzugsweise von etwa 1,5 mPa·s (cp) bis etwa 1000 mPa·s (cp) beträgt.
Die spezifische Komponente sollte weder die Bindung der analytspezifischen Einheit an den Träger noch an die Analyteinheit wesentlich beeinträchtigen und sollte außerdem nicht die Reaktion der Signaleinheit mit der Vorstufe beeinträchtigen.
Die Konzentration der spezifischen Komponente, die erforderlich ist, um eine Viskosität von etwa 1,5 mPa·s (cp) oder mehr zu erzeugen, ändert sich mit der jeweiligen spezifischen Komponente. Es sind Tabellen erhältlich, in denen die Viskositäten von Lösungen aufgeführt sind, die verschiedene Konzentrationen mehrerer spezifischer Komponenten enthalten. Vergleiche z. B. Bingham und Jackson, Bureau Standards Bulletin 14 (1918), 59; M. L. Sheeley, Ind. Eng. Chem. 24 (1932), 1060; und Segur und Oberstar, Ind. Eng. Chem. 43 (1951), 2117. Die erforderliche Menge anderer spezifischer Komponenten, die zur Erhöhung der Viskosität einer Lösung nützlich sind, kann ein Fachmann einfach bestimmen, indem er das Produkt so lange nach und nach hinzufügt, bis die beispielsweise mit einem Viskosimeter gemessene, gewünschte Viskosität erhalten wird.
Spezifische Komponenten, die für diese Erfindung geeignet sind, umfassen Monomere, Oligomere und Polymere, die in der Lösung löslich sind. Die spezifischen Komponenten umfassen z. B. Zucker, Alkohole, Glycole, Proteine, Polypeptide, Aminosäuren, Desoxynucleinsäuren, Ribonucleinsäuren, Polynucleotide, Nucleotide, Nucleoside, Basen, Fettsäuren, Pectine, Mucine, Polysaccharide, Steroide, Flavanoide, Alkaloide, Terpene, Vitamine, Coenzyme und Prostaglandine, Kohlenwasserstoffe, aromatische Kohlenwasserstoffe und Porphyrine.
Bevorzugte spezifische Komponenten umfassen z. B. Zucker, Glycole, Proteine, Polypeptide, Aminosäuren, Desoxynucleinsäuren, Ribonucleinsäuren, Polynucleotide, Nucleotide, Nucleoside, Basen, Pectine, Mucine und Polysaccharide. Besonders bevorzugt sind Zucker, Glycole, Proteine, Desoxynucleinsäuren, Ribonucleinsäuren, Polynucleotide, Pectine, Mucine und Polysaccharide.
Einige spezifische Komponenten können, zusätzlich zur Hemmung der Diffusion des Signales durch Erhöhung der Viskosität, auch noch die Ausbreitung mittels Konvektion durch Bildung eines Netzwerkes im Medium einschränken. Ein Beispiel einer solchen spezifischen Komponente ist Carboxymethylcellulose.
Die spezifische Komponente hemmt die Diffusion des Signals, indem sie das Schergefälle oder die Scherrate des Mediums erhöht, wodurch die Viskosität des Mediums erhöht wird. Das Ausmaß der Erhöhung der Viskosität des Mediums durch die spezifische Komponente hängt vom Achsenverhältnis, von der Form und Größe der spezifischen Komponente ab. Die Viskosität eines Mediums, das eine spezifische Komponente umfaßt, kann mit Verfahren bestimmt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Solche Verfahren umfassen beispielsweise ein Ostwald-Kapillarviskosimeter, ein Ubbelohde-Kappillarviskosimeter, ein Couette-Viskosimeter, ein Zimm-Crothers-Rotationsviskosimeter und ein Cartesian-Tauch-Viskosimeter mit rotierendem Zylinder. Vergleiche z. B. "Physical Biochemistry" von David Freifelder, S. 359-363.
Das viskose oder dicke Medium der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden, indem eine Menge der spezifischen Komponente in einer wässerigen oder organischen Lösung suspendiert oder gelöst wird, wodurch ein Medium mit einer Viskosität von mindestens etwa 1,5 mPa·s (cp) erzeugt wird. Bei einigen ziemlich unlöslichen spezifischen Komponenten kann es nötig sein, die Lösung anfangs zu erhitzen und sodann abkühlen zu lassen, um eine gleichmäßige Verteilung der spezifischen Komponente sicherzustellen. Das viskose oder dicke Medium kann gegebenenfalls außerdem einen Puffer umfassen.
Medien mit hoher Viskosität sind bei der Lokalisierung eines Signals effektiver als Medien mit niedriger Viskosität; Medien mit hoher Viskosität können jedoch die Diffusion der Signalvorstufe hemmen und auf diese Weise verhindern, daß die Signaleinheit mit der Signalvorstufe rasch in Kontakt tritt und reagiert. Daher hängt die für das Medium gewählte tatsächliche Viskosität von dem jeweiligen Test ab. Die optimale Viskosität für einen bestimmten Test kann von einem Fachmann unter Verwendung von Standardverfahren einfach festgelegt werden.

III. Andere Komponenten der Medien

Der Lösungsteil des Mediums kann eine beliebige Flüssigkeit sein, die mit der Analyteinheit, der analytspezifischen Einheit, der Signaleinheit, der spezifischen Komponente und der Vorstufe kompatibel ist. Für Signaleinheiten, die Katalysatoren, z. B. Enzyme, sind, können wässerige Lösungen oder organische Lösungen verwendet werden. Bevorzugt sind die wässerigen Lösungen. Vgl. "Enzymatic Catalysis in Organic Media at 100ºC", A. Zaks und A. M. Klibanov, Science 224 (1984), 1249- 1251, und "Preparative Production of Optically Active Esters and Alcohols using Esterase-Catalysed Stereospecific Transesterification in Organic Media", von B. Cambuv und A. M. Klibanov, J. Amer. Chem. Soc. 106 (1984), 2687-2692.
Die Signalvorstufe ist die Verbindung, die in das Signal überführt wird. Die Signalvorstufe wird üblicherweise durch eine Oxidation oder Hydrolyse in ein Signal umgewandelt, wodurch die Resonanzstruktur der Vorstufe erhöht wird. Die Oxidation umfaßt im allgemeinen eine Dehydrierung der Signalvorstufe. Die Hydrolyse umfaßt im allgemeinen die Entfernung eines Fragmentes aus der Vorstufe, wodurch eine aromatische Hydroxyl-, aromatische Amin-, Thiol- oder Carbonylgruppe erzeugt wird. Die Vorstufe kann vor oder nach Zusatz der Komponente zugefügt werden. Sofern die Vorstufe hitzestabil und in dem bestimmten Medium nicht leicht löslich ist, kann sie häufig durch Hitze solubilisiert werden.
Signalvorstufen umfassen beispielsweise die verschiedenen Farbstoffe. Ein Beispiel einer Signalvorstufe, die durch Oxidation in ein Signal umgewandelt wird, ist Diaminobenzidin, ein Beispiel einer Signalvorstufe, die durch Hydrolyse in ein Signal umgewandelt wird, ist Bromchlorindolylphosphat (BCIP).
Die Signaleinheit erzeugt das Signal. Die Signaleinheit kann beispielsweise ein Katalysator, z. B. ein Enzym, ein Radikalerzeuger oder ein Oxidationsmittel sein. Bevorzugte Signaleinheiten sind die Katalysatoren und Enzyme, da ein Katalysator oder Enzym aus Vorstufen viele Signale erzeugen kann. Spezifische Beispiele von Signaleinheiten sind die Enzyme Phosphatase, Esterase, Dehydrogenase und Peroxidase, Porphyrin- Coenzyme, katalytische Cyclodextrine, Alkylperoxide und Alkylpersulfate.
Die Signaleinheit ist an die analytspezifische Einheit gebunden. Die Signaleinheit kann an die analytspezifische Einheit gebunden werden, bevor die analytspezifische Einheit mit der Analyteinheit in Kontakt gebracht wird, oder nachdem die analytspezifische Einheit mit der Analyteinheit in Kontakt gebracht wird. Die Signaleinheit kann an die analytspezifische Einheit kovalent oder nicht-kovalent gebunden werden. Eine kovalente Bindung kann beispielsweise über eine Isothiocyanatgruppe stattfinden, während eine nicht-kovalente Bindung z. B. über eine Wasserstoffbindung zustande kommen kann. Vergleiche Ward et al., EP-A-63 879, veröffentlicht am 3. November 1982, basierend auf dem Prioritätsdokument, das als US-Patent Nr. 4 711 955 erteilt wurde. Vergleiche auch Engelhardt et al., EP- A-97 373, veröffentlicht am 4. Januar 1984.
Die Signaleinheit muß ein nachweisbares Kennzeichen aufweisen, das in der Vorstufe nicht vorliegt. Das Kennzeichen kann eine Fluoreszenz-Emission, Lumineszenz-Emission, Ultraviolett-Absorption oder eine sichtbare Farbe sein.
Das Signal wird durch die Signaleinheit direkt oder indirekt erzeugt. Die direkte Erzeugung bedeutet, daß die Signaleinheit die Signalvorstufe in ein Signal umwandelt. Die indirekte Erzeugung bedeutet, daß die Signaleinheit eine erste Substanz in eine zweite Substanz umwandelt und die zweite Substanz entweder die Signalvorstufe in ein Signal umwandelt oder weiter eine dritte Substanz in eine vierte Substanz umwandelt, wobei im letzteren Fall die vierte Substanz die Signalvorstufe in das Signal umwandelt.
Ein Beispiel, bei dem eine Signaleinheit direkt wirkt, um eine Signalvorstufe in ein Signal umzuwandeln (direkte Umwandlung), ist die Umwandlung von p-Nitrophenylphosphat (Signalvorstufe) in p-Nitrophenol (Signal) durch die alkalische Phosphatase (Signaleinheit). Ein Beispiel, bei dem eine Signaleinheit indirekt wirkt, ist die Spaltung einer Substanz durch eine Signaleinheit unter Erzeugung von Radikalen und die Umwandlung der Signaleinheiten in Signale durch Wirkung der Radikale. Bevorzugte Substanzen zur Verwendung für solche indirekte Umwandlungen umfassen Peroxide und Persulfate. Wasserstoffperoxid ist besonders bevorzugt. Ein Beispiel dieser indirekten Umwandlung ist die Umwandlung von Wasserstoffperoxid in Hydroxylionen durch Meerrettich-Peroxidase und die Umwandlung von NADH in NAD&spplus; durch Hydroxylionen. Ein Beispiel einer noch indirekteren Umwandlung liegt vor, wenn ein Hydroxylion nicht wie vorstehend zur Umwandlung von NADH in NAD&spplus; verwendet wird, sondern wenn es Kaliumjodid in Jod umwandelt und das Jod Polyethylenglycol in einen Polyethylenglycol-Jod- Komplex umwandelt.
In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, wenn die Signaleinheit ein Signal indirekt anstatt direkt erzeugt. Das kann zutreffen, wenn das Medium sehr dick und viskos ist und die Signalvorstufe ein ziemlich großes Molekül ist. Ein großes Molekül diffundiert in einem solchen Medium langsamer als ein kleines Molekül. Da eine direkte Signalerzeugung vom Kontakt der Signalvorstufe mit der Signaleinheit abhängt, kann, sofern die Signalvorstufe ein großes Molekül ist, die Verzögerung der Diffusion dieses Signalvorstufenmoleküls die Geschwindigkeit der Signalerzeugung wesentlich herabsetzen. In diesen Fällen kann eine stärkere Signalerzeugung erhalten werden, indem ein kleines Molekül als erste Substanz verwendet wird, das schneller zur Signaleinheit diffundieren kann und das zu einer zweiten Substanz umgewandelt werden kann, die wiederum schnell zur Signalvorstufe diffundieren kann und die sodann die letztere in ein Signal umwandeln kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich auf fällbare und lösliche Tests anwenden. Bei fällbaren Tests führt die Verzögerung der Diffusion dazu, daß das Signal in einem kleinen Volumen angereichert und auf diese Weise dessen Löslichkeit in der Lösung überschritten wird, so daß ein sichtbarer Niederschlag erzeugt wird. Bei löslichen Tests führt die Verzögerung der Diffusion dazu, daß die Signalmoleküle angereichert bleiben, so daß die Fluoreszenz, die Lumineszenz oder das Chromogen schneller beobachtet werden können.

IV. Beschreibung anderer Einheiten

Die Analyteinheit ist die Substanz, die im Test nachgewiesen wird. Der Nachweis wird mit Hilfe einer analytspezifischen Einheit durchgeführt, die einen Komplex mit der Analyteinheit bildet. Die Analyteinheit muß einen Informations-Anteil aufweisen, den eine analytspezifische Einheit mit Hilfe einer komplementären Struktur erkennen kann. Als Informations- Anteil wird die Sequenz und/oder Anordnung innerhalb der Analyteinheit bezeichnet, durch die die Analyteinheit unterscheidbar und erkennbar wird. Analyteinheiten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Mikroorganismen, Pilze, Algen, pflanzliche Zellen, tierische Zellen, Tumorzellen, Liganden, Polysaccharide, Polypeptide, Nucleinsäuren und Polynucleotide. Die Analyteinheit kann aus Serum, Gewebeextrakten, Zellabstrichen, Urin, Sputum, Fäzes, Speichel, Eiter, Sperma, Fermentationsbrühe, Kulturmedien, Wasserproben, Umweltproben und Nahrungsmitteln stammen.
Die analytspezifische Einheit erkennt und bindet an eine spezifische Analyteinheit. Die analytspezifische Einheit kann beispielsweise ein Ligand, Rezeptor, Glycoprotein, Protein, Enzym, Enzymsubstrat, Enzyminhibitor, Antigen, Hormon, Antikörper, Polynucleotid, Aminosäure, Lipid und Lectin sein. Vorzugsweise ist sie ein Polynucleotid oder Oligonucleotid.

V. Verfahren zur Durchführung der Erfindung

Ein Test, der sich zur Anwendung dieser Erfindung typischerweise eignet, umfaßt beispielsweise das Anheften einer Probe, die die Analyteinheiten enthält, an einen Träger, z. B. eine Nitrocellulose-Membran. Der Träger wird sodann mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die eine blockierende Verbindung, z. B. Rinderserumalbumin (BSA), enthält. Die blockierende Verbindung bindet an die Stellen auf dem Träger, die von der Probe noch nicht besetzt sind. Das stellt sicher, daß die analytspezifischen Einheiten (wie nachstehend definiert) nur dann an den Träger gebunden werden, wenn die Probe die Analyteinheiten enthält. Weitere Einzelheiten solcher Tests finden sich in den Artikeln von Wie-Shing Lee und James L. Bennington, "Recombinant DNA Technology: Some Applications in Clinical Microbiology", Laboratory Management (April 1985), 21-26, C. J. Stanley, F. Paris, A. Plumb, A. Webb und A. Johannsson, "Enzyme Amplification: A New Technique for Enhancing the Speed and Sensitivity of Enzyme Immunoassays", American Biotechnology Journal (Mai/Juni 1985), 48-53, und Robert H. Yolken, "Enzyme Immunoassays for the Detection of Infectious Antigens in Body Fluids: Current Limitations and Future Prospects", Reviews of Infectious Diseases 4 (1982), 35-68; D. E. Kennell, "Principles and Practices of Nucleic Acid Hybridization", Proc. Natl. Acad. Res. Mol. Biol. 11 (1971), 259-301; und Enzo Biochem. Inc., Katalog 1985.
Der Träger wird sodann mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die die analytspezifischen Einheiten enthält, wobei es zur Bindung der analytspezifischen Einheiten an die vorliegenden Analyteinheiten kommt. Die analytspezifische Einheit erkennt spezifisch die jeweilige Analyteinheit und bindet daran. Eine Signaleinheit ist an die analytspezifische Einheit gebunden. Verfahren zur Bindung einer Signaleinheit an eine analytspezifische Einheit finden sich in der Europäischen Patentveröffentlichung 0 638 79 von Ward et al., veröffentlicht am 3. November 1982, basierend auf dem Prioritätsdokument, das als US-Patent Nr. 4 711 955 erteilt wurde, a. a. O.. Vergleiche auch Europäische Patentveröffentlichung 0 097 373 von Engelhardt et al., veröffentlicht am 4. Januar 1984, und den vorstehend zitierten Artikel von Yolken. Zur Entfernung aller ungebundenen analytspezifischen Einheiten aus dem Träger wird eine Waschlösung verwendet, die aus Wasser oder einem Puffer mit einem pH-Wert von etwa 7,0 bestehen kann.
Ein Test kann außerdem beispielsweise die Immobilisierung der analytspezifischen Einheiten auf dem Träger und das Inkontaktbringen der Probe, die die Analyteinheiten enthält, mit dem Träger umfassen. Anschließend wird der Träger sodann mit einem blockierenden Mittel blockiert und die zweiten, anderen analytspezifischen Einheiten, die für die gleichen Analyteinheiten spezifisch sind, werden mit dem Träger in Kontakt gebracht (im allgemeinen als Sandwich-Test bekannt). Eine Signaleinheit ist an die zweite analytspezifische Einheit gebunden.
Der Träger, der die analytspezifischen und die Signaleinheiten enthält, befindet sich in einem Behälter. Der Behälter kann beispielsweise ein Tablett, ein Becher oder eine Schale sein. Das Medium wird auf den Träger aufgebracht. Wenn das Netzwerk durch polymere Einheiten gebildet wird, die in der Lösung unlöslich sind, kann das Medium auf den Träger als Film oder als Platte aufgebracht werden, wenn das Netzwerk durch monomere, oligomere oder polymere Einheiten gebildet wird, die in der Lösung löslich sind, kann das Medium auf den Träger als Lösung aufgebracht werden.
Das Aufbringen des Mediums auf den Träger bringt eine Masse zustande, in der die Signaleinheit mit der Signaleinheit (Analyt?) in Kontakt treten kann. Dies führt zur Erzeugung eines Signals, wie nachstehend erklärt, das im allgemeinen ein fluoreszierendes oder chromogenes Signal ist. Die Erfinder vermuten, ohne sich an eine Theorie binden zu wollen, daß die Ausbreitung des Signals durch Konvektion in einem spezifischen oder anzeigenden Medium durch die Netzwerkstruktur im Medium vermindert wird und daß die Ausbreitung des Signals durch Diffusion in einem viskosen oder dicken Medium durch die Viskosität des Mediums vermindert wird, folglich wird ein Signal gebildet, das eine relativ lange Zeitspanne lokalisiert bleibt. Die wirkliche Dauer der Signallokalisierung hängt vom verwendeten Medium ab. Je fester und stärker das Netzwerk ist, desto stärker wird die Ausbreitung gehemmt und desto länger dauert die Signallokalisierung an.
Wenn ein viskoses Medium verwendet wird, ist die Diffusion des Signals aufgrund des Vorhandenseins der spezifischen Komponente eingeschränkt, wodurch die Signallokalisierung zustande kommt. Die wirkliche Dauer der Signallokalisierung hängt von der verwendeten spezifischen Komponente ab. Je höher die Viskosität ist, desto stärker wird die Diffusion gehemmt und desto länger dauert die Signallokalisierung an.
Dieses Verfahren der Signallokalisierung kann beispielsweise mit Enzyme-Multiplied-Immunotest-Techniken (EMIT), Enzyme-Linked-Immunosorbent-Tests (ELISA) und in-situ-Hybridisierungsverfahren bequem ausgeführt werden. Die analytspezifische Einheit, die die Signaleinheit enthält, kann in kompetitiven Bindungstests, in heterogenen sequentiellen Sättigungsmechanismen und heterogenen "Sandwich"-Anordnungen verwendet werden. Diese Verfahren sind dem Fachmann wohlbekannt. Vergleiche US-A-4 238 195 von R. C. Boguslaski und R. J. Carrico.
Das Verfahren der Siganllokalisierung kann auch zum Nachweis eines Analyts verwendet werden, wobei die Analyteinheit eine Signaleinheit ist oder umfaßt. Das kann beispielsweise der Fall sein, wenn das Analyt ein Enzym, ein Oxidationsmittel oder ein Reduktionsmittel ist oder umfaßt. In diesen Fällen ist keine analytspezifische Einheit erforderlich. Eine Signalvorstufe für die Signaleinheit liegt im Medium vor. Bei Kontakt und Reaktion der Signaleinheit, z. B. eines Enzyms, mit der Signalvorstufe wird eine Farbe oder Fluoreszenz (Signal) erzeugt, die (das) im Medium lokalisiert bleibt. Die Signaleinheit kann auf die Signalvorstufe, wie vorstehend beschrieben, direkt oder indirekt wirken.
Auf ähnliche Weise kann das Verfahren zum Nachweis einer Analyteinheit verwendet werden, die eine Signalvorstufe umfaßt, die mit Hilfe einer im Medium vorliegenden Signaleinheit in ein Signal umgewandelt werden kann. Die Signaleinheit kann beispielsweise ein Enzym, Oxidationsmittel oder Reduktionsmittel sein, dementsprechend kann die Signalvorstufe ein Substrat, eine oxidierbare Substanz oder eine reduzierbare Substanz sein. Ein Signal wird bei der Reaktion der Signaleinheit mit der Signalvorstufe erzeugt. Dieses Verfahren ist geeignet, wenn die Analyteinheit ein Enzym, z. B. eine Peroxidase, eine Desaminase, eine Oxidoreduktase, eine Esterase, eine Phosphatase oder eine Isomerase, ist oder umfaßt. Bevorzugte Analyteinheiten sind diejenigen, die Peroxidasen sind oder umfassen. Diese Enzyme spalten Peroxide unter Erzeugung von Sauerstoff, der eine Signalvorstufe zu einem Signal, wie z. B. einem Chromogen, oxidieren kann.
Peroxide, die für die Verwendung mit Peroxidase-Enzymen geeignet sind, sind beispielsweise Peroxide von Polyhydroxyl- Verbindungen, wie z. B. Mannitperoxid und Sorbitperoxid. Signalvorstufen, die in Gegenwart von Peroxidasen und Peroxiden in ein Signal umgewandelt werden können, sind beispielsweise Farbstoffe, wie z. B. Guajakharz und 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure) (ABTS).
Die Peroxidase in der Analyteinheit kann aus einer beliebigen ein Peroxidase-vermitteltes System umfassenden zellulären Komponente stammen. Eine Anwendung, wobei die Analyteinheit eine Signaleinheit umfaßt, ist beispielsweise der Nachweis von Blut im Stuhl. Bei einem zur Zeit gebräuchlichen Verfahren wird ein Teststreifen verwendet, der mit Guajakharz imprägniert ist, das bei einer Peroxidase-ähnlichen Reaktion von Blut als Chromogen wirkt. Der Test umfaßt in der herkömmlichen Kit-Form Filterpapier, das mit Guajakharz imprägniert ist, sowie einen getrennten Behälter mit Wasserstoffperoxid. Die separate Verpackung des Peroxids ist erforderlich. Die Qualität und Stabilität des Peroxids in seinem separaten Behälter muß vom Lieferant garantiert werden. Da der das Peroxid enthaltende Behälter unabhängig vom Teststreifen vorliegt, wird er häufig verlegt und ist daher nicht verfügbar, wenn er zur Durchführung des Tests gebraucht wird. Zur Durchführung des Tests wird eine Stuhlprobe auf das Guajak-Testpapier aufgebracht und sodann die Wasserstoffperoxid-Lösung auf die andere Seite des Papiers aufgetragen. Die Bildung eines blauen Rings zeigt das Vorhandensein von Blut. Die vorliegende Offenbarung beschreibt eine Formulierung, wobei sowohl das Guajakharz oder ein anderes Chromogen als auch ein stabilisiertes Wasserstoffperoxid in ein Medium eingearbeitet sind. Hierfür kann ein spezifisches oder viskoses Medium verwendet werden, vorzugsweise wird ein spezifisches Medium verwendet. Vorzugsweise wird das Netzwerk in dem spezifischen Medium mittels eines Gels erzeugt. Hiermit müssen die Reagentien nicht mehr separat verpackt und das Wasserstoffperoxid nicht mehr separat zugegeben werden, wodurch die Durchführung des Tests erleichtert wird.
Der Nachweis kann ausgeführt werden, indem ein anzeigendes oder dickes Medium verwendet wird, wobei die Analyteinheit eine Signalvorstufe ist oder umfaßt. In diesem Fall wird eine Signaleinheit zum Medium zugefügt. Das Netzwerk oder die spezifische Komponente des Mediums führt dazu, daß das Signal lokalisiert bleibt.
Die folgenden Beispiele sind zum besseren Verständnis der erfindungsgemäßen Verfahren dargestellt, sie dienen lediglich der Erläuterung und sollen in keiner Weise den Umfang der Patentansprüche einschränken. In den Beispielen I bis V wird die erste Ausführungsform dieser Erfindung erläutert, in den Beispielen VI bis VIII wird die zweite Ausführungsform dieser Erfindung erläutert.

BEISPIEL I

Saure Phosphatase aus Batate wurde mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 0,1% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, seriell 1 : 10 verdünnt. (Das BSA war zuvor mit Säure behandelt worden, um eventuell als Verunreinigung vorliegende Phosphatase zu zerstören.) Die Verdünnungen lagen im Bereich von 1 Einheit/ml bis 1 · 10&supmin;&sup7; Einheiten/ml. Sodann wurden Aliquots zu je 1 ul von jeder Enzymverdünnung auf Nitrocellulosemembran-Streifen getüpfelt, die mit destilliertem Wasser gespült worden waren, und diese getrocknet. Das spezifische Medium wurde hergestellt, indem Agarose zum Erhalt einer Konzentration von 1,5% zu einer 0,2 M Natriumacetat-Lösung, pH 5,5, hinzugefügt und die Lösung auf 80ºC erhitzt wurde, um die Agarose aufzulösen. Das resultierende Medium wurde auf etwa 40ºC abgekühlt und sodann die Vorstufe 7-Methylumbelliferylphosphat hinzugefügt (1 mg/ml). Das klare Medium wurde auf die Streifen mit dem aufgetüpfeltem Enzym aufgebracht und abkühlen gelassen, wobei ein Agarosegel gebildet wurde.
Dieses Agarosegel wurde in bestimmten Zeitabständen mit einer Minerallampe beobachtet, die langwelliges Licht ausstrahlte. Innerhalb von etwa 15 Minuten wurde im Agarosegel über dem Fleck, der 10&supmin;&sup5; Einheiten Enzym enthielt, ein fluoreszierendes Signal beobachtet.
Ein Kontroll-Nitrocellulosestreifen, auf den die gleichen Enzymlösungen getüpfelt wurden, der jedoch in einer Lösung inkubiert wurde, die 1 mg/ml 7-Methylumbelliferylphosphat in 0,2 M Natriumacetat, pH 5,5, ohne Agarose enthielt, zeigte keine lokalisierte Fluoreszenz im Bereich der Tüpfelflecken. Stattdessen entstand eine diffuse fluoreszierende Lösung.

BEISPIEL II

Alkalische Phosphatase in Mengen im Bereich von 10&supmin;³ Einheiten bis 10&supmin;&sup9; Einheiten wurde nacheinander auf jeden von acht Nitrocellulosemembran-Streifen getüpfelt. Sodann wurde Flavondiphosphat, eine Vorstufe, zum Erhalt einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml in den folgenden Lösungen gelöst:
A. 0,1 M Tris, pH 8,8, in 2 M NaCl,
B. 0,1 M Tris, pH 8,8, 0,75% Agarose, in 2 M NaCl,
C. 0,1 M Tris, pH 8,8, 0,4% Agarose, 1,0% Carboxymethylcellulose (CMC), in 2 M NaCl,
D. 0,1 M Tris, pH 8,0, 2% CMC,
E. 0,1 M Tris, pH 8,5, 2% CMC in 2 M NaCl,
F. 0,1 M Tris, pH 8,8, 1,5% CMC in 2 M NaCl,
G. 0,1 M Tris, pH 8,8, 1% CMC in 2 M NaCl,
H. 0,1 M Tris, pH 8,8, 0,5% CMC in 2 M NaCl.
Die Agarose bildete in den Beispielen ein unlösliches Netzwerk, die CMC dagegen bildete ein lösliches Netzwerk. Das spezifische Medium umfaßte die Vorstufe, die Lösung und entweder Agarose oder CMC. Die Nitrocellulose-Streifen wurden in eines der vorstehenden Medien gelegt und zur Entwicklung des Signals bei Raumtemperatur verschiedene Zeiten belassen, wie nachstehend beschrieben. Die Ergebnisse können folgendermaßen zusammengefaßt werden:
1. Auf allen Streifen wurde unmittelbar nach Kontakt mit dem Substrat Fluoreszenz beobachtet.
2. Die Signale in den Medien B und C waren deutlicher als die anderen. Sie wiesen in der Zeit von etwa 5 Stunden bis 18 Stunden nach dem Kontakt anscheinend die gleiche Intensität auf, das Signal in B wurde jedoch nach 18 Stunden diffuser.
3. Die Signale in D bis H waren diffus wie in A; zwischen D und E war kein Unterschied zu beobachten.
4. Carboxymethylcellulose (CMC) in Konzentrationen über 0,5% bildete bei Quellung eine viskose, transparente, homogene Lösung. Lösungen, die weniger als 0,5% CMC enthielten, trennten sich in zwei Phasen auf, wobei sich das CMC am Boden absetzte.

BEISPIEL III

Alkalische Phosphatase aus Kalbsdarm wurde in Wasser 1 : 10 seriell verdünnt und in Aliquots zu jeweils 1 ul auf kleine Quadrate Nitrocellulosepapier aufgetragen. Die Menge des aufgetragenen Enzyms lag in jeder Serie im Bereich von 10&supmin;¹ bis 10&supmin;&sup4; Einheiten. Die Quadrate, die das Enzym enthielten, wurden in einzelne Vertiefungen einer Polystyrolplatte mit vielen Vertiefungen gelegt. Jede Serie mit Enzymverdünnungen wurde sorgfältig mit einem Gemisch überschichtet, umfassend 1 mg/ml 4-Methyl-7-hydroxycumarinphosphat (Natriumsalz), gelöst in einer der folgenden Lösungen:
A. 0,1 M Tris-HCl, pH 8,8
B. 0,1 M Tris-HCl, pH 8,8, in 50% (Vol./Vol.) Glycerin: H&sub2;O
C. 0,1 M Tris-HCl, pH 8,8 in 50% (Gew./Vol.) Saccharose: H&sub2;O
D. 1,5% (Gew./Vol.) Agarose in A
E. 1,5% (Gew./Vol.) Agarose in B
F. 1,5% (Gew./Vol.) Agarose in C
Die Medien wurden bei Raumtemperatur in der Platte ungestört inkubiert. Das durch die Phosphatase erzeugte Produkt wurde unter Verwendung einer langwelligen Minerallampe zu verschiedenen Zeiten als blaue Fluoreszenz sichtbar gemacht. Die Lokalisierung des löslichen Produktes 4-Methyl-7-hydroxycumarin wurde bei der höchsten Enzymkonzentration festgestellt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen I und II zusammengefaßt.

TABELLE I

Signallokalisierung in verschiedenen Substratmedien Substratmedien Signallokalisierung mit 10&supmin;¹ Einheiten Enzym

A Ein lokalisierter "Dot" (Fleck) auf Nitrocellulose erschien nach 15 Sekunden und begann sich sofort gleichmäßig zu verteilen. Nach 1 Stunde war die Fluoreszenz gleichmäßig über das Medium verteilt und kein lokalisiertes Signal nachweisbar.
B + C Ein lokalisierter Dot erschien nach 15 Sekunden. Die Verteilung der Fluoreszenz ins Medium ging anfangs durch Konvektion vor sich und war im Vergleich zu A gehemmt. Nach 1 Stunde war in der allgemein verteilten Fluoreszenz des Mediums ein lokalisiertes Signal gerade noch sichtbar.
D Ein lokalisierter Dot erschien nach 15 Sekunden. Die Verteilung der Fluoreszenz zeigte sich nach 10 Minuten deutlich und ging unregelmäßig vor sich, wobei eine sich ausdehnende kuppelförmige Fluoreszenzregion gebildet wurde. Die Verteilung kam anscheinend durch Diffusion zustande.
E + F Ein lokalisierter Dot erschien nach 15 Sekunden. Nach 1 Stunde verblieb E lokalisiert auf dem Nitrocellulosefilter, wobei wenig Diffusion vorlag. F zeigte über dem Dot infolge von Diffusion etwas Verteilung ins Medium. TABELLE II Lokalisierung des Signals, das durch verschiedene Enzymkonentrationen nach einer Stunde erzeugt wurde

BEISPIEL IV

2,0 ml der nachstehenden Lösungen werden in Glaskulturröhrchen einer Größe von 10 mm · 75 mm gefüllt:
1. Wasser
2. 1% (Gew./Vol.) Agarose in Wasser
3. 1% (Gew./Vol.) Agarose in 50% (Gew./Vol.) Glycerin: Wasser
4. 1% (Gew./Vol.) Agarose in 50% (Gew./Vol.) Saccharose: Wasser
Die Agarose enthaltenden Gele (2 bis 4) läßt man bei Raumtemperatur aushärten. 15 ul einer Lösung von Rhodamin B (30 mg/ml), gelöst entweder in Wasser, 5% Saccharose in Wasser oder 50% Glycerin in Wasser, werden oben auf die entsprechenden Agarosegele (2 bis 4) aufgetragen. Die Agaroseröhrchen werden nach 10 Minuten umgedreht, nach dieser Zeit ist die Farbstofflösung vollständig ins Gel eingedrungen. Die Strecke, die von der Farbstoff-Front zurückgelegt wird, welche als deutlich begrenzter, konkaver Meniskus läuft, wird in allen Röhrchen zu bestimmten Zeiten gemessen. Die Konvektionsverteilung des Farbstoffs in der Lösung über der Diffusionsfront war in Röhrchen 1 (keine Agarose) bereits nach einer Stunde sichtbar, in Röhrchen 2 jedoch mindestens 9 Stunden und in den Röhrchen 3 und 4 mindestens 95 Stunden nicht sichtbar (Tabelle III).

TABELLE III

Konvektionsverteilung des Farbstoffs in verschiedenen Medien

Lösung Konvektionsverteilung des Farbstoffs
Wasser +a
Wasser + 1% Agarose -b
50% Glycerin + 1% Agarose -c
50% Agarose
(Saccharose?) + 1% Agarose -c
a bestimmt als sichtbar nachweisbare Farbe über der Diffusionsfront
b nicht nachweisbar nach 9 Stunden
c nicht nachweisbar nach 95 Stunden

BEISPIEL V

Ein Agarosegel in Wasser wird hergestellt, wie in Beispiel IV beschrieben, mit der Ausnahme, daß es anstelle von Rhodamin B Mannitperoxid und Guajakharz enthält. Eine Stuhlprobe, die Blutzellen enthält, wird auf das Gel ausgestrichen oder aufgetüpfelt. Um den Abstrich oder die getüpfelte Stelle herum entwickelt sich eine bläuliche Farbe, die lokalisiert bleibt.

BEISPIEL VI

2,0 ml der nachstehenden Lösungen werden in Glaskulturröhrchen einer Größe von 10 mm · 75 mm gefüllt:
1. Wasser
2. 50% (Gew./Vol.) Saccharose: Wasser
3. 50% (Gew./Vol.) Glycerin: Wasser
15 ul einer Lösung von Rhodamin B (30 mg/ml), gelöst in Lösung 1, 2 oder 3, werden mit einer Spritze sorgfältig auf den Boden des jeweiligen Röhrchens gespritzt, das die entsprechende Lösung enthält (1, 2 oder 3). Diese Lösungen werden auf eine solche Weise eingeführt, daß kein Farbstoff in der Lösung über dem Boden des Röhrchens verteilt wird. Die Strecke, die von der Farbstoff-Front zurückgelegt wird, welche als deutlich begrenzter, konkaver Meniskus läuft, wird in allen Röhrchen zu bestimmten Zeiten gemessen. Die Diffusionsgeschwindigkeit des Farbstoffs, die durch die Wanderungsgeschwindigkeit der Lösungsmittelfront angezeigt wird, wird durch die Viskosität der Lösung deutlich beeinträchtigt, wobei die Wanderung über die gleiche Strecke in 50% Saccharose oder 50% Glycerin fünf- bis sechsmal so lange dauert wie in Wasser.

BEISPIEL VII

Diffusion von Farbstoff in Glycerin: Wasser-Lösungen mit verschiedenen Viskositäten

Glycerin wurde in verschiedenen Konzentrationen, wie in der nachstehenden Tabelle IV dargestellt, in Wasser gelöst, das 1 Gew.-% Agarose enthielt. Die Lösung wurde auf 80ºC erhitzt, um die Agarose zu lösen, sodann wurden 11 ml von jeder Lösung in Kulturröhrchen einer Größe von 10 mm · 75 mm gegossen. Man ließ die Lösungen auf Raumtemperatur abkühlen, dies führte dazu, daß die Agarose ein Gel bildete. Die Röhrchen wurden in einem Wasserbad bei 30ºC gehalten, sodann wurden 10 ul einer Lösung von Rhodamin B in Wasser (30 mg/ml) sorgfältig auf die Oberfläche des Gels aufgetragen. Man ließ den Farbstoff ins Gel diffundieren und bestimmte zu bestimmten Zeiten die Strecke vom Ursprung zur Lösungsmittelfront. Die Diffusion des Farbstoffs wurde durch eine Viskosität von 1,5 mPa·s (cp) im Vergleich zu Wasser bei 30ºC signifikant verzögert. TABELLE IV Diffusion von Rhodamin B in Glycerin: Wasser-Lösungen mit verschienen Viskositäten
a bei 30ºC aus "Lange's Handbook of Chemistry", 11. Auflage, J, A. Dean (Hrsg.), McGraw Hill (1973), S. 289
b bei 30ºC, Mittelwert aus zwei Bestimmungen.

BEISPIEL VIII

Diffusion von Farbstoff in Saccharose: Wasser-Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen

Saccharose wurde in verschiedenen Konzentrationen, wie in der nachstehenden Tabelle V dargestellt, in Wasser gelöst, das 1 Gew.-% Agarose enthielt. Die Lösung wurde zur Bildung eines Gels in Röhrchen gegossen und das Gel mit Rhodamin B überschichtet, wie in Beispiel IV beschrieben. Die Diffusion des Farbstoffs wurde durch eine Viskosität von 1,49 mPa·s (cp) im Vergleich zu Wasser bei 30ºC signifikant gehemmt. TABELLE V Diffusion von Rhodamin B in Saccharose: Wasser-Lösungen mit verschiedenen Viskositäten
a bei 30ºC aus "Lange's Handbook of Chemistry", 11. Auflage, J. A. Dean (Hrsg.), McGraw Hill (1973), S. 289,
b bei 30ºC, Mittelwert aus zwei Bestimmungen
c Saccharose lag bei dieser Konzentration teilweise kristallisiert vor.

Claims

1. Verfahren zum verbesserten Nachweis des Vorhandenseins einer Analyteinheit durch Begrenzung der Ausbreitung des Signals vom Ausgangspunkt des Signals aus, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Anheften einer ersten Analyteinheit oder einer ersten analytspezifischen Einheit an einen Träger;

(b) Bildung eines Komplexes, der:

(1) die erste Analyteinheit und eine zweite analytspezifische Einheit oder

(2) die erste analytspezifische Einheit und eine zweite Analyteinheit umfasst, wobei sowohl die zweite analytspezifische Einheit als auch die erste analytspezifische Einheit eine direkt oder indirekt gebundene Signaleinheit aufweisen, die fähig ist, ein Signal zu erzeugen,

(c) Bildung eines spezifischen oder viskosen Mediums auf dem Träger, wobei das spezifische Medium (1) eine Lösung, (2) ein Polymernetzwerk und (3) eine Signalvorstufe umfasst, und wobei das viskose Medium (1) eine Lösung, (2) eine spezifische Komponente, die dem viskosen Medium die gewünschte Viskosität verleiht, und (3) eine Signalvorstufe umfasst; und

(d) Erzeugen eines Signals mithilfe der Signaleinheit.

2. Verfahren zum verbesserten Nachweis des Vorhandenseins einer Analyteinheit in einer Probe durch Begrenzung der Ausbreitung des Signals vom Ausgangspunkt des Signals aus, wobei die Analyteinheit eine Signaleinheit oder eine Signalvorstufe ist oder umfasst, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Bildung entweder

(1) eines spezifischen oder viskosen Mediums auf einem Träger, wenn die Analyteinheit eine Signaleinheit ist oder umfasst, die zur direkten oder indirekten Erzeugung eines Signals fähig ist, wobei das spezifische Medium (a) eine Lösung, (b) ein Netzwerk und (c) eine Signalvorstufe umfasst, und wobei das viskose Medium (a) eine Lösung, (b) eine spezifische Komponente und (c) eine Signalvorstufe umfasst, oder

(2) eines anzeigenden oder dicken Mediums auf einem Träger, wenn die Analyteinheit eine Signalvorstufe ist oder umfasst, wobei das anzeigende Medium (a) eine Lösung, (b) ein Polymernetzwerk und

(c) eine Signaleinheit umfasst, und wobei das dicke Medium (a) eine Lösung, (b) eine spezifische Komponente und (c) eine Signaleinheit umfasst;

(b) Inkontaktbringen der Medien mit der Analyteinheit; und

(c) Erzeugen eines Signals mithilfe der Signaleinheit.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Viskosität zwischen 1,5 mPa·s (cp) und 1000 mPa·s (cp) liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polymernetzwerk ausgewählt ist aus der Polymergruppe, die aus Kohlenhydraten, Polysacchariden, Stärken, Polynucleotiden, Proteinen, Polypeptiden, Polyglycolen, Liposacchariden, Dextranen, Methylcellulosen, Pectinen, Pflanzenschleim, Pflanzengummen, Cellulosen, Agarosen, vernetzten Agarosen, Polyacrylamiden, flüssigen Kristallen, Zeoliten, Silikaten, Phosphaten, Sulfaten und Aluminaten besteht.

5. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 4, wobei im signalerzeugenden Schritt das Netzwerk oder der Träger mit dem Signal in Wechselwirkung tritt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Netzwerk durch ein Gel produziert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei in dem Schritt zur Erzeugung des spezifischen Mediums die Signalvorstufe zur Erzeugung des Mediums zu dieser Lösung zugefügt wird, bevor die Lösung auf den Träger aufgebracht oder gegossen wird, oder nachdem die Lösung auf den Träger aufgebracht oder gegossen worden ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 7, wobei die spezifische Komponente ausgewählt ist aus der Gruppe Zucker, Alkohole, Glykole, Proteine, Polypeptide, Aminosäuren, Desoxyribonucleinsäuren, Ribonucleinsäuren, Polynucleotide, Nucleotide, Nucleoside, Basen, Fettsäuren, Pectine, Mucine, Polysaccharide, Steroide, Flavanoide, Alkaloide, Terpene, Vitamine, Co- Enzyme, Prostaglandine, Kohlenwasserstoffe und Porphyrine.

9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Signal in dem Medium löslich oder unlöslich ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Analyteinheit ausgewählt ist aus der Gruppe Liganden, Rezeptoren, Proteine, Antikörper, Antigene, Nucleinsäuren, Polynucleotide, Polysaccharide, Polypeptide, Mikroorganismen, Viren, Phagen, Bakterien, Pilze, Algen, Allergene, tierische Zellen, pflanzliche Zellen und Tumorzellen.

11. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die analytspezifische Einheit ausgewählt ist aus der Gruppe Mikroorganismen, Liganden, Rezeptoren, Glycoproteine, Proteine, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzyminhibitoren, Antigene, Hormone, Antikörper, Polynucleotide, Aminosäuren, Lipide und Lektine.

12. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Signaleinheit ausgewählt ist aus der Gruppe Enzyme, Katalysatoren, Radikalerzeuger und Oxidationsmittel.